Summary
Ce protocole décrit comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative. MMC peut cultiver et sous-cultiver des micro-organismes automatiquement et en continu et surveiller en ligne leur croissance avec un débit relativement élevé et une bonne parallélisation, réduisant ainsi la consommation de main-d’œuvre et de réactifs.
Abstract
Les méthodes de culture microbienne conventionnelles ont généralement des opérations lourdes, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. De plus, les méthodes de culture à haut débit à base de microplaques développées ces dernières années ont un faible statut de croissance microbienne et une parallélisation expérimentale en raison de leur faible teneur en oxygène dissous, de leur mauvais mélange et de leur effet d’évaporation et thermique sévères. En raison de nombreux avantages des micro-gouttelettes, tels qu’un petit volume, un débit élevé et une forte contrôlabilité, la technologie microfluidique à base de gouttelettes peut surmonter ces problèmes, qui a été utilisée dans de nombreux types de recherche sur la culture, le criblage et l’évolution microbiens à haut débit. Cependant, la plupart des études antérieures restent au stade de la construction et de l’application du laboratoire. Certains problèmes clés, tels que les exigences opérationnelles élevées, la difficulté de construction élevée et l’absence de technologie d’intégration automatisée, limitent l’application généralisée de la technologie microfluidique des gouttelettes dans la recherche microbienne. Ici, un système automatisé de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes, permettant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance en ligne, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. Dans ce protocole, Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage et une souche d’E. coli essentielle au méthanol (MeSV2.2) ont été prises comme exemples pour présenter comment utiliser le MMC pour effectuer une culture microbienne automatisée et à débit relativement élevé et une évolution adaptative en détail. Cette méthode est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente de grands avantages par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et fiable en termes de résultats pour permettre aux chercheurs scientifiques de mener des recherches microbiennes connexes.
Introduction
La culture microbienne est une base importante pour la recherche scientifique microbiologique et les applications industrielles, qui est largement utilisée dans l’isolement, l’identification, la reconstruction, le criblage et l’évolution des micro-organismes 1,2,3. Les méthodes de culture microbienne conventionnelles utilisent principalement des tubes à essai, des flacons à agiter et des plaques solides comme récipients de culture, combinés à des incubateurs à secouer, des spectrophotomètres, des lecteurs de microplaques et d’autres équipements pour la culture, la détection et le dépistage microbiens. Cependant, ces méthodes présentent de nombreux problèmes, tels que des opérations fastidieuses, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. Les méthodes de culture à haut débit développées ces dernières années sont principalement basées sur la microplaque. Mais la microplaque a un faible niveau d’oxygène dissous, une mauvaise propriété de mélange et une évaporation et un effet thermique sévères, ce qui conduit souvent à un mauvais état de croissance et à une parallélisation expérimentale des micro-organismes 4,5,6,7; d’autre part, il doit être équipé d’équipements coûteux, tels que des postes de travail de manipulation de liquides et des lecteurs de microplaques, pour réaliser une culture automatisée et une détection de processus 8,9.
En tant que branche importante de la technologie microfluidique, la microfluidique des gouttelettes a été développée ces dernières années sur la base de systèmes microfluidiques traditionnels à flux continu. Il s’agit d’une technologie microfluidique à écoulement discret qui utilise deux phases liquides non miscibles (généralement huile-eau) pour générer des micro-gouttelettes dispersées et opérer sur elles10. Étant donné que les micro-gouttelettes présentent les caractéristiques d’un petit volume, d’une grande surface spécifique, d’un taux de transfert de masse interne élevé et d’aucune contamination croisée causée par la compartimentation, ainsi que les avantages d’une forte contrôlabilité et d’un débit élevé de gouttelettes, il existe de nombreux types de recherche appliquant la technologie microfluidique des gouttelettes dans la culture, le criblage et l’évolution à haut débit des micro-organismes11 . Cependant, il reste encore une série de questions clés pour rendre la technologie microfluidique des gouttelettes popularisée et largement appliquée. Tout d’abord, le fonctionnement de la microfluidique des gouttelettes est lourd et complexe, ce qui entraîne des exigences techniques élevées pour les opérateurs. Deuxièmement, la technologie microfluidique des gouttelettes combine des composants optiques, mécaniques et électriques et doit être associée à des scénarios d’application de la biotechnologie. Il est difficile pour un seul laboratoire ou une seule équipe de construire des systèmes efficaces de contrôle microfluidique des gouttelettes s’il n’y a pas de collaboration multidisciplinaire. Troisièmement, en raison du faible volume de micro-gouttelettes (du picoliter (pL) au microlitre (μL)), il faut beaucoup de difficulté pour réaliser le contrôle automatisé précis et la détection en ligne en temps réel des gouttelettes pour certaines opérations microbiennes de base telles que la sous-culture, le tri et l’échantillonnage, et il est également difficile de construire un système d’équipement intégré12.
Afin de résoudre les problèmes ci-dessus, un système automatique de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes13. La MMC se compose de quatre modules fonctionnels : un module de reconnaissance de gouttelettes, un module de détection de spectre de gouttelettes, un module de puce microfluidique et un module d’échantillonnage. Grâce à l’intégration du système et au contrôle de tous les modules, le système d’exploitation automatisé comprenant la génération, la culture, la mesure (densité optique (OD) et fluorescence), le fractionnement, la fusion, le tri des gouttelettes est établi avec précision, réalisant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. MMC peut contenir jusqu’à 200 unités de culture de gouttelettes répliquées de 2 à 3 μL de volume, ce qui équivaut à 200 unités de culture de flacons agités. Le système de culture de micro-gouttelettes peut satisfaire aux exigences de non-contamination, d’oxygène dissous, de mélange et d’échange masse-énergie pendant la croissance des micro-organismes, et répondre aux divers besoins de la recherche microbienne grâce à de multiples fonctions intégrées, par exemple, la mesure de la courbe de croissance, l’évolution adaptative, l’analyse multi-niveaux à facteur unique et la recherche et l’analyse des métabolites (basées sur la détection de fluorescence)13,14.
Ici, le protocole présente en détail comment utiliser la MMC pour effectuer une culture automatisée et microbienne et une évolution adaptative (Figure 1). Nous avons pris comme exemple Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage pour démontrer la mesure de la courbe de croissance et une souche d’E. coli essentielle au méthanol MeSV2.215 pour démontrer l’évolution adaptative de la MMC. Un logiciel d’exploitation pour MMC a été développé, ce qui rend l’opération très simple et claire. Dans l’ensemble du processus, l’utilisateur doit préparer la solution bactérienne initiale, définir les conditions de la MMC, puis injecter la solution bactérienne et les réactifs connexes dans la MMC. Par la suite, la MMC effectuera automatiquement des opérations telles que la génération de gouttelettes, la reconnaissance et la numérotation, la culture et l’évolution adaptative. Il effectuera également la détection en ligne (OD et fluorescence) des gouttelettes avec une résolution temporelle élevée et affichera les données associées (qui peuvent être exportées) dans le logiciel. L’opérateur peut arrêter le processus de culture à tout moment en fonction des résultats et extraire les gouttelettes cibles pour des expériences ultérieures. Le MMC est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental relativement élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et robuste permettant aux chercheurs de mener des recherches microbiennes connexes.
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Protocol
1. Installation de l’instrument et du logiciel
- Choisissez un environnement propre et stérile (comme un banc propre) comme espace permanent dédié à MMC. Installez la console MMC régulièrement dans l’espace.
REMARQUE: Gardez la MMC à l’écart des interférences des champs électriques forts, des champs magnétiques et des sources de rayonnement thermique fortes. Évitez les vibrations sévères qui affectent les composants de détection optique. Fournissez l’alimentation de AC220 V, 50 HZ à la console MMC. Pour plus de détails sur MMC, reportez-vous à la Table des matériaux et au site Web de MMC16. - Installez le logiciel d’exploitation à partir du fichier MMC.zip
Remarque : Contactez les auteurs du fichier MMC.zip.- Créez un dossier dédié et enregistrez-y le fichier zip.
- Créez un autre dossier dédié en tant que « Répertoire d’installation ». Décompressez la console MMC.zip et enregistrez les fichiers dans le nouveau dossier.
REMARQUE: La configuration de l’ordinateur est préférable de répondre: (1) Système d’exploitation Windows 7 64 bits ou supérieur; (2) CPU: i5 ou supérieur; (3) mémoire: 4 Go ou plus; (4) disque dur : 300 Go ou plus (vitesse de rotation supérieure à 7200 tr/min ou disque SSD).
2. Préparatifs
- Connectez l’aiguille de la seringue (diamètre intérieur de 0,41 mm et diamètre extérieur de 0,71 mm), le connecteur rapide A et le flacon de réactif (Figure 2C) et autoclavez-les à 121 °C pendant 15 min.
REMARQUE: Dévissez légèrement le bouchon du flacon de réactif pendant la stérilisation. Quelques bouteilles de réactif supplémentaires peuvent être préparées à chaque fois pour l’utilisation. - Utilisez un filtre au fluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,22 μm pour filtrer l’huile MMC. Mettez la puce microfluidique (Figure 2B) et l’huile MMC dans le banc propre à l’avance et stérilisez-les par irradiation ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation.
REMARQUE: Pour plus de détails sur le connecteur rapide A, la bouteille de réactif, l’huile MMC et la puce microfluidique, reportez-vous à la table des matériaux. - Installez la puce microfluidique
- Ouvrez la porte de la chambre de commande (Figure 2A) et soulevez la sonde à fibre optique.
- Alignez les trous de champ électrique avec les aiguilles de champ électrique et placez doucement la puce sur le piédestal de la puce. Insérez ensuite les deux colonnes de positionnement dans les trous de positionnement et posez la sonde à fibre optique (Figure 2D).
- Connectez le connecteur rapide A de la puce au port correspondant du MMC en fonction du numéro de position (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.
- Reconstituez l’huile MMC (à environ 80 mL) dans la bouteille d’huile et videz le liquide résiduaire dans la bouteille de déchets avant utilisation.
REMARQUE: Les déchets liquides sont généralement des déchets organiques. Veuillez vous référer à la législation et à la réglementation régionales lors de l’élimination, sous réserve de modifications en fonction de la configuration expérimentale.
3. Mesure de la courbe de croissance dans MMC
- Préparation de la solution bactérienne initiale
- Suivez les réglementations standard correspondantes pour préparer le milieu Luria-Bertani (LB) et l’autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
REMARQUE: Composants du milieu LB: NaCl (10 g / L), extrait de levure (5 g / L) et tryptone (10 g / L). - Retirez la souche E. coli MG1655 du bouillon de glycérol et cultivez-la dans une fiole agitée de 50 mL avec 10 mL de milieu LB dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 5-8 h.
REMARQUE: Le temps de culture dépend des souches spécifiques. Il est optimal de cultiver la souche jusqu’à la période/phase logarithmique. - Diluer la solution cultivée d’E. coli MG1655 avec un milieu frais à une OD600 de 0,05-0,1 pour obtenir une solution bactérienne initiale (préparer environ 10 mL).
- Suivez les réglementations standard correspondantes pour préparer le milieu Luria-Bertani (LB) et l’autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
- Cliquez sur Initialisation pour initialiser la console MMC. Une fois l’interface d’initialisation affichée, réglez la température de culture sur 37 °C et la valeur du signal photoélectrique sur 0,6 (Figure 3A). L’initialisation prendra environ 20 min.
- Allumez la lampe UV (longueur d’onde 254 nm) pendant l’initialisation.
- Injecter la solution bactérienne initiale et l’huile MMC dans le flacon de réactif.
- Sortez un flacon de réactif stérilisé sur le banc propre et serrez le bouchon.
- Utilisez une seringue stérile de 10 mL pour injecter 3 à 5 mL d’huile MMC à partir de l’aiguille de la seringue du tube latéral. Inclinez et faites pivoter lentement le flacon de réactif pour que l’huile s’infiltre complètement dans la paroi intérieure.
- Injecter environ 5 mL de solution bactérienne initiale, puis remplir le flacon de réactif en injectant à nouveau 5 à 7 mL d’huile.
- Retirez le connecteur rapide indépendant A et insérez le connecteur rapide A du flacon de réactif dans son connecteur rapide B pour terminer l’opération d’injection de l’échantillon (Figure 4A).
- Attendez la fin de l’initialisation, puis éteignez la lampe UV (longueur d’onde 254 nm).
- Ouvrez la porte de la chambre d’opération et placez le flacon de réactif dans le bain métallique.
- Retirez le connecteur C2 de la puce et le connecteur rapide A de la bouteille de réactif. Connectez le connecteur de tube latéral de la bouteille de réactif au connecteur C2 et le connecteur de tube supérieur au connecteur O2. Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.
- Cliquez sur Courbe de croissance pour choisir la fonction de mesure de la courbe de croissance (Figure 3A). Dans l’interface de paramétrage, entrez le nombre sur 15, activez le commutateur de détection OD et définissez la longueur d’onde sur 600 nm. Cliquez sur Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes. Cela prendra environ 10 min.
REMARQUE: Ici, nombre fait référence au nombre de gouttelettes à générer. La longueur d’onde fait référence à la longueur d’onde de la DO à détecter. Définissez le nombre (maximum 200) et la longueur d’onde (350-800 nm) en fonction des exigences de l’expérience. - Lorsqu’une fenêtre contextuelle apparaît sur l’interface principale vous invitant à « Retirer le flacon de réactif entre C2 et O2, puis cliquez sur le bouton OK après l’achèvement », ouvrez la porte de la chambre de commande pour sortir le flacon de réactif et connectez les connecteurs C2 et O2.
- Fermez la porte et cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre contextuelle pour cultiver automatiquement les gouttelettes et détecter les valeurs OD.
REMARQUE: La console MMC détecte la valeur OD lorsque la gouttelette passe la sonde à fibre optique. Par conséquent, la période de détection dépend du nombre de gouttelettes générées. - Lorsque la courbe de croissance atteint la phase stationnaire, cliquez sur le bouton Exportation de données pour exporter les données OD. Sélectionnez le chemin d’enregistrement des données et exportez la valeur OD enregistrée pendant la période de culture au format .csv, qui peut être ouvert par un logiciel approprié (par exemple, Microsoft Excel). Utilisez ensuite un logiciel de cartographie (par exemple, EXCEL et Origin 9.0) pour tracer la courbe de croissance.
REMARQUE: Pendant le processus de culture, il est possible de cliquer sur l’exportation de données à tout moment pour exporter les données OD de toutes les gouttelettes actuelles.
4. Évolution adaptative dans la MMC
- Préparation de la solution bactérienne initiale
- Suivez les réglementations standard applicables pour préparer le milieu liquide spécial et les plaques solides pour le MeSV2.2 et l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
REMARQUE: Pour les composants du support spécial, reportez-vous au tableau 1 et au tableau des matériaux. - Cultivez le MeSV2.2 à l’aide de la plaque solide (diamètre = 90 mm) dans un incubateur à température constante à 37 °C pendant 72 h. Ensuite, choisissez une colonie indépendante et cultivez-la dans une fiole agitée de 50 mL avec 10 mL du milieu liquide spécial dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 72 h.
- Diluer la solution de MeSV2.2 cultivée avec le milieu à une OD600 de 0,1-0,2 (s’assurer que le volume total n’est pas inférieur à 10 mL) et continuer à la cultiver dans la fiole agitée pendant 5 h pour obtenir la solution bactérienne initiale.
REMARQUE : Le MeSV2.2 est une souche d’E. coli essentielle au méthanol. Le milieu liquide spécial contient 500 mmol / L de méthanol, ce qui est un stress fort pour MeSV2.2, entraînant une croissance très lente. Notez que l’obtention de la solution bactérienne initiale ici est différente de celle décrite à l’étape 3.1.
- Suivez les réglementations standard applicables pour préparer le milieu liquide spécial et les plaques solides pour le MeSV2.2 et l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.
- Initialisez la console MMC comme expliqué aux étapes 3.2, 3.3 et 3.5.
- Sortez deux flacons de réactif stérilisés, dont l’un est pour la solution bactérienne initiale et l’autre est pour le milieu frais. Injecter la solution bactérienne initiale (5 mL), le milieu frais (12-15 mL) et l’huile MMC dans les flacons de réactif comme expliqué à l’étape 3.4.
REMARQUE: Comme l’évolution adaptative est un processus à long terme impliquant de multiples sous-cultures, stockez autant de milieu frais que possible dans la MMC. Le support ne peut pas être réapprovisionné pendant l’exécution de l’expérience. - Installez les deux flacons de réactif dans MMC comme expliqué à l’étape 3.6. Installez l’un pour la solution bactérienne initiale entre le connecteur C2 et O2 et l’autre pour le milieu frais entre le connecteur C4 et O4.
- Cliquez sur ALE pour choisir la fonction d’évolution adaptative (Figure 3B). Dans l’interface de paramétrage, activez le commutateur Détection OD .
- Définissez le nombre sur 50, la longueur d’onde sur 600 nm, la concentration sur 0 %, le type sur le temps, le paramètre sur 30 h et les répétitions sur 99. Cliquez sur Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes. Cela prendra environ 25 min.
NOTE: Ici, « Concentration » fait référence à la concentration maximale de facteurs chimiques pour l’évolution adaptative. Pour différentes gouttelettes, il est possible dans la MMC d’introduire différentes concentrations de facteurs chimiques pour fournir différentes conditions de croissance. Calculez les concentrations introduites à l’aide de l’équation suivante :
Ici, « C » fait référence à la concentration de facteurs chimiques introduits dans les gouttelettes; « a » fait référence à la concentration de facteurs chimiques dans les bouteilles de réactif entre le connecteur C4 et O4; « b » fait référence à la concentration de facteurs chimiques dans les bouteilles de réactif entre le connecteur C6 et O6; et « i » fait référence à la concentration disponible. Huit concentrations sont disponibles dans la MMC. Étant donné que le facteur chimique a ici une concentration unique (500 mmol / L de méthanol) et qu’il s’agit de l’un des ingrédients du milieu, une seule bouteille de réactif contenant le facteur chimique est installée ici et la concentration est fixée à 0%. Le type fait référence au mode de sous-culture, qui est divisé en trois types: le mode temporel, le mode de valeur OD et le mode de fluorescence. Le premier signifie cultiver les gouttelettes pendant un temps fixe, puis sous-cultiver, tandis que les deux derniers signifient cultiver les gouttelettes à une valeur OD / intensité de fluorescence prédéfinie, puis sous-cultiver. Le paramètre fait référence au paramètre associé requis lors du choix d’un mode de sous-culture. Les répétitions font référence au nombre de sous-cultures. - Retirez le flacon de réactif placé entre le connecteur C2 et O2 comme expliqué à l’étape 3.8.
- Observez si les valeurs maximales de DO des gouttelettes au cours de chaque période de sous-culture ont augmenté de manière significative. Si l’augmentation se produit et répond aux exigences de l’expérience, cliquez sur le bouton Exportation de données pour exporter les données OD comme expliqué à l’étape 3.9.
REMARQUE: Ici, la période de sous-culture dépend du paramètre. Par exemple, lorsque vous définissez Type comme Temps et Paramètre sur 30 h, la période de sous-culture est de 30 h. Au cours de chaque période de sous-culture, il y a les valeurs maximales de DO des gouttelettes. Estimer si l’évolution adaptative répond aux exigences de l’expérience par l’augmentation des valeurs maximales de DO (l’augmentation dépend du processus de culture réel de la souche, par exemple, augmenté de plus de 20%).
ATTENTION : Faites attention à ce que le milieu frais stocké soit épuisé. Si l’augmentation significative ne s’est pas produite même après l’épuisement du milieu, extraire les gouttelettes les plus en croissance et effectuer un nouveau cycle d’évolution adaptative. - Extrayez les gouttelettes cibles de la console MMC.
- Cliquez sur le bouton Criblage pour choisir la fonction d’extraction des gouttelettes (Figure 3C). Choisissez l’option Collecter , cliquez sur le nombre de gouttelettes cibles, puis cliquez sur OK.
REMARQUE: Le criblage des gouttelettes comprend « Collecter », « Jeter » et « Extraire la solution de semences ». Par « extraire la solution de semences », on entend la collecte des gouttelettes restantes13 après l’opération de sous-culture. - Attendez que la fenêtre contextuelle vous invite à « Veuillez retirer le connecteur rapide CF et le mettre dans le tube EP ». Placez le connecteur rapide CF dans le tube de microcentrifugation pour la collecte en fonction de l’invite du logiciel, puis cliquez sur OK (Figure 4D).
- Après 1-2 min, l’interface du logiciel affichera une nouvelle fenêtre invitant, « Veuillez insérer le connecteur en arrière et cliquez sur OK si vous avez terminé ». Ensuite, insérez le connecteur rapide CF et cliquez sur OK pour que la console MMC continue de fonctionner (Figure 4D). Lorsque la gouttelette cible suivante atteint le site de reconnaissance des gouttelettes, répétez 4.9.2-4.9.3 pour la collecter.
REMARQUE: Une fois que toutes les gouttelettes cibles sont collectées, la MMC continuera à cultiver les gouttelettes restantes. Si la culture n’est pas nécessaire, cliquez sur Arrêter pour mettre fin directement à l’opération. - Extrayez la gouttelette à l’aide d’une pipette de 2,5 μL, déposez-la sur la plaque d’agarose de 90 mm et étalez-la uniformément avec une tige d’étalement triangulaire en verre d’une longueur latérale de 3 cm. Ensuite, cultivez-le dans un incubateur à température constante à 37 °C pendant 72 h.
- Choisissez 3 à 5 colonies indépendantes et cultivez-les séparément dans les flacons agités de 50 mL avec 10 mL de milieu frais dans un incubateur à agitation (200 tr/min) à 37 °C pendant 48-72 h. Suivez les réglementations standard connexes pour stocker la solution de bactéries cultivées dans le tube de glycérol pour les expériences ultérieures.
- Cliquez sur le bouton Criblage pour choisir la fonction d’extraction des gouttelettes (Figure 3C). Choisissez l’option Collecter , cliquez sur le nombre de gouttelettes cibles, puis cliquez sur OK.
5. Nettoyage de la MMC
- Une fois l’expérience terminée, cliquez sur Arrêter pour arrêter toutes les opérations. Cliquez ensuite sur Nettoyer pour nettoyer la puce et les tubes. Cela prendra environ 15 min.
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Representative Results
Ce protocole utilise E. coli MG1655 et une souche MeSV2.2 comme exemples pour démontrer la culture microbienne et l’évolution adaptative essentielle au méthanol avec une stratégie automatisée et à débit relativement élevé dans la MMC. La mesure de la courbe de croissance a été principalement utilisée pour caractériser la culture microbienne. L’évolution adaptative a été réalisée par la sous-culture continue automatisée et l’ajout d’une forte concentration de méthanol comme pression sélective lors de chaque sous-culture. La question de savoir si l’évolution adaptative avait été réalisée a été estimée par la tendance de variation de la valeur maximale de LACO des gouttelettes au cours de chaque période de sous-culture. Les paramètres réglables et les paramètres de précision de la console MMC sont présentés dans le tableau 2.
Résultats de la mesure de la courbe de croissance
Les valeurs OD600 des 15 gouttelettes détectées au cours du processus de culture ont été exportées de la MMC après une culture d’environ 20 h (figure 5A). On peut observer que la détection a été effectuée environ toutes les 14 minutes. Cette période de détection dépend du nombre de gouttelettes générées car les gouttelettes sont cyclées d’avant en arrière dans les tubes pour la culture, et le module de détection ne détecte les valeurs OD (la détection et le calcul de la valeur OD sont montrés dans la figure supplémentaire 1) que lorsque les gouttelettes passent la sonde à fibre optique. Par conséquent, la période de détection de 14 minutes est très courte, fournissant un processus de détection à haute résolution temporelle pour refléter plus précisément la croissance des micro-organismes.
Selon les données exportées, les valeurs moyennes de laDO 600 et l’écart-type (ET) de 15 gouttelettes à chaque point temporel ont été calculés, et la courbe de croissance d’E. coli MG1655 a été tracée (figure 5B). Les résultats montrent que la courbe de croissance présente une forme en « S », y compris la phase de décalage, la phase logarithmique et la phase stationnaire, ce qui est très cohérent avec le modèle de croissance microbienne classique. Dans le même temps, les écarts-types de 15 gouttelettes sont très faibles, ce qui indique une bonne cohérence et parallélisation de la croissance. Ainsi, il démontre pleinement les bonnes performances de culture et de détection microbiennes de la MMC. De plus, il a également été vérifié qu’il y a peu de diaphonie entre les gouttelettes pendant la culture (figure supplémentaire 2 et tableau supplémentaire 1).
Résultats de l’évolution adaptative
Nous avons effectué une évolution adaptative à long terme du MeSV2.2 dans MMC. Le 18e jour, selon la tendance à la hausse des valeurs maximales OD600 des gouttelettes au cours de chaque période de sous-culture à partir des courbes de croissance affichées sur l’interface du logiciel, nous avons estimé qu’une bonne évolution adaptative était obtenue dans les 50 gouttelettes. Les données OD600 ont été exportées et 8 gouttelettes (y compris la gouttelette 6) ayant des performances de croissance relativement bonnes ont été extraites13. La figure 6A montre les courbes de croissance de 50 gouttelettes dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative. En 18 jours, MMC a automatiquement effectué 13 opérations de sous-culture. On peut voir à partir de la figure 6A que MeSV2.2 se développe lentement d’abord et rapidement par la suite, ce qui indique la piste de l’évolution adaptative dans MeSV2.2. Pour fournir une pression de sélection, le méthanol a été ajouté au milieu MeSV2.2. Initialement, le méthanol inhibait la croissance cellulaire. Après l’évolution adaptative, les cellules enrichies adaptées au méthanol avaient un taux de croissance plus élevé. La courbe de croissance de la gouttelette 6 dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative a été tracée séparément (figure 6B). Les valeurs maximales deLA OD 600 au cours de la première génération et de la dernière sous-culture étaient de 0,37 et 0,58, respectivement, en hausse de 56,8 %. Cela indique que la souche dans la gouttelette 6 a réalisé une évolution adaptative évidente.
Par la suite, la souche de gouttelettes 6 et la souche initiale dans des flacons agités ont été cultivées, et leurs courbes de croissance ont été comparées (figure 6C). Selon les méthodes données dans la littérature17,18, les taux de croissance spécifiques maximaux (μmax) de la souche droplet 6 et de la souche initiale ont été calculés, qui étaient respectivement de 0,096 h-1 et 0,072 h-1. La figure 6C révèle que la souche de gouttelettes 6 présentait un taux de croissance spécifique maximal plus élevé (augmentant de 54,8 %) et avait une concentration cellulaire plus élevée dans la phase stationnaire (augmentant de 20,0 %) que la souche initiale lorsqu’elle était cultivée dans des flacons agités, ce qui suggérait en outre que l’évolution adaptative du MeSV2.2 avait été réalisée.
Figure 1 : Flux de travail global de mesure de la courbe de croissance et évolution adaptative dans MMC. (A) Mesure de la courbe de croissance dans la MMC. Tout d’abord, cultivez la souche dans une fiole agitée pour préparer la solution bactérienne initiale. Ensuite, injectez la solution bactérienne initiale dans le flacon de réactif. Ensuite, générez les gouttelettes dans MMC. MMC fait tourner les gouttelettes d’avant en arrière dans la puce microfluidique et les tubes pour les cultiver. Lorsque des gouttelettes passent sur le site de détection, les données OD sont détectées et enregistrées. Enfin, exportez les données pour analyse. (B) Évolution adaptative dans la MMC. Choisissez une seule colonie dans la plaque d’agarose et cultivez-la dans une fiole agitée pour préparer la solution bactérienne initiale. Après avoir injecté la solution bactérienne initiale dans le flacon de réactif, effectuer l’évolution adaptative dans la MMC. L’évolution adaptative implique une sous-culture continue, qui peut être automatiquement opérée par fractionnement et fusion de gouttelettes. Après l’évolution adaptative, exportez les données pour analyse. Les gouttelettes cibles peuvent être extraites puis étalées sur la plaque pour obtenir des colonies uniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Structure et outils essentiels de la MMC. (A) Chambre externe et de fonctionnement de MMC. (B) La puce microfluidique de MMC. La puce a sept canaux (C1-C6 et CF). (C) Flacon de réactif. Il a un tube supérieur et un tube latéral. Avant d’injecter l’échantillon dans le flacon de réactif, il doit d’abord connecter une aiguille de seringue à un connecteur rapide A, puis connecter le connecteur rapide A au tube latéral. D) Installation de la puce microfluidique. La puce microfluidique est installée sur le piédestal. Ensuite, les sept canaux (C1-C6 et CF) sont respectivement connectés aux ports correspondants de MMC (O1-O6 et OF).
1 - Chambre de fonctionnement de MMC.
2 - Flacon d’huile contenant l’huile MMC.
3 - Bouteille de déchets pour la collecte des déchets liquides.
4 - Lampe UV (longueur d’onde 254 nm) pour la stérilisation. Cette lampe peut être allumée à l’avance pour stériliser la puce et les tubes.
5 - Laser (620 nm) pour la reconnaissance des gouttelettes. Le point où le laser est irradié sur la puce est le site de reconnaissance des gouttelettes.
6 - Sonde de température pour mesurer la température à l’intérieur de la chambre de fonctionnement.
7 - Chauffage pour la chambre de fonctionnement. Il peut être utilisé pour maintenir la température de la culture microbienne. La plage de température qui peut être réglée est de 25 ± 0,5 °C à 40 ± 0,5 °C.
8 - Sonde à fibre optique pour mesurer l’OD ou la fluorescence des gouttelettes.
9 - Piédestal à puce pour installer la puce Microfluidic.
10 - Bain métallique pour fixer les bouteilles de réactif et les chauffer pour élever rapidement la température d’un réactif à la température de la culture microbienne.
11 - Ports pour la puce microfluidique (O1-O6 et OF). La puce microfluidique est connectée à la console MMC via ces ports.
12 - Tubes pour le stockage et la culture des gouttelettes.
13 - Blocs magnétiques pour localiser rapidement la puce microfluidique lors de l’installation.
14 - Aiguille de seringue pour injecter les échantillons dans les flacons de réactif. Son diamètre intérieur est de 0,41 mm et son diamètre extérieur est de 0,71 mm.
15 - Connecteur rapide A. Connectez-vous avec le connecteur rapide B.
16 - Connecteur rapide B. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Interface du logiciel d’exploitation de la console MMC. (A) L’interface principale du logiciel. (1) Température dans la chambre de fonctionnement. (2) Valeur du signal photoélectrique de la reconnaissance des gouttelettes. Lorsque la gouttelette passe, la valeur du signal est élevée (>2 V). Lorsque l’huile passe, la valeur du signal est faible (<1 V). (3) Sélection des fonctions. Vous avez le choix entre quatre fonctions : la mesure de la courbe de croissance (courbe de croissance), l’évolution adaptative en laboratoire (ALE), l’analyse multi-niveaux à facteur unique (One-factor) et la personnalisation des opérations en fonction des besoins expérimentaux (Personnalisation). (4) Interface de paramétrage. Définissez ici les paramètres expérimentaux correspondants après avoir choisi une fonction. (5) Zone d’exécution de commande. (6) Commutateur de caméra. La caméra est installée directement au-dessus de la puce, qui peut être utilisée pour observer en ligne les gouttelettes dans la puce. (7) Zone d’affichage du processus. Affiche la durée d’exécution, les données de surveillance et l’opération en cours d’exécution. (B) L’interface de paramétrage de l’évolution adaptative. (C) L’interface de criblage des gouttelettes. La console MMC peut numéroter automatiquement les gouttelettes. Ici, les gouttelettes cibles peuvent être sélectionnées et extraites de la console MMC. D) Interface d’observation par caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Injection d’échantillons, génération de gouttelettes et extraction de gouttelettes. (A) Le flacon de réactif après l’injection de solution bactérienne et d’huile MMC. La solution bactérienne et l’huile MMC sont injectées à partir du tube latéral. La phase huileuse est dans la couche supérieure et la solution bactérienne est dans la couche inférieure. Après l’injection, connectez les connecteurs rapides A et B, puis installez-les dans la console MMC. (B) Génération de gouttelettes dans la puce microfluidique. Pour améliorer la visibilité des gouttelettes, une solution de pigment rouge a été utilisée pour démontrer le processus de génération de gouttelettes. (C) Gouttelette stockée dans le tube observée au microscope. Barre d’échelle : 400 μm. (D) Invites de fenêtre contextuelle et opérations correspondantes. Lorsque l’invite « Veuillez retirer le connecteur rapide CF et le mettre dans le tube EP » apparaît, retirez le connecteur CF et placez-le dans le tube EP pour collecter la gouttelette cible; lorsque l’invite « Veuillez insérer le connecteur en arrière » s’affiche, la collecte des gouttelettes est terminée, réinsérez le connecteur CF dans le port OF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Exportation de données et tracé de la courbe de croissance. (A) Capture d’écran d’une partie des données exportées. Les données exportées incluent chaque point de temps de détection des 15 gouttelettes générées et les valeurs OD600 correspondantes. (B) Courbe de croissance d’E. coli MG1655 tracée sur la base des données exportées. Calculez les valeurs moyennes de l’OD600 et l’écart-type (ET) de 15 gouttelettes à chaque point temporel et tracez la courbe de croissance. Il est clair que cette courbe de croissance comprend la phase de décalage, la phase logarithmique et la phase stationnaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Résultats de l’évolution adaptative du MeSV2.2 dans la MMC. (A) Courbes de croissance de 50 gouttelettes dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative. Les données de détection OD600 de 50 gouttelettes au cours du processus d’évolution adaptative de 18 jours ont été exportées de la console MMC et tracées. Le 18ème jour, 8 gouttelettes, dont 6 gouttelettes ont été extraites. (B) Courbe de croissance de la gouttelette 6 dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative. Les valeurs maximales deLA OD 600 au cours de la première génération et de la dernière sous-culture étaient de 0,37 et 0,58, respectivement, en hausse de 56,8 %. C) Comparaison de la souche de gouttelettes 6 et de la souche initiale dans la fiole d’agitation. La souche de gouttelette 6 et la souche initiale ont été cultivées dans des flacons agités, et les courbes de croissance (y compris SD, n = 3) ont été mesurées. Ce chiffre a été modifié à partir de Jian X. J. et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composants | Concentration |
| Na2HPO4·12H2O | 6,78 g/L |
| KH2PO4 | 3 g/L |
| NaCl | 0,5 g/L |
| NH4Cl | 1 g/L |
| vitamine B1 (stérilisée par filtration) | 0,34 g/L |
| MgSO4·7H2O | 0,049 g/L |
| CaCl2·2H2O | 1,5 mg/L |
| Microéléments : | |
| FeCl3·6H2O | 0,5 mg/L |
| ZnSO4·7H2O | 0,09 mg/L |
| CuSO4·5H2O | 0,088 mg/L |
| MnCl2 | 0,045 mg/L |
| CoCl2·6H2O | 0,09 mg/L |
| Gluconate | 1,09 g/L |
| méthanol | 500 mmol/L |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside | 0,1 mmol/L |
| sulfate de streptomycine | 20 μg/mL |
| sulfate de kanamycine | 50 μg/mL |
| Ajouter 15 g/L d’agarose supplémentaire pour préparer le milieu solide. | |
Tableau 1: Composants du support spécial pour MeSV2.2.
| Paramètres réglables | |
| Paramètre | Gamme |
| Température de culture | 25–40 °C ± 0,5 °C |
| Nombre de gouttelettes | 0–200 |
| Concentration d’inoculum | 13.3–86.7 % |
| Concentration du facteur chimique | 8 concentrations différentes, jusqu’à la concentration maximale du facteur chimique stocké |
| Le temps de la sous-culture | Jusqu’à l’utilisateur |
| Le nombre de sous-cultures | Jusqu’à l’utilisateur |
| Longueur d’onde de détection OD | 350–800 nm |
| Longueur d’onde de détection de fluorescence | Excitation: 470, 528 nm Émission : 350–800 nm |
| Paramètres de précision | |
| Paramètre | C.V. |
| Volume de gouttelettes | 1.88% |
| Concentration d’inoculum | <5,0 % |
Tableau 2 : Paramètres réglables et paramètres de précision de la console MMC. Les paramètres réglables font référence aux paramètres qui peuvent être ajustés en fonction des exigences spécifiques des utilisateurs; les paramètres de précision désignent les paramètres qui reflètent la précision et la reproductibilité des différentes opérations fluidiques.
Figure supplémentaire 1 : Reconnaissance et détection des gouttelettes dans la MMC. (A) La forme d’onde d’une gouttelette dans MMC. Cette forme d’onde provient des données spectrales brutes du spectromètre MMC. Après avoir traité les données spectrales brutes en arrière-plan, MMC donnera la valeur OD mesurée. (B) Calcul od des gouttelettes dans la MMC. Dans la forme d’onde de la gouttelette, 'a' représente la longueur maximale de la gouttelette, 'c' représente l’interface en forme d’arc formée par la phase huile et la phase aqueuse, et 'b' représente la partie principale de la gouttelette. Sur la base de la loi de Lambert-Beer, la valeur OD de la gouttelette est calculée à l’aide de la formule suivante : valeur OD = lg(E/D) × 10. « E » fait référence à la valeur moyenne du signal spectral de la phase huileuse; « D » fait référence à la valeur moyenne du signal spectral de la partie principale b de la gouttelette. Il convient de noter que la valeur DE mesurée par MMC est différente de celle mesurée par un spectrophotomètre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Essai de diaphonie entre les gouttelettes. Pour vérifier s’il y a diaphonie entre les gouttelettes pendant la culture à long terme, la solution d’E. coli MG1655 a été diluée à une très faible concentration (selon la distribution de Poisson, λ = 0,1), puis 200 gouttelettes ont été générées et cultivées pendant 5 jours. Après avoir mesuré la DO, il a été constaté que le E. coli MG1655 a grandi en un petit nombre de gouttelettes. Et il n’y avait presque pas de croissance bactérienne dans les gouttelettes autour de ces gouttelettes. Le résultat montre également de manière préliminaire qu’il y a peu de diaphonie entre les gouttelettes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Stabilité de la production de gouttelettes dans la MMC. Comme le montre la figure supplémentaire 1, la gouttelette a une forme d’onde fixe. Le spectromètre de MMC génère un certain nombre de points de données par seconde, de sorte que le nombre de points de données de la forme d’onde de gouttelette peut refléter la taille de la gouttelette. La solution de colorant rouge a été utilisée pour générer 397 gouttelettes dans la MMC, et la valeur OD a été mesurée. Les données spectrales brutes ont été exportées, les points de données de chaque forme d’onde de gouttelette ont été comptés et le coefficient de variation (C.V) des points de données de gouttelettes a été calculé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire 2 : Évaporation des gouttelettes dans la MMC. Ici, la solution de colorant rouge a été utilisée pour générer des gouttelettes dans le MMC et les gouttelettes ont été stockées dans le tube de culture. Le tube a ensuite été placé dans un incubateur à température constante de 37 °C pendant 30 jours, et la longueur des gouttelettes a été régulièrement mesurée (prendre des photos au microscope et mesurer la longueur avec une barre d’échelle). Il montre que le volume de la gouttelette a été réduit d’environ 12,3% après 30 jours, ce qui indique que l’évaporation de la gouttelette est très faible dans la MMC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Ce protocole montre comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative à long terme. MMC est un système de culture microbienne miniaturisé, automatisé et à haut débit. Par rapport aux méthodes et instruments de culture microbiens à haut débit conventionnels, la MMC présente de nombreux avantages tels qu’une faible consommation de main-d’œuvre et de réactifs, un fonctionnement simple, une détection en ligne (OD et fluorescence), une collecte de données à haute résolution et une parallélisation supérieure. MMC présente également des avantages particuliers différents de la technologie microfluidique conventionnelle des gouttelettes, qui utilise généralement les gouttelettes pL et nL. La plupart des systèmes précédemment signalés qui utilisaient des gouttelettes pL et nL ont de mauvaises performances de culture et peu de paramètres détectables (généralement seulement la fluorescence)18,19,20,21. Bien qu’il y ait eu quelques plates-formes qui peuvent atteindre de meilleures performances de culture et la détection de paramètres multiples, c’est difficile et nécessite beaucoup d’efforts. Par exemple, certains chercheurs ont signalé la détection OD de gouttelettes de pL. Il est basé sur la reconnaissance d’image, qui a non seulement des faux positifs, mais nécessite également une vérification supplémentaire de la précision22. Cependant, MMC peut les accomplir d’une manière relativement simple. MMC utilise des gouttelettes de microlitres (μL) qui sont rarement rapportées. Les performances de culture microbienne supérieures de la MMC ont été vérifiées et peuvent également détecter directement la DO et la fluorescence. En raison du grand volume de gouttelettes μL, la génération de gouttelettes est moins sensible aux interférences, ce qui a une plus grande stabilité. Pendant ce temps, des opérations plus diverses peuvent être effectuées dans les gouttelettes de microlitres, propices à la réalisation d’opérations automatisées. De plus, comme les gouttelettes sont des espaces d’enceinte, la volatilité du contenu peut être supprimée (tableau supplémentaire 2), ce qui permet d’effectuer la culture microbienne à long terme et l’évolution adaptative lorsque des substances volatiles existent dans le milieu14. Ceci est difficile à réaliser dans les flacons agités et les microplaques.
Cependant, certains points critiques du protocole méritent d’être soulignés. Tout d’abord, il convient de noter que la valeur DE SA mesurée par MMC est différente de celle d’un spectrophotomètre parce que leurs longueurs de chemin optique de mesure OD sont différentes (1 mm et 10 mm, respectivement). Par conséquent, lors de la comparaison de la valeur OD de la MMC avec celle de la fiole agitée, il est nécessaire de mesurer la courbe d’étalonnage13. Heureusement, le processus d’évolution adaptative ne nécessite pas de courbes d’étalonnage car nous nous concentrons sur les tendances relatives parmi les courbes de croissance. Ensuite, certains micro-organismes ne sont pas cultivés dans la MMC. Les gouttelettes dépendent de la tension superficielle de l’interface huile-eau pour maintenir la stabilité23. Si les micro-organismes produisent certaines substances qui perturbent la tension superficielle de l’interface huile-eau, comme certaines souches de Bacillus subtilis produisant des tensioactifs24, les gouttelettes ne peuvent pas maintenir la stabilité. De plus, si le milieu lui-même est un obstacle à la génération de gouttelettes, il n’est pas viable d’être utilisé dans les MMC, par exemple, milieu très visqueux ou milieu contenant de grosses particules. À l’heure actuelle, les espèces que nous avons cultivées avec succès dans MMC comprennent E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, levures, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, microalgues et ainsi de suite. Il est recommandé de cultiver la souche dans MMC pour une expérience préliminaire. Enfin, les connecteurs et les ports entre la puce, la bouteille de réactif et la MMC doivent être connectés en stricte conformité avec le protocole. Sinon, la solution bactérienne peut s’écouler dans le MMC et contaminer l’intérieur. En outre, il convient de souligner que le débit actuel de MMC est limité (0-200), en raison du temps nécessaire pour les opérations de sous-culture. À l’avenir, nous optimiserons le logiciel de contrôle et la taille de la puce pour raccourcir le temps et améliorer le débit. Étant donné que MMC est un système modulaire, seules les pièces ou les logiciels connexes doivent être remplacés sans avoir besoin d’un nouvel équipement.
À l’heure actuelle, MMC peut non seulement effectuer des mesures de courbe de croissance, une évolution adaptative en laboratoire et une analyse multi-niveaux à facteur unique, mais également être utilisée pour personnaliser différentes procédures d’exploitation des gouttelettes afin de répondre aux besoins expérimentaux. À l’avenir, il est nécessaire d’enrichir davantage les fonctions d’application du système MMC en réponse aux différents besoins de la recherche microbienne, tels que la réalisation d’expériences orthogonales multifactorielles à plusieurs niveaux, la technologie d’échantillonnage automatique multi-échantillons pour mesurer simultanément les courbes de croissance de plusieurs espèces bactériennes et détecter et contrôler avec précision plus de paramètres (par exemple, l’oxygène dissous (OD) et le pH). Dans le même temps, il est également nécessaire de développer plus de fonctions dans le domaine de la microbiologie pour appliquer la MMC à des scénarios plus pratiques, tels que l’optimisation des compositions moyennes, la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI), la co-culture de micro-organismes25, etc.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), le National Key Scientific Instrument and Equipment Project de la National Natural Science Foundation of China (21627812) et le Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Nous remercions également le professeur Julia A. Vorholt (Institut de microbiologie, Département de biologie, ETH Zurich, Zurich 8093, Suisse) pour la fourniture de la souche d’E. coli essentielle au méthanol version 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
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