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Bioengineering

ऑप्टिकल रूप से वाष्पीकृत परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट्स का निर्माण और ध्वनिक मॉड्यूलेशन

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

ऑप्टिकल रूप से सक्रिय परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट्स संवहनी प्रणाली के बाहर इमेजिंग अनुप्रयोगों में वादा दिखाते हैं। यह लेख प्रदर्शित करेगा कि इन कणों को कैसे संश्लेषित किया जाए, पॉलीक्रिलामाइड फैंटम को क्रॉसलिंक किया जाए, और उनके संकेत को बढ़ाने के लिए बूंदों को ध्वनिक रूप से संशोधित किया जाए।

Abstract

माइक्रोबबल अल्ट्रासाउंड में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला इमेजिंग कंट्रास्ट एजेंट है। हालांकि, उनके आकार के कारण, वे संवहनी डिब्बों तक सीमित हैं। इन माइक्रोबबल्स को संघनित किया जा सकता है या परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट्स (पीएफसीएनडी) के रूप में तैयार किया जा सकता है जो अतिरिक्त रूप से पर्याप्त छोटे होते हैं और फिर लक्ष्य स्थल पर ध्वनिक रूप से ट्रिगर किए जाते हैं। इन नैनोकणों को इन्फ्रारेड कार्बनिक डाई या नैनोकणों (जैसे, कॉपर सल्फाइड नैनोकणों या सोने के नैनोकणों / नैनोरोड्स) जैसे ऑप्टिकल अवशोषक को शामिल करके आगे बढ़ाया जा सकता है। ऑप्टिकल रूप से टैग किए गए पीएफसीएनडी को ऑप्टिकल ड्रॉपलेट वाष्पीकरण (ओडीवी) नामक प्रक्रिया में लेजर विकिरण के माध्यम से वाष्पीकृत किया जा सकता है। सक्रियण की यह प्रक्रिया उच्च क्वथनांक परफ्लोरोकार्बन कोर के उपयोग को सक्षम बनाती है, जिसे नैदानिक इमेजिंग के लिए अधिकतम यांत्रिक सूचकांक सीमा के तहत ध्वनिक रूप से वाष्पीकृत नहीं किया जा सकता है। उच्च क्वथनांक कोर के परिणामस्वरूप बूंदें होती हैं जो वाष्पीकरण के बाद फिर से घुल जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप "पलक झपकने" वाले पीएफसीएनडी होते हैं जो नैनोड्रॉपलेट रूप में संघनित होने से पहले वाष्पीकरण के बाद संक्षेप में विपरीत पैदा करते हैं। इस प्रक्रिया को मांग पर कंट्रास्ट का उत्पादन करने के लिए दोहराया जा सकता है, जिससे ऑप्टिकल और ध्वनिक मॉड्यूलेशन दोनों के माध्यम से पृष्ठभूमि मुक्त इमेजिंग, मल्टीप्लेक्सिंग, सुपर-रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट वृद्धि की अनुमति मिलती है। यह लेख दिखाएगा कि जांच सोनिकेशन का उपयोग करके ऑप्टिकल-ट्रिगरेबल, लिपिड शेल पीएफसीएनडी को कैसे संश्लेषित किया जाए, नैनोड्रॉपलेट्स को चिह्नित करने के लिए पॉलीक्रिलामाइड फैंटम बनाएं, और विपरीत में सुधार के लिए ओडीवी के बाद पीएफसीएनडी को ध्वनिक रूप से संशोधित करें।

Introduction

माइक्रोबबल्स नरम ऊतकों की तुलना में उनकी जैव-रासायनिकता और उत्कृष्ट इकोजेनेसिटी के कारण सबसे सर्वव्यापी अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट हैं। यह उन्हें रक्त प्रवाह, अंग चित्रण औरअन्य अनुप्रयोगों की कल्पना करने के लिए मूल्यवान उपकरण बनाता है। हालांकि, उनका आकार (1-10 μm), जो उन्हें उनकी अनुनाद आवृत्ति के आधार पर इमेजिंग के लिए असाधारण बनाता है, उनके अनुप्रयोगों को वास्कुलचर2 तक सीमित करता है।

इस सीमा ने पीएफसीएनडी के विकास को जन्म दिया है, जो एक तरल परफ्लोरोकार्बन कोर के चारों ओर एक सर्फेक्टेंट से बने नैनो-इमल्शन हैं। इन नैनोकणों को 200 एनएम जितने छोटे आकार में संश्लेषित किया जा सकता है और ट्यूमर वास्कुलचर में पाए जाने वाले "लीक" वाहिका या छिद्रों और खुले फेनेस्ट्रेशन का लाभ उठाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। जबकि ये व्यवधान ट्यूमर पर निर्भर हैं, यह पारगम्यता ट्यूमर 3,4 के आधार पर ~ 200 एनएम - 1.2 μm से नैनोकणों के अतिरिक्तीकरण की अनुमति देती है। अपने प्रारंभिक रूप में, ये कण बहुत कम अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट का उत्पादन करते हैं। वाष्पीकरण पर - ध्वनिक या ऑप्टिकल रूप से प्रेरित - कोर चरण तरल से गैस में बदल जाता है, व्यास 5,6,7 में ढाई से पांच गुना वृद्धि को प्रेरित करता है और फोटोएकॉस्टिक और अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट उत्पन्न करता है। जबकि ध्वनिक वाष्पीकरण सबसे आम सक्रियण विधि है, यह दृष्टिकोण ध्वनिक कलाकृतियों का निर्माण करता है जो वाष्पीकरण की इमेजिंग को सीमित करता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश परफ्लोरोकार्बन को 8 को वाष्पीकृत करने के लिए सुरक्षा सीमा से परे यांत्रिक सूचकांक के साथ केंद्रित अल्ट्रासाउंड की आवश्यकता होतीहै। इससे निचले क्वथनांक पीएफसीएनडी का विकास हुआ है, जिसे माइक्रोबबल को नैनोड्रॉपलेट्स9 में संघनित करके संश्लेषित किया जा सकता है। हालांकि, ये बूंदें अधिक अस्थिर होती हैं और सहज वाष्पीकरण10 के अधीन होती हैं।

दूसरी ओर, ऑप्टिकल ड्रॉपलेट वाष्पीकरण (ओडीवी), को नैनोपार्टिकल्स11,12,13 या डाई 6,14,15 जैसे ऑप्टिकल ट्रिगर को जोड़ने की आवश्यकता होती है और एएनएसआई सुरक्षा सीमा 11 के भीतर समृद्धि का उपयोग करके उच्च क्वथनांक परफ्लोरोकार्बन को वाष्पीकृत कर सकता है। उच्च क्वथनांक कोर के साथ संश्लेषित पीएफसीएनडी अधिक स्थिर होते हैं और वाष्पीकरण के बाद पुन: उत्पन्न होंगे, जिससे पृष्ठभूमि मुक्त इमेजिंग16, मल्टीप्लेक्सिंग17 और सुपर-रिज़ॉल्यूशन18 की अनुमति मिलती है। इन तकनीकों की प्रमुख सीमाओं में से एक यह तथ्य है कि उच्च क्वथनांक पीएफसीएनडी मिलीसेकंड19 के पैमाने पर केवल थोड़े समय के लिए वाष्पीकरण के बाद इकोजेनिक होते हैं, और अपेक्षाकृत बेहोश होते हैं। हालांकि इस मुद्दे को बार-बार वाष्पीकरण और औसत के माध्यम से कम किया जा सकता है, ड्रॉपलेट सिग्नल का पता लगाना और पृथक्करण एक चुनौती बनी हुई है।

पल्स व्युत्क्रमण से प्रेरणा लेते हुए, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग पल्स19 के चरण को संशोधित करके अवधि और कंट्रास्ट को बढ़ाया जा सकता है। एक दुर्लभ चरण (एन-पल्स) के साथ अल्ट्रासाउंड इमेजिंग पल्स शुरू करके, वाष्पीकृत पीएफसीएनडी की अवधि और विपरीत दोनों बढ़ जाते हैं। इसके विपरीत, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग पल्स को संपीड़न चरण (पी-पल्स) के साथ शुरू करने से कंट्रास्ट कम हो जाता है और अवधि कम हो जाती है। यह लेख वर्णन करेगा कि ऑप्टिकल रूप से ट्रिगर करने योग्य परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट्स, पॉलीक्रिलामाइड फैंटम को आमतौर पर इमेजिंग में कैसे उपयोग किया जाता है, और ध्वनिक मॉड्यूलेशन के माध्यम से विपरीत वृद्धि और बेहतर सिग्नल दीर्घायु का प्रदर्शन करता है।

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Protocol

1. परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट फॉर्मूलेशन

  1. क्लोरोफॉर्म के साथ 10 एमएल गोल-बॉटम फ्लास्क को धोएं और क्लोरोफॉर्म के साथ 10 μL और 1 mL गैस टाइट ग्लास सिरिंज को बार-बार फुल सिरिंज की मात्रा को दबाकर और इसे कुल तीन बार बाहर निकालें।
    चेतावनी: क्लोरोफॉर्म अस्थिर है और साँस लेने पर विषाक्त हो सकता है। इस विलायक के साथ सभी काम एक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
  2. सिरिंज का उपयोग करके, राउंड-बॉटम फ्लास्क में डीएसपीई-एमपीईजी 2000 (25 मिलीग्राम / एमएल) के 200 μL, 1,2-डिस्टीरियल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (DSPC, 25 mg/ mL) और आईआर 1048 के 1 एमएल (क्लोरोफॉर्म में 1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। स्टॉक के संदूषण को रोकने के लिए लिपिड / डाई के बीच सिरिंज को साफ करना याद रखें।
    नोट: इन्फ्रारेड रंजक प्रकाश संवेदनशील होते हैं, और काम मंद परिस्थितियों में किया जाना चाहिए या फ्लास्क को एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किया जाना चाहिए।
  3. रोटरी बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करके विलायक को हटा दें। सुनिश्चित करें कि बंपिंग को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे-धीरे 332 एमबार में समायोजित किया जाता है। 5 मिनट के बाद, समाधान में प्रवेश करने वाले किसी भी पानी को हटाने के लिए दबाव को 42 मिलीबार तक कम करें।
    नोट: लिपिड केक को 4 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिल्म से ढके एक गोल तल फ्लास्क में रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. लिपिड केक को 1 एमएल फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) और सोनिकेट या भंवर में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर निलंबित करें या जब तक कि सभी लिपिड केक को निलंबित और घोल में भंग न कर दिया जाए। समाधान को समरूप बनाने के लिए अतिरिक्त 2 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  5. घोल को 7 एमएल ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें और शीशी को बर्फ से भरे ग्लास डिश में रखें ताकि गैस टाइट ग्लास सिरिंज का उपयोग करके 50 μL परफ्लोरोहेक्सेन जोड़ने से पहले घोल को 5 मिनट के लिए ठंडा होने दिया जा सके। शीशी में डालने से पहले सिरिंज को परफ्लोरोहेक्सेन से कुल्ला करना याद रखें।
  6. जांच सोनिकेटर बाड़े में लिपिड और बर्फ स्नान युक्त कांच की शीशी रखें और मिनिस्कस के नीचे जांच की नोक को डुबो दें। सुनिश्चित करें कि सोनिकेटर जांच के किनारे कांच की शीशी के होंठ को नहीं छूते हैं।
  7. प्रोब मिश्रण को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ जोड़ता है: आयाम 1, प्रक्रिया समय: 20 एस, पल्स-ऑन: 1 एस, पल्स-ऑफ: 5 एस। फिर निम्नलिखित सेटिंग्स पर ध्वनि करें: आयाम: 50, प्रक्रिया समय: 5 एस, पल्स-ऑन: 1 एस, पल्स-ऑफ: 10 एस।
  8. नैनोड्रॉपलेट समाधान को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और छोटी बूंदों से बड़ी बूंदों (>1 μm) को अलग करने के लिए 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. गोली को छोड़ दें और सुपरनैटेंट को दूसरे 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। घोल में सभी बूंदों को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 3000 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके सतह पर तैरने वाले को धो लें। पीबीएस के 1 एमएल में पीएफएस को फिर से निलंबित करें और फिर 1 मिनट के लिए स्नान सोनिकेटर में सोनिकेट करें।
  10. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) का उपयोग करके बूंदों के आकार को मापें। स्टॉक पीएफसीएनडी को 100 गुना पतला करें (पीबीएस के 990 μL में PFCnD स्टॉक का 10 μL) और मापने से पहले PFCND को फैलाने के लिए स्नान सोनिकेट। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1 में दिखाए गए हैं।
  11. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषक का उपयोग करके पीएफसीएनडी की एकाग्रता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एकाग्रता की सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए पीएफसीएनडी को 100-1000 गुना पतला करें। प्रोटोकॉल आमतौर पर 1010 कणों / एमएल के क्रम पर एकाग्रता पर बूंदों का उत्पादन करता है।
  12. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 एमएल अल्ट्रासाउंड युग्मन जेल तैयार करें और ~ 108 कणों / एमएल का समाधान बनाने के लिए 1% (वी / वी) या 100 μL PFCND जोड़ें। भंवर मिश्रण करने का समाधान है। बुलबुले को हटाने के लिए मिश्रण को 3 मिनट के लिए 4000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।

2. पॉलीक्रिलामाइड फैंटम तैयारी

  1. 400 एमएल विआयनीकृत पानी के साथ 500 एमएल वैक्यूम फ्लास्क को भरकर, रबर कॉर्क के साथ सील करके और फ्लास्क को वैक्यूम लाइन से जोड़कर डेगास पानी। वैक्यूम लाइन खोलें और फ्लास्क के निचले हिस्से को स्नान सोनिकेटर में डुबोएं। 5 मिनट के लिए या जब तक कोई गैस बुलबुला गठन दिखाई नहीं देता है, तब तक सोनिकेट करें।
  2. 5 एमएल डिगैस्ड पानी में 500 मिलीग्राम को घोलकर 10% अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) समाधान तैयार करें। यदि अमोनियम परसल्फेट पूरी तरह से भंग नहीं होता है तो धीरे से घोल को घुमाएं।
  3. एक 400 एमएल बीकर में, एक 150 एमएल डिगैस्ड पानी और 40% (डब्ल्यू / वी) एक्रिलामाइड-बिसाक्रिलामाइड घोल के 50 एमएल को 10% एक्रिलामाइड-बिसाक्रिलामाइड समाधान बनाने के लिए जोड़ें। बुलबुले पेश किए बिना उचित मिश्रण की अनुमति देने के लिए मिश्रण को 200 आरपीएम पर हिलाएं।
    चेतावनी: एक्रिलामाइड एक कार्सिनोजेन है, और सभी काम दस्ताने के साथ एक फ्यूम हुड में किए जाने चाहिए, खासकर यदि पाउडर के रूप में एक्रिलामाइड के साथ काम कर रहे हैं।
  4. 400 मिलीग्राम सिलिका का वजन करें और इसे चरण 2.3 से 10% एक्रिलामाइड-बिसाक्रिलामाइड समाधान में जोड़ें ताकि सिलिका और एक्रिलामाइड समाधान का 0.2% (डब्ल्यू / वी) बनाया जा सके।
    सावधानी: सांस लेने पर सिलिका एक कार्सिनोजेन हो सकता है। वजन सहित सभी काम एक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
  5. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट से युक्तियों को काटकर और लैब टेप के साथ मोल्ड में इसका समर्थन करके बेलनाकार समावेश के साथ एक 58 मिमी x 58 मिमी x 78 मिमी वर्ग मोल्ड तैयार करें। चित्र 2 देखें।
  6. 0.1% एपीएस की अंतिम सांद्रता बनाने के लिए बीकर में 10% एपीएस घोल का 2 एमएल जोड़ें और फैंटम समाधान में टेट्रामेथाइलेथिलीनडायमाइन (टीईएमईडी) का 250 μL जोड़ें। घोल को संक्षेप में हिलाने दें (एक मिनट से भी कम)।
  7. समाधान को जल्दी से मोल्ड में डालें, जबकि सावधान रहें कि समाधान में हवा के बुलबुले पेश न करें। समाधान को 10 मिनट के भीतर पॉलीमराइज्ड करना चाहिए। मोल्ड के किनारे के चारों ओर एक प्रयोगशाला स्पैटुला के सपाट छोर को चलाकर और मोल्ड को उलटकर प्रेत को हटा दें।
    नोट: इन प्रेतों को कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है और पानी में डुबोया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

3. परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट इमेजिंग

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ~ 20 मिनट के लिए स्पंदित लेजर सिस्टम को चालू और गर्म करें। सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिकल बंडल लेजर आउटपुट से ठीक से जुड़ा हुआ है और दो पैरों को फाइबर बंडल धारक के भीतर ठीक से रखा गया है।
  2. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम चालू करें, सरणी इमेजिंग ट्रांसड्यूसर (एल 11-4 वी) को सिस्टम से कनेक्ट करें और लेजर क्रॉस सेक्शन के साथ अपने इमेजिंग विमान को संरेखित करने के लिए धारक के भीतर ट्रांसड्यूसर को ठीक करें।
  3. लेजर सिस्टम की पल्स पुनरावृत्ति आवृत्ति को 10 हर्ट्ज पर सेट करें और ऊर्जा को मापने के लिए फाइबर बंडल के अंत में एक पावरमीटर रखें। क्यू-स्विच देरी को तब तक ट्यून करें जब तक कि अनुमानित समृद्धि 70 एमजे / सेमी2 न हो।
    सावधानी: लेजर फायर करते समय उचित आईवियर पहना जाना चाहिए और लेजर पर्दे को अंतरिक्ष को घेरना चाहिए।
  4. 1 एमएल प्लास्टिक स्लिप टिप सिरिंज का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड जेल / पीएफसीएनडी मिश्रण के साथ पॉलीक्रिलामाइड फैंटम में चैनलों में से एक को बैकफिल करें। लिबरल रूप से अल्ट्रासाउंड जेल के साथ चैनल के शीर्ष को कवर करें और 1 एमएल प्लास्टिक स्लिप टिप सिरिंज के साथ किसी भी बुलबुले को हटा दें। ट्रांसड्यूसर और फाइबर बंडल के नीचे पॉलीक्रिलामाइड फैंटम रखें जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।
  5. ऑप्टिकल सक्रियण के साथ सिंक्रनाइज़ किए गए पीएफसीएनडी को चित्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर20 पर आधारित संयुक्त लेजर अल्ट्रासाउंड और लोच (CLUE) इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करें। इमेजिंग के लिए परम संरचना में सामान्य उपयोगकर्ता-परिभाषित मापदंडों को बदलें: स्टार्ट/एंड गहराई को 0/40 मिमी, केंद्र आवृत्ति को 6.9 मेगाहर्ट्ज और ट्रांसड्यूसर नाम को 'एल 11-4 वी' पर सेट करें।
  6. एक नया रनकेस परिभाषित करें और पीएफएचएनडी के बार-बार ऑप्टिकल सक्रियण / पुन: संघनन और यूएस इमेजिंग के लिए एक मॉड्यूल अनुक्रम डिजाइन करें। यह पूर्वनिर्धारित मॉड्यूल जैसे अल्ट्राफास्ट इमेजिंग (एमयूएफ), बाहरी लेजर (एमएक्सटीलेज़र) और आइडल (एमआईएलडीएल) को सूचीबद्ध करके किया जाता है।
    1. एन-पल्स और पी-पल्स इमेजिंग डेटा दोनों प्राप्त करने के लिए अनुक्रम सेट mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF को दो बार दोहराएं।
      नोट: प्रत्येक अनुक्रम में पहला mExtLaser मॉड्यूल ExtLaser सेट करके एक शाम लेजर के रूप में सेट किया गया है। 0 को सक्षम करें और लेजर सक्रियण के बाद पृष्ठभूमि अमेरिकी छवियों और n / p-पल्स US छवियों के बीच समय को कम करने के लिए 'mIdle' को शामिल किया गया है।
  7. वर्तमान रन केस के मॉड्यूल अनुक्रम में रखे गए प्रत्येक मॉड्यूल के लिए मॉड्यूल पैरामीटर सेट करें। मॉड्यूल अनुक्रम में अपने क्रम के अनुरूप सूचकांक द्वारा प्रत्येक मॉड्यूल पैरामीटर तक पहुंचें। मॉड्यूल यहां सेट मॉड्यूल पैरामीटर उपयोगकर्ता के साथ पूर्व-परिभाषित संचालन निष्पादित करेंगे।
    1. माइक्रोसेकंड में चरण 3.3 में ट्यून किए गए लेजर क्यू-स्विच देरी के मान के लिए बाहरी लेजर मॉड्यूल में ExtLaser.QSdelay सेट करें। यह मॉड्यूल लेजर सिस्टम के फ्लैशलैंप ट्रिगर की प्रतीक्षा करता है और क्यूएसडीले में निर्दिष्ट देरी के बाद क्यू-स्विच ट्रिगर उत्पन्न करता है।
    2. अल्ट्राफास्ट इमेजिंग मॉड्यूल में, Resource.numFrame को 100 पर सेट करें, SeqControl.PRI को 200 (μs) पर सेट करें, और TW.polarity को P-पल्स के लिए 1 और N-पल्स के लिए -1 पर सेट करें (संबंधित पल्स आकार के लिए चित्रा 4 देखें)। यह मॉड्यूल TW.polarity में निर्दिष्ट पल्स प्रकार के साथ अल्ट्राफास्ट 0-डिग्री प्लानर तरंग संचारित करेगा।
      1. Resource.numFrame में फ्रेम की संख्या के लिए 38.8 मिमी चौड़ी पूर्ण एपर्चर इमेजिंग विंडो प्राप्त करें, SeqControl.PRI के पल्स पुनरावृत्ति अंतराल, फिर ऑफ-लाइन प्रसंस्करण के लिए डेटा सहेजें।
    3. निष्क्रिय मॉड्यूल में SeqControl.lastPRI_Module को क्यू-स्विच देरी, इमेजिंग डेटा अधिग्रहण समय (20 एमएस) द्वारा घटाए गए लेजर पल्स (100 एमएस) और सिग्नल को यात्रा करने के लिए 20 डिग्री मार्जिन के बीच समय की लंबाई पर सेट करें। यह मॉड्यूल इमेजिंग डेटा अधिग्रहण के अंत और अगले लेजर पल्स उत्तेजना के बीच समय अंतराल को भरने के लिए SeqControl.lastPRI_Module में समय के लिए सिस्टम को 'नो ऑपरेशन' स्थिति में रखता है।

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Representative Results

पीएफसीएनडी के सफल सूत्रीकरण और केन्द्रापसारक पृथक्करण से व्यास में 200-300 एनएम के आकार के आसपास बूंदें उत्पन्न होनी चाहिए (चित्रा 1 ए)। अनुचित रूप से अलग की गई बूंदें 1 μm के आसपास छोटी चोटियों को दिखा सकती हैं। बड़ी बूंदों को तोड़ने के लिए इन समाधानों को आगे स्नान किया जा सकता है। ओस्टवाल्ड पकने की प्रक्रिया में कोयला और / या प्रसार के कारण बूंदों का आकार समय के साथ बढ़ेगा जिसे ओस्टवाल्ड राइपनिंग21,22 (चित्रा 1 बी) के रूप में जाना जाता है।

इमेजिंग पल्स में हेरफेर करके बूंदों के ध्वनिक मॉड्यूलेशन ने वाष्पीकृत पीएफसीएनडी के विपरीत में सुधार किया। यह पीएफसीएनडी छवियों में बीमफॉर्म छवियों के आसन्न फ्रेम को घटाकर पुनर्निर्मित किया गया था ताकि वाष्पीकृत पीएफसीएनडी से लौटाए गए संकेत ही दिखाई दें और स्थिर पृष्ठभूमि संकेत दबा दिया जाए। कंट्रास्ट को परिपत्र समावेशन क्षेत्र के औसत संकेतों और औसत पृष्ठभूमि संकेत पर औसत पृष्ठभूमि संकेत के बीच अंतर के अनुपात से निर्धारित किया जाता है। पृष्ठभूमि संकेत को पृष्ठभूमि के दो आयताकार आरओआई से संकेतों द्वारा परिभाषित किया जाता है जो समावेशन के समान गहराई और समकक्ष क्षेत्र में होते हैं। एन-पल्स के लिए समावेश से विपरीत पी-पल्स (चित्रा 5) की तुलना में लगभग 3.2 गुना अधिक (यानी, 220% सुधार) है।

एन्टेड इमेजिंग पल्स ने पीएफसीएनडी वाष्पीकरण से सिग्नल की दीर्घायु में भी वृद्धि की। यह पृष्ठभूमि संकेत से अधिक गोलाकार समावेश क्षेत्र में पिक्सेल को थ्रेशोल्ड करके निर्धारित किया गया था। सीमा से ऊपर के समावेश में पिक्सेल का प्रतिशत हाइपरइकोइक क्षेत्र (%) के रूप में परिभाषित किया गया था। समय के साथ पीएफसीएनडी के हाइपरेकोजेनिक व्यवहार की जांच करने के लिए, हाइपरइकोइक क्षेत्र की गणना प्रत्येक फ्रेम के लिए की जाती है और पहले फ्रेम के हाइपरइकोइक क्षेत्र द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, और फिर एक घातीय क्षय मॉडल में फिट किया जाता है। इस फ़ंक्शन का उपयोग विशिष्ट क्षय समय को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसे पीएफसीएनडी सक्रियण के बाद हाइपरइकोइक क्षेत्र के लिए प्रारंभिक क्षेत्र के केवल 10% तक क्षय होने के लिए लगने वाले समय के रूप में परिभाषित किया गया था (चित्रा 6 ए)। पी-पल्स की तुलना में एन-पल्स इमेजिंग में सामान्यीकृत हाइपरइकोइक क्षेत्र का विशिष्ट क्षय समय 3.5 गुना अधिक है। प्रत्येक एन-पल्स और पी-पल्स इमेजिंग के लिए समय में प्रतिनिधि बी-मोड अंतर छवि फ्रेम चित्रा 6 बी में दिखाए गए हैं।

Figure 1
चित्र 1: पीएफसीएनडी और स्थिरता का डीएलएस आकार माप। (ए) संश्लेषण के बाद बूंदों के तीन मापों से औसत बूंदों का आकार तीव्रता वितरण (औसत पीडीआई: 0.132± 0.016; औसत जेड-औसत: 259.3 ± 0.7 एनएम)। (बी) बूंदों का आकार तीव्रता वितरण संश्लेषण के 24 घंटे बाद लिए गए तीन मापों से औसत है (औसत पीडीआई: 0.252± 0.061; औसत जेड-औसत: 322.5 ± 4.5 एनएम)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: पॉलीक्रिलामाइड मोल्ड की छवि और योजनाबद्ध। (ए) लैब टेप और प्लास्टिक कंटेनर से बने मोल्ड की छवि। (बी) मोल्ड से हटाने के बाद पॉलीक्रिलामाइड फैंटम के माप के साथ योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: लेजर पल्स डिलीवरी और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का एक योजनाबद्ध। (ए) असेंबली के घटकों को लेबल किया जाता है और समावेश स्थिति के सापेक्ष लेजर बीम / अल्ट्रासाउंड इमेजिंग विमान संरेखण को चित्रित किया जाता है। (बी) वास्तविक सेटअप दिखाने वाली एक छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सिम्युलेटेड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग पल्स। वेवफॉर्म अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर द्वारा अनुकरण किए जाते हैं, जो 250 मेगाहर्ट्ज द्वारा नमूना लिया जाता है। पी-पल्स और एन-पल्स की तरंग समान केंद्र आवृत्ति और पल्स चौड़ाई के साथ उत्पन्न होती है लेकिन इसमें 180 ° चरण अंतर होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विपरीत माप। एन-पल्स और पी-पल्स के लिए समावेश क्षेत्र का औसत विपरीत मान, त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (एन = 3) का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: हाइपरइकोइक क्षेत्र और प्रतिनिधि विभेदक बी-मोड मैग्स की विशिष्ट क्षय वक्र( ए) एक ही क्रॉस-सेक्शन पर एन-पल्स और पी-पल्स इमेजिंग के लिए समय के साथ पीएफसीएनडी सक्रियण द्वारा प्रेरित सामान्यीकृत हाइपरोइक क्षेत्र। डॉटेड लाइन प्रारंभिक हाइपरइकोइक क्षेत्र के 10% को इंगित करती है। वह समय जिस पर फिट किया गया प्लॉट बिंदीदार रेखा के साथ प्रतिच्छेद करता है, विशिष्ट क्षय समय का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) छवियां समावेश पर केंद्रित एक क्रॉप्ड आरओआई विंडो दिखाती हैं, जिसे 35 की गतिशील सीमा के साथ डीबी पैमाने पर प्लॉट किया गया है। शीर्ष पंक्ति पी-पल्स द्वारा चित्रित पुन: संयोजित व्यवहार को दर्शाती है और निचली पंक्ति एन-पल्स दिखाती है। पीले रंग की डैश लाइन समावेश क्षेत्र को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फैंटम की कुल मात्रा (एमएल) 50 100 250 500
डीआई पानी (एमएल) 37.5 74.9 187.4 375
40% पीए समाधान (एमएल) 12.5 25.1 62.6 125
सिलिका (मिलीग्राम) 100 200 500 1000
10% एपीएस समाधान (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

तालिका 1: मोल्ड वॉल्यूम के आधार पर पॉलीक्रिलामाइड फैंटम क्रॉसलिंकिंग के लिए अभिकर्मकों और मात्राओं का सारांश। यह तालिका उपयोग किए गए अभिकर्मकों का संक्षिप्त मूल्य सारांश प्रदान करती है और कई सामान्य मोल्ड वॉल्यूम के आधार पर मात्रा प्रदान करती है।

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Discussion

प्रोब सोनिकेशन पीएफसीएनडी बनाने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और सीखने में आसान तरीका है। कुछ कदम हैं जहां देखभाल की जानी चाहिए। क्लोरोफॉर्म को संभालते समय, यह जरूरी है कि एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट या ग्लास सिरिंज का उपयोग किया जाए, क्योंकि यह अस्थिर है और मानक वायु विस्थापन पिपेट से "रिसाव" होगा। इसके अलावा, यदि सकारात्मक विस्थापन का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि क्लोरोफॉर्म के रूप में एक उपयुक्त टिप का उपयोग किया जाता है, जो अधिकांश प्लास्टिक युक्तियों को भंग कर देगा, जो समाधान में दूषित पदार्थों को पेश कर सकता है। परफ्लोरोहेक्सेन के लिए एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट या ग्लास सिरिंज की भी सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह पानी की तुलना में अस्थिर और सघन दोनों है। आमतौर पर, अस्थिरता और उच्च घनत्व के व्यक्तिगत प्रभावों को क्रमशः वायु विस्थापन पिपेट में पूर्व-गीला करके और पिपेट पर निर्धारित मात्रा को समायोजित करने के लिए एक पैमाने का उपयोग करके कम किया जा सकता है। लेकिन परफ्लोरोहेक्सेन के मामले में जिसमें दोनों गुण होते हैं, अस्थिरता सटीक वजन माप प्राप्त करना मुश्किल बना देगी, जिससे सकारात्मक विस्थापन पिपेट / ग्लास सिरिंज सबसे व्यवहार्य विकल्प बन जाएगा।

समाधान को जांच करने से पहले, लिपिड और परफ्लोरोकार्बन समाधान को बर्फ स्नान में इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है ताकि इसे सोनिकेशन के दौरान परफ्लोरोकार्बन को उबालने से रोकने के लिए ठंडा किया जा सके। यह कदम कम उबलते परफ्लोरोकार्बन जैसे परफ्लोरोकार्पेंटेन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होगा। इसके अलावा, समाधान की जांच करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। सोनिकेशन जांच टिप को जलमग्न किया जाना चाहिए, लेकिन इसे कांच की शीशी के तल या किनारों के साथ संपर्क नहीं करना चाहिए क्योंकि यह नोक को नुकसान पहुंचा सकता है और शीशी को चकनाचूर कर सकता है, लिपिड समाधान को बर्फ स्नान में खाली कर सकता है।

पीएफसीएनडी निर्माण प्रोटोकॉल को कुछ मामूली तरीकों से अनुकूलित किया जा सकता है। यदि चरण 1.3 में एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता अनुपलब्ध है, तो घोल को नाइट्रोजन गैस की एक स्थिर धारा के साथ सुखाया जा सकता है या लिपिड केक बनाने के लिए रात भर वैक्यूम कक्ष में रखा जा सकता है। लिपिड के संबंध में, यह सूत्रीकरण डीएसपीई-पीईजी: डीएसपीसी के मानक 1: 9 अनुपात की तुलना में डीएसपीई-पीईजी: डीएसपीसी के 9: 1 अनुपात का उपयोग करता है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप छोटे और अधिक आकार की स्थिर बूंदेंहोती हैं। इस सूत्रीकरण को डीएसपीई-पीईजी के एक छोटे से अंश (~ 2 मोल%) को वांछित मोइटी (जैसे, बायोटिन, थिओल, अमाइन, आदि) के साथ कार्यात्मक डीएसपीई-पीईजी के साथ प्रतिस्थापित करके सतह संयुग्मन की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, प्रोब सोनिकेटर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होते हैं, उपयोग करने में अपेक्षाकृत सरल होते हैं, और आसानी से अन्य उच्च क्वथनांक परफ्लोरोकार्बन और सर्फेक्टेंट फॉर्मूलेशन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन इसका उपयोग परफ्लोरोकार्बन कोर के साथ बूंदें बनाने के लिए नहीं किया जा सकता है जो महत्वपूर्ण संशोधनों के बिना कमरे के तापमान पर गैसीय होते हैं। ऐसा ही एक संशोधन माइक्रोबबल बनाने के लिए प्रोब सोनिकेशन का उपयोग कर रहा है और फिर दबाव लागू कर रहा है और माइक्रोबबल कोबूंदों में संघनित करने के लिए तापमान को कम कर रहा है। हालांकि यह विधि ध्वनिक रूप से वाष्पीकृत बूंदों को उत्पन्न करने का एक चतुर तरीका है, संक्षेपण के बाद ओडीवी सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोबबल के भीतर पर्याप्त डाई को समाहित करना मुश्किल है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण डाई (जैसे, Cy7.5) को लिपिड में संयुग्मित करना और माइक्रोबबल बनाना है जिसे ODV सक्षम कम क्वथनांकPFCNDS 25 में संघनित किया जा सकता है।

प्रोब सोनिकेशन अपेक्षाकृत कम समय में नैनोड्रॉपलेट्स (~ 1010 बूंदों / एमएल) की उच्च सांद्रता भी पैदा करता है। हालांकि, इस तकनीक के परिणामस्वरूप एक बड़े आकार का वितरण होता है जो नैनोड्रॉपलेट्स की मात्रा को कम करेगा जो अतिरिक्त होगा। हालांकि, बड़ी बूंदों को हटाने के लिए केन्द्रापसारक फ़िल्टरिंग या सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से इसमें सुधार किया जा सकता है, परिणामस्वरूप पीएफसीएनडी माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके संश्लेषित बूंदों की तुलना में अधिक पॉलीस्प्रिटिटी प्रदर्शित करेंगे या एक्सट्रूज़न26 के माध्यम से फ़िल्टर किए जाएंगे। सोनिकेशन की जांच के लिए एक और दोष यह है कि सोनिकेशन जांच टिप अनिवार्य रूप से सोनिकेशन के दौरान गुहिकायन से अलग हो जाएगी और इसे समय-समय पर प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी।

बूंदों को बनाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करता है जिसका उपयोग बूंदों को कम पॉलीस्प्रेसिटी इंडेक्स (पीडीआई) के साथ एक विशिष्ट आकार में तैयार करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, ये उपकरण अपेक्षाकृत धीमी दर (~ 10 4-10 6 बूंदें / एस)26 पर बूंदों का उत्पादन करते हैं और, जबकि कई विकास हुए हैं जैसे कि चरण पायसीकरण27, प्रवाह केंद्रित उपकरणों में टिप स्ट्रीमिंग28,29, और एक क्रमबद्ध हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर30 के साथ ओजो प्रभाव का उपयोग करना। - नैनोसाइज्ड ड्रॉपलेट्स पैदा करना अभी भी चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। इसके अलावा, यह तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, और इन उपकरणों के निर्माण के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अन्य तरीकों में एक्सट्रूज़न और होमोजेनाइजेशन शामिल हैं। एक्सट्रूज़न बूंदों को पारित करने के लिए झिल्ली का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप सोनिकेशन की तुलना में संकीर्ण आकार की सीमा के साथ नैनो-आकार की बूंदें होती हैं। हालांकि यह विधि भारी फॉर्मूलेशन निर्भर है और ड्रॉपलेट26 के भीतर डाई या चिकित्सीय कार्गो को शामिल करना चुनौतीपूर्ण है। उच्च दबाव समरूपीकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होमोजेनाइज़र का उपयोग करता है जो स्केलेबल फैशन31,32,33 में मोनोस्प्रेट, नैनोस्केल लिपिड कणों को उत्पन्न करने के लिए उच्च दबाव और कतरनी तनाव का उपयोग करता है। इस विधि को उच्च और निम्न क्वथनांक परफ्लोरोकार्बन32,34 के साथ बूंदें बनाने के लिए अनुकूलित किया गया है। ड्रॉपलेट फॉर्मूलेशन विधियों और नमूना प्रोटोकॉल की अधिक महत्वपूर्ण समीक्षा निम्नलिखित समीक्षा26 में पाई जा सकती है।

फैंटम विट्रो में नैनोड्रॉपलेट्स के प्रदर्शन को चिह्नित करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं। इस प्रोटोकॉल में, सिलिका के साथ पॉलीक्रिलामाइड-आधारित प्रेतों का उपयोग किया जाता है। पॉलीक्रिलामाइड फैंटम के साथ सबसे लगातार मुद्दे धीमे या बिना पोलीमराइजेशन से संबंधित हैं। धीमी पोलीमराइजेशन, जबकि कम समस्याग्रस्त है, एम्बेडेड स्कैटर के विषम वितरण को जन्म दे सकता है। इस मुद्दे के लिए सबसे आम अपराधी अमोनियम परसल्फेट के पुराने समाधानों का उपयोग है जो क्रॉसलिंकिंग शुरू करने वाले मुक्त कणों के उत्पादन को कम करते हैं। समाधान को ताजा बनाकर या एक सप्ताह से अधिक पुराने तैयार समाधानों का उपयोग न करके इसे आसानी से संबोधित किया जा सकता है। एक और संभावना टीईएमईडी का क्षरण है - यह पीले अवक्षेप के गठन में स्पष्ट होगा। एक अन्य आम मुद्दा बहुलक प्रेत में हवा के बुलबुले की उपस्थिति है। पानी का उचित विघटन और अतिरिक्त सतह आंदोलन से बचने के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग से इस मुद्दे को कम करना चाहिए। एक वैकल्पिक रणनीति चरण 2.5 के बाद पूरे समाधान को अलग करना होगा। हालांकि, यह एक्रिलामाइड की उपस्थिति के कारण एक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।

ये प्रेत व्यक्तिगत बूंद व्यवहार का अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित बूंदों के व्यवहार की इमेजिंग के लिए भी उत्कृष्ट हैं; यह चरण 2.4 पर प्रेत में पीएफसीएनडी जोड़कर किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि क्रॉसलिंकिंग एक रासायनिक प्रतिक्रिया के कारण होती है, इसलिए जिलेटिन जैसे ऊपरी महत्वपूर्ण समाधान तापमान के आधार पर भौतिक क्रॉसलिंकिंग की तुलना में अपेक्षाकृत कम गर्मी उत्पन्न होती है। यह एम्बेडेड बूंदों के सहज वाष्पीकरण की संभावना को कम करता है।

जबकि प्रेतों को संश्लेषित करने के लिए विभिन्न तरीके हैं, पॉलीक्रिलामाइड एक अपेक्षाकृत टिकाऊ और गैर-अपघटनीय प्रेत का उत्पादन करता है जिसमें कम ध्वनिक क्षीणन35 और ऑप्टिकल अवशोषण गुणांक36 होता है। इन गुणों को अंतिम पॉलीक्रिलामाइड समाधान की एकाग्रता को समायोजित करके और सिलिका, ग्लास बीड्स या टाइटेनियम डाइऑक्साइड36 जैसे प्रेत में कणों को शामिल करके मानव ऊतक के ध्वनिक और ऑप्टिकल गुणों की अधिक बारीकी से नकल करने के लिए ट्यून किया जा सकता है। इसके अलावा प्रेतों के यांत्रिक गुणों को बहुलक सामग्री के प्रतिशत (यानी एक्रिलामाइड और बीआईएस (एक्रिलामाइड) का प्रतिशत) और क्रॉसलिंकर के प्रतिशत (यानी कुल बहुलक सामग्री में बीआईएस (एक्रिलामाइड) का प्रतिशत) को संशोधित करके समायोजित किया जा सकता है। वैकल्पिक प्रेतों में शामिल हैं लेकिन एगर38, जिलेटिन39, पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) 40 आदि तक सीमित नहीं हैं।

सक्रिय पीएफसीएनडी वितरण और हाइपरेचोजेनिक गतिशीलता की सफल इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम निम्नानुसार हैं। 1) लेजर सिस्टम (सक्रियण स्रोत) और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम को सिंक्रनाइज़ करें। 2) लेजर क्रॉस सेक्शन को लक्ष्य क्षेत्र और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्लेन दोनों के साथ संरेखित करें। 3) पीएफसीएनडी इमेजिंग (यानी, फ्रेमरेट, पल्स वेवफॉर्म, आदि) के लिए उचित अल्ट्रासाउंड इमेजिंग पैरामीटर समायोजित करें।

पीएफसीएनडी के ऑप्टिकल सक्रियण में ध्वनिक रूप से सक्रिय लोगों पर एक ध्यान देने योग्य लाभ है कि यह ध्वनिक हस्तक्षेप से बच सकता है जो समय में इसके पुन: समेकन चरण को देखते हुए अल्ट्रासाउंड छवि की गुणवत्ता को काफी कम कर देता है। हालांकि, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम के साथ लेजर सिस्टम को स्थानिक और अस्थायी रूप से एकीकृत और संरेखित करना चुनौतीपूर्ण है। 3 डी मुद्रित धारक का उपयोग दोहराने योग्य और नियंत्रित प्रकाश वितरण की अनुमति देता है। पॉलीक्रिलामाइड फैंटम में शामिल करने में धातु की छड़ डालकर प्रकाश वितरण को भी समस्या निवारण किया जा सकता है क्योंकि धातु की छड़ को प्रकाश वितरण को इंगित करने के लिए फोटोएकोस्टिक कंट्रास्ट का उत्पादन करना चाहिए। टेम्पोरल सिंक्रनाइज़ेशन को पहले से विकसित प्लेटफॉर्म20 का निर्माण करके हासिल किया गया था, जो उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के साथ वेरासोनिक्स इमेजिंग सिस्टम की पूर्ण प्रोग्रामेबिलिटी को रखते हुए लासिंग और इमेजिंग सिस्टम के सिंक्रनाइज़ेशन दोनों की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, कार्यक्रम वास्तविक समय पारंपरिक बी-मोड इमेजिंग और फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग प्रदान करता है ताकि समस्या निवारण और रुचि के क्षेत्र का पता लगाने में सहायता मिल सके जहां पीएफसीएनडी वितरित किए जाते हैं। हालांकि, इस सेटअप के लिए बाहरी नैनोसेकंड स्पंदित लेजर की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, हमारे ज्ञान के लिए, कुछ वाणिज्यिक प्रणालियां हैं जिनमें एकीकृत लेजर-अल्ट्रासाउंड इमेजिंग सिस्टम हैं जो पीएफसीएनडी इमेजिंग के लिए अनुमति दे सकते हैं जैसे, विजुअलसोनिक्स (वेवो एलएजेडआर, वेवो एलएजेडआर-एक्स, वेवो 3100, वेवो एफ 2), एंडेरा नेक्सस 128, और आईथेरामेडिकल (अंतर्दृष्टि 64, इनविजन 128, इनविजन 256-टीएफ, और इनविजन 512-इको)।

पीएफसीएनडी के वाष्पीकरण-पुन: संघनन व्यवहार की अल्ट्राफास्ट अल्ट्रासाउंड इमेजिंग मुख्य रूप से कम संवेदनशीलता से ग्रस्त है। जबकि छवि संवेदनशीलता वृद्धि के लिए सबसे आम समाधानों में मल्टी-फ्रेम कंपाउंडिंग शामिल है, वे तकनीकें फ्रेमरेट को नीचा दिखाने की उनकी अंतर्निहित विशेषता से सीमित हैं, क्योंकि पीएफसीएनडी इमेजिंग गति कलाकृतियों के लिए अत्यधिक कमजोर है जिसमें समय-अंतर प्रक्रिया शामिल है। हमारे प्रोटोकॉल में पल्स पोलैरिटी मॉड्यूलेशन प्रभावी रूप से पीएफसीएनडी इमेजिंग में इस समस्या को संबोधित करता है, वाष्पीकृत पीएफसीएनडी की ध्वनिक गतिशीलता का लाभ उठाकर अधिक डिस्क्रिमिनेबल और लंबे समय तक छवि रखने के लिए, जबकि अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को बिल्कुल प्रभावित नहीं करता है।

जबकि ओडीवी बार-बार वाष्पीकरण और फोटोएकोस्टिक कंट्रास्ट जैसी अनूठी क्षमताओं वाली बूंदों की अनुमति देता है, सक्रियण विधि में अल्ट्रासाउंड की तुलना में सीमित गहराई प्रवेश होता है। चूंकि प्रकाश प्रवेश सीमित है, यह अनुप्रयोगों को मुख्य रूप से सतही प्रक्रियाओं तक सीमित करता है जैसे कि सेंटिनल लिम्फ नोड बायोप्सी41 के प्रतिस्थापन। इस सीमा को संभावित रूप से कैथेटर आधारित प्रकाश वितरण प्रणालियों के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है, जिससे ऊतक में गहराई से सक्रियण की अनुमति मिलती है। चूंकि कंट्रास्ट ध्वनिक है, वाष्पीकरण एडीवी के बराबर गहराई पर चित्रित किया जा सकेगा। एक वैकल्पिक सक्रियण तकनीक चुंबकीय बूंद वाष्पीकरण हो सकती है, जिसमें लोहे के ऑक्साइड नैनोकणों जैसे चुंबकीय कंट्रास्ट एजेंटों को बूंद42 के भीतर समझाया जाता है। यह किसी भी गहराई पर वाष्पीकरण की अनुमति देगा।

भविष्य में, एक ही समय में पीएफसीएनडी की हाइपरेकोजेनिक प्रतिक्रिया को छवि और संशोधित करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की क्षमता का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है जहां पीएफसीएनडी की निगरानी और हेरफेर की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, लंबे समय तक पता लगाने योग्य समय औसत के लिए बड़ी संख्या में फ्रेम देकर सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की छवि गुणवत्ता में सुधार कर सकता है। इसके अलावा, पीएफसीएनडी के अधिक सटीक नियंत्रण में बीबीबी खोलने और दवा वितरण जैसे बबल-मध्यस्थता चिकित्सीय की दक्षता और सुरक्षा को बढ़ाने की क्षमता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को बीसीआरएफ-20-043 अनुदान के तहत स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 173 अल्ट्रासाउंड परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट्स नैनोड्रॉपलेट्स कंट्रास्ट एजेंट इमल्शन नैनोपार्टिकल फोटोएकोस्टिक चरण-परिवर्तन
ऑप्टिकल रूप से वाष्पीकृत परफ्लोरोकार्बन नैनोड्रॉपलेट्स का निर्माण और ध्वनिक मॉड्यूलेशन
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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S.… More

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

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