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Bioengineering

Formulation et modulation acoustique de nanogouttelettes de perfluorocarbone vaporisées optiquement

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

Les nanogouttelettes de perfluorocarbone optiquement activées sont prometteuses dans les applications d’imagerie en dehors du système vasculaire. Cet article montrera comment synthétiser ces particules, réticuler les fantômes de polyacrylamide et moduler les gouttelettes acoustiquement pour améliorer leur signal.

Abstract

Les microbulles sont l’agent de contraste d’imagerie le plus couramment utilisé en échographie. Cependant, en raison de leur taille, ils sont limités aux compartiments vasculaires. Ces microbulles peuvent être condensées ou formulées sous forme de nanogouttelettes de perfluorocarbures (PFCnD) suffisamment petites pour extravaser puis être déclenchées acoustiquement sur le site cible. Ces nanoparticules peuvent être encore améliorées en incluant un absorbeur optique tel qu’un colorant organique proche infrarouge ou des nanoparticules (par exemple, des nanoparticules de sulfure de cuivre ou des nanoparticules d’or / nanotiges d’or). Les PFCnD marqués optiquement peuvent être vaporisés par irradiation laser dans un processus connu sous le nom de vaporisation optique de gouttelettes (ODV). Ce processus d’activation permet l’utilisation de noyaux perfluorés à point d’ébullition élevé, qui ne peuvent pas être vaporisés acoustiquement en dessous du seuil d’indice mécanique maximal pour l’imagerie diagnostique. Les noyaux à point d’ébullition plus élevé produisent des gouttelettes qui se recondensent après la vaporisation, ce qui entraîne des PFCnD « clignotants » qui produisent brièvement un contraste après la vaporisation avant de se condenser à nouveau sous forme de nanogouttelettes. Ce processus peut être répété pour produire un contraste à la demande, ce qui permet l’imagerie sans arrière-plan, le multiplexage, la super-résolution et l’amélioration du contraste grâce à la modulation optique et acoustique. Cet article montrera comment synthétiser des PFCnD à enveloppe lipidique déclenchables optiquement en utilisant la sonication de sonde, créer des fantômes de polyacrylamide pour caractériser les nanogouttelettes et moduler acoustiquement les PFCnD après ODV pour améliorer le contraste.

Introduction

Les microbulles sont l’agent de contraste ultrasonore le plus omniprésent en raison de leur biocompatibilité et de leur excellente échogénicité par rapport aux tissus mous. Cela en fait des outils précieux pour visualiser le flux sanguin, la délimitation des organes et d’autres applications1. Cependant, leur taille (1-10 μm), ce qui les rend exceptionnels pour l’imagerie basée sur leur fréquence de résonance, limite leurs applications au système vasculaire2.

Cette limitation a conduit au développement des PFCnD, qui sont des nano-émulsions composées d’un tensioactif enfermé autour d’un noyau de perfluorocarbone liquide. Ces nanoparticules peuvent être synthétisées à des tailles aussi petites que 200 nm et sont conçues pour tirer parti du système vasculaire ou des pores « perméables » et des fenestrations ouvertes trouvées dans le système vasculaire tumoral. Bien que ces perturbations soient dépendantes de la tumeur, cette perméabilité permet une extravasation des nanoparticules de ~200 nm à 1,2 μm selon la tumeur 3,4. Dans leur forme initiale, ces particules produisent peu ou pas de contraste ultrasonore. Lors de la vaporisation - induite acoustiquement ou optiquement - la phase centrale passe du liquide au gaz, induisant une augmentation de deux fois et demie à cinq du diamètre 5,6,7 et générant un contraste photoacoustique et ultrasonore. Bien que la vaporisation acoustique soit la méthode d’activation la plus courante, cette approche crée des artefacts acoustiques qui limitent l’imagerie de la vaporisation. De plus, la plupart des hydrocarbures perfluorés nécessitent des ultrasons focalisés avec un indice mécanique au-delà du seuil de sécurité pour se vaporiser8. Cela a conduit au développement de PFCnD à point d’ébullition inférieur, qui peuvent être synthétisés en condensant des microbulles en nanogouttelettes9. Cependant, ces gouttelettes sont plus volatiles et sujettes à une vaporisation spontanée10.

La vaporisation optique par gouttelettes (ODV), en revanche, nécessite l’ajout d’un déclencheur optique tel que les nanoparticules 11,12,13 ou le colorant 6,14,15 et peut vaporiser des perfluorocarbones à point d’ébullition plus élevé en utilisant des fluences dans la limite de sécurité ANSI 11. Les PFCnD synthétisés avec des noyaux à point d’ébullition plus élevé sont plus stables et se recondensent après vaporisation, ce qui permet une imagerie sans arrière-plan16, un multiplexage 17 et une super-résolution18. L’une des principales limites de ces techniques est le fait que les PFCnD à point d’ébullition élevé sont échogènes après vaporisation pendant une courte période, à l’échelle de millisecondes19, et sont relativement faibles. Bien que ce problème puisse être atténué par des vaporisations répétées et la moyenne, la détection et la séparation du signal des gouttelettes restent un défi.

En s’inspirant de l’inversion d’impulsion, la durée et le contraste peuvent être améliorés en modifiant la phase de l’impulsion d’imagerie ultrasonore19. En démarrant l’impulsion d’imagerie ultrasonore avec une phase de raréfaction (n-pulse), la durée et le contraste des PFCnDs vaporisés augmentent. En revanche, le démarrage de l’impulsion d’imagerie ultrasonore avec une phase de compression (p-pulse) entraîne une réduction du contraste et une durée plus courte. Cet article décrira comment synthétiser des nanogouttelettes de perfluorocarbone déclenchables optiquement, des fantômes de polyacrylamide couramment utilisés en imagerie, et démontrera l’amélioration du contraste et la longévité du signal grâce à la modulation acoustique.

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Protocol

1. Formulation de nanogouttelettes de fluorocarbone

  1. Rincer une fiole à fond rond de 10 ml avec du chloroforme et laver une seringue en verre étanche aux gaz de 10 μL et 1 mL avec du chloroforme en aspirant à plusieurs reprises le volume complet de la seringue et en l’expulsant trois fois au total.
    ATTENTION : Le chloroforme est volatil et peut être toxique en cas d’inhalation. Tous les travaux avec ce solvant doivent être effectués dans une hotte.
  2. À l’aide des seringues, ajouter 200 μL de DSPE-mPEG2000 (25 mg/mL), 6,3 μL de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC, 25 mg/mL) et 1 mL d’IR 1048 (1 mg/mL dans le chloroforme) dans la fiole à fond rond. N’oubliez pas de nettoyer les seringues entre les lipides / colorants pour éviter la contamination du stock.
    REMARQUE: Les colorants infrarouges sont sensibles à la lumière et le travail doit être effectué dans des conditions sombres ou les flacons doivent être recouverts de papier d’aluminium.
  3. Retirez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif. Assurez-vous que le vide est lentement ajusté à 332 mbar pour éviter les chocs. Après 5 min, réduire la pression à 42 mbar pour éliminer toute eau qui aurait pu pénétrer dans la solution.
    NOTE: Le gâteau lipidique peut être conservé pendant la nuit dans une fiole à fond rond recouverte de parafilm à 4 °C.
  4. Suspendre le gâteau lipidique dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et sonicater ou vortex à température ambiante pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que tout le gâteau lipidique ait été mis en suspension et dissous dans la solution. Sonicer pendant 2 minutes supplémentaires pour homogénéiser la solution.
  5. Transférer la solution dans un flacon en verre de 7 ml et placer le flacon dans un plat en verre rempli de glace pour laisser refroidir la solution pendant 5 minutes avant d’ajouter 50 μL de perfluorohexane à l’aide d’une seringue en verre étanche aux gaz. N’oubliez pas de rincer la seringue avec du perfluorohexane avant de la distribuer dans le flacon.
  6. Placez le flacon en verre contenant les lipides et le bain de glace dans l’enceinte du sonicateur de sonde et immergez l’extrémité de la sonde sous le miniscus. Assurez-vous que les côtés de la sonde du sonicateur ne touchent pas la lèvre du flacon en verre.
  7. Sonder soniquer le mélange avec les réglages suivants: Amplitude 1, Temps de traitement: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Puis sonicer aux réglages suivants : Amplitude : 50, Temps de traitement : 5 s, Pulse-on : 1 s, Pulse-off : 10 s.
  8. Transférer la solution de nanogouttelettes dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 3 minutes pour séparer les grosses gouttelettes (>1 μm) des gouttelettes plus petites.
  9. Jeter la pastille et transférer le surnageant dans un autre tube à centrifuger de 1,5 mL. Laver le surnageant par centrifugation à 3000 x g pendant 5 min pour enduire toutes les gouttelettes en solution. Remettez en suspension les PFCnDs dans 1 mL de PBS en pipetant la pastille de haut en bas, puis en soniquant dans un sonicateur de bain pendant 1 min.
  10. Mesurez la taille des gouttelettes à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Diluer les PFCnDs de base de 100 fois (10 μL de PFCnD dans 990 μL de PBS) et le soniquat de bain pour disperser les PFCnD avant de mesurer. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 1.
  11. Déterminer la concentration des PFCnDs à l’aide de l’analyseur de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux). Diluer les PFCnDs de 100 à 1000 fois pour assurer une mesure précise de la concentration. Le protocole produit généralement des gouttelettes à une concentration de l’ordre de 10à 10 particules/mL.
  12. Préparer 10 mL de gel de couplage à ultrasons dans un tube centrifuge de 50 mL et ajouter 1 % (v/v) ou 100 μL de PFCnDs pour obtenir une solution de ~108 particules/mL. Vortex la solution à mélanger. Centrifuger le mélange à 4000 x g pendant 3 min pour éliminer les bulles.

2. Préparation fantôme de polyacrylamide

  1. Dégazer l’eau en remplissant un ballon sous vide de 500 ml avec 400 ml d’eau désionisée, sceller avec un bouchon en caoutchouc et raccorder le ballon à la conduite de vide. Ouvrez la conduite de vide et immergez le fond de la fiole dans le sonicateur de bain. Sonicer pendant 5 minutes ou jusqu’à ce qu’aucune formation de bulles de gaz ne soit visible.
  2. Préparer une solution de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % en dissolvant 500 mg dans 5 mL d’eau dégazée. Remuer doucement la solution si le persulfate d’ammonium ne se dissout pas complètement.
  3. Dans un bécher de 400 mL muni d’une barre d’agitation sur une plaque d’agitation, ajouter 150 mL d’eau dégazée et 50 mL de solution acrylamide-bisacrylamide à 40 % (p/v) pour former 200 mL de solution d’acrylamide-bisacrylamide à 10 %. Remuer le mélange à 200 tr/min pour permettre le bon mélange sans introduire de bulles.
    ATTENTION: L’acrylamide est cancérogène et tout travail doit être effectué dans une hotte avec des gants, surtout si vous travaillez avec de l’acrylamide sous forme de poudre.
  4. Peser 400 mg de silice et l’ajouter à la solution d’acrylamide-bisacrylamide à 10 % de l’étape 2.3 pour former une solution à 0,2 % (p/v) de silice et d’acrylamide.
    ATTENTION : La silice lorsqu’elle est inhalée peut être cancérigène. Tous les travaux, y compris la pesée, doivent être effectués dans une hotte.
  5. Préparez un moule carré de 58 mm x 58 mm x 78 mm avec une inclusion cylindrique en coupant les extrémités d’une pipette de transfert en plastique et en la soutenant dans le moule avec du ruban de laboratoire. Voir la figure 2.
  6. Ajouter 2 mL de solution d’APS à 10 % dans le bécher pour obtenir une concentration finale de 0,1 % APS et ajouter 250 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) à la solution fantôme. Laisser la solution remuer brièvement (moins d’une minute).
  7. Versez rapidement la solution dans le moule, tout en veillant à ne pas introduire de bulles d’air dans la solution. La solution doit polymériser en 10 minutes. Retirez le fantôme en faisant passer l’extrémité plate d’une spatule de laboratoire autour du bord du moule et en inversant le moule.
    REMARQUE: Ces fantômes peuvent être réutilisés plusieurs fois et doivent être immergés dans l’eau et stockés à 4 ° C.

3. Imagerie des nanogouttelettes de fluorocarbone

  1. Allumez et réchauffez le système laser pulsé pendant ~20 minutes en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous que le faisceau de fibres optiques est correctement connecté à la sortie laser et que les deux pieds sont correctement placés dans le support du faisceau de fibres.
  2. Allumez le système d’imagerie par ultrasons, connectez le transducteur d’imagerie matricielle (L11-4v) au système et fixez le transducteur dans le support pour aligner son plan d’imagerie avec la section transversale laser.
  3. Réglez la fréquence de répétition des impulsions du système laser sur 10 Hz et placez un capteur de puissance à l’extrémité du faisceau de fibres pour mesurer l’énergie. Réglez le délai de l’interrupteur q jusqu’à ce que la fluence estimée soit de 70 mJ/cm2.
    ATTENTION: Des lunettes appropriées doivent être portées lors du tir du laser et des rideaux laser doivent entourer l’espace.
  4. Remplissez l’un des canaux du fantôme de polyacrylamide avec le mélange gel à ultrasons/PFCnD à l’aide d’une seringue à embout coulissant en plastique de 1 mL. Couvrir généreusement le haut du canal avec un gel à ultrasons et enlever les bulles avec une seringue à embout en plastique de 1 mL. Placez le fantôme de polyacrylamide sous le transducteur et le faisceau de fibres, comme illustré à la Figure 3.
  5. Utilisez la plate-forme d’imagerie combinée à ultrasons laser et élasticité (CLUE) basée sur le logiciel20 pour imager PFCnD synchronisée avec activation optique. Modifiez les paramètres généraux définis par l’utilisateur dans la structure Param pour l’imagerie : définissez la profondeur de début/fin sur 0/40 mm, la fréquence centrale sur 6,9 MHz et le nom du transducteur sur « L11-4v ».
  6. Définir un nouveau RunCase et concevoir une séquence de modules pour l’activation/recondensation optique répétée et l’imagerie US des PFHnD. Cela se fait en répertoriant les modules prédéfinis tels que l’imagerie ultrarapide (mUF), le laser externe (mExtLaser) et le ralenti (mIdle).
    1. Répétez deux fois le jeu de séquences mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF pour acquérir les données d’imagerie à n impulsions et p.
      REMARQUE: Le premier module mExtLaser de chaque séquence est défini comme un laser simulé en réglant ExtLaser.Enable sur 0 et le 'mIdle' est inclus pour minimiser le temps entre les images US d’arrière-plan et les images US n/p-pulse après l’activation laser.
  7. Définissez les paramètres de module pour chaque module placé dans la séquence de module du cas d’exécution en cours. Accédez à chaque paramètre de module par index correspondant à son ordre dans la séquence du module. Les modules exécuteront des opérations prédéfinies avec les paramètres de module définis par l’utilisateur ici.
    1. Réglez ExtLaser.QSdelay dans les modules laser externes sur la valeur du retard du Q-switch laser réglé à l’étape 3.3, en microsecondes. Ce module attend que le déclenchement de la lampe de poche du système laser s’éteigne et génère le déclenchement Q-switch après le délai spécifié dans QSdelay.
    2. Dans le module d’imagerie ultrarapide, définissez Resource.numFrame sur 100, SeqControl.PRI sur 200 (μs) et définissez TW.polarity sur 1 pour l’impulsion P et -1 pour l’impulsion N (voir la Figure 4 pour la forme d’impulsion correspondante). Ce module transmettra une onde plane ultrarapide de 0 degré avec le type d’impulsion spécifié en polarité TW.
      1. Obtenez une fenêtre d’imagerie à pleine ouverture de 38,8 mm de large pour le nombre d’images dans Resource.numFrame, l’intervalle de répétition d’impulsions de SeqControl.PRI, puis enregistrez les données pour un traitement hors ligne.
    3. Réglez SeqControl.lastPRI_Module en module inactif sur la durée entre les impulsions laser (100 ms) soustraite par le retard du commutateur Q, le temps d’acquisition des données d’imagerie (20 ms) et une marge de 20 μs pour que le signal se déplace. Ce module maintient le système sous l’état « sans fonctionnement » pendant la durée de SeqControl.lastPRI_Module pour combler le laps de temps entre la fin de l’acquisition des données d’imagerie et la prochaine excitation d’impulsion laser.

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Representative Results

Une formulation réussie et une séparation centrifuge des PFCnD devraient produire des gouttelettes d’environ 200 à 300 nm de diamètre (Figure 1A). Des gouttelettes mal séparées peuvent montrer de petits pics autour de 1 μm. Ces solutions peuvent être davantage soniquées pour briser les plus grosses gouttelettes. La taille des gouttelettes augmentera avec le temps en raison de la coalescence et/ou de la diffusion dans un processus connu sous le nom de maturation d’Ostwald21,22 (Figure 1B).

La modulation acoustique des gouttelettes en manipulant l’impulsion d’imagerie a amélioré le contraste des PFCnD vaporisés. Cela a été démontré dans les images PFCnD reconstruites en soustrayant les images adjacentes des images formées par faisceau de sorte que seul le signal renvoyé par PFCnD vaporisé soit visible et que le signal de fond stationnaire soit supprimé. Le contraste est quantifié par le rapport de la différence entre les signaux moyens de la zone d’inclusion circulaire et le signal de fond moyen sur le signal de fond moyen. Le signal de fond est défini par les signaux de deux ROI rectangulaires de l’arrière-plan qui sont à la même profondeur et à la même surface que les inclusions. Le contraste avec l’inclusion de l’impulsion N est environ 3,2 fois plus important (c.-à-d. une amélioration de 220 %) que de l’impulsion P (figure 5).

L’impulsion d’imagerie inversée a également augmenté la longévité du signal de vaporisation PFCnD. Cela a été quantifié en seuillant les pixels dans la zone d’inclusion circulaire qui dépasse le signal de fond. Le pourcentage de pixels dans l’inclusion qui était au-dessus du seuil a été défini comme la zone hyperéchogène (%). Pour examiner le comportement hyperéchogène des PFCnD au fil du temps, la zone hyperéchogène est calculée pour chaque image et normalisée par la zone hyperéchogène de la première image, puis ajustée à un modèle de décroissance exponentielle. Cette fonction a été utilisée pour déterminer le temps de désintégration caractéristique, défini comme le laps de temps nécessaire pour que la zone hyperéchogène après l’activation de PFCnD se désintègre à seulement 10 % de la zone initiale (Figure 6a). Le temps de désintégration caractéristique de la zone hyperéchogène normalisée est jusqu’à 3,5 fois plus long en imagerie par impulsions N par rapport à l’impulsion P. La figure 6b montre des images différentielles représentatives en mode B dans le temps pour chaque imagerie à impulsions N et à impulsions P.

Figure 1
Figure 1 : Mesures de la taille DLS des PFCnDs et de la stabilité. (A) La distribution de l’intensité granulométrique des gouttelettes a été calculée en moyenne à partir de trois mesures de gouttelettes après synthèse (DJP moyenne : 0,132± 0,016 ; moyenne Z moyenne : 259,3 ± 0,7 nm). (B) La distribution de l’intensité granulométrique des gouttelettes a été calculée en moyenne à partir de trois mesures effectuées 24 heures après la synthèse (DJP moyenne : 0,252± 0,061 ; moyenne Z moyenne : 322,5 ± 4,5 nm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Image et schéma du moule en polyacrylamide. (A) Image du moule fabriqué à partir de ruban de laboratoire et du récipient en plastique. (B) Schéma avec mesures du fantôme de polyacrylamide après élimination de la moisissure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de l’émission d’impulsions laser et de l’imagerie par ultrasons. (A) Les composants de l’ensemble sont étiquetés et l’alignement du plan d’imagerie du faisceau laser / ultrasons par rapport à la position d’inclusion est illustré. (B) Une image montrant la configuration réelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Impulsion d’imagerie ultrasonore simulée. Les formes d’onde sont simulées par un logiciel de système d’imagerie par ultrasons, échantillonné par 250 MHz. La forme d’onde de l’impulsion P et de l’impulsion N est générée avec la même fréquence centrale et la même largeur d’impulsion, mais a une différence de phase de 180°. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Mesure du contraste. Valeur de contraste moyenne de la zone d’inclusion pour les impulsions N et P, les barres d’erreur représentent l’écart-type (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Courbe de désintégration caractéristique de la zone hyperéchogène et des mages représentatifs différentiels en mode B. (A) Zone hyperéchogène normalisée induite par l’activation de PFCnD au fil du temps pour l’imagerie par impulsions N et par impulsions P à la même section transversale. La ligne pointillée indique 10% de la zone hyperéchogène initiale. Le moment auquel la parcelle ajustée croise la ligne pointillée représente le temps de désintégration caractéristique. (B) Les images montrent une fenêtre de retour sur investissement recadrée centrée sur l’inclusion, tracée sur une échelle de dB avec une plage dynamique de 35. La rangée supérieure montre le comportement de recondensation imagé par l’impulsion P et la rangée inférieure montre l’impulsion N. La ligne pointillée de couleur jaune indique la zone d’inclusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Volume total de fantôme (mL) 50 100 250 500
Eau DI (mL) 37.5 74.9 187.4 375
Solution de PA à 40 % (mL) 12.5 25.1 62.6 125
Silice (mg) 100 200 500 1000
Solution d’APS à 10 % (μL) 500 1000 2500 5000
TEMED (μL) 62.5 125 312.5 625

Tableau 1 : Résumé des réactifs et des quantités pour la réticulation fantôme de polyacrylamide en fonction du volume de moule. Ce tableau fournit un résumé concis des valeurs des réactifs utilisés et des quantités basées sur plusieurs volumes de moules courants.

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Discussion

La sonication de sonde est une méthode relativement simple et facile à apprendre pour fabriquer des PFCnD. Il y a quelques étapes où il faut faire attention. Lors de la manipulation du chloroforme, il est impératif d’utiliser une pipette volumétrique ou des seringues en verre, car il est volatil et « fuira » des pipettes à déplacement d’air standard. De plus, si vous utilisez un déplacement positif, assurez-vous qu’une pointe appropriée est utilisée car le chloroforme dissoudra la plupart des embouts en plastique, ce qui peut introduire des contaminants dans la solution. Une pipette volumétrique ou une seringue en verre est également recommandée pour le perfluorohexane, car il est à la fois volatil et plus dense que l’eau. En règle générale, les effets individuels de la volatilité et de la densité élevée peuvent être réduits en prémouillant dans les pipettes à déplacement d’air et en utilisant une échelle pour ajuster le volume réglé sur la pipette, respectivement. Mais dans le cas du perfluorohexane qui possède les deux propriétés, la volatilité rendra difficile l’obtention de mesures de poids précises, ce qui fera d’une pipette / seringue en verre à déplacement positif l’option la plus viable.

Avant de sonder la solution, il est important d’incuber la solution lipidique et perfluorocarbonée dans un bain de glace pour lui permettre de refroidir et éviter de faire bouillir le perfluorocarbone pendant la sonication. Cette étape sera particulièrement importante pour les perfluorocarbones à faible point d’ébullition tels que le perfluoropentane. En outre, des précautions doivent être prises lors de la sonde de la solution. L’embout de la sonde de sonication doit être immergé, mais il ne doit pas entrer en contact avec le fond ou les côtés du flacon en verre car il pourrait endommager l’embout et briser le flacon, vidant la solution lipidique dans le bain de glace.

Le protocole de fabrication PFCnD peut être adapté de quelques façons mineures. Si un évaporateur rotatif n’est pas disponible à l’étape 1.3, la solution peut être séchée avec un flux constant d’azote gazeux ou être placée dans une chambre à vide pendant une nuit pour former le gâteau lipidique. En ce qui concerne les lipides, cette formulation utilise un rapport de 9:1 de DSPE-PEG:DSPC par rapport au rapport standard de 1:9 de DSPE-PEG:DSPC, car il en résulte des gouttelettes plus petites et plus stables23. Cette formulation peut être adaptée pour permettre la conjugaison de surface en remplaçant une petite fraction (~2 mol %) du DSPE-PEG par un DSPE-PEG fonctionnalisé avec la fraction souhaitée (par exemple, biotine, thiol, amine, etc.).

En général, les sondes sont disponibles dans le commerce, relativement simples à utiliser et peuvent être facilement adaptés à d’autres perfluorocarbones et formulations de tensioactifs à point d’ébullition plus élevé, mais ils ne peuvent pas être utilisés pour fabriquer des gouttelettes avec des noyaux de perfluorocarbures gazeux à température ambiante sans modifications significatives. L’une de ces modifications consiste à utiliser la sonde pour créer des microbulles, puis à appliquer une pression et à réduire la température pour condenser les microbulles en gouttelettes24. Bien que cette méthode soit un moyen astucieux de générer des gouttelettes acoustiquement vaporisables, il est difficile d’encapsuler suffisamment de colorant dans les microbulles pour assurer l’ODV après condensation. Une autre approche consiste à conjuguer le colorant (p. ex., Cy7.5) aux lipides et à former des microbulles qui peuvent être condensées en PFCnDs25 à bas point d’ébullition compatible ODV.

La sonication de sonde produit également une concentration élevée de nanogouttelettes (~1010 gouttelettes / mL) dans un laps de temps relativement court. Cependant, cette technique se traduit par une grande distribution de taille qui réduira la quantité de nanogouttelettes qui extravaseront. Bien que cela puisse être amélioré par un filtrage centrifuge ou des filtres à seringues pour éliminer les plus grosses gouttelettes, les PFCnD résultants présenteront une plus grande polydispersité par rapport aux gouttelettes synthétisées à l’aide de la microfluidique ou filtrées par extrusion26. Un autre inconvénient de la sonication de sonde est que la pointe de la sonde de sonication sera inévitablement piquée par cavitation pendant la sonication et devra être remplacée périodiquement.

Une approche alternative à la création de gouttelettes utilise des dispositifs microfluidiques qui peuvent être utilisés pour adapter les gouttelettes à une taille spécifique avec un faible indice de polydispersité (PDI). Cependant, ces dispositifs produisent des gouttelettes à un rythme relativement lent (~10 4-106 gouttelettes/s)26 et, bien qu’il y ait eu plusieurs développements tels que l’émulsification par étapes 27, l’écoulement de pointe dans les dispositifs de focalisation de flux28,29 et l’utilisation de l’effet ouzo avec un micromélangeur à chevrons décalé30 - La génération de gouttelettes de taille nanométrique reste encore difficile. De plus, cette technique n’est pas disponible dans le commerce et la fabrication de ces dispositifs nécessite une expertise spécialisée.

D’autres méthodes disponibles dans le commerce comprennent l’extrusion et l’homogénéisation. L’extrusion utilise des membranes pour faire passer des gouttelettes, ce qui donne des gouttelettes de taille nanométrique avec une gamme de taille plus étroite par rapport à la sonication. Cependant, cette méthode dépend fortement de la formulation et il est difficile d’incorporer un colorant ou une cargaison thérapeutique dans la gouttelette26. L’homogénéisation à haute pression utilise des homogénéisateurs disponibles dans le commerce qui utilisent une pression élevée et une contrainte de cisaillement élevées pour générer des particules lipidiques monodispersées à l’échelle nanométrique de manière évolutive31,32,33. Cette méthode a été adaptée pour créer des gouttelettes avec des perfluorocarbures à point d’ébullition élevé et bas32,34. Un examen plus approfondi des méthodes de formulation des gouttelettes et des protocoles d’échantillonnage peut être trouvé dans l’examen suivant26.

Les fantômes sont un outil précieux pour caractériser la performance des nanogouttelettes in vitro. Dans ce protocole, des fantômes à base de polyacrylamide avec de la silice sont utilisés. Les problèmes les plus fréquents avec les fantômes de polyacrylamide sont liés à une polymérisation lente ou inexistante. Une polymérisation lente, bien que moins problématique, peut conduire à une distribution hétérogène de la diffusion intégrée. Le coupable le plus courant de ce problème est l’utilisation d’anciennes solutions de persulfate d’ammonium qui réduisent la production de radicaux libres qui initient la réticulation. Cela peut être facilement résolu en rendant la solution fraîche ou en n’utilisant pas de solutions préparées datant de plus d’une semaine. Une autre possibilité est la dégradation de TEMED - cela sera évident dans la formation d’un précipité jaune. Un autre problème courant est la présence de bulles d’air dans le fantôme polymérisé. Un dégazage adéquat de l’eau et une manipulation prudente pour éviter une agitation excessive de la surface devraient atténuer ce problème. Une autre stratégie consisterait à dégazer l’ensemble de la solution après l’étape 2.5. Cependant, cela doit être effectué dans une hotte en raison de la présence d’acrylamide.

Ces fantômes sont également excellents pour imager le comportement des gouttelettes restreintes afin d’étudier le comportement individuel des gouttelettes; cela peut être fait en ajoutant PFCnDs dans le fantôme à l’étape 2.4. De plus, comme la réticulation est due à une réaction chimique, relativement peu de chaleur est produite par rapport à une réticulation physique basée sur une température de solution critique supérieure comme la gélatine. Cela réduit la probabilité de vaporisation spontanée des gouttelettes incrustées.

Bien qu’il existe une variété de méthodes pour synthétiser des fantômes, le polyacrylamide produit un fantôme relativement durable et non dégradable qui possède une faible atténuation acoustique35 et un faible coefficient d’absorption optique36. Ces propriétés peuvent être réglées pour imiter plus étroitement les propriétés acoustiques et optiques des tissus humains en ajustant la concentration de la solution finale de polyacrylamide et en incluant des particules dans le fantôme telles que la silice, les billes de verre ou le dioxyde de titane36. En outre, les propriétés mécaniques des fantômes peuvent être ajustées en modifiant le pourcentage de teneur en polymère (c’est-à-dire le pourcentage d’acrylamide et de bis(acrylamide)) et le pourcentage de réticulation (c’est-à-dire le pourcentage de bis(acrylamide) dans la teneur totale en polymère)37. Les fantômes alternatifs comprennent, sans toutefois s’y limiter, la gélose38, la gélatine39, l’alcool polyvinylique (PVA)40, etc.

Les étapes critiques pour une imagerie réussie de la distribution activée de PFCnD et de la dynamique hyperéchogène sont les suivantes. 1) Synchroniser le système laser (source d’activation) et le système d’imagerie par ultrasons. 2) Aligner la section transversale du laser à la fois avec la région cible d’intérêt et avec le plan d’imagerie par ultrasons. 3) Ajuster les paramètres d’imagerie par ultrasons propres à l’imagerie PFCnD (c.-à-d. fréquence d’images, forme d’onde pulsée, etc.).

L’activation optique de PFCnD présente un avantage notable par rapport à celles activées acoustiquement car elle peut échapper aux interférences acoustiques qui dégradent considérablement la qualité de l’image ultrasonore tout en observant sa phase de recondensation dans le temps. Cependant, il est difficile d’intégrer et d’aligner le système laser avec le système d’imagerie par ultrasons à la fois spatialement et temporellement. L’utilisation d’un support imprimé en 3D permet une livraison de lumière reproductible et contrôlée. La livraison de lumière peut également être dépanneée en insérant une tige métallique dans l’inclusion dans le fantôme de polyacrylamide, car la tige métallique doit produire un contraste photoacoustique pour indiquer la livraison de lumière. La synchronisation temporelle a été réalisée en s’appuyant sur une plate-forme20 précédemment développée, qui permet à la fois la synchronisation du laser et du système d’imagerie tout en conservant la programmabilité complète du système d’imagerie Verasonics avec une interface conviviale. De plus, le programme fournit une imagerie conventionnelle en mode B et une imagerie photoacoustique en temps réel pour aider au dépannage et à la localisation de la région d’intérêt où les PFCnD sont distribués. Cependant, cette configuration nécessite un laser pulsé externe de la nanoseconde. Actuellement, à notre connaissance, il existe quelques systèmes commerciaux qui ont intégré des systèmes d’imagerie par ultrasons laser qui peuvent permettre l’imagerie PFCnD, par exemple, Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 et iTheraMedical (insight 64, inVision 128, inVision 256-TF et inVision 512-echo).

L’imagerie ultrasonore ultrarapide du comportement de vaporisation-recondensation de PFCnD souffre principalement d’une faible sensibilité. Bien que les solutions les plus courantes pour l’amélioration de la sensibilité de l’image incluent la composition multi-images, ces techniques sont limitées par leur caractéristique inhérente de dégradation de la fréquence d’images, car l’imagerie PFCnD est très vulnérable aux artefacts de mouvement en ce sens qu’elle inclut un processus différentiel temporel. La modulation de polarité des impulsions dans notre protocole résout efficacement ce problème dans l’imagerie PFCnD en tirant parti de la dynamique acoustique des PFCnD vaporisés pour avoir une image plus discriminable et prolongée sans affecter la résolution temporelle du tout.

Alors que l’ODV permet des gouttelettes avec des capacités uniques telles que la vaporisation répétée et le contraste photoacoustique, la méthode d’activation a une pénétration de profondeur limitée par rapport aux ultrasons. Comme la pénétration de la lumière est limitée, cela limite les applications aux procédures principalement superficielles telles que le remplacement de la biopsie du ganglion sentinelle41. Cette limitation peut potentiellement être contournée grâce à des systèmes de distribution de lumière basés sur un cathéter, permettant une activation profonde dans les tissus. Comme le contraste est acoustique, la vaporisation pourra être imagée à une profondeur comparable à l’ADV. Une autre technique d’activation peut être la vaporisation de gouttelettes magnétiques, dans laquelle des agents de contraste magnétiques tels que des nanoparticules d’oxyde de fer sont encapsulés dans la gouttelette42. Cela permettra la vaporisation à n’importe quelle profondeur.

À l’avenir, la capacité de notre protocole à imager et à moduler la réponse hyperéchogène de PFCnD en même temps peut être utilisée pour plusieurs applications où la surveillance et la manipulation de PFCnD sont nécessaires. Par exemple, un temps de détection plus long peut améliorer la qualité d’image de l’imagerie à super-résolution en donnant un plus grand nombre d’images à la moyenne. En outre, un contrôle plus précis de la PFCnD a le potentiel d’accroître l’efficacité et la sécurité des traitements à médiation par bulles tels que l’ouverture de la BHE et l’administration de médicaments.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le travail a été financé en partie par la Fondation de la recherche sur le cancer du sein dans le cadre de la subvention BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

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Formulation et modulation acoustique de nanogouttelettes de perfluorocarbone vaporisées optiquement
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Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

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