Summary
Detta protokoll beskriver hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att genomföra automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution. MMC kan odla och subkultivera mikroorganismer automatiskt och kontinuerligt och övervaka online deras tillväxt med relativt hög genomströmning och god parallellisering, vilket minskar arbetskrafts- och reagensförbrukningen.
Abstract
Konventionella mikrobiella odlingsmetoder har vanligtvis besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagens. Dessutom har mikroplattbaserade odlingsmetoder med hög genomströmning som utvecklats under de senaste åren dålig mikrobiell tillväxtstatus och experimentparallellisering på grund av deras låga upplösta syre, dåliga blandning och allvarliga avdunstning och termiska effekt. På grund av många fördelar med mikrodroppar, såsom liten volym, hög genomströmning och stark kontrollerbarhet, kan den droppbaserade mikrofluidiska tekniken övervinna dessa problem, som har använts i många typer av forskning om mikrobiell odling, screening och evolution med hög genomströmning. De flesta tidigare studier förblir dock på scenen för laboratoriekonstruktion och tillämpning. Några viktiga frågor, såsom höga operativa krav, höga konstruktionssvårigheter och brist på automatiserad integrationsteknik, begränsar den breda tillämpningen av droppmikrofluidisk teknik i mikrobiell forskning. Här utvecklades ett automatiserat mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik, vilket uppnådde integration av funktioner som ympning, odling, onlineövervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. I detta protokoll togs vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 och en metanol-essentiell E. coli-stam (MeSV2.2) som exempel för att introducera hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och relativt högkapacitets mikrobiell odling och adaptiv utveckling i detalj. Denna metod är lätt att använda, förbrukar mindre arbetskraft och reagens och har hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har stora fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och resultatsäker experimentell plattform för vetenskapliga forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.
Introduction
Mikrobiell odling är en viktig grund för mikrobiologisk vetenskaplig forskning och industriella tillämpningar, som används i stor utsträckning vid isolering, identifiering, rekonstruktion, screening och utveckling av mikroorganismer 1,2,3. Konventionella mikrobiella odlingsmetoder använder huvudsakligen provrör, skakkolvar och fasta plattor som odlingsbehållare, i kombination med skakinkubatorer, spektrofotometrar, mikroplattläsare och annan utrustning för mikrobiell odling, detektion och screening. Dessa metoder har emellertid många problem, såsom besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagenser. De odlingsmetoder med hög kapacitet som utvecklats under de senaste åren är huvudsakligen baserade på mikroplattan. Men mikroplattan har en låg nivå av upplöst syre, dålig blandningsegenskap och svår avdunstning och termisk effekt, vilket ofta leder till dålig tillväxtstatus och experimentparallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; å andra sidan måste den vara utrustad med dyr utrustning, såsom vätskehanteringsarbetsstationer och mikroplattläsare, för att uppnå automatiserad odling och processdetektering 8,9.
Som en viktig gren av mikrofluidisk teknik har droppmikrofluidik utvecklats under de senaste åren baserat på traditionella mikrofluidiska system med kontinuerligt flöde. Det är en diskret flödesmikrofluidisk teknik som använder två oblandbara vätskefaser (vanligtvis oljevatten) för att generera dispergerade mikrodroppar och arbeta med dem10. Eftersom mikrodroppar har egenskaperna hos liten volym, stor specifik ytarea, hög intern massöverföringshastighet och ingen korskontaminering orsakad av fackbildning, och fördelarna med stark kontrollerbarhet och hög genomströmning av droppar, har det funnits många typer av forskning som tillämpar droppmikrofluidisk teknik vid odling, screening och utveckling av mikroorganismer med hög genomströmning11 . Det finns dock fortfarande en rad viktiga frågor för att göra droppmikrofluidisk teknik populariserad och allmänt tillämpad. För det första är driften av droppmikrofluidik besvärlig och invecklad, vilket resulterar i höga tekniska krav för operatörer. För det andra kombinerar droppmikrofluidisk teknik optiska, mekaniska och elektriska komponenter och måste associeras med biotekniska applikationsscenarier. Det är svårt för ett enda laboratorium eller team att bygga effektiva droppmikrofluidiska styrsystem om det inte finns något tvärvetenskapligt samarbete. För det tredje, på grund av den lilla volymen mikrodroppe (från picoliter (pL) till mikroliter (μL)), krävs det mycket svårigheter att förverkliga den exakta automatiserade kontrollen och realtidsdetekteringen av droppar för vissa grundläggande mikrobiella operationer som subodling, sortering och provtagning, och det är också svårt att konstruera ett integrerat utrustningssystem12.
För att ta itu med ovanstående problem utvecklades ett automatiskt mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik13. MMC består av fyra funktionella moduler: en droppigenkänningsmodul, en droppspektrumdetekteringsmodul, en mikrofluidisk chipmodul och en provtagningsmodul. Genom systemintegration och kontroll av alla moduler fastställs automatiserat operativsystem inklusive generering, odling, mätning (optisk densitet (OD) och fluorescens), splittring, fusion, sortering av droppar exakt, vilket uppnår integrationen av funktioner som inokulering, odling, övervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. MMC kan rymma upp till 200 replikerade droppodlingsenheter med en volym på 2-3 μl, vilket motsvarar 200 odlingsenheter för skakkolvar. Odlingssystemet för mikrodroppar kan uppfylla kraven på icke-kontaminering, upplöst syre, blandning och massenergiutbyte under tillväxten av mikroorganismer och tillgodose de olika behoven hos mikrobiell forskning genom flera integrerade funktioner, till exempel tillväxtkurvmätning, adaptiv evolution, enfaktoranalys på flera nivåer och metabolitforskning och analys (baserat på fluorescensdetektering)13,14.
Här introducerar protokollet hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och mikrobiell odling och adaptiv evolution i detalj (Figur 1). Vi tog vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 som ett exempel för att demonstrera mätningen av tillväxtkurvan och en metanol-essentiell E. coli-stam MeSV2.215 för att demonstrera den adaptiva utvecklingen i MMC. En operationsprogramvara för MMC utvecklades, vilket gör operationen mycket enkel och tydlig. I hela processen måste användaren förbereda den ursprungliga bakterielösningen, ställa in villkoren för MMC och sedan injicera bakterielösningen och relaterade reagenser i MMC. Därefter kommer MMC automatiskt att utföra operationer som droppgenerering, igenkänning och numrering, odling och adaptiv evolution. Det kommer också att utföra online-detektering (OD och fluorescens) av dropparna med hög tidsupplösning och visa relaterade data (som kan exporteras) i programvaran. Operatören kan stoppa odlingsprocessen när som helst enligt resultaten och extrahera måldropparna för efterföljande experiment. MMC är lätt att använda, förbrukar mindre arbete och reagenser och har relativt hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har betydande fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och robust experimentell plattform för forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installation av instrument och programvara
- Välj en ren och steril miljö (t.ex. en ren bänk) som ett dedikerat permanent utrymme för MMC. Installera MMC stadigt i utrymmet.
OBS: Håll MMC borta från störningar från starka elektriska fält, magnetfält och starka värmestrålningskällor. Undvik att allvarliga vibrationer påverkar de optiska detekteringskomponenterna. Ge strömförsörjningen på AC220 V, 50 HZ till MMC. Mer information om MMC finns i materialförteckningen och webbplatsen för MMC16. - Installera operationsprogramvaran från MMC.zip-filen
Kontakta författarna för filen MMC.zip.- Skapa en dedikerad mapp och spara zip-filen i den.
- Skapa en annan dedikerad mapp som "Installationskatalog". Packa upp MMC.zip och spara filerna i den nya mappen.
Datorkonfigurationen är bäst att uppfylla: (1) Windows 7 64-bitars operativsystem eller högre; (2) CPU: i5 eller högre; (3) minne: 4 GB eller högre; (4) hårddisk: 300 GB eller högre (rotationshastighet större än 7200 rpm eller solid state-disk).
2. Förberedelser
- Anslut sprutnålen (innerdiametern är 0,41 mm och ytterdiametern är 0,71 mm), snabbkopplingen A och reagensflaskan (figur 2C) och autoklavera dem vid 121 °C i 15 minuter.
OBS: Skruva av locket på reagensflaskan något under sterilisering. Några fler reagensflaskor kan beredas varje gång för användning. - Använd ett 0,22 μm polyvinylidenfluoridfilter (PVDF) för att filtrera MMC-olja. Lägg det mikrofluidiska chipet (figur 2B) och MMC-oljan i den rena bänken i förväg och sterilisera dem genom ultraviolett bestrålning i 30 minuter före användning.
OBS: För detaljer om snabbkoppling A, reagensflaska, MMC-olja och mikrofluidiskt chip, se materialtabellen. - Installera mikrofluidikchipet
- Öppna dörren till operationskammaren (figur 2A) och lyft den optiska fibersonden.
- Rikta in de elektriska fälthålen med de elektriska fältnålarna och placera försiktigt chipet på chippiedestalen. Sätt sedan in de två positioneringskolumnerna i positioneringshålen och lägg ner den optiska fibersonden (figur 2D).
- Anslut snabbkontakten A på chipet till motsvarande port på MMC enligt positionsnumret (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Stäng sedan dörren till operationskammaren.
- Fyll på MMC-oljan (till cirka 80 ml) i oljeflaskan och töm avfallsvätskan i avfallsflaskan före användning.
OBS: Avfallsvätskan är vanligtvis organiskt avfall. Se regionala lagar och förordningar vid bortskaffande, med förbehåll för ändringar baserat på experimentell installation.
3. Mätning av tillväxtkurva i MMC
- Förberedelse för initial bakterielösning
- Följ de relaterade standardbestämmelserna för att förbereda Luria-Bertani (LB) medium och autoklav vid 121 ° C i 15 minuter.
OBS: Komponenter i LB-medium: NaCl (10 g / L), jästextrakt (5 g / L) och trypton (10 g / L). - Ta ut E. coli MG1655-stammen från glycerolbuljongen och odla den i en 50 ml skakkolv med 10 ml LB-medium i en skakinkubator (200 rpm) vid 37 °C i 5-8 timmar.
OBS: Odlingstiden beror på de specifika stammarna. Det är optimalt att odla stammen till den logaritmiska perioden/fasen. - Späd den odlade E. coli MG1655-lösningen med färskt medium till en OD600 av 0,05-0,1 för att erhålla en initial bakterielösning (bered ca 10 ml).
- Följ de relaterade standardbestämmelserna för att förbereda Luria-Bertani (LB) medium och autoklav vid 121 ° C i 15 minuter.
- Klicka på Initialisering för att initiera MMC. När initieringsgränssnittet visas ställer du in odlingstemperaturen som 37 °C och det fotoelektriska signalvärdet som 0,6 (figur 3A). Initieringen tar cirka 20 minuter.
- Slå på UV-lampan (våglängd 254 nm) under initialisering.
- Injicera den ursprungliga bakterielösningen och MMC-oljan i reagensflaskan.
- Ta ut en steriliserad reagensflaska på den rena bänken och dra åt locket.
- Använd en 10 ml steril spruta för att injicera 3-5 ml MMC-olja från sidorörets sprutnål. Luta och rotera reagensflaskan långsamt så att oljan helt infiltrerar innerväggen.
- Injicera cirka 5 ml initial bakterielösning och fyll sedan reagensflaskan genom att injicera 5-7 ml av oljan igen.
- Dra ut den oberoende snabbkontakten A och sätt in snabbkopplingen A på reagensflaskan i snabbkopplingen B för att slutföra provinjektionen (figur 4A).
- Vänta tills initialiseringen är slut och stäng sedan av UV-lampan (våglängd 254 nm).
- Öppna dörren till operationskammaren och sätt reagensflaskan i metallbadet.
- Dra ut C2-kontakten på chipet och snabbkontakten A på reagensflaskan. Anslut reagensflaskans sidorörskontakt till C2-kontakten och den övre rörkontakten till O2-kontakten. Stäng sedan dörren till operationskammaren.
- Klicka på Tillväxtkurva för att välja funktionen för mätning av tillväxtkurvan (figur 3A). I parameterinställningsgränssnittet matar du in numret som 15, slår på OD-detekteringsomkopplaren och ställer in våglängden som 600 nm. Klicka på Start för att starta droppgenerering. Det tar ca 10 min.
OBS: Här hänvisar Nummer till antalet droppar som ska genereras. Våglängd avser våglängden för OD som ska detekteras. Ställ in antal (maximalt 200) och våglängd (350-800 nm) enligt experimentkraven. - När ett popup-fönster visas i huvudgränssnittet som uppmanar "Ta bort reagensflaskan mellan C2 och O2, klicka sedan på OK-knappen efter avslutad", öppna dörren till operationskammaren för att ta ut reagensflaskan och anslut C2- och O2-kontakterna.
- Stäng dörren och klicka på OK knappen i popup-fönstret för att automatiskt odla dropparna och upptäcka OD-värdena.
OBS: MMC detekterar OD-värdet när droppen passerar den optiska fibersonden. Därför beror detekteringsperioden på antalet genererade droppar. - När tillväxtkurvan når den stationära fasen klickar du på knappen Dataexport för att exportera OD-data. Välj sökvägen för att spara data och exportera OD-värdet som registrerats under odlingsperioden i .csv format, som kan öppnas med lämplig programvara (t.ex. Microsoft Excel). Använd sedan en kartprogramvara (t.ex. EXCEL och Origin 9.0) för att rita tillväxtkurvan.
OBS: Under odlingsprocessen är det möjligt att klicka på dataexporten när som helst för att exportera OD-data för alla strömdroppar.
4. Adaptiv utveckling i MMC
- Förberedelse för initial bakterielösning
- Följ de relaterade standardbestämmelserna för att förbereda det speciella flytande mediet och fasta plattor för MeSV2.2 och autoklaven vid 121 °C i 15 minuter.
OBS: För komponenterna i specialmediet, se tabell 1 och materialtabellen. - Odla MeSV2.2 med den fasta plattan (diameter = 90 mm) i en 37 °C konstanttemperaturinkubator i 72 timmar. Välj sedan en oberoende koloni och odla den i en 50 ml skakkolv med 10 ml av det speciella flytande mediet i en skakinkubator (200 rpm) vid 37 °C i 72 timmar.
- Späd den odlade MeSV2.2-lösningen med mediet till en OD600 av 0,1-0,2 (se till att den totala volymen inte är mindre än 10 ml) och fortsätt att odla den i skakkolven i 5 timmar för att erhålla den ursprungliga bakterielösningen.
OBS: MeSV2.2 är en metanol-essentiell E. coli-stam . Det speciella flytande mediet innehåller 500 mmol /L metanol, vilket är en stark stress för MeSV2.2, vilket resulterar i mycket långsam tillväxt. Observera att erhållandet av den ursprungliga bakterielösningen här skiljer sig från den som beskrivs i steg 3.1.
- Följ de relaterade standardbestämmelserna för att förbereda det speciella flytande mediet och fasta plattor för MeSV2.2 och autoklaven vid 121 °C i 15 minuter.
- Initiera MMC enligt beskrivningen i steg 3.2, 3.3 och 3.5.
- Ta ut två steriliserade reagensflaskor, varav en är för den ursprungliga bakterielösningen och den andra är för det färska mediet. Injicera den ursprungliga bakterielösningen (5 ml), färskt medium (12-15 ml) och MMC-olja i reagensflaskorna enligt beskrivningen i steg 3.4.
OBS: Eftersom adaptiv evolution är en långsiktig process som involverar flera delodlingar, lagra så mycket färskt medium som möjligt i MMC. Mediet kan inte fyllas på under experimentkörningen. - Installera de två reagensflaskorna i MMC enligt beskrivningen i steg 3.6. Installera den för den första bakterielösningen mellan C2- och O2-kontakten och den andra för det färska mediet mellan C4- och O4-kontakten.
- Klicka på ALE för att välja funktionen för adaptiv evolution (figur 3B). I parameterinställningsgränssnittet slår du på OD Detection-omkopplaren .
- Ställ in tal som 50, våglängd som 600 nm, koncentration som 0%, typ som tid, parameter som 30 timmar och repetitioner som 99. Klicka på Start för att starta droppgenerering. Det tar ca 25 min.
OBS: Här avser "Koncentration" den maximala koncentrationen av kemiska faktorer för adaptiv evolution. För olika droppar är det realiserbart i MMC att införa olika koncentrationer av kemiska faktorer för att ge olika tillväxtförhållanden. Beräkna de införda koncentrationerna med hjälp av följande ekvation:
Här hänvisar "C" till koncentrationen av kemiska faktorer som införs i droppar; a: koncentrationen av kemiska faktorer i reagensflaskorna mellan C4- och O4-kontakten. b: koncentrationen av kemiska faktorer i reagensflaskorna mellan C6- och O6-kontakten. och "i" avser den tillgängliga koncentrationen. Det finns åtta koncentrationer tillgängliga i MMC. Eftersom den kemiska faktorn här har en enda koncentration (500 mmol / L metanol) och det är en av ingredienserna i mediet, installeras endast en reagensflaska som innehåller den kemiska faktorn här och koncentrationen är inställd som 0%. Typ avser läget för subodling, som är indelat i tre typer: tidsläge, OD-värdeläge och fluorescensläge. Den förra betyder att odla dropparna under en fast tid och sedan delkultivera, medan de två senare betyder att odla dropparna till fördefinierat OD-värde / fluorescensintensitet och sedan delkultivera. Parameter avser den relaterade parameter som krävs när du väljer ett sätt att subodling. Upprepningar avser antalet delodlingar. - Ta bort reagensflaskan som placerats mellan C2- och O2-kontakten enligt beskrivningen i steg 3.8.
- Observera om dropparnas maximala OD-värden under varje delodlingsperiod har ökat avsevärt. Om ökningen inträffar och uppfyller experimentkraven klickar du på knappen Dataexport för att exportera OD-data som förklaras i steg 3.9.
OBS: Här beror delodlingsperioden på parametern. När du till exempel anger Typ som Tid och Parameter som 30 h är underodlingsperioden 30 h. Under varje delodlingsperiod finns dropparnas maximala OD-värden. Uppskatta om den adaptiva utvecklingen uppfyller experimentkraven genom ökningen av maximala OD-värden (Ökningen beror på den faktiska odlingsprocessen för stammen, till exempel ökad med mer än 20%).
VARNING: Var uppmärksam på om det lagrade färska mediet är uttömt. Om den signifikanta ökningen inte har inträffat även efter att mediet är uttömt, extrahera de bättre växande dropparna och utför en ny omgång adaptiv evolution. - Extrahera måldropparna från MMC.
- Klicka på screeningknappen för att välja funktionen för droppextraktion (figur 3C). Välj alternativet Samla in , klicka på antalet måldroppar och klicka sedan på OK.
OBS: Droppscreening inkluderar "Samla", "Kassera" och "Extrahera frölösning". med extraktfrölösning avses att de återstående dropparnasamlas upp 13 efter delodlingen. - Vänta tills popup-fönstret frågar" Dra ut CF-snabbkontakten och sätt den i EP-röret". Sätt CF-snabbkontakten i mikrocentrifugröret för insamling enligt programvaruprompten och klicka sedan på OK (figur 4D).
- Efter 1-2 minuter kommer programvarugränssnittet att dyka upp ett nytt fönster som uppmanar "Sätt tillbaka kontakten och klicka på OK om du är klar". Sätt sedan tillbaka CF-snabbkontakten och klicka på OK för att få MMC att fortsätta att köras (bild 4D). När nästa måldroppe når droppigenkänningsplatsen upprepar du 4.9.2-4.9.3 för att samla upp den.
OBS: När alla måldroppar har samlats in fortsätter MMC att odla de återstående dropparna. Om odlingen inte är nödvändig, klicka på Stopp för att direkt avsluta operationen. - Extrahera droppen med en 2,5 μL pipett, släpp den på 90 mm agarosplattan och sprid den jämnt med en triangulär glasspridningsstång med en sidolängd på 3 cm. Odla den sedan i en 37 °C konstanttemperaturinkubator i 72 timmar.
- Plocka 3-5 oberoende kolonier och odla dem separat i 50 ml skakkolvar med 10 ml färskt medium i en skakinkubator (200 rpm) vid 37 °C i 48-72 timmar. Följ de relaterade standardbestämmelserna för att lagra den odlade bakterielösningen i glycerolröret för efterföljande experiment.
- Klicka på screeningknappen för att välja funktionen för droppextraktion (figur 3C). Välj alternativet Samla in , klicka på antalet måldroppar och klicka sedan på OK.
5. Rengör MMC
- När experimentet är klart klickar du på Stopp för att stoppa alla operationer. Klicka sedan på Rengör för att rengöra chipet och rören. Det tar ca 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll använder E. coli MG1655 och en MeSV2.2-stam som exempel för att demonstrera den mikrobiella odlingen och metanol-essentiell adaptiv utveckling med en automatiserad och relativt hög genomströmningsstrategi i MMC. Tillväxtkurvmätningen användes främst för att karakterisera mikrobiell odling. Den adaptiva evolutionen genomfördes genom automatiserad kontinuerlig subodling och tillsats av en hög koncentration av metanol som selektivt tryck under varje delodling. Huruvida adaptiv evolution hade realiserats uppskattades genom variationstrenden för dropparnas maximala OD-värde under varje delodlingsperiod. De avstämbara parametrarna och noggrannhetsparametrarna för MMC visas i tabell 2.
Resultat av mätning av tillväxtkurva
OD600-värdena för de 15 droppar som detekterades under odlingsprocessen exporterades från MMC efter odling i cirka 20 timmar (figur 5A). Det kan observeras att detekteringen genomfördes ungefär var 14: e min. Denna detektionsperiod beror på antalet droppar som genereras eftersom dropparna cyklas fram och tillbaka i rören för odling, och detekteringsmodulen detekterar endast OD-värdena (detektering och beräkning av OD-värde visas i kompletterande figur 1) när dropparna passerar den optiska fibersonden. Därför är 14 min en mycket kort detektionsperiod, vilket ger en detekteringsprocess med hög tidsupplösning för att återspegla tillväxten av mikroorganismer mer exakt.
Enligt de exporterade uppgifterna beräknades de genomsnittliga OD600-värdena och standardavvikelsen (SD) på 15 droppar vid varje tidpunkt och tillväxtkurvan för E. coli MG1655 plottades (figur 5B). Resultaten visar att tillväxtkurvan presenterar en "S" -form, inklusive fördröjningsfas, logaritmisk fas och stationär fas, vilket är mycket förenligt med den klassiska mikrobiella tillväxtmodellen. Samtidigt är standardavvikelserna för 15 droppar mycket små, vilket indikerar god tillväxtkonsistens och parallellitet. Således visar det fullt ut den goda mikrobiella odlings- och detektionsprestandan hos MMC. Dessutom kontrollerades det också att det finns lite överhörning mellan droppar under odling (kompletterande figur 2 och tilläggstabell 1).
Resultat av adaptiv evolution
Vi har utfört en långsiktig adaptiv evolution av MeSV2.2 i MMC. Den 18: e dagen, enligt den ökande trenden för de maximala OD600-värdena för dropparna under varje subodlingsperiod från tillväxtkurvorna som visas på mjukvarugränssnittet, trodde vi att en bra adaptiv utveckling uppnåddes i de 50 dropparna. OD600-data exporterades och 8 droppar (inklusive dropp 6) med relativt god tillväxtprestanda extraherades13. Figur 6A visar tillväxtkurvorna för 50 droppar i hela den adaptiva utvecklingsprocessen. På 18 dagar har MMC automatiskt genomfört 13 delodlingsoperationer. Det framgår av figur 6A att MeSV2.2 växer långsamt först och snabbt efteråt, vilket indikerar spåret för adaptiv utveckling i MeSV2.2. För att leverera ett selektionstryck tillsattes metanolen till MeSV2.2-mediet. Initialt hämmade metanol celltillväxten. Efter den adaptiva evolutionen hade de berikade cellerna anpassade till metanol en högre tillväxthastighet. Tillväxtkurvan för dropp 6 i hela den adaptiva utvecklingsprocessen plottades separat (figur 6B). De maximala OD600-värdena under den första generationen och den senaste delodlingsperioden var 0,37 respektive 0,58, ökade med 56,8%. Det indikerar att stammen i dropp 6 har realiserat en uppenbar adaptiv utveckling.
Därefter odlades dropp 6-stammen och den ursprungliga stammen i skakkolvar och deras tillväxtkurvor jämfördes (figur 6C). Enligt de metoder som anges i litteraturen 17,18 beräknades de maximala specifika tillväxthastigheterna (μmax) för dropp 6-stammen och den initiala stammen, vilka var 0,096 h-1 respektive 0,072 h-1. Figur 6C avslöjar att dropp 6-stammen uppvisade en högre maximal specifik tillväxthastighet (ökade med 54,8%) och hade en högre cellkoncentration i den stationära fasen (ökade med 20,0%) än den ursprungliga stammen när den odlades i skakkolvar, vilket ytterligare föreslog att den adaptiva utvecklingen i MeSV2.2 har realiserats.
Figur 1: Övergripande arbetsflöde för mätning av tillväxtkurva och adaptiv utveckling i MMC. (A) Mätning av tillväxtkurvan i MMC. För det första, odla stammen i skakkolv för att förbereda den ursprungliga bakterielösningen. Injicera sedan den ursprungliga bakterielösningen i reagensflaskan. Generera sedan dropparna i MMC. MMC får dropparna att cykla fram och tillbaka i mikrofluidikchipet och rören för att odla dem. När droppar passerar detekteringsplatsen kommer OD-data att detekteras och registreras. Slutligen exporterar du data för analys. (B) Adaptiv utveckling i MMC. Välj en enda koloni från agarosplattan och odla den i en skakkolv för att förbereda den ursprungliga bakterielösningen. Efter injektion av den initiala bakterielösningen i reagensflaskan, utför den adaptiva utvecklingen i MMC. Adaptiv evolution innebär kontinuerlig subodling, som automatiskt kan drivas genom droppsplittring och fusion. Efter den adaptiva utvecklingen exporterar du data för analys. Måldroppar kan extraheras och sedan spridas på plattan för att få enstaka kolonier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Struktur och viktiga verktyg för MMC. (A) Mmcs utvändiga kammare och driftskammare. (B) Det mikrofluidiska chipet i MMC. Chipet har sju kanaler (C1-C6 och CF). C) Reagensflaska. Den har ett topprör och ett sidorub. Innan provet injiceras i reagensflaskan måste det först ansluta en sprutnål till en snabbkoppling A och sedan ansluta snabbkopplingen A till sidoröret. (D) Installation av det mikrofluidiska chipet. Det mikrofluidiska chipet är installerat på piedestalen. Därefter är de sju kanalerna (C1-C6 och CF) anslutna till motsvarande portar i MMC (O1-O6 och OF).
1 - Driftskammare för MMC.
2 - Oljeflaska som innehåller MMC-oljan.
3 - Avfallsflaska för uppsamling av avfallsvätska.
4 - UV-lampa (våglängd 254 nm) för sterilisering. Denna lampa kan tändas i förväg för att sterilisera chipet och rören.
5 - Laser (620 nm) för droppigenkänning. Den punkt där lasern bestrålas på chipet är droppigenkänningsstället.
6 - Temperatursond för att mäta temperaturen inuti operationskammaren.
7 - Värmare för driftskammaren. Den kan användas för att bibehålla temperaturen på mikrobiell odling. Temperaturintervallet som kan ställas in är 25 ± 0,5 °C till 40 ± 0,5 °C.
8 - Optisk fibersond för att mäta dropparnas OD eller fluorescens.
9 - Chip piedestal för att installera Microfluidic chip.
10 - Metallbad för att fixera reagensflaskorna och värma dem för att snabbt höja temperaturen på ett reagens till temperaturen för mikrobiell odling.
11 - Portar för det mikrofluidiska chipet (O1-O6 och OF). Det mikrofluidiska chipet är anslutet till MMC via dessa portar.
12 - Rör för dropplagring och odling.
13 - Magnetblock för att snabbt hitta det mikrofluidiska chipet under installationen.
14 - Sprutnål för att injicera proverna i reagensflaskorna. Dess innerdiameter är 0,41 mm och dess ytterdiameter är 0,71 mm.
15 - Snabbkoppling A. Anslut med snabbkoppling B.
16 - Snabbkoppling B. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Mmc:s gränssnitt för driftsprogramvara. (A) Programvarans huvudgränssnitt. (1) Temperatur i operationskammaren. (2) Fotoelektriskt signalvärde för droppigenkänning. När droppen passerar är signalvärdet högt (>2 V). När oljan passerar är signalvärdet lågt (<1 V). (3) Val av funktion. Det finns fyra funktioner att välja mellan: tillväxtkurvmätning (tillväxtkurva), adaptiv laboratorieutveckling (ALE), enfaktors flernivåanalys (enfaktor) och anpassning av operationerna efter experimentella behov (Anpassning). (4) Gränssnitt för parameterinställning. Ställ in motsvarande experimentella parametrar här efter att ha valt en funktion. (5) Kommandokörningsområde. (6) Byte av kamera. Kameran installeras direkt ovanför chipet, som kan användas för att online observera dropparna i chipet. (7) Processvisningsområde. Visar körtid, övervakningsdata och åtgärden som körs. (B) Parameterinställningsgränssnittet för adaptiv evolution. C) Gränssnittet för droppscreening. MMC kan automatiskt numrera dropparna. Här kan måldropparna väljas och extraheras från MMC. (D) Gränssnitt för kameraobservation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Provinjektion, droppgenerering och droppextraktion. (A) Reagensflaskan efter injektion av bakterielösning och MMC-olja. Både bakterielösningen och MMC-oljan injiceras från sidoröret. Oljefasen är i det övre lagret och bakterielösningen är i det nedre lagret. Efter injektionen ansluter du snabbkontakten A och B och installerar den sedan i MMC. (B) Droppgenerering i det mikrofluidiska chipet. För att förbättra synligheten av droppar användes en röd pigmentlösning för att demonstrera processen för droppgenerering. (C) Dropp lagrad i röret observerad med mikroskop. Skalstreck: 400 μm. (D) Popup-fönsteruppmaningar och motsvarande åtgärder. När uppmaningen "Dra ut CF-snabbkontakten och sätt den i EP-röret" visas, dra ut CF-kontakten och sätt den i EP-röret för att samla upp måldroppen; när prompten "Sätt tillbaka kontakten" visas, droppsamlingen är klar, sätt tillbaka CF-kontakten i OF-porten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Dataexport och figurdiagram över tillväxtkurvan. (A) Skärmdump av en del av de exporterade uppgifterna. Exporterade data inkluderar varje detekteringstidpunkt för de 15 genererade dropparna och motsvarande OD600-värden. B) Tillväxtkurvan för E. coli MG1655 ritad på grundval av exporterade data. Beräkna de genomsnittliga OD600-värdena och standardavvikelsen (SD) för 15 droppar vid varje tidpunkt och plotta tillväxtkurvan. Det är tydligt att se att denna tillväxtkurva inkluderar fördröjningsfasen, logaritmisk fas och stationär fas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Resultat av den adaptiva utvecklingen av MeSV2.2 i MMC. (A) Tillväxtkurvor på 50 droppar i hela den adaptiva evolutionsprocessen. OD600-detektionsdata för 50 droppar under den 18-dagars adaptiva utvecklingsprocessen exporterades från MMC och plottades. På den 18: e dagen extraherades 8 droppar, inklusive dropp 6. (B) Tillväxtkurva för droppen 6 i hela den adaptiva evolutionsprocessen. De maximala OD600-värdena under den första generationen och den senaste delodlingsperioden var 0,37 respektive 0,58, ökade med 56,8%. C) Jämförelse mellan dropp 6-stammen och den ursprungliga stammen i skakkolven. Stammen av dropp 6 och den ursprungliga stammen odlades i skakkolvar och tillväxtkurvorna (inklusive SD, n = 3) mättes. Denna siffra har modifierats från Jian X. J. et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponenter | Koncentration |
| Na2HPO4·12H2O | 6,78 g/l |
| KH2PO4 | 3 g/l |
| NaCl | 0,5 g/l |
| NH4Cl | 1 g/l |
| vitamin B1 (steriliserad genom filtrering) | 0,34 g/l |
| MgSO4·7H2O | 0,049 g/l |
| CaCl2·2H2O | 1,5 mg/l |
| Mikroelement: | |
| FeCl3·6H2O | 0,5 mg/l |
| ZnSO4·7H2O | 0,09 mg/l |
| CuSO4·5H2O | 0,088 mg/l |
| MnCl2 | 0,045 mg/l |
| CoCl2·6H2O | 0,09 mg/l |
| Glukonat | 1,09 g/l |
| metanol | 500 mmol/l |
| isopropyl-β-d-tiogolaktopyranosid | 0,1 mmol/l |
| streptomycinsulfat | 20 μg/ml |
| kanamycinsulfat | 50 μg/ml |
| Tillsätt extra 15 g/l agaros för att bereda fast medium. | |
Tabell 1: Komponenter i det speciella mediet för MeSV2.2.
| Avstämbara parametrar | |
| Parameter | Sortiment |
| Odlingstemperatur | 25–40 °C ± 0,5 °C |
| Antal droppar | 0–200 |
| Koncentration av inokulum | 13.3–86.7 % |
| Koncentration av kemisk faktor | 8 olika koncentrationer, upp till den maximala koncentrationen av lagrad kemisk faktor |
| Tiden för subodling | Upp till användaren |
| Antalet delodlingar | Upp till användaren |
| Våglängd för OD-detektion | 350–800 nm |
| Våglängd för fluorescensdetektering | Excitation: 470, 528 nm Utsläpp: 350–800 nm |
| Parametrar för noggrannhet | |
| Parameter | C.V |
| Volym droppar | 1.88% |
| Koncentration av inokulum | <5,0% |
Tabell 2: Avstämbara parametrar och noggrannhetsparametrar för MMC. Avstämbara parametrar avser de parametrar som kan justeras enligt användarnas specifika krav. noggrannhetsparametrar avser de parametrar som återspeglar noggrannheten och reproducerbarheten för de olika fluida operationerna.
Kompletterande figur 1: Igenkänning och detektion av droppar i MMC. (A) Vågformen av en droppe i MMC. Denna vågform kommer från MMC-spektrometerns råa spektraldata. Efter bearbetning av råa spektraldata i bakgrunden kommer MMC att ge det uppmätta OD-värdet. B) OD-beräkning av droppar i MMC. I droppens vågform representerar 'a' droppens maximala längd, 'c' representerar det bågformade gränssnittet som bildas av oljefas och vattenfas och 'b' representerar huvuddelen av droppen. Baserat på Lambert-Beer-lagen beräknas DROPPENS OD-värde med följande formel: OD-värde = lg (E / D) × 10. "E" avser det genomsnittliga spektrala signalvärdet för oljefasen. "D" avser det genomsnittliga spektrala signalvärdet för droppens huvuddel b. Det bör noteras att OD-värdet som mäts med MMC skiljer sig från det som mäts med en spektrofotometer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Test av överhörning mellan dropparna. För att verifiera om det finns överhörning mellan dropparna under den långsiktiga odlingen späddes E. coli MG1655-lösningen till en mycket låg koncentration (enligt Poisson-fördelningen, λ = 0,1) och sedan genererades och odlades 200 droppar i 5 dagar. Efter mätning av OD fann man att E. coli MG1655 växte i ett litet antal droppar. Och det fanns nästan ingen bakterietillväxt i dropparna runt dessa droppar. Resultatet visar också preliminärt att det finns lite överhörning mellan dropparna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Stabilitet för droppgenerering i MMC. Som visas i kompletterande figur 1 har droppen en fast vågform. Spektrometern för MMC genererar ett visst antal datapunkter per sekund, så antalet datapunkter i droppvågformen kan återspegla droppens storlek. Den röda färglösningen användes för att generera 397 droppar i MMC, och OD-värdet mättes. Råspektraldata exporterades, datapunkterna för varje droppvågform räknades och variationskoefficienten (C.V) för droppdatapunkterna beräknades. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggstabell 2: Droppavdunstning i MMC. Här användes den röda färglösningen för att generera droppar i MMC och dropparna lagrades i odlingsröret. Röret placerades sedan i en 37 °C konstanttemperaturinkubator i 30 dagar, och dropplängden mättes regelbundet (ta bilder i mikroskop och mät längden med en skalstång). Det visar att droppvolymen reducerades med cirka 12, 3% efter 30 dagar, vilket indikerar att avdunstningen av droppen är mycket liten i MMC. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenterar hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att utföra automatiserad mikrobiell odling och långsiktig adaptiv evolution. MMC är ett miniatyriserat, automatiserat och mikrobiellt odlingssystem med hög genomströmning. Jämfört med konventionella mikrobiella odlingsmetoder och instrument med hög genomströmning har MMC många fördelar som låg arbets- och reagensförbrukning, enkel drift, onlinedetektering (OD och fluorescens), datainsamling med hög tidsupplösning och överlägsen parallellisering. MMC har också några speciella fördelar som skiljer sig från den konventionella droppmikrofluidiska tekniken, som vanligtvis använder pL- och nL-dropparna. De flesta tidigare rapporterade system som använde pL- och nL-droppar har dålig odlingsprestanda och få detekterbara parametrar (vanligtvis bara fluorescens)18,19,20,21. Även om det har funnits några plattformar som kan uppnå bättre odlingsprestanda och detektering av flera parametrar, är det svårt och kräver mycket ansträngning. Till exempel rapporterade vissa forskare OD-detektion av pL-droppar. Den är baserad på bildigenkänning, som inte bara har falska positiva resultat utan också behöver ytterligare verifiering av noggrannhet22. MMC kan dock åstadkomma dessa på ett relativt enkelt sätt. MMC använder mikroliterdroppar (μL) som sällan rapporteras. Den överlägsna mikrobiella odlingsprestandan för MMC har verifierats, och den kan också direkt detektera OD och fluorescens. På grund av den stora volymen av μL-dropparna är droppgenereringen mindre mottaglig för störningar, vilket har högre stabilitet. Under tiden kan mer olika operationer utföras i mikroliterdropparna, vilket bidrar till förverkligandet av automatiserade operationer. Eftersom dropparna är inneslutningsutrymmen kan dessutom innehållets flyktighet undertryckas (tilläggstabell 2), vilket bidrar till att utföra den långsiktiga mikrobiella odlingen och adaptiva evolutionen när flyktiga ämnen finns i mediet14. Detta är svårt att uppnå i skakkolvar och mikroplattor.
Vissa kritiska punkter i protokollet är dock värda att betona. För det första bör det noteras att OD-värdet som mäts med MMC skiljer sig från det för en spektrofotometer eftersom deras optiska banlängder för OD-mätning är olika (1 mm respektive 10 mm). Vid jämförelse av OD-värdet för MMC med skakkolvens värde är det därför nödvändigt att mäta kalibreringskurvan13. Lyckligtvis kräver den adaptiva utvecklingsprocessen inte kalibreringskurvor eftersom vi fokuserar på de relativa trenderna bland tillväxtkurvorna. Därefter odlas vissa mikroorganismer i MMC. Dropparna är beroende av ytspänningen i olje-vattengränssnittet för att upprätthålla stabilitet23. Om mikroorganismerna producerar vissa ämnen som stör ytspänningen i olje-vattengränssnittet, såsom vissa Bacillus subtilis-stammar som producerar ytaktiva ämnen24, kan dropparna inte upprätthålla stabilitet. Dessutom, om mediet i sig är ett hinder för generering av droppar, är det inte livskraftigt att användas i MMC, till exempel mycket visköst medium eller medium som innehåller stora partiklar. För närvarande inkluderar de arter vi framgångsrikt har odlat i MMC E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, jäst, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, mikroalger och så vidare. Det rekommenderas att odla stammen i MMC för preliminärt experiment. Slutligen måste kontakterna och portarna mellan chipet, reagensflaskan och MMC anslutas i strikt överensstämmelse med protokollet. Annars kan bakterielösningen strömma in i MMC och förorena det inre. Dessutom måste det påpekas att den nuvarande genomströmningen av MMC är begränsad (0-200) på grund av den tid det tar för underodling. I framtiden kommer vi att optimera styrprogramvaran och chipets storlek för att förkorta tiden och förbättra genomströmningen. Eftersom MMC är ett modulsystem behöver endast relaterade delar eller programvara bytas ut utan krav på ny utrustning.
För närvarande kan MMC inte bara utföra tillväxtkurvmätning, adaptiv laboratorieutveckling och enfaktoranalys på flera nivåer utan också användas för att anpassa olika droppoperationsprocedurer för att möta experimentella behov. I framtiden är det nödvändigt att ytterligare berika MMC-systemets applikationsfunktioner som svar på de olika behoven hos mikrobiell forskning, såsom att utföra multifaktor-ortogonala experiment på flera nivåer, automatisk provtagningsteknik med flera prover för att samtidigt mäta tillväxtkurvorna för flera bakteriearter och exakt detektera och kontrollera fler parametrar (t.ex. upplöst syre (DO) och pH). Samtidigt är det också nödvändigt att utveckla fler funktioner inom mikrobiologi för att tillämpa MMC på mer praktiska scenarier, såsom optimering av medelkompositioner, bestämning av minsta hämmande koncentration (MIC), samodling av mikroorganismer25 etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project från National Natural Science Foundation of China (21627812) och Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi tackar också prof. Julia A. Vorholt (Institute of Microbiology, Institutionen för biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) för tillhandahållandet av den metanol-essentiella E. coli-stammen version 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O.
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al.
- Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C.
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
