Summary
Optik olarak aktive edilmiş perflorokarbon nanodamlacıklar, vasküler sistem dışındaki görüntüleme uygulamalarında umut vaat etmektedir. Bu makale, bu parçacıkların nasıl sentezleneceğini, poliakrilamid hayaletlerinin çapraz bağlanacağını ve sinyallerini arttırmak için damlacıkların akustik olarak nasıl modüle edileceğini gösterecektir.
Abstract
Mikrokabarcıklar ultrasonda en sık kullanılan görüntüleme kontrast maddesidir. Bununla birlikte, büyüklüklerinden dolayı, vasküler bölmelerle sınırlıdırlar. Bu mikro kabarcıklar, ekstravazasyon için yeterince küçük olan ve daha sonra hedef bölgede akustik olarak tetiklenen perflorokarbon nanodamlacıklar (PFCnD'ler) olarak yoğunlaştırılabilir veya formüle edilebilir. Bu nanopartiküller, yakın kızılötesi organik boya veya nanopartiküller (örneğin, bakır sülfür nanopartikülleri veya altın nanopartiküller / nanoçubuklar) gibi bir optik emici dahil edilerek daha da geliştirilebilir. Optik olarak etiketlenmiş PFCnD'ler, optik damlacık buharlaştırma (ODV) olarak bilinen bir işlemde lazer ışınlaması yoluyla buharlaştırılabilir. Bu aktivasyon işlemi, tanısal görüntüleme için maksimum mekanik indeks eşiği altında akustik olarak buharlaştırılamayan yüksek kaynama noktalı perflorokarbon çekirdeklerin kullanılmasını sağlar. Daha yüksek kaynama noktası çekirdekleri, buharlaşmadan sonra yeniden yoğunlaşacak damlacıklarla sonuçlanır, bu da nanodamlacık formuna geri yoğuşmadan önce buharlaşmadan sonra kısa bir süre kontrast üreten PFCnD'lerin "yanıp sönmesine" neden olur. Bu işlem, talep üzerine kontrast üretmek için tekrarlanabilir, böylece hem optik hem de akustik modülasyon yoluyla arka planda serbest görüntüleme, çoklama, süper çözünürlük ve kontrast iyileştirme sağlar. Bu makale, prob sonikasyonunu kullanarak optik olarak tetiklenebilir, lipit kabuğu PFCnD'lerin nasıl sentezleneceğini, nanodamlacıkları karakterize etmek için poliakrilamid hayaletlerinin nasıl oluşturulacağını ve kontrastı iyileştirmek için ODV'den sonra PFCnD'lerin akustik olarak nasıl modüle edileceğini gösterecektir.
Introduction
Mikrokabarcıklar, yumuşak dokulara kıyasla biyouyumluluğu ve mükemmel ekojenitesi nedeniyle en yaygın ultrason kontrast maddesidir. Bu, onları kan akışını, organ tanımlamasını ve diğer uygulamaları görselleştirmek için değerli araçlar haline getirir1. Bununla birlikte, rezonans frekanslarına göre görüntüleme için onları istisnai kılan boyutları (1-10 μm), uygulamalarını vaskülatür2 ile sınırlar.
Bu sınırlama, sıvı bir perflorokarbon çekirdeğin etrafına yerleştirilmiş bir yüzey aktif maddeden oluşan nano-emülsiyonlar olan PFCnD'lerin gelişmesine yol açmıştır. Bu nanopartiküller 200 nm kadar küçük boyutlarda sentezlenebilir ve tümör vaskülatüründe bulunan "sızdıran" vaskülatür veya gözeneklerden ve açık fenestrasyonlardan yararlanmak için tasarlanmıştır. Bu bozulmalar tümöre bağımlı olsa da, bu geçirgenlik, tümör 3,4'e bağlı olarak nanopartiküllerin ~ 200 nm - 1.2 μm'den ekstravazasyonuna izin verir. İlk formlarında, bu parçacıklar ultrason kontrastı çok az üretir veya hiç üretmez. Buharlaşma üzerine - akustik veya optik olarak indüklenir - çekirdek faz sıvıdan gaza değişir, 5,6,7 çapında iki buçuk ila beş kat artışa neden olur ve fotoakustik ve ultrason kontrastı üretir. Akustik buharlaştırma en yaygın aktivasyon yöntemi olsa da, bu yaklaşım buharlaşmanın görüntülenmesini sınırlayan akustik eserler yaratır. Ek olarak, çoğu perflorokarbon,8'i buharlaştırmak için güvenlik eşiğinin ötesinde mekanik bir indekse sahip odaklanmış ultrason gerektirir. Bu, mikrokabarcıkların nanodamlacıklara yoğunlaştırılmasıyla sentezlenebilen daha düşük kaynama noktası PFCnD'lerin gelişmesine yol açmıştır9. Bununla birlikte, bu damlacıklar daha uçucudur ve kendiliğinden buharlaşmaya maruz kalır10.
Öte yandan, optik damlacık buharlaşması (ODV), nanopartiküller 11,12,13 veya boya 6,14,15 gibi bir optik tetikleyicinin eklenmesini gerektirir ve ANSI güvenlik sınırı 11 içindeki akıcılıkları kullanarak daha yüksek kaynama noktası perflorokarbonlarını buharlaştırabilir. Daha yüksek kaynama noktası çekirdekleriyle sentezlenen PFCnD'ler daha kararlıdır ve buharlaşmadan sonra yeniden yoğunlaşır, arka planda olmayan görüntüleme16, çoklama17 ve süper çözünürlüklü18'e izin verir. Bu tekniklerin en büyük sınırlamalarından biri, yüksek kaynama noktası PFCnD'lerin buharlaşmadan sonra sadece kısa bir zaman diliminde, milisaniye19 ölçeğinde ekojenik olması ve nispeten soluk olmasıdır. Bu sorun, tekrarlanan buharlaşmalar ve ortalamalar yoluyla hafifletilebilirken, damlacık sinyalinin algılanması ve ayrılması bir zorluk olmaya devam etmektedir.
Nabız inversiyonundan ilham alarak, ultrason görüntüleme nabzının fazını değiştirerek süre ve kontrast arttırılabilir19. Ultrason görüntüleme nabzını nadir faz (n-pulse) ile başlatarak, buharlaştırılmış PFCnD'lerin hem süresi hem de kontrastı artar. Buna karşılık, ultrason görüntüleme darbesini bir sıkıştırma fazı (p-darbesi) ile başlatmak, kontrastın azalmasına ve sürenin kısalmasına neden olur. Bu makalede, optik olarak tetiklenebilir perflorokarbon nanodamlacıkların, görüntülemede yaygın olarak kullanılan poliakrilamid hayaletlerin nasıl sentezleneceği açıklanacak ve akustik modülasyon yoluyla kontrast artışı ve gelişmiş sinyal ömrünün nasıl gösterileceği anlatılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Perflorokarbon nanodamlacık formülasyonu
- 10 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeyi kloroform ile durulayın ve 10 μL ve 1 mL gaz geçirmez cam şırıngayı kloroform ile yıkayın, tam şırınga hacmini tekrar tekrar aspire ederek ve toplam üç kez dışarı atarak.
DİKKAT: Kloroform uçucudur ve solunması halinde toksik olabilir. Bu çözücü ile yapılan tüm çalışmalar bir duman davlumbazında yapılmalıdır. - Şırıngaları kullanarak, yuvarlak tabanlı şişeye 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg / mL), 6.3 μL 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC, 25 mg / mL) ve 1 mL IR 1048 (kloroformda 1 mg / mL) ekleyin. Stokun kirlenmesini önlemek için lipitler / boya arasındaki şırıngaları temizlemeyi unutmayın.
NOT: Kızılötesi boyalar ışığa duyarlıdır ve loş koşullarda çalışma yapılmalı veya şişeler alüminyum folyo ile kaplanmalıdır. - Döner bir evaporatör kullanarak çözücüyü çıkarın. Çarpmayı önlemek için vakumun yavaşça 332 mbar'a ayarlandığından emin olun. 5 dakika sonra, çözeltiye girmiş olabilecek suyu çıkarmak için basıncı 42 mbar'a düşürün.
NOT: Lipit kek, 4 ° C'de parafilm ile kaplı yuvarlak tabanlı bir şişede gece boyunca saklanabilir. - Lipid kekini 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve sonikat veya vorteks içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca veya lipit kekinin tamamı askıya alınıp çözelti içinde çözülene kadar askıya alın. Çözeltiyi homojenize etmek için 2 dakika daha sonikat yapın.
- Çözeltiyi 7 mL'lik bir cam şişeye aktarın ve gaz geçirmez bir cam şırınga kullanarak 50 μL perfloroheksan eklemeden önce çözeltinin 5 dakika soğumasını sağlamak için şişeyi buzla dolu bir cam kaba yerleştirin. Şırıngayı şişeye dağıtmadan önce perfloroheksan ile durulamayı unutmayın.
- Lipitleri ve buz banyosunu içeren cam şişeyi prob sonicator muhafazasına yerleştirin ve prob ucunu miniscusun altına batırın. Sonikatör probunun kenarlarının cam şişenin dudağına temas etmediğinden emin olun.
- Prob, karışımı aşağıdaki ayarlarla sonikleştirin: Genlik 1, İşlem süresi: 20 s, Darbe-Açık: 1s, Darbe kapalı: 5s. Daha sonra aşağıdaki ayarlarda sonikat: Genlik: 50, İşlem süresi: 5 s, Darbe açma: 1 s, Darbe kapalı: 10 s.
- Nanodamlacık çözeltisini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve daha büyük damlacıkları (>1 μm) daha küçük damlacıklardan ayırmak için 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- Peleti atın ve süpernatantı başka bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatantı 3000 x g'da santrifüjleyerek 5 dakika boyunca yıkayarak çözeltideki tüm damlacıkları toplayın. Pelet yukarı ve aşağı pipetleyerek PFCnD'leri 1 mL PBS'de yeniden askıya alın ve ardından 1 dakika boyunca bir banyo sonikatöründe sonikasyon yapın.
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanarak damlacıkların boyutunu ölçün. Stok PFCnD'leri 100 kat seyreltin (990 μL PBS'de 10 μL PFCnD stoğu) ve ölçmeden önce PFCnD'leri dağıtmak için banyo sonikat. Temsili sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir.
- Nanopartikül izleme analizörünü kullanarak PFCnD'lerin konsantrasyonunu belirleyin (bkz. Konsantrasyonun doğru ölçümünü sağlamak için PFCnD'leri 100-1000 kat seyreltin. Protokol tipik olarak 1010 parçacık / mL mertebesinde bir konsantrasyonda damlacıklar verir.
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL ultrason kaplin jeli hazırlayın ve ~ 108 parçacık / mL çözeltisi yapmak için% 1 (v / v) veya 100 μL PFCnD ekleyin. Vorteks karıştırmak için çözüm. Kabarcıkları gidermek için karışımı 4000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
2. Poliakrilamid hayalet preparat
- 500 mL'lik bir vakum şişesini 400 mL deiyonize suyla doldurarak suyu degazdan arındırın, kauçuk bir mantarla kapatın ve şişeyi vakum hattına bağlayın. Vakum hattını açın ve şişenin altını banyo sonikatörüne batırın. 5 dakika boyunca veya hiçbir gaz kabarcığı oluşumu görünmeyene kadar sonikat.
- 5 mL gazdan arındırılmış suda 500 mg eriterek% 10 amonyum persülfat (APS) çözeltisi hazırlayın. Amonyum persülfat tamamen çözünmezse çözeltiyi yavaşça döndürün.
- Bir karıştırma plakası üzerinde karıştırma çubuğu bulunan 400 mL'lik bir beherde, 200 mL% 10 akrilamid çözeltisi oluşturmak için 150 mL gazdan arındırılmış su ve 50 mL% 40 (w / v) akrilamid çözeltisi ekleyin. Kabarcıklar sokmadan uygun karıştırmaya izin vermek için karışımı 200 rpm'de karıştırın.
DİKKAT: Akrilamid bir kanserojendir ve tüm çalışmalar, özellikle toz halinde akrilamid ile çalışıyorsanız, eldivenli bir duman başlığında yapılmalıdır. - 400 mg silika tartın ve% 0.2 (w / v) silika ve akrilamid çözeltisi oluşturmak için adım 2.3'ten% 10 akrilamid-bisakrilamid çözeltisine ekleyin.
DİKKAT: Solunduğunda silika kanserojen olabilir. Tartım da dahil olmak üzere tüm işler bir duman davlumbazında yapılmalıdır. - Plastik transfer pipetinin uçlarını keserek ve laboratuvar bandı ile kalıpta destekleyerek silindirik bir kapanıma sahip 58 mm x 58 mm x 78 mm kare bir kalıp hazırlayın. Bkz. Şekil 2.
- %0,1'lik son konsantrasyonda APS yapmak için beherin içine 2 mL'lik %10 APS çözeltisi ekleyin ve fantom çözeltisine 250 μL Tetrametilenidiamin (TEMED) ekleyin. Çözeltinin kısaca karıştırılmasına izin verin (bir dakikadan az).
- Çözeltiye hava kabarcıkları sokmamaya dikkat ederken, çözeltiyi kalıba hızlı bir şekilde dökün. Çözelti 10 dakika içinde polimerize olmalıdır. Bir laboratuvar spatulasının düz ucunu kalıbın kenarı etrafında çalıştırarak ve kalıbı ters çevirerek hayaleti çıkarın.
NOT: Bu hayaletler birden çok kez tekrar kullanılabilir ve suya batırılmalı ve 4 ° C'de saklanmalıdır.
3. Perflorokarbon nanodamlacık görüntüleme
- Darbeli lazer sistemini üretici talimatlarını izleyerek ~ 20 dakika boyunca açın ve ısıtın. Fiber optik demetinin lazer çıkışına düzgün bir şekilde bağlandığından ve iki bacağın fiber demet tutucusuna düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
- Ultrason görüntüleme sistemini açın, dizi görüntüleme dönüştürücüsünü (L11-4v) sisteme bağlayın ve görüntüleme düzlemini lazer kesiti ile hizalamak için dönüştürücüyü tutucu içinde sabitleyin.
- Lazer sisteminin darbe tekrarlama frekansını 10Hz'e ayarlayın ve enerjiyi ölçmek için fiber demetinin sonuna bir güç ölçer yerleştirin. Q-switch gecikmesini tahmini akıcılık 70 mJ/cm2 olana kadar ayarlayın.
DİKKAT: Lazer ateşlenirken uygun gözlükler giyilmeli ve lazer perdeler alanı kapatmalıdır. - Poliakrilamid fantomdaki kanallardan birini, 1 mL plastik kayma ucu şırıngası kullanarak ultrason jeli / PFCnD karışımı ile doldurun. Kanalın üst kısmını ultrason jeli ile serbestçe örtün ve 1 mL plastik kayma ucu şırıngası ile kabarcıkları çıkarın. Poliakrilamid fantomu Şekil 3'te gösterildiği gibi dönüştürücü ve fiber demeti altına yerleştirin.
- PFCnD'yi optik aktivasyonla senkronize olarak görüntülemek için20 yazılımına dayanan kombine lazer ultrason ve elastikiyet (CLUE) görüntüleme platformunu kullanın. Görüntüleme için Param yapısındaki genel kullanıcı tanımlı parametreleri değiştirin: başlangıç/bitiş derinliğini 0/40 mm, merkez frekansını 6,9 MHz ve dönüştürücü adını 'L11-4v' olarak ayarlayın.
- Yeni bir RunCase tanımlayın ve PFHnD'lerin tekrarlanan optik aktivasyonu/yoğuşması ve ABD görüntülemesi için bir modül dizisi tasarlayın. Bu, ultra hızlı görüntüleme (mUF), harici lazer (mExtLaser) ve boşta (mIdle) gibi önceden tanımlanmış modülleri listeleyerek yapılır.
- Hem n-pulse hem de p-pulse görüntüleme verilerini almak için mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF sıra kümesini iki kez tekrarlayın.
NOT: Her dizideki ilk mExtLaser modül, ExtLaser.Enable değeri 0 olarak ayarlanarak sahte lazer olarak ayarlanır ve lazer aktivasyonundan sonra arka plan ABD görüntüleri ile n/p-pulse US görüntüleri arasındaki süreyi en aza indirmek için 'mIdle' dahil edilir.
- Hem n-pulse hem de p-pulse görüntüleme verilerini almak için mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF sıra kümesini iki kez tekrarlayın.
- Geçerli çalıştırma durumunun modül sırasına yerleştirilen her modül için modül parametrelerini ayarlayın. Her modül parametresine, modül sırasındaki sırasına karşılık gelen dizine göre erişin. Modüller, burada ayarlanan modül parametreleri kullanıcı tarafından önceden tanımlanmış işlemleri yürütür.
- Harici lazer modüllerinde ExtLaser.QSdelay'i adım 3.3'te ayarlanan lazer Q-switch gecikme değerinin mikrosaniyeler cinsinden değerine ayarlayın. Bu modül, lazer sisteminin el feneri tetiğinin sönmesini bekler ve QSdelay'de belirtilen gecikmeden sonra Q-switch tetikleyicisi oluşturur.
- Ultra hızlı görüntüleme modülünde, Resource.numFrame'i 100'e, SeqControl.PRI'yi 200 (μs) olarak ayarlayın ve P-darbesi için TW.polarite'yi 1'e ve N-darbesi için -1'e ayarlayın (karşılık gelen darbe şekli için bkz . Bu modül, TW.polaritesinde belirtilen darbe tipi ile ultra hızlı 0 derecelik düzlemsel dalga iletecektir.
- Resource.numFrame'deki kare sayısı, SeqControl.PRI'nin darbe tekrarlama aralığı için 38,8 mm genişliğinde tam diyaframlı görüntüleme penceresi elde edin, ardından çevrimdışı işleme için verileri kaydedin.
- Boştayken modüldeki SeqControl.lastPRI_Module, Q-anahtarı gecikmesi, görüntüleme veri toplama süresi (20 ms) ve sinyalin hareket etmesi için 20 μs kenar boşluğu ile çıkarılan lazer darbeleri arasındaki süreye (100 ms) ayarlayın. Bu modül, görüntüleme verilerinin toplanmasının sonu ile bir sonraki lazer darbe uyarımı arasındaki zaman boşluğunu doldurmak için SeqControl.lastPRI_Module sistemi 'çalışma yok' durumunda tutar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PFCnD'lerin başarılı bir şekilde formüle edilmesi ve santrifüjlü olarak ayrılması, çapı 200-300 nm civarında damlacıklar vermelidir (Şekil 1A). Yanlış ayrılmış damlacıklar 1 μm civarında küçük zirveler gösterebilir. Bu çözeltiler, daha büyük damlacıkları parçalamak için daha fazla banyo sonikleştirilebilir. Ostwald olgunlaşması21,22 olarak bilinen bir süreçte birleşme ve / veya difüzyon nedeniyle damlacıkların boyutu zamanla artacaktır (Şekil 1B).
Görüntüleme darbesini manipüle ederek damlacıkların akustik modülasyonu, buharlaştırılmış PFCnD'lerin kontrastını iyileştirdi. Bu, ışınlanmış görüntülerin bitişik çerçeveleri çıkarılarak yeniden oluşturulan PFCnD görüntülerinde gösterilmiştir, böylece yalnızca buharlaştırılmış PFCnD'den dönen sinyal görülebilir ve sabit arka plan sinyali bastırılır. Kontrast, dairesel içerme alanının ortalama sinyalleri ile ortalama arka plan sinyali arasındaki farkın ortalama arka plan sinyaline oranı ile ölçülür. Arka plan sinyali, arka planın iki dikdörtgen ROI'sinden gelen ve inklüzyonlarla aynı derinlikte ve eşdeğer alanda bulunan sinyallerle tanımlanır. N-darbesinin dahil edilmesinden kaynaklanan kontrast, P-darbesinden yaklaşık 3.2 kat daha fazladır (yani,% 220 iyileşme) (Şekil 5).
Ters görüntüleme darbesi, PFCnD buharlaşmasından gelen sinyalin ömrünü de artırdı. Bu, arka plan sinyalini aşan dairesel dahil etme bölgesindeki piksellerin eşiklenmesiyle ölçülmüştür. Dahil etmede eşiğin üzerinde olan piksellerin yüzdesi hiperekoik alan (%) olarak tanımlandı. PFCnD'lerin zaman içindeki hiperekojenik davranışını incelemek için, her kare için hiperekoik alan hesaplanır ve ilk karenin hiperekoik alanı tarafından normalleştirilir ve daha sonra üstel bir bozunma modeline uyarlanır. Bu fonksiyon, PFCnD aktivasyonundan sonra hiperekoik alanın başlangıç alanının sadece% 10'una bozunması için gereken zaman aralığı olarak tanımlanan karakteristik bozunma süresini belirlemek için kullanıldı (Şekil 6a). Normalize hiperekoik alanın karakteristik bozunma süresi, N-pulse görüntülemede P-pulse ile karşılaştırıldığında 3.5 kat daha uzundur. Her N-pulse ve P-pulse görüntüleme için zaman içinde temsili B-modu diferansiyel görüntü kareleri Şekil 6b'de gösterilmiştir.
Şekil 1: PFCnD'lerin DLS boyut ölçümleri ve stabilite. (A) Sentezden sonra damlacıkların üç ölçümünden elde edilen ortalama damlacıkların boyut yoğunluğu dağılımı (ortalama PDI: 0.132± 0.016; ortalama Z-ortalaması: 259.3 ± 0.7 nm). (B) Sentezden 24 saat sonra alınan üç ölçümden elde edilen damlacıkların boyut yoğunluğu dağılımı ortalaması (ortalama PDI: 0,252± 0,061; ortalama Z-ortalaması: 322,5 ± 4,5 nm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Poliakrilamid kalıbının görüntüsü ve şeması. (A) Laboratuvar bandından ve plastik kaptan yapılmış kalıbın görüntüsü. (B) Kalıptan çıkarıldıktan sonra poliakrilamid fantomunun ölçümleri ile şematik. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Lazer darbe iletimi ve ultrason görüntülemenin bir şeması . (A) Montajın bileşenleri etiketlenir ve inklüzyon konumuna göre lazer ışını / ultrason görüntüleme düzlemi hizalaması gösterilmiştir. (B) Gerçek kurulumu gösteren bir resim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Simüle edilmiş ultrason görüntüleme nabzı. Dalga formları, 250 MHz ile örneklenen ultrason görüntüleme sistemi yazılımı tarafından simüle edilir. P-darbe ve N-darbenin dalga formu aynı merkez frekansı ve darbe genişliği ile üretilir, ancak 180 ° faz farkına sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kontrast ölçümü. N-pulse ve P-pulse için dahil etme alanının ortalama kontrast değeri, hata çubukları standart sapmayı temsil eder (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hiperekoik alanın ve temsili diferansiyel B-mod büyücülerin karakteristik bozunma eğrisi . (A) Aynı kesitte N-pulse ve P-pulse görüntüleme için zaman içinde PFCnD aktivasyonu ile indüklenen normalleştirilmiş hiperekoik alan. Noktalı çizgi, başlangıçtaki hiperekoik alanın% 10'unu gösterir. Takılı grafiğin noktalı çizgi ile kesiştiği zaman, karakteristik bozunma süresini temsil eder. (B) Görüntüler, dahil etme üzerine ortalanmış, 35 dinamik aralıklı dB ölçeğinde çizilmiş, kırpılmış bir ROI penceresini göstermektedir. Üst satır, P-darbesi tarafından görüntülenen yeniden yoğunlaşma davranışını gösterir ve alt satır N-darbesini gösterir. Sarı renkli kesikli çizgi, dahil etme alanını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Toplam Fantom Hacmi (mL) | 50 | 100 | 250 | 500 |
| DI su (mL) | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| %40 PA çözeltisi (mL) | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| Silika (mg) | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| %10 APS çözeltisi (μL) | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| TEMED (μL) | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
Tablo 1: Kalıp hacmine göre poliakrilamid fantom çapraz bağlama için reaktiflerin ve miktarların özeti. Bu tablo, kullanılan reaktiflerin ve birkaç ortak kalıp hacmine dayanan miktarların kısa bir değer özetini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prob sonikasyonu, PFCnD'leri imal etmek için nispeten basit ve öğrenmesi kolay bir yöntemdir. Dikkat edilmesi gereken birkaç adım vardır. Kloroform kullanıldığında, uçucu olduğu ve standart hava yer değiştirmeli pipetlerden "sızacağı" için pozitif yer değiştirmeli pipet veya cam şırıngaların kullanılması zorunludur. Ayrıca, pozitif bir yer değiştirme kullanılıyorsa, kloroform olarak uygun bir ucun kullanıldığından emin olun, bu da kirleticileri çözeltiye sokabilecek çoğu plastik ucu çözecektir. Perfloroheksan için pozitif deplasmanlı pipet veya cam şırınga da önerilir, çünkü hem uçucu hem de sudan daha yoğundur. Tipik olarak, uçuculuğun ve yüksek yoğunluğun bireysel etkileri, hava yer değiştirmeli pipetlerde önceden ıslatma ve sırasıyla pipet üzerinde ayarlanan ses seviyesini ayarlamak için bir ölçek kullanılarak azaltılabilir. Ancak her iki özelliğe de sahip olan perfloroheksan durumunda, uçuculuk doğru ağırlık ölçümleri elde etmeyi zorlaştıracak ve pozitif deplasmanlı pipet / cam şırıngayı en uygun seçenek haline getirecektir.
Çözeltiyi sondalamadan önce, sonikasyon sırasında perflorokarbonun kaynamasını önlemek için soğumasına izin vermek için lipit ve perflorokarbon çözeltisini bir buz banyosunda inkübe etmek önemlidir. Bu adım, perfloropentan gibi daha düşük kaynama perflorokarbonu için özellikle önemli olacaktır. Ayrıca, çözeltiyi sondalarken dikkatli olunmalıdır. Sonikasyon probu ucu suya batırılmalıdır, ancak uca zarar verebileceği ve şişeyi parçalayabileceğinden, lipit çözeltisini buz banyosuna boşaltabileceğinden, cam şişenin tabanına veya yanlarına temas etmemelidir.
PFCnD üretim protokolü birkaç küçük yolla uyarlanabilir. Adım 1.3'te döner bir evaporatör mevcut değilse, çözelti sabit bir azot gazı akışı ile kurutulabilir veya lipit kekini oluşturmak için gece boyunca bir vakum odasına yerleştirilebilir. Lipitlerle ilgili olarak, bu formülasyon, DSPE-PEG: DSPC'nin standart 1: 9 oranına kıyasla 9: 1 DSPE-PEG: DSPC oranını kullanır, çünkü daha küçük ve daha büyük boyutlu kararlı damlacıklar23 ile sonuçlanır. Bu formülasyon, DSPE-PEG'in küçük bir fraksiyonunu (~ 2 mol %) istenen moiety (örneğin, biotin, tiol, amin, vb.) ile işlevselleştirilmiş bir DSPE-PEG ile değiştirerek yüzey konjugasyonuna izin verecek şekilde uyarlanabilir.
Genel olarak, prob sonicators ticari olarak temin edilebilir, kullanımı nispeten basittir ve diğer yüksek kaynama noktası perflorokarbonlarına ve yüzey aktif madde formülasyonlarına kolayca uyarlanabilir, ancak önemli değişiklikler olmadan oda sıcaklığında gaz halinde olan perflorokarbon çekirdeklerle damlacıklar yapmak için kullanılamaz. Böyle bir modifikasyon, mikro kabarcıklar oluşturmak için prob sonikasyonunu kullanmak ve daha sonra mikro kabarcıkları damlacıklara yoğunlaştırmak için basıncı uygulamak ve sıcaklığı düşürmektir24. Bu yöntem, akustik olarak buharlaştırılabilir damlacıklar üretmenin akıllıca bir yolu olsa da, yoğuşmadan sonra ODV'yi sağlamak için mikro kabarcıklar içinde yeterince boya kapsüllemek zordur. Alternatif bir yaklaşım, boyayı (örneğin, Cy7.5) lipitlere konjuge etmek ve ODV özellikli düşük kaynama noktası PFCnDs25'e yoğunlaştırılabilen mikro kabarcıklar oluşturmaktır.
Prob sonikasyonu ayrıca nispeten kısa bir süre içinde yüksek konsantrasyonda nanodamlacıklar (~ 1010 damlacık / mL) üretir. Bununla birlikte, bu teknik, ekstravaze olacak nanodamlacıkların miktarını azaltacak büyük boyutlu bir dağılımla sonuçlanır. Bu, daha büyük damlacıkları gidermek için santrifüjlü filtreleme veya şırınga filtreleri ile iyileştirilebilirken, elde edilen PFCnD'ler, mikroakışkanlar kullanılarak sentezlenen veya ekstrüzyon26 ile filtrelenen damlacıklara kıyasla daha fazla polidispersite sergileyecektir. Prob sonikasyonunun bir başka dezavantajı, sonikasyon prob ucunun kaçınılmaz olarak sonikasyon sırasında kavitasyondan çukurlaşacağı ve periyodik olarak değiştirilmesi gerekeceğidir.
Damlacık oluşturmaya alternatif bir yaklaşım, damlacıkları düşük polidispersite indeksi (PDI) ile belirli bir boyuta uyarlamak için kullanılabilecek mikroakışkan cihazları kullanır. Bununla birlikte, bu cihazlar nispeten yavaş bir hızda damlacıklar üretir (~ 10 4-106 damlacık / s)26 ve adım emülsifikasyonu 27, akış odaklama cihazlarında uç akışı28,29 ve kademeli balıksırtı mikromikseri ile uzo etkisinin kullanılması gibi çeşitli gelişmeler olmuştur30 - Nano boyutlu damlacıklar üretmek hala zor olmaya devam ediyor. Ayrıca, bu teknik ticari olarak temin edilemez ve bu cihazların üretimi özel uzmanlık gerektirir.
Ticari olarak temin edilebilen diğer yöntemler arasında ekstrüzyon ve homojenizasyon bulunur. Ekstrüzyon, damlacıkları geçmek için membranları kullanır, bu da sonikasyona kıyasla daha dar bir boyut aralığına sahip nano boyutlu damlacıklarla sonuçlanır. Bununla birlikte, bu yöntem büyük ölçüde formülasyona bağımlıdır ve damlacık26'ya boya veya terapötik kargo dahil etmek zordur. Yüksek basınçlı homojenizasyon, ölçeklenebilir bir şekilde monodispers, nano ölçekli lipit parçacıkları üretmek için yüksek basınç ve kesme gerilmesi kullanan ticari olarak temin edilebilen homojenizatörlerden yararlanır31,32,33. Bu yöntem, yüksek ve düşük kaynama noktalı perflorokarbonlara sahip damlacıklar oluşturmak için uyarlanmıştır32,34. Damlacık formülasyon yöntemlerinin ve numune protokollerinin daha önemli bir incelemesi aşağıdaki derleme26'da bulunabilir.
Fantomlar, nanodamlacıkların in vitro performansını karakterize etmek için değerli bir araçtır. Bu protokolde, silika içeren poliakrilamid bazlı hayaletler kullanılmaktadır. Poliakrilamid fantomlarla ilgili en sık karşılaşılan sorunlar, yavaş polimerizasyon veya hiç polimerizasyon ile ilgili değildir. Yavaş polimerizasyon, daha az sorunlu olsa da, gömülü saçılmanın heterojen dağılımına yol açabilir. Bu sorunun en yaygın suçlusu, çapraz bağlamayı başlatan serbest radikallerin üretimini azaltan eski amonyum persülfat çözeltilerinin kullanılmasıdır. Bu, çözeltiyi taze hale getirerek veya bir haftadan daha eski hazırlanmış çözeltileri kullanmayarak kolayca ele alınabilir. Başka bir olasılık TEMED'in bozulmasıdır - bu sarı bir çökelti oluşumunda belirgin olacaktır. Diğer bir yaygın sorun, polimerize hayalette hava kabarcıklarının varlığıdır. Suyun gazdan uygun şekilde arındırılması ve aşırı yüzey ajitasyonunu önlemek için dikkatli bir şekilde kullanılması bu sorunu hafifletmelidir. Alternatif bir strateji, adım 2.5'ten sonra tüm çözümün gazını kesmek olacaktır. Bununla birlikte, bu, akrilamid varlığından dolayı bir duman davlumbazında yapılmalıdır.
Bu hayaletler, bireysel damlacık davranışını incelemek için kısıtlanmış damlacıkların davranışını görüntülemek için de mükemmeldir; bu, adım 2.4'te hayalete PFCnD'ler eklenerek yapılabilir. Ayrıca, çapraz bağlama kimyasal bir reaksiyondan kaynaklandığından, jelatin gibi bir üst kritik çözelti sıcaklığına dayanan fiziksel bir çapraz bağlamaya kıyasla nispeten az ısı üretilir. Bu, gömülü damlacıkların kendiliğinden buharlaşma olasılığını azaltır.
Fantomları sentezlemek için çeşitli yöntemler olsa da, poliakrilamid düşük akustik zayıflama35 ve optik absorpsiyon katsayısı36'ya sahip nispeten dayanıklı ve parçalanamayan bir hayalet üretir. Bu özellikler, nihai poliakrilamid çözeltisinin konsantrasyonunu ayarlayarak ve silika, cam boncuklar veya titanyum dioksit36 gibi hayaletin içine parçacıkların dahil edilmesiyle insan dokusunun akustik ve optik özelliklerini daha yakından taklit edecek şekilde ayarlanabilir. Ayrıca, fantomların mekanik özellikleri, polimer içeriğinin yüzdesini (yani akrilamid ve bis(akrilamid yüzdesi)) ve çapraz bağlayıcı yüzdesini (yani toplam polimer içeriğindeki bis(akrilamid yüzdesi)37) değiştirerek ayarlanabilir. Alternatif hayaletler agar38, jelatin39, polivinil alkol (PVA)40, vb. İçerir ancak bunlarla sınırlı değildir.
Aktif PFCnD dağılımının ve hiperekojenik dinamiklerin başarılı bir şekilde görüntülenmesi için kritik adımlar aşağıdaki gibidir. 1) Lazer sistemini (aktivasyon kaynağı) ve ultrason görüntüleme sistemini senkronize edin. 2) Lazer kesitini hem hedef bölge hem de ultrason görüntüleme düzlemi ile hizalayın. 3) Ultrason görüntüleme parametrelerini PFCnD görüntülemeye uygun olarak ayarlayın (yani, kare hızı, darbe dalga formu, vb.).
PFCnD'nin optik aktivasyonu, akustik olarak aktive edilenlere göre, zaman içinde yeniden yoğunlaşma aşamasını gözlemlerken ultrason görüntüsünün kalitesini büyük ölçüde düşüren akustik parazitten kaçınabilmesi için gözle görülür bir avantaja sahiptir. Bununla birlikte, lazer sistemini ultrason görüntüleme sistemi ile hem mekansal hem de geçici olarak entegre etmek ve hizalamak zordur. 3D baskılı tutucunun kullanılması, tekrarlanabilir ve kontrollü ışık dağıtımına izin verir. Işık dağıtımı, poliakrilamid fantomuna dahil edilmesine metal bir çubuk yerleştirilerek de sorun giderilebilir, çünkü metal çubuk ışık dağıtımını göstermek için fotoakustik kontrast üretmelidir. Zamansal senkronizasyon, Verasonics görüntüleme sisteminin tam programlanabilirliğini kullanıcı dostu bir arayüzle korurken, hem lasing hem de görüntüleme sisteminin senkronizasyonuna izin veren daha önce geliştirilmiş bir platform20 oluşturularak elde edildi. Ek olarak, program PFCnD'lerin dağıtıldığı ilgi alanının sorun giderilmesine ve konumlandırılmasına yardımcı olmak için gerçek zamanlı geleneksel B modu görüntüleme ve fotoakustik görüntüleme sağlar. Bununla birlikte, bu kurulum harici bir nanosaniye darbeli lazer gerektirir. Şu anda, bildiğimiz kadarıyla, PFCnD görüntülemeye izin verebilecek entegre lazer-ultrason görüntüleme sistemlerine sahip birkaç ticari sistem vardır, örneğin, Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 ve iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF ve inVision 512-echo).
PFCnD'nin buharlaşma-yoğuşma davranışının ultra hızlı ultrason görüntülemesi esas olarak düşük hassasiyetten muzdariptir. Görüntü hassasiyetini artırmaya yönelik en yaygın çözümler çok kareli birleştirmeyi içerirken, PFCnD görüntüleme, zaman farkı sürecini içerdiği için hareket artefaktları için oldukça savunmasız olduğundan, bu teknikler kare hızını düşürmenin doğal özellikleri ile sınırlıdır. Protokolümüzdeki darbe polarite modülasyonu, buharlaştırılmış PFCnD'lerin akustik dinamiklerini, zamansal çözünürlüğü hiç etkilemeden daha ayrımcı ve uzun süreli görüntüye sahip olmak için kullanarak PFCnD görüntülemede bu sorunu etkili bir şekilde ele almaktadır.
ODV, tekrarlanan buharlaşma ve fotoakustik kontrast gibi benzersiz özelliklere sahip damlacıklara izin verirken, aktivasyon yöntemi ultrasona kıyasla sınırlı derinlik penetrasyonuna sahiptir. Işık penetrasyonu sınırlı olduğundan, bu durum uygulamaları esas olarak sentinel lenf nodu biyopsisinin değiştirilmesi gibi yüzeysel prosedürlerle sınırlandırır41. Bu sınırlama potansiyel olarak kateter bazlı ışık dağıtım sistemlerinden atlanabilir ve dokuda derin aktivasyona izin verir. Kontrast akustik olduğundan, buharlaşma ADV ile karşılaştırılabilir derinlikte görüntülenebilecektir. Alternatif bir aktivasyon tekniği, demir oksit nanopartikülleri gibi manyetik kontrast maddelerin damlacık42 içinde kapsüllendiği manyetik damlacık buharlaşması olabilir. Bu, herhangi bir derinlikte buharlaşmaya izin verecektir.
Gelecekte, protokolümüzün PFCnD'nin hiperekojenik tepkisini aynı anda görüntüleme ve modüle etme yeteneği, PFCnD'nin izlenmesi ve manipülasyonunun gerekli olduğu çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Örneğin, daha uzun algılanabilir süre, ortalamaya daha fazla sayıda kare vererek süper çözünürlüklü görüntülemenin görüntü kalitesini iyileştirebilir. Ayrıca, PFCnD'nin daha hassas kontrolü, BBB açma ve ilaç dağıtımı gibi kabarcık aracılı terapötiklerin verimliliğini ve güvenliğini artırma potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Çalışma kısmen BCRF-20-043 hibesi altında Meme Kanseri Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
- Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
- Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
- Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
- Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
- Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
- Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
- Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
- Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
- Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
- Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
- Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
- Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
- Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
- Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
- Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
- Taylor, P.
- Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
- Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
- Jeong, W. -C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
- Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
- Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
- Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
- Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
- Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
- Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
- Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
- Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
- Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
- Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).
