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Bioengineering

Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa utilizando el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/62800
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4, 1,2,6, 1,2,5, 3, 1,2,5
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. MMC puede cultivar y subcultivar microorganismos de forma automática y continua y monitorear en línea su crecimiento con un rendimiento relativamente alto y una buena paralelización, reduciendo el consumo de mano de obra y reactivos.

Abstract

Los métodos convencionales de cultivo microbiano generalmente tienen operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Además, los métodos de cultivo de alto rendimiento basados en microplacas desarrollados en los últimos años tienen un estado de crecimiento microbiano deficiente y experimentan paralelización debido a su bajo oxígeno disuelto, mezcla deficiente y evaporación severa y efecto térmico. Debido a muchas ventajas de las microgotas, como el pequeño volumen, el alto rendimiento y la fuerte capacidad de control, la tecnología microfluídica basada en gotas puede superar estos problemas, que se ha utilizado en muchos tipos de investigación de cultivo microbiano de alto rendimiento, cribado y evolución. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos permanecen en la etapa de construcción y aplicación del laboratorio. Algunos problemas clave, como los altos requisitos operativos, la alta dificultad de construcción y la falta de tecnología de integración automatizada, restringen la amplia aplicación de la tecnología microfluídica de gotas en la investigación microbiana. Aquí, se desarrolló con éxito un sistema automatizado de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en tecnología microfluídica de gotas, logrando la integración de funciones como la inoculación, el cultivo, el monitoreo en línea, el subcultivo, la clasificación y el muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. En este protocolo, se tomaron como ejemplos escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre y una cepa de E. coli esencial de metanol (MeSV2.2) para introducir cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y de rendimiento relativamente alto y la evolución adaptativa en detalle. Este método es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un alto rendimiento experimental y una buena paralelización de datos, lo que tiene grandes ventajas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental de bajo costo, fácil de operar y confiable para que los investigadores científicos realicen investigaciones microbianas relacionadas.

Introduction

El cultivo microbiano es una base importante para la investigación científica microbiológica y las aplicaciones industriales, que se utiliza ampliamente en el aislamiento, identificación, reconstrucción, cribado y evolución de microorganismos 1,2,3. Los métodos convencionales de cultivo microbiano utilizan principalmente tubos de ensayo, matraces de agitación y placas sólidas como contenedores de cultivo, combinados con incubadoras de agitación, espectrofotómetros, lectores de microplacas y otros equipos para el cultivo, detección y detección microbiana. Sin embargo, estos métodos tienen muchos problemas, como operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Los métodos de cultivo de alto rendimiento desarrollados en los últimos años se basan principalmente en la microplaca. Pero la microplaca tiene un bajo nivel de oxígeno disuelto, una propiedad de mezcla deficiente y una evaporación severa y un efecto térmico, que a menudo conducen a un mal estado de crecimiento y paralelización experimental de microorganismos 4,5,6,7; por otro lado, necesita estar equipado con equipos costosos, como estaciones de trabajo de manipulación de líquidos y lectores de microplacas, para lograr el cultivo automatizado y la detección de procesos 8,9.

Como una rama importante de la tecnología microfluídica, la microfluídica de gotas se ha desarrollado en los últimos años basada en sistemas microfluídicos tradicionales de flujo continuo. Es una tecnología microfluídica de flujo discreto que utiliza dos fases líquidas inmiscibles (generalmente aceite-agua) para generar microgotas dispersas y operar sobre ellas10. Debido a que las microgotas tienen las características de pequeño volumen, gran área de superficie específica, alta tasa de transferencia de masa interna y sin contaminación cruzada causada por la compartimentación, y las ventajas de una fuerte capacidad de control y alto rendimiento de las gotas, ha habido muchos tipos de investigación que aplican tecnología microfluídica de gotas en el cultivo de alto rendimiento, el cribado y la evolución de microorganismos11 . Sin embargo, todavía hay una serie de cuestiones clave para hacer que la tecnología microfluídica de gotas se popularice y se aplique ampliamente. En primer lugar, el funcionamiento de la microfluídica de gotas es engorroso e intrincado, lo que resulta en altos requisitos técnicos para los operadores. En segundo lugar, la tecnología microfluídica de gotas combina componentes ópticos, mecánicos y eléctricos y debe asociarse con escenarios de aplicación de biotecnología. Es difícil para un solo laboratorio o equipo construir sistemas eficientes de control microfluídico de gotas si no hay una colaboración multidisciplinaria. En tercer lugar, debido al pequeño volumen de microgotas (desde el picolitro (pL) hasta el microlitro (μL)), se necesita mucha dificultad para realizar el control automatizado preciso y la detección en línea en tiempo real de gotas para algunas operaciones microbianas básicas, como el subcultivo, la clasificación y el muestreo, y también es difícil construir un sistema de equipo integrado12.

Para abordar los problemas anteriores, se desarrolló con éxito un sistema automático de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en la tecnología microfluídica degotas 13. El MMC consta de cuatro módulos funcionales: un módulo de reconocimiento de gotas, un módulo de detección de espectro de gotas, un módulo de chip microfluídico y un módulo de muestreo. A través de la integración y control del sistema de todos los módulos, se establece con precisión el sistema de operación automatizado que incluye la generación, cultivo, medición (densidad óptica (OD) y fluorescencia), división, fusión, clasificación de gotas, logrando la integración de funciones como inoculación, cultivo, monitoreo, subcultivo, clasificación y muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. MMC puede contener hasta 200 unidades de cultivo de gotas replicadas de 2-3 μL de volumen, lo que equivale a 200 unidades de cultivo de matraz de agitación. El sistema de cultivo de microgotas puede satisfacer los requisitos de no contaminación, oxígeno disuelto, mezcla e intercambio masa-energía durante el crecimiento de microorganismos, y satisfacer las diversas necesidades de la investigación microbiana a través de múltiples funciones integradas, por ejemplo, medición de la curva de crecimiento, evolución adaptativa, análisis multinivel de un solo factor e investigación y análisis de metabolitos (basados en la detección de fluorescencia)13,14.

Aquí, el protocolo presenta cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo automatizado y microbiano y la evolución adaptativa en detalle (Figura 1). Tomamos como ejemplo escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre para demostrar la medición de la curva de crecimiento y una cepa de E. coli esencial de metanol MeSV2.215 para demostrar la evolución adaptativa en MMC. Se desarrolló un software de operación para MMC, lo que hace que la operación sea muy simple y clara. En todo el proceso, el usuario debe preparar la solución inicial de bacterias, establecer las condiciones del MMC y luego inyectar la solución de bacterias y los reactivos relacionados en el MMC. Posteriormente, el MMC realizará automáticamente operaciones como la generación de gotas, el reconocimiento y la numeración, el cultivo y la evolución adaptativa. También realizará la detección en línea (OD y fluorescencia) de las gotas con alta resolución de tiempo y mostrará los datos relacionados (que se pueden exportar) en el software. El operador puede detener el proceso de cultivo en cualquier momento de acuerdo con los resultados y extraer las gotas objetivo para experimentos posteriores. El MMC es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un rendimiento experimental relativamente alto y una buena paralelismo de datos, lo que tiene ventajas significativas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental robusta, de bajo costo, fácil de operar para que los investigadores realicen investigaciones microbianas relacionadas.

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Protocol

1. Instalación de instrumentos y software

  1. Elija un ambiente limpio y estéril (como un banco limpio) como un espacio permanente dedicado para MMC. Instale el MMC de forma constante en el espacio.
    NOTA: Mantenga el MMC alejado de la interferencia de campos eléctricos fuertes, campos magnéticos y fuentes de radiación de calor fuertes. Evite que las vibraciones severas afecten a los componentes de detección óptica. Proporcione la fuente de alimentación de AC220 V, 50 HZ al MMC. Para obtener más información sobre MMC, consulte la Tabla de materiales y el sitio web de MMC16.
  2. Instale el software de operación desde el archivo MMC.zip
    Nota : póngase en contacto con los autores para el archivo MMC.zip.
    1. Cree una carpeta dedicada y guarde el archivo zip en ella.
    2. Cree otra carpeta dedicada como el "Directorio de instalación". Descomprima el MMC.zip y guarde los archivos en la nueva carpeta.
      NOTA: La configuración de la computadora es la mejor para cumplir: (1) Sistema operativo Windows 7 de 64 bits o superior; (2) CPU: i5 o superior; (3) memoria: 4 GB o más; (4) disco duro: 300 GB o más (velocidad de rotación superior a 7200 rpm o disco de estado sólido).

2. Preparativos

  1. Conecte la aguja de la jeringa (el diámetro interior es de 0,41 mm y el diámetro exterior es de 0,71 mm), el conector rápido A y el frasco de reactivo (Figura 2C), y póngalos en autoclave a 121 °C durante 15 min.
    NOTA: Desenrosque ligeramente la tapa del frasco de reactivo durante la esterilización. Se pueden preparar algunas botellas de reactivos más cada vez para su uso.
  2. Utilice un filtro de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm para filtrar el aceite MMC. Coloque el chip microfluídico (Figura 2B) y el aceite MMC en el banco limpio con anticipación y esterilícelos por irradiación ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.
    NOTA: Para obtener los detalles del conector rápido A, la botella de reactivo, el aceite MMC y el chip microfluídico, consulte la Tabla de materiales.
  3. Instalar el chip microfluídico
    1. Abra la puerta de la cámara de operación (Figura 2A) y levante la sonda de fibra óptica.
    2. Alinee los orificios del campo eléctrico con las agujas del campo eléctrico y coloque suavemente el chip en el pedestal del chip. A continuación, inserte las dos columnas de posicionamiento en los orificios de posicionamiento y coloque la sonda de fibra óptica (Figura 2D).
    3. Conecte el conector rápido A del chip al puerto correspondiente del MMC según el número de posición (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Luego cierre la puerta de la cámara de operación.
  4. Reponga el aceite MMC (a unos 80 ml) en la botella de aceite y vacíe el líquido residual en la botella de desecho antes de usarlo.
    NOTA: El líquido residual suele ser un residuo orgánico. Consulte la ley y el reglamento regionales en el momento de la eliminación, sujetos a cambios basados en la configuración experimental.

3. Medición de la curva de crecimiento en MMC

  1. Preparación para la solución bacteriana inicial
    1. Siga las regulaciones estándar relacionadas para preparar el medio Luria-Bertani (LB) y el autoclave a 121 ° C durante 15 min.
      NOTA: Componentes del medio LB: NaCl (10 g/L), extracto de levadura (5 g/L) y triptona (10 g/L).
    2. Saque la cepa de E. coli MG1655 de la cepa de glicerol y cultive en un matraz de agitación de 50 ml con 10 ml de LB medio en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 °C durante 5-8 h.
      NOTA: El tiempo de cultivo depende de las cepas específicas. Es óptimo cultivar la cepa hasta el período/fase logarítmica.
    3. Diluya la solución cultivada de E. coli MG1655 con medio fresco a un OD600 de 0.05-0.1 para obtener una solución inicial de bacterias (prepare aproximadamente 10 ml).
  2. Haga clic en Inicialización para inicializar el MMC. Después de que aparezca la interfaz de inicialización, establezca la temperatura de cultivo en 37 °C y el valor de la señal fotoeléctrica en 0,6 (Figura 3A). La inicialización tardará unos 20 minutos.
  3. Encienda la lámpara UV (longitud de onda 254 nm) durante la inicialización.
  4. Inyecte la solución inicial de bacterias y el aceite MMC en la botella de reactivo.
    1. Saque una botella de reactivo esterilizada en el banco limpio y apriete la tapa.
    2. Use una jeringa estéril de 10 ml para inyectar 3-5 ml de aceite MMC de la aguja de la jeringa del tubo lateral. Incline y gire la botella de reactivo lentamente para que el aceite se infiltre completamente en la pared interior.
    3. Inyecte aproximadamente 5 ml de solución inicial de bacterias y luego llene la botella de reactivo inyectando 5-7 ml de aceite nuevamente.
    4. Extraiga el conector rápido independiente A e inserte el conector rápido A del frasco de reactivo en su conector rápido B para completar la operación de inyección de muestra (Figura 4A).
  5. Espere a que finalice la inicialización y, a continuación, apague la lámpara UV (longitud de onda 254 nm).
  6. Abra la puerta de la cámara de operación y coloque la botella de reactivo en el baño de metal.
  7. Extraiga el conector C2 del chip y el conector rápido A de la botella de reactivo. Conecte el conector de tubo lateral de la botella de reactivo al conector C2 y el conector de tubo superior al conector de O2. Luego cierre la puerta de la cámara de operación.
  8. Haga clic en Curva de crecimiento para elegir la función de medición de la curva de crecimiento (Figura 3A). En la interfaz de configuración de parámetros, ingrese el Número como 15, encienda el interruptor de detección OD y establezca la Longitud de onda como 600 nm. Haga clic en Iniciar para iniciar la generación de gotas. Tardará unos 10 min.
    NOTA: Aquí, Número se refiere al número de gotas que se generarán. La longitud de onda se refiere a la longitud de onda del OD a detectar. Establezca el número (máximo 200) y la longitud de onda (350-800 nm) de acuerdo con los requisitos del experimento.
  9. Cuando aparece una ventana emergente en la interfaz principal que indica "Retire la botella de reactivo entre C2 y O2, luego haga clic en el botón Aceptar después de la finalización", abra la puerta de la cámara de operación para sacar la botella de reactivo y conecte los conectores C2 y O2.
  10. Cierre la puerta y haga clic en el botón Aceptar en la ventana emergente para cultivar automáticamente las gotas y detectar los valores de OD.
    NOTA: El MMC detecta el valor OD cuando la gota pasa por la sonda de fibra óptica. Por lo tanto, el período de detección depende del número de gotas generadas.
  11. Cuando la curva de crecimiento alcance la fase estacionaria, haga clic en el botón Exportar datos para exportar los datos OD. Seleccione la ruta de guardado de datos y exporte el valor de OD registrado durante el período de cultivo en el formato .csv, que se puede abrir con el software adecuado (por ejemplo, Microsoft Excel). Luego use un software de mapeo (por ejemplo, EXCEL y Origin 9.0) para trazar la curva de crecimiento.
    NOTA: Durante el proceso de cultivo, es factible hacer clic en la Exportación de datos en cualquier momento para exportar los datos OD de todas las gotas actuales.

4. Evolución adaptativa en MMC

  1. Preparación para la solución bacteriana inicial
    1. Siga las regulaciones estándar relacionadas para preparar el medio líquido especial y las placas sólidas para el MeSV2.2 y el autoclave a 121 ° C durante 15 min.
      NOTA: Para los componentes del medio especial, consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales.
    2. Cultive el MeSV2.2 utilizando la placa sólida (diámetro = 90 mm) en una incubadora de temperatura constante de 37 °C durante 72 h. Luego elija una colonia independiente y cultive en un matraz de agitación de 50 ml con 10 ml del medio líquido especial en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 ° C durante 72 h.
    3. Diluya la solución de MeSV2.2 cultivada con el medio a un OD600 de 0.1-0.2 (asegúrese de que el volumen total no sea inferior a 10 ml) y continúe cultivándola en el matraz de agitación durante 5 h para obtener la solución inicial de bacterias.
      NOTA: La MeSV2.2 es una cepa de E. coli esencial para el metanol. El medio líquido especial contiene 500 mmol / L de metanol, que es un fuerte estrés para MeSV2.2, lo que resulta en un crecimiento muy lento. Tenga en cuenta que la obtención de la solución inicial de bacterias aquí es diferente de la descrita en el paso 3.1.
  2. Inicialice el MMC como se explica en los pasos 3.2, 3.3 y 3.5.
  3. Saque dos botellas de reactivo esterilizadas, una de las cuales es para la solución inicial de bacterias y la otra es para el medio fresco. Inyecte la solución inicial de bacterias (5 ml), el medio fresco (12-15 ml) y el aceite MMC en los frascos de reactivos como se explica en el paso 3.4.
    NOTA: Como la evolución adaptativa es un proceso a largo plazo que involucra múltiples subcultivos, almacene la mayor cantidad posible de medio fresco en MMC. El medio no se puede reponer durante la ejecución del experimento.
  4. Instale las dos botellas de reactivo en MMC como se explica en el paso 3.6. Instale el uno para la solución de bacterias inicial entre el conector C2 y O2 y el otro para el medio fresco entre el conector C4 y O4.
  5. Haga clic en ALE para elegir la función de evolución adaptativa (Figura 3B). En la interfaz de configuración de parámetros, active el interruptor de detección de OD .
  6. Establezca el número como 50, la longitud de onda como 600 nm, la concentración como 0%, el tipo como tiempo, el parámetro como 30 h y las repeticiones como 99. Haga clic en Iniciar para iniciar la generación de gotas. Tardará unos 25 min.
    NOTA: Aquí, "Concentración" se refiere a la concentración máxima de factores químicos para la evolución adaptativa. Para diferentes gotas, es realizable en MMC introducir diferentes concentraciones de factores químicos para proporcionar diferentes condiciones de crecimiento. Calcule las concentraciones introducidas utilizando la siguiente ecuación:
    Equation 1
    Aquí "C" se refiere a la concentración de factores químicos introducidos en las gotas; "a" se refiere a la concentración de factores químicos en las botellas de reactivo entre el conector C4 y O4; "b" se refiere a la concentración de factores químicos en las botellas de reactivo entre el conector C6 y O6; y "i" se refiere a la concentración disponible. Hay ocho concentraciones disponibles en MMC. Dado que el factor químico aquí tiene una sola concentración (500 mmol / L de metanol) y es uno de los ingredientes del medio, solo se instala una botella de reactivo que contiene el factor químico aquí, y la concentración se establece como 0%. El tipo se refiere al modo de subcultivo, que se divide en tres tipos: modo de tiempo, modo de valor OD y modo de fluorescencia. El primero significa cultivar las gotas durante un tiempo fijo y luego subcultivar, mientras que los dos últimos significan cultivar las gotas a un valor OD predefinido / intensidad de fluorescencia y luego subcultivar. Parámetro se refiere al parámetro relacionado requerido al elegir un modo de subcultivo. Las repeticiones se refieren al número de subcultivos.
  7. Retire el frasco de reactivo colocado entre el conector C2 y O2 como se explica en el paso 3.8.
  8. Observe si los valores máximos de OD de las gotas durante cada período de subcultivo han aumentado significativamente. Si se produce el aumento y cumple con los requisitos del experimento, haga clic en el botón Exportar datos para exportar los datos de OD como se explica en el paso 3.9.
    NOTA: Aquí, el período de subcultivo depende del parámetro. Por ejemplo, al establecer Tipo como Tiempo y Parámetro como 30 h, el período de subcultivo es de 30 h. Durante cada período de subcultivo, hay los valores máximos de OD de las gotas. Estimar si la evolución adaptativa cumple con los requisitos del experimento mediante el aumento de los valores máximos de OD (el aumento depende del proceso de cultivo real de la cepa, por ejemplo, aumentado en más del 20%).
    PRECAUCIÓN: Preste atención a si el medio fresco almacenado está agotado. Si el aumento significativo no se ha producido incluso después de que se agote el medio, extraiga las gotas que crecen mejor y lleve a cabo una nueva ronda de evolución adaptativa.
  9. Extraiga las gotas de destino del MMC.
    1. Haga clic en el botón Screening para elegir la función de extracción de gotas (Figura 3C). Elija la opción Recopilar , haga clic en el número de gotas de destino y luego haga clic en Aceptar.
      NOTA: El cribado de gotas incluye "Recolectar", "Descartar" y "Extraer solución de semillas". Por "solución de semilla de extracto" se entiende la recogida de las gotas restantes13 después de la operación de subcultivo.
    2. Espere a que la ventana emergente le indique: "Saque el conector rápido CF y colóquelo en el tubo EP". Coloque el conector rápido CF en el tubo de la microcentrífuga para su recolección de acuerdo con el mensaje del software y luego haga clic en Aceptar (Figura 4D).
    3. Después de 1-2 minutos, la interfaz del software aparecerá en una nueva ventana que le pedirá: "Vuelva a insertar el conector y haga clic en Aceptar si ha terminado". Luego, inserte el conector rápido CF de nuevo y haga clic en Aceptar para que MMC continúe ejecutándose (Figura 4D). Cuando la siguiente gota objetivo llegue al sitio de reconocimiento de gotas, repita 4.9.2-4.9.3 para recogerla.
      NOTA: Después de recolectar todas las gotas objetivo, el MMC continuará cultivando las gotas restantes. Si el cultivo no es necesario, haga clic en Detener para finalizar directamente la operación.
    4. Extraiga la gota con una pipeta de 2,5 μL, déjela caer sobre la placa de agarosa de 90 mm y extiéndala uniformemente con una varilla triangular de vidrio con una longitud lateral de 3 cm. Luego cultivarlo en una incubadora de temperatura constante de 37 °C durante 72 h.
    5. Elija 3-5 colonias independientes y cultive por separado en los matraces de agitación de 50 ml con 10 ml de medio fresco en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 ° C durante 48-72 h. Siga las regulaciones estándar relacionadas para almacenar la solución de bacterias cultivadas en el tubo de glicerol para experimentos posteriores.

5. Limpieza del MMC

  1. Después de completar el experimento, haga clic en Detener para detener todas las operaciones. Luego haga clic en Limpiar para limpiar el chip y los tubos. Tardará unos 15 min.

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Representative Results

Este protocolo utiliza E. coli MG1655 y una cepa MeSV2.2 como ejemplos para demostrar el cultivo microbiano y la evolución adaptativa esencial del metanol con una estrategia automatizada y de rendimiento relativamente alto en MMC. La medición de la curva de crecimiento se utilizó principalmente para caracterizar el cultivo microbiano. La evolución adaptativa se llevó a cabo mediante el subcultivo continuo automatizado y la adición de una alta concentración de metanol como presión selectiva durante cada subcultivo. Si la evolución adaptativa se había realizado se estimó a través de la tendencia de variación del valor máximo de OD de las gotas durante cada período de subcultivo. Los parámetros sintonizables y los parámetros de precisión de MMC se muestran en la Tabla 2.

Resultados de la medición de la curva de crecimiento
Los valores de OD600 de las 15 gotas detectadas durante el proceso de cultivo se exportaron desde el MMC después de cultivar durante aproximadamente 20 h (Figura 5A). Se puede observar que la detección se realizó aproximadamente cada 14 min. Este período de detección depende del número de gotas generadas porque las gotas se reciclan hacia adelante y hacia atrás en los tubos para el cultivo, y el módulo de detección solo detecta los valores de OD (la detección y el cálculo del valor de OD se muestran en la Figura suplementaria 1) cuando las gotas pasan la sonda de fibra óptica. Por lo tanto, los 14 minutos son un período de detección muy corto, que proporciona un proceso de detección de alta resolución de tiempo para reflejar el crecimiento de los microorganismos con mayor precisión.

De acuerdo con los datos exportados, se calcularon los valores promedio de OD600 y la desviación estándar (DE) de 15 gotas en cada punto de tiempo, y se trazó la curva de crecimiento de E. coli MG1655 (Figura 5B). Los resultados muestran que la curva de crecimiento presenta una forma de "S", incluyendo fase de retraso, fase logarítmica y fase estacionaria, que es muy consistente con el modelo clásico de crecimiento microbiano. Al mismo tiempo, las desviaciones estándar de 15 gotas son muy pequeñas, lo que indica una buena consistencia y paralelismo de crecimiento. Por lo tanto, demuestra plenamente el buen rendimiento de cultivo y detección microbiana de MMC. Además, también se verificó que hay poca diafonía entre las gotas durante el cultivo (Figura suplementaria 2 y Tabla suplementaria 1).

Resultados de la evolución adaptativa
Hemos realizado una evolución adaptativa a largo plazo de MeSV2.2 en MMC. Eldía 18, de acuerdo con la tendencia creciente de los valores máximos de OD600 de las gotas durante cada período de subcultivo a partir de las curvas de crecimiento mostradas en la interfaz del software, creímos que se logró una buena evolución adaptativa en las 50 gotas. Se exportaron los datos de OD600 y se extrajeron 8 gotas (incluida la gota 6) con un rendimiento de crecimiento relativamente bueno13. La Figura 6A muestra las curvas de crecimiento de 50 gotas en todo el proceso de evolución adaptativa. En 18 días, MMC ha llevado a cabo automáticamente 13 operaciones de subcultivo. Se puede ver en la Figura 6A que MeSV2.2 crece lentamente primero y rápido después, lo que indica la pista de evolución adaptativa en MeSV2.2. Para suministrar una presión de selección, se agregó el metanol al medio MeSV2.2. Inicialmente, el metanol inhibió el crecimiento celular. Después de la evolución adaptativa, las células enriquecidas adaptadas al metanol tuvieron una mayor tasa de crecimiento. La curva de crecimiento de la gota 6 en todo el proceso de evolución adaptativa se trazó por separado (Figura 6B). Los valores máximos de OD600 en la primera generación y el último período de subcultivo fueron de 0,37 y 0,58, respectivamente, aumentaron en un 56,8%. Indica que la tensión en la gota 6 ha realizado una evolución adaptativa obvia.

Posteriormente, se cultivaron la cepa de gota 6 y la cepa inicial en matraces de agitación, y se compararon sus curvas de crecimiento (Figura 6C). De acuerdo con los métodos dados en la literatura17,18, se calcularon las tasas máximas de crecimiento específico (μmáx.) de la cepa gota 6 y la cepa inicial, que fueron de 0,096 h-1 y 0,072 h-1, respectivamente. La Figura 6C revela que la cepa de gota 6 exhibió una mayor tasa de crecimiento específico máximo (aumentando en un 54,8%) y tuvo una mayor concentración celular en la fase estacionaria (aumentando en un 20,0%) que la cepa inicial cuando se cultivó en matraces de agitación, lo que sugirió además que la evolución adaptativa en MeSV2.2 se ha realizado.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo general de medición de la curva de crecimiento y evolución adaptativa en MMC. (A) Medición de la curva de crecimiento en MMC. En primer lugar, cultive la cepa en matraz de agitación para preparar la solución bacteriana inicial. Luego, inyecte la solución inicial de bacterias en la botella de reactivo. A continuación, genere las gotas en MMC. MMC hace que las gotas circulen de un lado a otro en el chip microfluídico y los tubos para cultivarlas. Cuando las gotas pasan por el sitio de detección, los datos de OD se detectarán y registrarán. Finalmente, exporte los datos para su análisis. (B) Evolución adaptativa en MMC. Elija una sola colonia de la placa de agarosa y cultivarla en un matraz de agitación para preparar la solución bacteriana inicial. Después de inyectar la solución bacteriana inicial en el frasco de reactivo, realice la evolución adaptativa en MMC. La evolución adaptativa implica un subcultivo continuo, que se puede operar automáticamente a través de la división y fusión de gotas. Después de la evolución adaptativa, exporte los datos para su análisis. Las gotas objetivo se pueden extraer y luego extender en la placa para obtener colonias individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Estructura y herramientas esenciales de MMC. (A) Cámara externa y de operación de MMC. (B) El chip microfluídico de MMC. El chip tiene siete canales (C1-C6 y CF). (C) Botella de reactivo. Tiene un tubo superior y un tubo lateral. Antes de inyectar la muestra en el frasco de reactivo, primero debe conectar una aguja de jeringa a un conector rápido A y luego conectar el conector rápido A al tubo lateral. (D) Instalación del chip microfluídico. El chip microfluídico se instala en el pedestal. Luego, los siete canales (C1-C6 y CF) se conectan respectivamente a los puertos correspondientes de MMC (O1-O6 y OF).

1 - Cámara de operación de MMC.
2 - Frasco de aceite que contiene el aceite MMC.
3 - Botella de residuos para la recogida de residuos líquidos.
4 - Lámpara UV (longitud de onda 254 nm) para esterilización. Esta lámpara se puede encender con anticipación para esterilizar el chip y los tubos.
5 - Láser (620 nm) para reconocimiento de gotas. El punto donde se irradia el láser en el chip es el sitio de reconocimiento de gotas.
6 - Sonda de temperatura para medir la temperatura dentro de la cámara de operación.
7 - Calentador para la cámara de operación. Se puede utilizar para mantener la temperatura del cultivo microbiano. El rango de temperatura que se puede establecer es de 25 ± 0.5 ° C a 40 ± 0.5 ° C.
8 - Sonda de fibra óptica para medir la OD o fluorescencia de las gotas.
9 - Pedestal de chip para instalar el chip microfluídico.
10 - Baño de metal para fijar las botellas de reactivo y calentarlas para elevar rápidamente la temperatura de un reactivo a la temperatura del cultivo microbiano.
11 - Puertos para el chip microfluídico (O1-O6, y OF). El chip microfluídico está conectado al MMC a través de estos puertos.
12 - Tubos para almacenamiento y cultivo de gotas.
13 - Bloques magnéticos para localizar rápidamente el chip microfluídico durante la instalación.
14 - Aguja de jeringa para inyectar las muestras en los frascos de reactivo. Su diámetro interior es de 0,41 mm, y su diámetro exterior es de 0,71 mm.
15 - Conector rápido A. Conéctese con el conector rápido B.
16 - Conector rápido B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Interfaz de software de operación de MMC. (A) La interfaz principal del software. (1) Temperatura en la cámara de operación. (2) Valor de la señal fotoeléctrica de reconocimiento de gotas. Cuando pasa la gota, el valor de la señal es alto (>2 V). Cuando el aceite pasa, el valor de la señal es bajo (<1 V). (3) Selección de funciones. Hay cuatro funciones para elegir: medición de la curva de crecimiento (Curva de crecimiento), evolución adaptativa del laboratorio (ALE), análisis multinivel de un solo factor (One-factor) y personalización de las operaciones de acuerdo con las necesidades experimentales (Personalización). (4) Interfaz de configuración de parámetros. Establezca los parámetros experimentales correspondientes aquí después de elegir una función. (5) Área de ejecución de comandos. (6) Interruptor de cámara. La cámara se instala directamente sobre el chip, que se puede utilizar para observar en línea las gotas en el chip. (7) Área de visualización del proceso. Muestra el tiempo de ejecución, los datos de supervisión y la operación que se está ejecutando. (B) La interfaz de ajuste de parámetros de la evolución adaptativa. (C) La interfaz de detección de gotas. El MMC puede numerar automáticamente las gotas. Aquí las gotas de destino se pueden seleccionar y extraer del MMC. (D) Interfaz de observación de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Inyección de muestras, generación de gotas y extracción de gotas. (A) La botella de reactivo después de la inyección de solución de bacterias y aceite MMC. Tanto la solución de bacterias como el aceite MMC se inyectan desde el tubo lateral. La fase de aceite está en la capa superior y la solución de bacterias está en la capa inferior. Después de la inyección, conecte el conector rápido A y B y, a continuación, instálelo en el MMC. (B) Generación de gotas en el chip microfluídico. Para mejorar la visibilidad de las gotas, se utilizó una solución de pigmento rojo para demostrar el proceso de generación de gotas. (C) Gota almacenada en el tubo observado por microscopio. Barra de escala: 400 μm. (D) Indicaciones de ventana emergente y las operaciones correspondientes. Cuando aparezca el mensaje "Saque el conector rápido CF y colóquelo en el tubo EP", extraiga el conector CF y colóquelo en el tubo EP para recoger la gota objetivo; cuando aparezca el mensaje "Inserte el conector de nuevo", la colección de gotas está completa, inserte el conector CF de nuevo en el puerto OF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Exportación de datos y trazado de figuras de la curva de crecimiento. (A) Captura de pantalla de parte de los datos exportados. Los datos exportados incluyen cada punto de tiempo de detección de las 15 gotas generadas y los valores correspondientes de OD600. (B) Curva de crecimiento de E. coli MG1655 trazada en base a los datos exportados. Calcule los valores promedio de OD600 y la desviación estándar (DE) de 15 gotas en cada punto de tiempo y trace la curva de crecimiento. Es claro ver que esta curva de crecimiento incluye la fase de retraso, la fase logarítmica y la fase estacionaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados de la evolución adaptativa de MeSV2.2 en MMC. (A) Curvas de crecimiento de 50 gotas en todo el proceso de evolución adaptativa. Los datos de detección de OD600 de 50 gotas durante el proceso de evolución adaptativa de 18 días se exportaron desde el MMC y se trazaron. En el día 18, se extrajeron 8 gotas, incluida la gota 6. (B) Curva de crecimiento de la gota 6 en todo el proceso de evolución adaptativa. Los valores máximos de OD600 en la primera generación y el último período de subcultivo fueron de 0,37 y 0,58, respectivamente, aumentaron en un 56,8%. (C) Comparación de la cepa de gota 6 y la cepa inicial en el matraz de agitación. La cepa de la gota 6 y la cepa inicial se cultivaron en matraces de agitación, y se midieron las curvas de crecimiento (incluyendo SD, n = 3). Esta cifra ha sido modificada a partir de Jian X. J. et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componentes Concentración
Na2HPO4·12H2O 6,78 g/L
KH2PO4 3 g/L
NaCl 0,5 g/L
NH4Cl 1 g/L
vitamina B1 (esterilizada por filtración) 0,34 g/L
mgSO4·7H2O 0,049 g/L
CaCl2·2H2O 1,5 mg/L
Microelementos:
FeCl3·6H2O 0,5 mg/L
ZnSO4·7H2O 0,09 mg/L
Cuso4·5H2O 0,088 mg/L
MnCl2 0,045 mg/L
CoCl2·6H2O 0,09 mg/L
gluconato 1,09 g/L
metanol 500 mmol/L
isopropil-β-d-tiogalactopiranósido 0,1 mmol/L
sulfato de estreptomicina 20 μg/ml
sulfato de kanamicina 50 μg/ml
Agregue 15 g / L de agarosa adicionales para preparar el medio sólido.

Tabla 1: Componentes del medio especial para MeSV2.2.

Parámetros ajustables
Parámetro Gama
Temperatura de cultivo 25–40 °C ± 0.5 °C
Número de gotas 0–200
Concentración de inóculo 13.3–86.7 %
Concentración del factor químico 8 concentraciones diferentes, hasta la concentración máxima de factor químico almacenado
El tiempo del subcultivo Hasta el usuario
El número de subcultivos Hasta el usuario
Longitud de onda de la detección de OD 350–800 nm
Longitud de onda de la detección de fluorescencia Excitación: 470, 528 nm
Emisión: 350–800 nm
Parámetros de precisión
Parámetro C.V.
Volumen de gotas 1.88%
Concentración de inóculo <5,0%

Tabla 2: Parámetros sintonizables y parámetros de precisión de MMC. Los parámetros sintonizables se refieren a los parámetros que se pueden ajustar de acuerdo con los requisitos específicos de los usuarios; Los parámetros de precisión se refieren a los parámetros que reflejan la precisión y reproducibilidad de las diferentes operaciones fluídicas.

Figura complementaria 1: Reconocimiento y detección de gotitas en MMC. (A) La forma de onda de una gota en MMC. Esta forma de onda proviene de los datos espectrales en bruto del espectrómetro MMC. Después de procesar los datos espectrales en bruto en segundo plano, MMC dará el valor OD medido. (B) Cálculo OD de gotas en MMC. En la forma de onda de la gota, 'a' representa la longitud máxima de la gota, 'c' representa la interfaz en forma de arco formada por la fase de aceite y la fase de agua, y 'b' representa la parte principal de la gota. Basado en la ley de Lambert-Beer, el valor OD de la gota se calcula utilizando la siguiente fórmula: valor OD = lg(E/D) × 10. «E» se refiere al valor medio de la señal espectral de la fase oleosa; «D» se refiere al valor medio de la señal espectral de la parte b principal de la gota. Cabe señalar que el valor de OD medido por MMC es diferente del medido por un espectrofotómetro. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Prueba de diafonía entre las gotas. Para verificar si hay diafonía entre las gotas durante el cultivo a largo plazo, la solución de E. coli MG1655 se diluyó a una concentración muy baja (según la distribución de Poisson, λ = 0.1), y luego se generaron y cultivaron 200 gotas durante 5 días. Después de medir la OD, se encontró que la E. coli MG1655 creció en un pequeño número de gotitas. Y casi no hubo crecimiento bacteriano en las gotitas alrededor de estas gotas. El resultado también muestra preliminarmente que hay poca diafonía entre las gotas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Estabilidad de la generación de gotas en MMC. Como se muestra en la Figura Suplementaria 1, la gota tiene una forma de onda fija. El espectrómetro de MMC genera un cierto número de puntos de datos por segundo, por lo que el número de puntos de datos de la forma de onda de la gota puede reflejar el tamaño de la gota. Se utilizó la solución de tinte rojo para generar 397 gotas en el MMC, y se midió el valor de OD. Se exportaron los datos espectrales brutos, se contaron los puntos de datos de cada forma de onda de gota y se calculó el coeficiente de variación (C.V) de los puntos de datos de gotas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla complementaria 2: Evaporación de gotas en MMC. Aquí se utilizó la solución de tinte rojo para generar gotas en el MMC y las gotas se almacenaron en el tubo de cultivo. Luego, el tubo se colocó en una incubadora de temperatura constante de 37 ° C durante 30 días, y la longitud de la gota se midió regularmente (tome fotos bajo un microscopio y mida la longitud con una barra de escala). Muestra que el volumen de la gota se redujo en aproximadamente un 12,3% después de 30 días, lo que indica que la evaporación de la gota es muy pequeña en MMC. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Este protocolo presenta cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para realizar el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa a largo plazo. MMC es un sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado y de alto rendimiento. En comparación con los métodos e instrumentos de cultivo microbianos convencionales de alto rendimiento, MMC tiene muchas ventajas, como un bajo consumo de mano de obra y reactivos, operación simple, detección en línea (OD y fluorescencia), recopilación de datos de alta resolución de tiempo y paralelización superior. MMC también tiene algunas ventajas especiales diferentes de la tecnología microfluídica de gotas convencional, que generalmente utiliza las gotas pL y nL. La mayoría de los sistemas reportados anteriormente que usaban gotas de pL y nL tienen un rendimiento de cultivo deficiente y pocos parámetros detectables (generalmente solo fluorescencia)18,19,20,21. Aunque ha habido algunas plataformas que pueden lograr un mejor rendimiento de cultivo y detección de múltiples parámetros, es difícil y requiere mucho esfuerzo. Por ejemplo, algunos investigadores informaron la detección de OD de gotas de pL. Se basa en el reconocimiento de imágenes, que no solo tiene falsos positivos, sino que también necesita una mayor verificación de la precisión22. Sin embargo, MMC puede lograr esto de una manera relativamente simple. MMC utiliza gotas de microlitro (μL) que rara vez se informan. Se ha verificado el rendimiento superior de cultivo microbiano de MMC, y también puede detectar directamente OD y fluorescencia. Debido al gran volumen de las gotas de μL, la generación de gotas es menos susceptible a la interferencia, que tiene una mayor estabilidad. Mientras tanto, se pueden realizar operaciones más diversas en las gotas de microlitros, lo que lleva a la realización de operaciones automatizadas. Además, debido a que las gotas son espacios de recinto, se puede suprimir la volatilidad de los contenidos (Tabla suplementaria 2), propicia para realizar el cultivo microbiano a largo plazo y la evolución adaptativa cuando existen sustancias volátiles en el medio14. Esto es difícil de lograr en matraces de agitación y microplacas.

Sin embargo, vale la pena enfatizar ciertos puntos críticos en el protocolo. En primer lugar, debe tenerse en cuenta que el valor de OD medido por MMC es diferente del de un espectrofotómetro porque sus longitudes de trayectoria óptica de medición de OD son diferentes (1 mm y 10 mm, respectivamente). Por lo tanto, al comparar el valor OD de MMC con el de matraz de agitación, es necesario medir la curva de calibración13. Afortunadamente, el proceso de evolución adaptativa no requiere curvas de calibración porque nos centramos en las tendencias relativas entre las curvas de crecimiento. A continuación, ciertos microorganismos no están cultivados en MMC. Las gotas dependen de la tensión superficial de la interfaz aceite-agua para mantener la estabilidad23. Si los microorganismos producen ciertas sustancias que interrumpen la tensión superficial de la interfaz aceite-agua, como algunas cepas de Bacillus subtilis que producen surfactantes24, las gotas no pueden mantener la estabilidad. Además, si el medio en sí mismo es un obstáculo para la generación de gotas, no es viable para ser utilizado en MMC, por ejemplo, medio muy viscoso o medio que contiene partículas grandes. En la actualidad, las especies que hemos cultivado con éxito en MMC incluyen E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, levaduras, Methylobacterium extorquens, Aspergillus oryzae, microalgas, etc. Se recomienda cultivar la cepa en MMC para un experimento preliminar. Finalmente, los conectores y puertos entre el chip, la botella de reactivo y el MMC deben conectarse en estricta conformidad con el protocolo. De lo contrario, la solución de bacterias puede fluir hacia el MMC y contaminar el interior. Además, debe señalarse que el rendimiento actual de MMC es limitado (0-200), debido al tiempo necesario para las operaciones de subcultivo. En el futuro, optimizaremos el software de control y el tamaño del chip para acortar el tiempo y mejorar el rendimiento. Dado que MMC es un sistema modular, solo las piezas o el software relacionados deben reemplazarse sin el requisito de nuevos equipos.

En la actualidad, MMC no solo puede realizar la medición de la curva de crecimiento, la evolución adaptativa del laboratorio y el análisis multinivel de un solo factor, sino que también se puede utilizar para personalizar diferentes procedimientos de operación de gotas para satisfacer las necesidades experimentales. En el futuro, es necesario enriquecer aún más las funciones de aplicación del sistema MMC en respuesta a las diferentes necesidades de la investigación microbiana, como la realización de experimentos ortogonales multifactor multinivel, la tecnología de muestreo automático multimuestra para medir simultáneamente las curvas de crecimiento de múltiples especies bacterianas y detectar y controlar con precisión más parámetros (por ejemplo, oxígeno disuelto (DO) y pH). Al mismo tiempo, también es necesario desarrollar más funciones en el campo de la microbiología para aplicar MMC a escenarios más prácticos, como la optimización de composiciones de medios, la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC), el cocultivo de microorganismos25, etc.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFA0901500), el Proyecto Nacional de Instrumentos y Equipos Científicos Clave de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21627812) y el Programa de Investigación Científica de la Iniciativa de la Universidad de Tsinghua (20161080108). Julia A. Vorholt (Instituto de Microbiología, Departamento de Biología, ETH Zurich, Zurich 8093, Suiza) por el suministro de la cepa de E. coli esencial para metanol versión 2.2 (MeSV2.2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. — For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

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