Summary
Оптически активированные перфторуглеродные нанокапли показывают многообещающие результаты в приложениях визуализации за пределами сосудистой системы. В этой статье будет показано, как синтезировать эти частицы, сшивать полиакриламидные фантомы и модулировать капли акустически для усиления их сигнала.
Abstract
Микропузырьки являются наиболее часто используемым контрастным веществом для визуализации в ультразвуке. Однако из-за своих размеров они ограничены сосудистыми компартментами. Эти микропузырьки могут быть конденсированы или сформулированы в виде перфторуглеродных нанокапель (PFCnD), которые достаточно малы, чтобы экстравазироваться, а затем акустически запускаться в целевом месте. Эти наночастицы могут быть дополнительно усилены путем включения оптического поглотителя, такого как органический краситель ближнего инфракрасного диапазона или наночастицы (например, наночастицы сульфида меди или наночастицы золота / наностержни). Оптически помеченные PFCnD могут быть испарены с помощью лазерного облучения в процессе, известном как оптической капельной испарение (ODV). Этот процесс активации позволяет использовать перфторуглеродные сердечники с высокой температурой кипения, которые не могут быть акустически испарены при максимальном пороге механического индекса для диагностической визуализации. Сердечники с более высокой температурой кипения приводят к образованию капель, которые будут восстанавливаться после испарения, что приводит к «миганию» PFCnD, которые кратковременно производят контраст после испарения, прежде чем конденсироваться обратно в форму нанокаплей. Этот процесс может быть повторен для создания контраста по требованию, что позволяет получать фоновые изображения, мультиплексирование, сверхразрешение и усиление контрастности с помощью оптической и акустической модуляции. В этой статье будет показано, как синтезировать оптически активируемые PFCnD липидной оболочки с использованием зондовой обработки ультразвуком, создавать полиакриламидные фантомы для характеристики нанокаплей и акустически модулировать PFCnD после ODV для улучшения контраста.
Introduction
Микропузырьки являются наиболее распространенным ультразвуковым контрастным веществом благодаря своей биосовместимости и отличной эхогенности по сравнению с мягкими тканями. Это делает их ценными инструментами для визуализации кровотока, разграничения органов и других приложений1. Однако их размер (1-10 мкм), что делает их исключительными для визуализации на основе их резонансной частоты, ограничивает их применение сосудистой системой2.
Это ограничение привело к разработке PFCnD, которые представляют собой наноэмульсии, состоящие из поверхностно-активного вещества, заключенного вокруг жидкого перфторуглеродного ядра. Эти наночастицы могут быть синтезированы при размерах до 200 нм и предназначены для использования «протекающих» сосудов или пор и открытых фенестрации, обнаруженных в сосудистой системе опухоли. Хотя эти нарушения зависят от опухоли, эта проницаемость позволяет экстравазировать наночастицы от ~ 200 нм до 1,2 мкм в зависимости от опухоли 3,4. В своей первоначальной форме эти частицы практически не производят ультразвукового контраста. При испарении - индуцированном акустически или оптически - фаза ядра изменяется из жидкой в газообразную, вызывая двукратное- пятикратное увеличение диаметра 5,6,7 и создавая фотоакустический и ультразвуковой контраст. Хотя акустическая испарение является наиболее распространенным методом активации, этот подход создает акустические артефакты, которые ограничивают визуализацию испарения. Кроме того, большинство перфторуглеродов требуют сфокусированного ультразвука с механическим индексом, превышающим порог безопасности для испарения8. Это привело к разработке PFCnD с более низкой температурой кипения, которые могут быть синтезированы путем конденсации микропузырьков в нанокапли9. Однако эти капли более летучи и подвержены спонтанному испарению10.
Оптическая капельная испарение (ODV), с другой стороны, требует добавления оптического триггера, такого как наночастицы11,12,13 или краситель 6,14,15, и может испарять перфторуглероды с более высокой температурой кипения с использованием флюенсов в пределах предела безопасностиANSI 11. PFCnD, синтезированные с ядрами с более высокой температурой кипения, более стабильны и будут восстанавливаться после испарения, что позволяет получать фоновые изображения16, мультиплексирование17 и сверхвысокое разрешение18. Одним из основных ограничений этих методов является тот факт, что PFCnD с высокой температурой кипения являются эхогенными после испарения только в течение короткого периода времени, в масштабемиллисекунд 19, и являются относительно слабыми. Хотя эта проблема может быть смягчена путем повторных испарений и усреднения, обнаружение и разделение капельного сигнала остается проблемой.
Черпая вдохновение из инверсии импульса, продолжительность и контраст могут быть увеличены путем изменения фазы ультразвукового импульсавизуализации 19. При запуске импульса ультразвуковой визуализации с фазы разрежения (n-импульса) увеличивается как продолжительность, так и контрастность испарившихся PFCnD. Напротив, запуск ультразвуковой визуализации импульса с фазой сжатия (p-импульс) приводит к снижению контрастности и сокращению продолжительности. В этой статье будет описано, как синтезировать оптически активируемые перфторуглеродные нанокапли, полиакриламидные фантомы, обычно используемые в визуализации, и продемонстрировать усиление контрастности и улучшенную долговечность сигнала с помощью акустической модуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Перфторуглеродная нанокаплевая формула
- Промыть хлороформом колбу круглого дна объемом 10 мл и промыть хлороформом газонепроницаемый стеклянный шприц объемом 10 мкл и 1 мл, многократно аспирируя весь объем шприца и выталкивая его в общей сложности три раза.
ВНИМАНИЕ: Хлороформ летучий и может быть токсичным при вдыхании. Все работы с этим растворителем должны выполняться в вытяжном шкафу. - Используя шприцы, добавьте 200 мкл DSPE-mPEG2000 (25 мг/мл), 6,3 мкл 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC, 25 мг/мл) и 1 мл IR 1048 (1 мг/мл в хлороформе) в колбу с круглым дном. Не забудьте очистить шприцы между липидами / красителем, чтобы предотвратить загрязнение запаса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасные красители чувствительны к свету, и работа должна выполняться в тусклых условиях или колбы должны быть покрыты алюминиевой фольгой. - Удалите растворитель с помощью ротационного испарителя. Убедитесь, что вакуум медленно регулируется до 332 мбар, чтобы предотвратить столкновение. Через 5 мин уменьшите давление до 42 мбар, чтобы удалить любую воду, которая могла попасть в раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Липидный пирог можно хранить в течение ночи в колбе с круглым дном, покрытой парапленкой при температуре 4 °C. - Приостановить липидный жмых в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и ультразвука или вихря при комнатной температуре в течение 5 мин или до тех пор, пока весь липидный пирог не будет суспендирован и растворен в растворе. Соникировать в течение дополнительных 2 мин для гомогенизации раствора.
- Переложите раствор в стеклянный флакон объемом 7 мл и поместите флакон в стеклянную посуду, наполненную льдом, чтобы дать раствору остыть в течение 5 мин, прежде чем добавить 50 мкл перфторгексана с использованием газонепроницаемого стеклянного шприца. Не забудьте промыть шприц перфторгексаном, прежде чем раздавать его во флакон.
- Поместите стеклянный флакон, содержащий липиды и ледяную ванну, в корпус зонда и погрузите наконечник зонда под миниск. Убедитесь, что боковые стороны зонда ультразвукового аппарата не касаются губы стеклянного флакона.
- Зонд обрабатывает смесь ультразвуком со следующими настройками: Амплитуда 1, Время процесса: 20 с, Импульс-Вкл: 1с, Импульс-выкл: 5с. Затем обработка ультразвуком при следующих настройках: Амплитуда: 50, Время процесса: 5 с, Импульс включения: 1 с, Импульс выключен: 10 с.
- Переложите раствор нанокаплета в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин, чтобы отделить более крупные капли (>1 мкм) от более мелких капель.
- Выбросьте гранулу и перенесите супернатант в другую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Супернатант промыть центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать все капли в растворе. Повторно суспендируют PFCnD в 1 мл PBS путем пипетирования гранулы вверх и вниз, а затем обрабатывают ультразвуком в анализаторе ванны в течение 1 мин.
- Измерьте размер капель с помощью динамического рассеяния света (DLS). Разбавите запас ПХКН в 100 раз (10 мкл запаса ПХКН в 990 мкл ПБС) и внесите ультразвук для диспергирования ПХКН перед измерением. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 1.
- Определение концентрации PFCnD с помощью анализатора отслеживания наночастиц (см. Таблицу материалов). Разбавьте PFCnD в 100-1000 раз, чтобы обеспечить точное измерение концентрации. Протокол обычно дает капли в концентрации порядка 1010 частиц/мл.
- Приготовьте 10 мл ультразвукового соединительного геля в центрифужной трубке объемом 50 мл и добавьте 1% (v/v) или 100 мкл PFCnD, чтобы получить раствор из ~108 частиц/мл. Вихрь раствора для смешивания. Центрифугируйте смесь при 4000 х г в течение 3 мин для удаления пузырьков.
2. Полиакриламидный фантомный препарат
- Разожгите воду, заполнив вакуумную колбу объемом 500 мл деионизированной водой объемом 400 мл, запечатайте резиновой пробкой и подключите колбу к вакуумной линии. Откройте вакуумную линию и погрузите дно колбы в анализатор ванны. Соник в течение 5 мин или до тех пор, пока не будет видно образования пузырьков газа.
- Готовят 10% раствор персульфата аммония (АФС), растворяя 500 мг в 5 мл дегазированной воды. Аккуратно закрутите раствор, если персульфат аммония не растворяется полностью.
- В стакан емкостью 400 мл с перемешивающим батончиком на перемешиваемой пластине добавляют 150 мл дегазированной воды и 50 мл 40% (мас./об.) раствора акриламид-бисакриламида с образованием 200 мл 10% раствора акриламид-бисакриламида. Перемешайте смесь со скоростью 200 об/мин, чтобы обеспечить правильное перемешивание без введения пузырьков.
ВНИМАНИЕ: Акриламид является канцерогеном, и все работы должны выполняться в вытяжном капюшоне с перчатками, особенно при работе с акриламидом в виде порошка. - Взвесьте 400 мг кремнезема и добавьте его в 10% раствор акриламида-бисакриламида со стадии 2.3 с образованием 0,2% (мас./об.) раствора кремнезема и акриламида.
ВНИМАНИЕ: Кремнезем при вдыхании может быть канцерогеном. Все работы, включая взвешивание, должны выполняться в вытяжном шкафу. - Подготовьте квадратную форму размером 58 мм x 58 мм x 78 мм с цилиндрическим включением, отрезав наконечники от пластиковой передаточной пипетки и подкрепив ее в форме лабораторной лентой. См. рисунок 2.
- Добавьте 2 мл 10% раствора APS в стакан, чтобы получить конечную концентрацию 0,1% APS и добавьте 250 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED) к фантомному раствору. Дайте раствору ненадолго перемешаться (менее мин).
- Быстро вылейте раствор в форму, при этом стараясь не вводить в раствор пузырьки воздуха. Раствор должен полимеризоваться в течение 10 мин. Удалите фантом, проведя плоским концом лабораторного шпателя по краю формы и перевернув форму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фантомы могут быть повторно использованы несколько раз и должны быть погружены в воду и храниться при 4 ° C.
3. Перфторуглеродная нанокаплетная визуализация
- Включите и прогрейте импульсную лазерную систему в течение ~ 20 минут, следуя инструкциям производителя. Убедитесь, что волоконно-оптический пучок правильно подключен к лазерному выходу, а две ножки правильно размещены в держателе пучка волокон.
- Включите систему ультразвуковой визуализации, подключите датчик массивной визуализации (L11-4v) к системе и зафиксируйте датчик внутри держателя, чтобы выровнять его плоскость изображения с лазерным сечением.
- Установите частоту повторения импульсов лазерной системы на 10 Гц и поместите измеритель мощности в конце пучка волокон для измерения энергии. Настройте задержку q-переключателя до тех пор, пока расчетная плавность не составит 70 мДж/см2.
ВНИМАНИЕ: При стрельбе лазером необходимо носить соответствующие очки, а лазерные шторы должны закрывать пространство. - Засыпьте один из каналов в полиакриламидном фантоме ультразвуковой смесью гель/PFCnD с помощью пластикового наконечника шприца объемом 1 мл. Обильно накройте верхнюю часть канала ультразвуковым гелем и удалите все пузырьки с помощью пластикового наконечника шприца объемом 1 мл. Поместите полиакриламидный фантом под датчик и пучок волокон, как показано на рисунке 3.
- Используйте комбинированную лазерную платформу визуализации ультразвука и эластичности (CLUE) на основе программного обеспечения20 для изображения PFCnD, синхронизированного с оптической активацией. Измените общие пользовательские параметры в структуре Param для визуализации: установите начальную / конечную глубину на 0/40 мм, центральную частоту на 6,9 МГц и имя преобразователя на «L11-4v».
- Определите новый RunCase и разработайте последовательность модулей для повторной оптической активации/реконденсации и визуализации PFHnD в США. Это делается путем перечисления предопределенных модулей, таких как сверхбыстрая визуализация (mUF), внешний лазер (mExtLaser) и неактивный (mIdle).
- Повторите набор последовательностей mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF дважды, чтобы получить данные визуализации как n-импульса, так и p-импульса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый модуль mExtLaser в каждой последовательности устанавливается как фиктивный лазер путем установки ExtLaser.Enable на 0, и 'mIdle' включен для минимизации времени между фоновыми изображениями США и n/p-импульсными изображениями США после лазерной активации.
- Повторите набор последовательностей mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF дважды, чтобы получить данные визуализации как n-импульса, так и p-импульса.
- Задайте параметры модуля для каждого модуля, помещенного в последовательность модуля текущего запуска. Доступ к каждому параметру модуля по индексу, соответствующему его порядку в последовательности модулей. Модули будут выполнять предопределенные операции с параметрами модуля, заданными пользователем здесь.
- Установите ExtLaser.QSdelay во внешних лазерных модулях на значение задержки лазерного Q-переключателя, настроенное на шаге 3.3, в микросекундах. Этот модуль ожидает срабатывания фонаря лазерной системы и генерирует триггер Q-переключателя после задержки, указанной в QSdelay.
- В модуле сверхбыстрой визуализации установите resource.numFrame равным 100, установите SeqControl.PRI значение 200 (μs) и установите TW.polarity равным 1 для P-импульса и -1 для N-импульса (см. рисунок 4 для соответствующей формы импульса). Этот модуль будет передавать сверхбыструю 0-градусную плоскую волну с типом импульса, указанным в TW.полярность.
- Получите окно изображения с полной диафрагмой шириной 38,8 мм для количества кадров в Resource.numFrame, интервал повторения импульсов SeqControl.PRI, а затем сохраните данные для автономной обработки.
- Установите SeqControl.lastPRI_Module в модуле простоя на промежуток времени между лазерными импульсами (100 мс), вычитаемый задержкой Q-переключателя, временем сбора данных изображения (20 мс) и запасом 20 мкс для прохождения сигнала. Этот модуль поддерживает систему в состоянии «без операции» в течение времени в SeqControl.lastPRI_Module , чтобы заполнить временной промежуток между окончанием сбора данных визуализации и следующим возбуждением лазерного импульса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная рецептура и центробежное разделение ПФУ должны давать капли диаметром около 200-300 нм (рисунок 1А). Неправильно разделенные капли могут показывать небольшие пики около 1 мкм. Эти растворы могут быть дополнительно обработаны ультразвуком для ванны, чтобы разбить более крупные капли. Размер капель будет увеличиваться с течением времени из-за объединения и/или диффузии в процессе, известном как созревание Оствальда21,22 (рисунок 1B).
Акустическая модуляция капель путем манипулирования импульсом изображения улучшала контрастность испарившихся PFCnD. Это было продемонстрировано на изображениях PFCnD, реконструированных путем вычитания смежных кадров изображений в форме луча таким образом, чтобы был виден только сигнал, возвращенный от испаренного PFCnD, и неподвижный фоновый сигнал подавлялся. Контрастность количественно определяется соотношением разницы между средними сигналами круговой области включения и средним фоновым сигналом над средним фоновым сигналом. Фоновый сигнал определяется сигналами от двух прямоугольных ROI фона, которые находятся на той же глубине и эквивалентной площади, что и включения. Контраст от включения для N-импульса примерно в 3,2 раза больше (т.е. улучшение на 220%), чем для Р-импульса (рисунок 5).
Обратный импульс визуализации также увеличил долговечность сигнала от испарения PFCnD. Это было количественно определено путем порогового значения пикселей в круговой области включения, которая превышает фоновый сигнал. Процент пикселей в включении, который был выше порогового значения, был определен как гиперэховая область (%). Чтобы изучить гиперэхогенное поведение PFCnD с течением времени, гиперэхогенная область вычисляется для каждого кадра и нормализуется гиперэхоической областью первого кадра, а затем устанавливается в экспоненциальную модель распада. Эта функция была использована для определения характеристического времени распада, определяемого как промежуток времени, необходимый для распада гиперэхогенной области после активации PFCnD только до 10 % от начальной площади (рисунок 6a). Характерное время распада нормализованной гиперэхогенной области до 3,5 раз больше при N-импульсной визуализации по сравнению с Р-импульсом. Репрезентативные B-режимные дифференциальные кадры изображения во времени для каждой N-импульсной и P-импульсной визуализации показаны на рисунке 6b.
Рисунок 1: Измерения размера DLS PFCnD и стабильности. (A) Распределение интенсивности размеров капель, усредненное из трех измерений капель после синтеза (средняя PDI: 0,132± 0,016; средняя Z-средняя: 259,3 ± 0,7 нм). (B) Распределение интенсивности размеров капель, усредненное из трех измерений, проведенных через 24 часа после синтеза (средний PDI: 0,252± 0,061; средний Z-средний: 322,5 ± 4,5 нм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображение и схема полиакриламидной формы. (А) Изображение пресс-формы, изготовленной из лабораторной ленты и пластикового контейнера. (B) Схема с измерениями полиакриламидного фантома после удаления из плесени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема доставки лазерного импульса и ультразвуковой визуализации. (A) Компоненты сборки маркируются и иллюстрируется выравнивание плоскости лазерного луча / ультразвуковой визуализации относительно положения включения. (B) Изображение, показывающее фактическую установку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Имитация пульса ультразвуковой визуализации. Формы сигналов моделируются программным обеспечением системы ультразвуковой визуализации, сэмплируемой на частоте 250 МГц. Формы сигналов P-импульса и N-импульса генерируются с одинаковой центральной частотой и шириной импульса, но имеют разность фаз 180°. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Измерение контрастности. Среднее значение контраста области включения для N-импульса и P-импульса, полосы погрешности представляют стандартное отклонение (n=3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Характеристическая кривая распада гиперэховой области и репрезентативные дифференциальные маги B-моды. (A) Нормализованная гиперэховая область, индуцированная активацией PFCnD с течением времени для N-импульсной и P-импульсной визуализации в одном и том же поперечном сечении. Пунктирная линия указывает на 10% начальной гиперэхоической области. Время, в которое установленный график пересекается с пунктирной линией, представляет собой характерное время распада. (B) Изображения показывают обрезанное окно ROI, центрированное на включении, построенное на шкале дБ с динамическим диапазоном 35. В верхней строке показано поведение реконденсации, отображаемое P-импульсом, а в нижней строке — N-импульс. Пунктирная линия желтого цвета указывает на область включения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Общий объем фантома (мл) | 50 | 100 | 250 | 500 |
| DI вода (мл) | 37.5 | 74.9 | 187.4 | 375 |
| 40% ПА раствор (мл) | 12.5 | 25.1 | 62.6 | 125 |
| Кремнезем (мг) | 100 | 200 | 500 | 1000 |
| 10% раствор АПС (мкл) | 500 | 1000 | 2500 | 5000 |
| ТЕМЕД (мкл) | 62.5 | 125 | 312.5 | 625 |
Таблица 1: Сводка реагентов и количеств фантомного сшивания полиакриламида в зависимости от объема плесени. В этой таблице приведена краткая сводка значений используемых реагентов и количеств, основанных на нескольких распространенных объемах пресс-формы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зондовая обработка ультразвуком является относительно простым и легким в освоении методом изготовления PFCnD. Есть несколько шагов, где необходимо соблюдать осторожность. При обращении с хлороформом крайне важно использовать пипетку с положительным смещением или стеклянные шприцы, так как она летучая и будет «просачиваться» из стандартных пипеток с воздушным вытеснением. Кроме того, при использовании положительного смещения убедитесь, что используется соответствующий наконечник, так как хлороформ растворит большинство пластиковых наконечников, которые могут ввести загрязняющие вещества в раствор. Для перфторгексана также рекомендуется пипетка с положительным смещением или стеклянный шприц, так как он летучий и плотный, чем вода. Как правило, индивидуальные эффекты летучести и высокой плотности могут быть уменьшены путем предварительного смачивания в пипетках с воздушным вытеснением и использования шкалы для регулировки объема, установленного на пипетке, соответственно. Но в случае перфторгексана, который обладает обоими свойствами, летучесть затруднит получение точных измерений веса, что делает пипетку с положительным смещением / стеклянный шприц наиболее жизнеспособным вариантом.
Перед зондовой обработкой раствора ультразвуком важно инкубировать липидный и перфторуглеродный раствор в ледяной ванне, чтобы он остыл, чтобы предотвратить кипячение перфторуглерода во время обработки ультразвуком. Этот шаг будет особенно важен для снижения кипения перфторуглерода, такого как перфторпентан. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при прощупывании раствора ультразвуком. Наконечник зонда для обработки ультразвуком должен быть погружен, но он не должен контактировать со дном или боковыми сторонами стеклянного флакона, так как это может повредить наконечник и разбить флакон, опорожнив липидный раствор в ледяную ванну.
Протокол изготовления PFCnD может быть адаптирован несколькими незначительными способами. Если роторный испаритель недоступен на стадии 1.3, раствор можно высушить устойчивым потоком газообразного азота или поместить в вакуумную камеру на ночь с образованием липидного пирога. Что касается липидов, эта формула использует соотношение 9:1 DSPE-PEG:DSPC по сравнению со стандартным соотношением 1:9 DSPE-PEG:DSPC, поскольку это приводит к меньшим и более стабильным каплям23. Этот состав может быть адаптирован для обеспечения поверхностной конъюгации путем замены небольшой доли (~2 моль%) DSPE-PEG функционализированным DSPE-PEG с желаемой частью (например, биотин, тиол, амин и т.д.).
В целом, зондовые ультразвуковые аппараты коммерчески доступны, относительно просты в использовании и могут быть легко адаптированы к другим перфторуглеродам с более высокой температурой кипения и составам поверхностно-активных веществ, но их нельзя использовать для изготовления капель с перфторуглеродными ядрами, которые являются газообразными при комнатной температуре без значительных модификаций. Одной из таких модификаций является использование зондовой обработки ультразвуком для создания микропузырьков, а затем применение давления и снижение температуры для конденсации микропузырьков в капли24. Хотя этот метод является умным способом получения акустически испаряемых капель, трудно инкапсулировать достаточное количество красителя в микропузырьки, чтобы обеспечить ODV после конденсации. Альтернативный подход заключается в сопряжении красителя (например, Cy7.5) с липидами и образовании микропузырьков, которые могут конденсироваться в ODV с низкой температурой кипения PFCnDs25.
Зондовая обработка ультразвуком также производит высокую концентрацию нанокапель (~10 10 капель / мл) за относительно короткий период времени. Однако этот метод приводит к большому распределению размеров, которое уменьшит количество нанокапель, которые будут экстравазироваться. Хотя это может быть улучшено с помощью центробежной фильтрации или шприцевых фильтров для удаления более крупных капель, полученные PFCnD будут демонстрировать большую полидисперсность по сравнению с каплями, синтезированными с использованием микрофлюидики или отфильтрованными через экструзию26. Еще одним недостатком зондовой обработки ультразвуком является то, что наконечник зонда для ультразвуковой обработки неизбежно станет точечным от кавитации во время обработки ультразвуком и должен будет периодически заменяться.
Альтернативный подход к созданию капель использует микрофлюидные устройства, которые могут быть использованы для адаптации капель к определенному размеру с низким индексом полидисперсности (PDI). Тем не менее, эти устройства производят капли с относительно медленной скоростью (~ 104-10 6 капель / с)26 и, хотя было несколько разработок, таких как ступенчатая эмульгация27, поток наконечника в устройствах фокусировки потока 28,29 и использование эффекта узо с микромикшером30 в шахматном порядке - генерация наноразмерных капель по-прежнему остается сложной задачей. Кроме того, этот метод не является коммерчески доступным, и изготовление этих устройств требует специализированных знаний.
Другие коммерчески доступные методы включают экструзию и гомогенизацию. Экструзия использует мембраны для пропускания капель, что приводит к наноразмерным каплям с более узким диапазоном размеров по сравнению с ультразвуком. Однако этот метод в значительной степени зависит от состава и является сложным для включения красителя или терапевтического груза в капельку26. Гомогенизация под высоким давлением использует коммерчески доступные гомогенизаторы, которые используют высокое давление и напряжение сдвига для генерации монодисперсных наноразмерных липидных частиц масштабируемым способом 31,32,33. Этот метод был адаптирован для создания капель с высокой и низкой температурой кипения перфторуглеродов32,34. Более содержательный обзор методов составления капель и протоколов отбора проб можно найти в следующем обзоре26.
Фантомы являются ценным инструментом для характеристики производительности нанокапрелей in vitro. В этом протоколе используются фантомы на основе полиакриламида с кремнеземом. Наиболее частые проблемы с полиакриламидными фантомами связаны с медленной полимеризацией или ее отсутствием. Медленная полимеризация, хотя и менее проблематична, может привести к гетерогенному распределению встроенного рассеяния. Наиболее распространенным виновником этого вопроса является использование старых растворов персульфата аммония, которые уменьшают выработку свободных радикалов, инициирующих сшивание. Это можно легко решить, сделав раствор свежим или не используя приготовленные растворы, которые старше одной недели. Другой возможностью является деградация TEMED - это будет проявляться в образовании желтого осадка. Еще одной распространенной проблемой является наличие пузырьков воздуха в полимеризованном фантоме. Правильная дегазация воды и осторожное обращение, чтобы избежать избыточного поверхностного перемешивания, должны смягчить эту проблему. Альтернативная стратегия заключается в дегазации всего решения после шага 2.5. Однако это должно быть выполнено в вытяжном шкафу из-за присутствия акриламида.
Эти фантомы также отлично подходят для визуализации поведения ограниченных капель для изучения поведения отдельных капель; это можно сделать, добавив PFCnD в фантом на шаге 2.4. Кроме того, поскольку сшивание происходит из-за химической реакции, образуется относительно мало тепла по сравнению с физическим сшиванием, основанным на верхней критической температуре раствора, такой как желатин. Это снижает вероятность спонтанного испарения внедренных капель.
Хотя существует множество методов синтеза фантомов, полиакриламид производит относительно прочный и неразлагаемый фантом, который обладает низким акустическим затуханием35 и коэффициентом оптического поглощения36. Эти свойства могут быть настроены таким образом, чтобы более точно имитировать акустические и оптические свойства тканей человека путем регулировки концентрации конечного раствора полиакриламида и путем включения частиц в фантом, таких как кремнезем, стеклянные шарики или диоксид титана36. Кроме того, механические свойства фантомов могут быть скорректированы путем изменения процента содержания полимера (т.е. процента акриламида и биса (акриламида)) и процента сшивающего (т.е. процента бис(акриламида) в общем содержании полимера)37. Альтернативные фантомы включают, но не ограничиваются ими, агар38, желатин39, поливиниловый спирт (ПВА)40 и др.
Критические шаги для успешной визуализации активированного распределения PFCnD и гиперэхогенной динамики заключаются в следующем. 1) Синхронизация лазерной системы (источника активации) и системы ультразвуковой визуализации. 2) Выровняйте поперечное сечение лазера как с целевой областью интереса, так и с плоскостью ультразвуковой визуализации. 3) Отрегулируйте параметры ультразвуковой визуализации в соответствии с визуализацией PFCnD (т. Е. Частота кадров, форма пульсового сигнала и т. Д.).
Оптическая активация PFCnD имеет заметное преимущество перед акустически активированными, поскольку она может уклоняться от акустических помех, которые резко ухудшают качество ультразвукового изображения при наблюдении его фазы реконденсации во времени. Тем не менее, сложно интегрировать и согласовать лазерную систему с системой ультразвуковой визуализации как пространственно, так и временно. Использование 3D-печатного держателя обеспечивает повторяемую и контролируемую подачу света. Подача света также может быть устранена путем вставки металлического стержня в включение в фантом полиакриламида, поскольку металлический стержень должен создавать фотоакустический контраст, чтобы указать на подачу света. Временная синхронизация была достигнута путем построения ранее разработанной платформы20, которая позволяет как синхронизировать лазерное соединение, так и систему визуализации, сохраняя при этом полную программируемость системы визуализации Verasonics с удобным интерфейсом. Кроме того, программа предоставляет обычную визуализацию в B-режиме и фотоакустическую визуализацию в режиме реального времени, чтобы помочь в устранении неполадок и поиске интересующей области, где распространяются PFCnD. Однако для этой установки требуется внешний наносекундный импульсный лазер. В настоящее время, насколько нам известно, существует несколько коммерческих систем, которые имеют интегрированные лазерно-ультразвуковые системы визуализации, которые могут позволить визуализацию PFCnD, например, Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 и iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF и inVision 512-echo).
Сверхбыстрая ультразвуковая визуализация испарительно-реконденсирующего поведения PFCnD страдает в основном низкой чувствительностью. Хотя наиболее распространенные решения для повышения чувствительности изображения включают многокадровое компаундирование, эти методы ограничены присущей им характеристикой снижения частоты кадров, поскольку изображение PFCnD очень уязвимо для артефактов движения, поскольку оно включает в себя дифференциальный процесс во времени. Импульсная модуляция полярности в нашем протоколе эффективно решает эту проблему в визуализации PFCnD, используя акустическую динамику испаренных PFCnD для получения более дискриминируемого и длительного изображения, не влияя при этом на временное разрешение вообще.
В то время как ODV допускает попадание капель с уникальными возможностями, такими как повторное вапоризация и фотоакустический контраст, метод активации имеет ограниченную глубину проникновения по сравнению с ультразвуком. Поскольку проникновение света ограничено, это ограничивает применение в основном поверхностными процедурами, такими как замена биопсии сторожевого лимфатического узла41. Это ограничение потенциально может быть обойдено с помощью систем доставки света на основе катетера, что позволяет активировать глубоко в ткани. Поскольку контраст является акустическим, испарение можно будет визуализировать на глубине, сопоставимой с ADV. Альтернативным методом активации может быть испарение магнитными каплями, при котором магнитные контрастные агенты, такие как наночастицы оксида железа, инкапсулируются внутри капли42. Это позволит проводить испарение на любой глубине.
В будущем способность нашего протокола одновременно отображать и модулировать гиперэхогенный ответ PFCnD может быть использована в нескольких приложениях, где требуется мониторинг и манипулирование PFCnD. Например, более длительное время обнаружения может улучшить качество изображения со сверхвысоким разрешением, давая большее количество кадров для среднего. Кроме того, более точный контроль PFCnD может повысить эффективность и безопасность терапевтических средств, опосредованных пузырьками, таких как открытие ГЭБ и доставка лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа была частично поддержана Фондом исследований рака молочной железы в рамках гранта BCRF-20-043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Persulfate (APS) | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880120C | Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical. |
| Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® | VWR | EM-1300 | acrylamide solution, lower concentration/ powder |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | Infrared dye |
| L11-4v | Verasonics | - | ultrasound linear array transducer |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | microtip for probe sonicator |
| N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | VWR | 97064-902 | Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | laser power meter |
| Perfluorohexane | Fluoromed | APF-60M | perfluorocarbon liquid |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablets | VWR | 97062-732 | Tablets used to make PBS |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | Probe sonicator |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | 288500 | 2-25 μm particle size |
| Tempest 30 | New wave research | - | Pulsed laser system |
| Vantage 128 | Verasonics | - | research ultrasound imaging system |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | Makes size measurements based on dynamic light scattering |
References
- Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
- Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
- Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
- Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
- Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
- Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
- Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
- Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
- Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
- Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
- Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
- Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
- Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
- Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
- Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
- Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
- Taylor, P.
- Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
- Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
- Jeong, W. -C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
- Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
- Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
- Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
- Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
- Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
- Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
- Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
- Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
- Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
- Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).
