Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formulering og akustisk modulering av optisk fordampede perfluorkarbon nanodråper

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62814
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

Summary

Optisk aktiverte perfluorkarbon nanodråper viser løfte i bildebehandlingsapplikasjoner utenfor det vaskulære systemet. Denne artikkelen vil demonstrere hvordan man syntetiserer disse partiklene, kryssbinder polyakrylamidfantomer og modulerer dråpene akustisk for å forbedre signalet.

Abstract

Mikrobobler er det mest brukte bildekontrastmiddelet i ultralyd. På grunn av deres størrelse er de imidlertid begrenset til vaskulære rom. Disse mikroboblene kan kondenseres eller formuleres som perfluorkarbonnanodråper (PFCnDs) som er små nok til å ekstravasere og deretter utløses akustisk på målstedet. Disse nanopartiklene kan forbedres ytterligere ved å inkludere en optisk absorber som nær infrarød organisk fargestoff eller nanopartikler (f.eks. Kobbersulfid nanopartikler eller gull nanopartikler / nanoroder). Optisk merkede PFCnDs kan fordampes gjennom laserbestråling i en prosess kjent som optisk dråpefordampning (ODV). Denne aktiveringsprosessen muliggjør bruk av perfluorkarbonkjerner med høyt kokepunkt, som ikke kan fordampes akustisk under den maksimale mekaniske indeksgrensen for diagnostisk avbildning. Høyere kokepunktkjerner resulterer i dråper som vil kondensere etter fordampning, noe som resulterer i "blinkende" PFCnD-er som kort produserer kontrast etter fordampning før de kondenserer tilbake til nanodråpeform. Denne prosessen kan gjentas for å produsere kontrast på forespørsel, noe som gir bakgrunnsfri bildebehandling, multipleksing, superoppløsning og kontrastforbedring gjennom både optisk og akustisk modulering. Denne artikkelen vil demonstrere hvordan man syntetiserer optisk utløsbare, lipidskall PFCnDs ved bruk av sondesonikering, lager polyakrylamidfantomer for å karakterisere nanodråpene, og akustisk modulerer PFCnDs etter ODV for å forbedre kontrasten.

Introduction

Mikrobobler er det mest allestedsnærværende ultralydkontrastmiddelet på grunn av deres biokompatibilitet og utmerket ekkogenitet i forhold til bløtvev. Dette gjør dem til verdifulle verktøy for å visualisere blodstrøm, organavgrensning og andre applikasjoner1. Imidlertid begrenser størrelsen (1-10 μm), som gjør dem eksepsjonelle for avbildning basert på resonansfrekvensen, deres applikasjoner til vaskulaturen2.

Denne begrensningen har ført til utviklingen av PFCnDs, som er nano-emulsjoner sammensatt av et overflateaktivt middel innkapslet rundt en flytende perfluorkarbonkjerne. Disse nanopartiklene kan syntetiseres i størrelser så små som 200 nm og er designet for å dra nytte av "lekkende" vaskulatur eller porer og åpne fenestrasjoner som finnes i tumorvaskulatur. Selv om disse forstyrrelsene er tumoravhengige, tillater denne permeabiliteten ekstravasering av nanopartikler fra ~ 200 nm - 1,2 μm, avhengig av svulsten 3,4. I sin opprinnelige form produserer disse partiklene liten eller ingen ultralydskontrast. Ved fordampning - indusert akustisk eller optisk - endres kjernefasen fra væske til gass, induserer en to og en halv til fem ganger økning i diameter 5,6,7 og genererer fotoakustisk og ultralydkontrast. Mens akustisk fordampning er den vanligste aktiveringsmetoden, skaper denne tilnærmingen akustiske artefakter som begrenser avbildningen av fordampningen. I tillegg krever de fleste perfluorkarboner fokusert ultralyd med en mekanisk indeks utover sikkerhetsgrensen for å fordampe8. Dette har ført til utviklingen av PFCnDs med lavere kokepunkt, som kan syntetiseres ved å kondensere mikrobobler til nanodråper9. Imidlertid er disse dråpene mer flyktige og utsatt for spontan fordampning10.

Optisk dråpefordampning (ODV) krever derimot tilsetning av en optisk utløser som nanopartikler 11,12,13 eller fargestoff 6,14,15 og kan fordampe perfluorkarboner med høyere kokepunkt ved bruk av fluenser innenfor ANSI-sikkerhetsgrensen 11. PFCnDs syntetisert med høyere kokepunktkjerner er mer stabile og vil kondensere etter fordampning, noe som muliggjør bakgrunnsfri avbildning16, multipleksing 17 og superoppløsning18. En av de største begrensningene ved disse teknikkene er det faktum at PFCnD-er med høyt kokepunkt er ekkogene etter fordampning i bare en kort tidsramme, på skalaen millisekunder19, og er relativt svake. Selv om dette problemet kan reduseres gjennom gjentatte fordampninger og gjennomsnitt, er deteksjon og separasjon av dråpesignal fortsatt en utfordring.

Med inspirasjon fra pulsinversjon kan varigheten og kontrasten forbedres ved å endre fasen av ultralydavbildningspulsen19. Ved å starte ultralydavbildningspulsen med en sjeldenhetsfase (n-puls), øker både varigheten og kontrasten til de fordampede PFCnDs. I motsetning til dette resulterer oppstart av ultralydavbildningspulsen med en kompresjonsfase (p-puls), i redusert kontrast og kortere varighet. Denne artikkelen vil beskrive hvordan man syntetiserer optisk utløsbare perfluorkarbonnanodråper, polyakrylamidfantomer som ofte brukes i bildebehandling, og demonstrerer kontrastforbedring og forbedret signallevetid gjennom akustisk modulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Perfluorkarbon nanodroplet formulering

  1. Skyll ut en 10 ml rundbunnskolbe med kloroform og vask ut en 10 μL og 1 ml gasstett glasssprøyte med kloroform ved gjentatte ganger å aspirere hele sprøytevolumet og utvise det totalt tre ganger.
    FORSIKTIG: Kloroform er flyktig og kan være giftig ved innånding. Alt arbeid med dette løsningsmidlet skal utføres i en avtrekksvifte.
  2. Bruk sprøytene til å tilsette 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC, 25 mg/ml) og 1 ml IR 1048 (1 mg/ml i kloroform) i den rundbunnede kolben. Husk å rengjøre sprøytene mellom lipider/fargestoffer for å unngå kontaminering av stamløsningen.
    MERK: Infrarøde fargestoffer er lysfølsomme, og arbeidet skal gjøres under svake forhold eller kolber skal dekkes av aluminiumsfolie.
  3. Fjern løsningsmidlet ved hjelp av en roterende fordamper. Forsikre deg om at vakuumet sakte justeres til 332 mbar for å forhindre støt. Etter 5 min, reduser trykket til 42 mbar for å fjerne vann som kan ha kommet inn i løsningen.
    MERK: Lipidkaken kan oppbevares over natten i en rund bunnkolbe dekket med parafilm ved 4 °C.
  4. Suspender lipidkaken i 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og sonikat eller virvel ved romtemperatur i 5 minutter eller til all lipidkaken er suspendert og oppløst i løsningen. Sonicat i ytterligere 2 minutter for å homogenisere løsningen.
  5. Overfør oppløsningen til et 7 ml hetteglass og legg hetteglasset i en glassfat fylt med is for å la oppløsningen avkjøles i 5 minutter før du tilsetter 50 μL perfluorheksan ved hjelp av en gasstett glasssprøyte. Husk å skylle ut sprøyten med perfluorohexane før du dispenserer den i hetteglasset.
  6. Plasser hetteglasset med glass som inneholder lipider og isbad i sonden sonens sonikatorkapsling og senk sondespissen under miniscus. Forsikre deg om at sidene av sonikersonden ikke berører leppen på hetteglasset.
  7. Sonde sonikerer blandingen med følgende innstillinger: Amplitude 1, Prosesstid: 20 s, Puls-På: 1s, Puls-av: 5s. Deretter sonikerer du ved følgende innstillinger: Amplitude: 50, Prosesstid: 5 s, Puls på: 1 s, Puls-av: 10 s.
  8. Overfør nanodråpeløsningen til et 1,5 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter for å skille ut de større dråpene (>1 μm) fra mindre dråper.
  9. Kast pelleten og overfør supernatanten til et annet 1,5 ml sentrifugerør. Vask supernatanten ved sentrifugering ved 3000 x g i 5 minutter for å pelletere alle dråpene i oppløsning. Resuspender PFCnDs i 1 ml PBS ved å pipettere pelleten opp og ned og deretter sonikere i en badsonikator i 1 min.
  10. Mål størrelsen på dråpene ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). Fortynn lageret PFCnDs med 100 ganger (10 μL PFCnD-lager i 990 μL PBS) og badesonikat for å spre PFCnDs før måling. Representative resultater er vist i figur 1.
  11. Bestem konsentrasjonen av PFCnDs ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalysatoren (se Materialtabell). Fortynn PFCnDs med 100-1000 ganger for å sikre nøyaktig måling av konsentrasjonen. Protokollen gir vanligvis dråper i en konsentrasjon i størrelsesorden 1010 partikler/ml.
  12. Forbered 10 ml ultralydkoblingsgel i et 50 ml sentrifugerør og tilsett 1% (v / v) eller 100 μL PFCnDs for å lage løsning av ~ 108 partikler / ml. Vortex løsningen å blande. Sentrifuge blandingen ved 4000 x g i 3 minutter for å fjerne bobler.

2. Polyakrylamidfantompreparat

  1. Degas vann ved å fylle en 500 ml vakuumflaske med 400 ml avionisert vann, forsegle med en gummikork og koble kolben til vakuumledningen. Åpne vakuumledningen og senk bunnen av kolben i badesonikatoren. Sonicat i 5 minutter eller til ingen gassbobledannelse er synlig.
  2. Forbered 10% ammoniumpersulfat (APS) løsning ved å oppløse 500 mg i 5 ml avgasset vann. Virvle oppløsningen forsiktig hvis ammoniumpersulfatet ikke oppløses helt.
  3. I et 400 ml beger med rørestang på en røreplate, tilsett 150 ml avgasset vann og 50 ml 40% (w / v) akrylamid-bisakrylamidoppløsning for å danne 200 ml 10% akrylamid-bisakrylamidoppløsning. Rør blandingen ved 200 o / min for å tillate riktig blanding uten å introdusere bobler.
    FORSIKTIG: Akrylamid er kreftfremkallende, og alt arbeid bør gjøres i en avtrekkshette med hansker, spesielt hvis du arbeider med akrylamid i pulverform.
  4. Vei ut 400 mg silika til og tilsett det i 10 % akrylamid-bisakrylamidoppløsningen fra trinn 2,3 for å danne en 0,2 % (w/v) silika- og akrylamidoppløsning.
    FORSIKTIG: Silika ved innånding kan være kreftfremkallende. Alt arbeid, inkludert veiing, skal utføres i en avtrekksvifte.
  5. Forbered en 58 mm x 58 mm x 78 mm firkantet form med sylindrisk inkludering ved å kutte av spissene på fra en plastoverføringspipette og støtte den i formen med laboratoriebånd. Se figur 2.
  6. Tilsett 2 ml 10% APS-løsning til begeret for å lage en endelig konsentrasjon på 0,1% APS og tilsett 250 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) til fantomløsningen. La løsningen røre kort (mindre enn et minutt).
  7. Hell løsningen raskt i formen, mens du er forsiktig så du ikke introduserer luftbobler i løsningen. Løsningen skal polymeriseres innen 10 minutter. Fjern fantomet ved å kjøre den flate enden av en laboratoriespatel rundt kanten av formen og invertere formen.
    MERK: Disse fantomene kan gjenbrukes flere ganger og skal senkes i vann og oppbevares ved 4 °C.

3. Perfluorkarbon nanodråpeavbildning

  1. Slå på og varm opp det pulserende lasersystemet i ~20 minutter ved å følge produsentens instruksjoner. Forsikre deg om at den fiberoptiske bunten er riktig koblet til laserutgangen og at de to bena er riktig plassert i fiberbuntholderen.
  2. Slå på ultralydbildesystemet, koble array imaging transduser (L11-4v) til systemet og fest transduseren i holderen for å justere bildeplanet med lasertverrsnitt.
  3. Sett pulsrepetisjonsfrekvensen til lasersystemet til 10Hz og plasser en effektmåler på enden av fiberbunten for å måle energi. Still inn q-bryterforsinkelsen til estimert fluens er 70 mJ/cm2.
    FORSIKTIG: Passende briller må brukes når du skyter laseren, og lasergardiner må omslutte rommet.
  4. Fyll en av kanalene i polyakrylamidfantomet på nytt med ultralydgel/PFCnD-blandingen ved hjelp av en 1 ml plastglidespisssprøyte. Dekk toppen av kanalen liberalt med ultralydgel og fjern eventuelle bobler med en 1 ml plast slip tip sprøyte. Plasser polyakrylamidfantomet under svingeren og fiberbunten som vist i figur 3.
  5. Bruk den kombinerte laserultralyd- og elastisitetsplattformen (CLUE) basert på programvaren20 for å avbilde PFCnD synkronisert med optisk aktivering. Endre de generelle brukerdefinerte parametrene i Param-struktur for bildebehandling: sett start/sluttdybde til 0/40 mm, senterfrekvens til 6,9 MHz og svingernavn til 'L11-4v'.
  6. Definer en ny RunCase og design en modulsekvens for gjentatt optisk aktivering/rekondensering og US imaging av PFHnDs. Dette gjøres ved å liste opp forhåndsdefinerte moduler som ultrafast imaging (mUF), ekstern laser (mExtLaser) og inaktiv (mIdle).
    1. Gjenta sekvenssettet mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF to ganger for å hente både n-puls- og p-pulsbildedata.
      MERK: Den første mExtLaser-modulen i hver sekvens er satt som en falsk laser ved å sette ExtLaser.Enable til 0 og 'mIdle' er inkludert for å minimere tiden mellom amerikanske bakgrunnsbilder og n/p-puls US-bildene etter laseraktivering.
  7. Angi modulparametere for hver modul som er plassert i modulsekvensen for gjeldende kjøresak. Få tilgang til hver modulparameter etter indeks som tilsvarer rekkefølgen i modulsekvens. Moduler vil utføre forhåndsdefinerte operasjoner med modulparametere brukerdefinert her.
    1. Sett ExtLaser.QSdelay i eksterne lasermoduler til verdien av Q-bryterforsinkelse for laser som er innstilt i trinn 3.3, i mikrosekunder. Denne modulen venter på at lasersystemets lommelyktutløser skal utløses og genererer Q-switch-utløser etter forsinkelsen som er angitt i QSdelay.
    2. I ultrarask bildemodul setter du Resource.numFrame til 100, setter SeqControl.PRI til 200 (μs) og setter TW.polarity til 1 for P-puls og -1 for N-puls (se figur 4 for tilsvarende pulsform). Denne modulen vil overføre ultrarask 0-graders plan bølge med pulstype spesifisert i TW.polaritet.
      1. Få bildevindu med full blenderåpning på 38,8 mm bredt for antall bilder i Resource.numFrame, pulsrepetisjonsintervallet til SeqControl.PRI, og lagre deretter data for frakoblet behandling.
    3. Sett SeqControl.lastPRI_Module i inaktiv modul til hvor lang tid mellom laserpulser (100 ms) trukket fra av Q-bryterforsinkelse, bildebehandlingstid (20 ms) og en margin på 20 μs for signalet å reise. Denne modulen holder systemet under "ingen drift" -tilstand for tiden i SeqControl.lastPRI_Module for å fylle tidsgapet mellom slutten av bildedatainnsamlingen og neste laserpulseksitasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket formulering og sentrifugalseparasjon av PFCnDs skal gi dråper rundt størrelsen 200-300 nm i diameter (figur 1A). Feil separerte dråper kan vise små topper rundt 1 μm. Disse løsningene kan videre badesonikeres for å bryte opp de større dråpene. Størrelsen på dråpene vil øke over tid på grunn av koalescing og/eller diffusjon i en prosess kjent som Ostwald modning21,22 (figur 1B).

Akustisk modulering av dråpene ved å manipulere bildepulsen forbedret kontrasten til de fordampede PFCnD-ene. Dette ble demonstrert i PFCnD-bilder rekonstruert ved å trekke fra tilstøtende rammer av de stråleformede bildene slik at bare signalet som returneres fra fordampet PFCnD er synlig og stasjonært bakgrunnssignal undertrykkes. Kontrast kvantifiseres av forholdet mellom forskjellen mellom gjennomsnittlige signaler fra det sirkulære inkluderingsområdet og gjennomsnittlig bakgrunnssignal over gjennomsnittlig bakgrunnssignal. Bakgrunnssignalet er definert av signalene fra to rektangulære avkastninger i bakgrunnen som er på samme dybde og ekvivalent område som inneslutningene. Kontrasten fra inklusjon for N-puls er ca. 3,2 ganger større (dvs. 220 % forbedring) enn P-puls (figur 5).

Den omvendte bildepulsen økte også levetiden til signalet fra PFCnD-fordampning. Dette ble kvantifisert ved å terskel pikslene i det sirkulære inkluderingsområdet som overskrider bakgrunnssignalet. Prosentandelen av piksler i inkluderingen som var over terskelen, ble definert som det hyperechoiske området (%). For å undersøke PFCnDs hyperechogenic oppførsel over tid, beregnes hyperechoic området for hver ramme og normaliseres av det hyperechoiske området i den første rammen, og deretter montert på en eksponentiell henfallsmodell. Denne funksjonen ble brukt til å bestemme den karakteristiske henfallstiden, definert som tidsperioden det tar for det hyperekoiske området etter PFCnD-aktivering å henfalle til bare 10 % av det opprinnelige området (figur 6a). Den karakteristiske henfallstiden for normalisert hyperekkoisk område er opptil 3,5 ganger lengre i N-pulsavbildning sammenlignet med P-puls. Representative B-modus differensialbilder i tid for hver N-puls og P-pulsavbildning er vist i figur 6b.

Figure 1
Figur 1: DLS-størrelsesmålinger av PFCnDs og stabilitet. (A) Størrelsesintensitetsfordelingen av dråper i gjennomsnitt fra tre målinger av dråper etter syntese (gjennomsnittlig PDI: 0,132± 0,016; gjennomsnittlig Z-gjennomsnitt: 259,3 ± 0,7 nm). (B) Størrelsesintensitetsfordelingen av dråper i gjennomsnitt fra tre målinger tatt 24 timer etter syntese (gjennomsnittlig PDI: 0,252± 0,061; gjennomsnittlig Z-gjennomsnitt: 322,5 ± 4,5 nm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Bilde og skjematisk polyakrylamidform . (A) Bilde av formen laget av laboratorietape og plastbeholderen. (B) Skjematisk med målinger av polyakrylamidfantomet etter fjerning fra mugg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Et skjema over laserpulslevering og ultralydavbildning . (A) Komponenter i sammenstillingen er merket og laserstråle / ultralydavbildningsplanjustering i forhold til inklusjonsposisjonen illustreres. (B) Et bilde som viser det faktiske oppsettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Simulert ultralydavbildningspuls. Bølgeformene simuleres av ultralydavbildningssystemprogramvare, samplet med 250 MHz. Bølgeformen til P-puls og N-puls genereres med samme senterfrekvens og pulsbredde, men har 180° faseforskjell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kontrastmåling. Gjennomsnittlig kontrastverdi for inklusjonsområde for N-puls og P-puls, feilfelt representerer standardavvik (n=3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Karakteristisk henfallskurve for hyperekkoisk areal og representative differensiale B-mode mages . (A) Normalisert hyperekkoisk område indusert av PFCnD-aktivering over tid for N-puls og P-pulsavbildning ved samme tverrsnitt. Den stiplede linjen indikerer 10% av det opprinnelige hyperechoiske området. Tiden hvor det monterte plottet krysser med den stiplede linjen representerer den karakteristiske forfallstiden. (B) Bilder viser et beskåret ROI-vindu sentrert på inkluderingen, plottet på en dB-skala med et dynamisk område på 35. Den øverste raden viser den rekondenserende virkemåten som avbildes av P-pulsen, og den nederste raden viser N-pulsen. Den gulfargede stiplede linjen angir inkluderingsområdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Totalt volum av Phantom (ml) 50 100 250 500
DI vann (ml) 37.5 74.9 187.4 375
40 % PA-løsning (ml) 12.5 25.1 62.6 125
Silika (mg) 100 200 500 1000
10 % APS-løsning (μL) 500 1000 2500 5000
TEMMET (μL) 62.5 125 312.5 625

Tabell 1: Sammendrag av reagensene og mengdene for polyakrylamidfantom-tverrbinding basert på formvolum. Denne tabellen gir en kortfattet verdioppsummering av reagensene som brukes og mengder basert på flere vanlige formvolumer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sonde sonikering er en relativt enkel og lett å lære metode for å fremstille PFCnDs. Det er noen få skritt der det må tas hensyn. Ved håndtering av kloroform er det viktig at en pipette eller glasssprøyter med positiv forskyvning brukes, da den er flyktig og vil "lekke" fra standard luftforskyvningspipetter. Videre, hvis du bruker en positiv forskyvning, må du sørge for at en passende spiss brukes, da kloroform vil oppløse de fleste plastspisser, noe som kan introdusere forurensninger i løsningen. En pipette eller glasssprøyte med positiv forskyvning anbefales også for perfluoroheksan, da den er både flyktig og tettere enn vann. Vanligvis kan de individuelle effektene av volatilitet og høy tetthet reduseres ved å forfukte i luftforskyvningspipetter og bruke en skala for å justere volumet som er satt på pipetten. Men når det gjelder perfluorheksan som har begge egenskapene, vil volatiliteten gjøre det vanskelig å oppnå nøyaktige vektmålinger, noe som gjør en positiv forskyvningspipette / glasssprøyte til det mest levedyktige alternativet.

Før sonde sonikerer løsningen, er det viktig å inkubere lipid- og perfluorkarbonoppløsningen i et isbad for å la det avkjøles for å forhindre koking av perfluorkarbonet under sonikering. Dette trinnet vil være spesielt viktig for lavere kokende perfluorkarbon som perfluoropentan. Videre må det utvises forsiktighet når sonden sonikerer løsningen. Sonikeringssondespissen skal være nedsenket, men den skal ikke komme i kontakt med bunnen eller sidene av glassflasken, da det kan skade spissen og knuse hetteglasset og tømme lipidoppløsningen i isbadet.

PFCnD-fabrikasjonsprotokollen kan tilpasses på noen få mindre måter. Hvis en roterende fordamper ikke er tilgjengelig i trinn 1.3, kan løsningen tørkes med en jevn strøm av nitrogengass eller plasseres i et vakuumkammer over natten for å danne lipidkaken. Når det gjelder lipidene, bruker denne formuleringen et 9: 1-forhold mellom DSPE-PEG: DSPC sammenlignet med standard 1: 9-forholdet mellom DSPE-PEG: DSPC, fordi det resulterer i mindre og mer størrelse stabile dråper23. Denne formuleringen kan tilpasses for å muliggjøre overflatekonjugering ved å erstatte en liten brøkdel (~ 2 mol%) av DSPE-PEG med en funksjonalisert DSPE-PEG med ønsket del (f.eks. Biotin, tiol, amin, etc.).

Generelt er sondesonikatorer kommersielt tilgjengelige, relativt enkle å bruke, og kan lett tilpasses andre perfluorkarboner med høyere kokepunkt og overflateaktive formuleringer, men det kan ikke brukes til å lage dråper med perfluorkarbonkjerner som er gassformige ved romtemperatur uten betydelige modifikasjoner. En slik modifikasjon er å bruke sondesonikering for å lage mikrobobler og deretter påføre trykk og redusere temperaturen for å kondensere mikroboblene til dråper24. Selv om denne metoden er en smart måte å generere akustisk fordampbare dråper på, er det vanskelig å kapsle inn nok fargestoff i mikroboblene for å sikre ODV etter kondensering. En alternativ tilnærming er å konjugere fargestoffet (f.eks. Cy7.5) til lipidene og danne mikrobobler som kan kondenseres ned til ODV-kompatibelt lavt kokepunkt PFCnDs25.

Probe sonikering produserer også en høy konsentrasjon av nanodråper (~ 1010 dråper / ml) på relativt kort tid. Imidlertid resulterer denne teknikken i en stor størrelsesfordeling som vil redusere mengden nanodråper som vil ekstravasere. Selv om dette kan forbedres gjennom sentrifugalfiltrering eller sprøytefiltre for å fjerne større dråper, vil de resulterende PFCnD-ene utvise større polydispersitet sammenlignet med dråper syntetisert ved hjelp av mikrofluidikk eller filtrert gjennom ekstrudering26. En annen ulempe med sondesonikering er at sonikeringssondespissen uunngåelig vil bli pitted fra kavitasjon under sonikering og må byttes ut med jevne mellomrom.

En alternativ tilnærming til å lage dråper benytter mikrofluidiske enheter som kan brukes til å skreddersy dråper til en bestemt størrelse med lav polydispersitetsindeks (PDI). Imidlertid produserer disse enhetene dråper med en relativt langsom hastighet (~ 104-10 6 dråper / s) 26, og mens det har vært flere utviklinger som trinnemulgering 27, spissstrømming i strømningsfokuseringsenheter28,29, og bruk av ouzo-effekten med en forskjøvet sildbeinmikromikser30 - Generering av nanosiserte dråper er fortsatt utfordrende. Videre er denne teknikken ikke kommersielt tilgjengelig, og fabrikasjon av disse enhetene krever spesialisert kompetanse.

Andre metoder som er kommersielt tilgjengelige inkluderer ekstrudering og homogenisering. Ekstrudering benytter membraner for å passere dråper gjennom, noe som resulterer i nanostørrelsesdråper med et smalere størrelsesområde sammenlignet med sonikering. Imidlertid er denne metoden sterkt formuleringsavhengig og er utfordrende å innlemme fargestoff eller terapeutisk last i dråpen26. Høytrykkshomogenisering benytter kommersielt tilgjengelige homogenisatorer som benytter høyt trykk og skjærspenning for å generere monodisperse, nanoskala lipidpartikler på en skalerbar måte31,32,33. Denne metoden er tilpasset for å lage dråper med perfluorkarboner med høyt og lavt kokepunkt32,34. En mer omfattende gjennomgang av dråpeformuleringsmetoder og prøveprotokoller finnes i følgende gjennomgang26.

Phantoms er et verdifullt verktøy for å karakterisere ytelsen til nanodråper in vitro. I denne protokollen brukes polyakrylamidbaserte fantomer med silika. De vanligste problemene med polyakrylamidfantomer er relatert til langsom eller ingen polymerisering. Langsom polymerisering, mens mindre problematisk, kan føre til heterogen fordeling av innebygd spredning. Den vanligste skyldige for dette problemet er bruken av gamle løsninger av ammoniumpersulfat som reduserer produksjonen av frie radikaler som initierer tverrbindingen. Dette kan enkelt løses ved å gjøre løsningen frisk eller ikke bruke tilberedte løsninger som er eldre enn en uke. En annen mulighet er nedbrytningen av TEMED - dette vil være tydelig i dannelsen av et gult bunnfall. Et annet vanlig problem er tilstedeværelsen av luftbobler i det polymeriserte fantomet. Riktig avgassing av vannet og forsiktig håndtering for å unngå overflødig overflateomrøring bør redusere dette problemet. En alternativ strategi vil være å avlede hele løsningen etter trinn 2.5. Dette bør imidlertid utføres i en avtrekkshette på grunn av tilstedeværelsen av akrylamid.

Disse fantomene er også utmerket for å avbilde oppførselen til begrensede dråper for å studere individuell dråpeadferd; Dette kan gjøres ved å legge PFCnDs inn i fantomet ved trinn 2.4. Videre, siden tverrbindingen skyldes en kjemisk reaksjon, produseres relativt lite varme sammenlignet med en fysisk tverrbinding basert på en øvre kritisk løsningstemperatur som gelatin. Dette reduserer sannsynligheten for spontan fordampning av de innebygde dråpene.

Mens det finnes en rekke metoder for syntetisering av fantomer, produserer polyakrylamid et relativt holdbart og ikke-nedbrytbart fantom som har lav akustisk demping35 og optisk absorpsjonskoeffisient36. Disse egenskapene kan justeres for å etterligne de akustiske og optiske egenskapene til humant vev nærmere ved å justere konsentrasjonen av den endelige polyakrylamidoppløsningen og gjennom inkludering av partikler i fantomet som silika, glassperler eller titandioksid36. Videre kan de mekaniske egenskapene til fantomene justeres ved å modifisere prosentandelen av polymerinnhold (dvs. prosentandel akrylamid og bis (akrylamid)) og prosentandel av tverrbinding (dvs. prosentandel av bis (akrylamid) i totalt polymerinnhold)37. Alternative fantomer inkluderer, men er ikke begrenset til, agar38, gelatin39, polyvinylalkohol (PVA) 40, etc.

De kritiske trinnene for en vellykket avbildning av aktivert PFCnD-distribusjon og hyperechogenic dynamikk er som følger. 1) Synkroniser lasersystemet (aktiveringskilde) og ultralydbildesystemet. 2) Juster lasertverrsnittet både med målområdet av interesse og med ultralydbildeplan. 3) Juster ultralydbildeparametere riktig til PFCnD-avbildning (dvs. framerate, pulsbølgeform, etc.).

Den optiske aktiveringen av PFCnD har en merkbar fordel i forhold til akustisk aktiverte at den kan unngå den akustiske forstyrrelsen som drastisk forringer kvaliteten på ultralydbildet mens den observerer dens rekondenserende fase i tide. Det er imidlertid utfordrende å integrere og justere lasersystemet med ultralydbildesystemet både romlig og tidsmessig. Bruken av en 3D-printet holder muliggjør repeterbar og kontrollert lyslevering. Lysleveringen kan også feilsøkes ved å sette inn en metallstang i inkluderingen i polyakrylamidfantomet, da metallstangen skal produsere fotoakustisk kontrast for å indikere lyslevering. Temporal synkronisering ble oppnådd ved å bygge av en tidligere utviklet plattform20, som muliggjør både synkronisering av lasing- og bildebehandlingssystemet, samtidig som hele programmerbarheten til Verasonics bildesystem holdes med et brukervennlig grensesnitt. I tillegg gir programmet sanntids konvensjonell B-modus bildebehandling og fotoakustisk bildebehandling for å hjelpe til med feilsøking og lokalisering av interesseområdet der PFCnDs distribueres. Dette oppsettet krever imidlertid en ekstern nanosekund pulserende laser. For tiden, så vidt vi vet, er det noen få kommersielle systemer som har integrerte laser-ultralydbildesystemer som kan tillate PFCnD-bildebehandling, for eksempel Visualsonics (Vevo LAZR, Vevo LAZR-X, Vevo 3100, Vevo F2), Endera Nexus 128 og iTheraMedical (innsikt 64, inVision 128, inVision 256-TF og inVision 512-echo).

Den ultraraske ultralydavbildningen av fordampende-rekodenserende oppførsel av PFCnD lider hovedsakelig av lav følsomhet. Mens de vanligste løsningene for forbedring av bildefølsomhet inkluderer flerrammesammensetning, er disse teknikkene begrenset av deres iboende egenskap for å forringe frameraten, siden PFCnD-avbildningen er svært sårbar for bevegelsesartefakter ved at den inkluderer tidsdifferensiell prosess. Pulspolaritetsmodulasjonen i protokollen vår løser effektivt dette problemet i PFCnD-avbildning ved å utnytte den akustiske dynamikken til fordampede PFCnD-er for å ha mer diskriminerbart og langvarig bilde, samtidig som det ikke påvirker tidsmessig oppløsning i det hele tatt.

Mens ODV tillater dråper med unike evner som gjentatt fordampning og fotoakustisk kontrast, har aktiveringsmetoden begrenset dybdepenetrasjon i forhold til ultralyd. Siden lyspenetrasjon er begrenset, begrenser dette applikasjonene til hovedsakelig overfladiske prosedyrer som erstatning for sentinel lymfeknutebiopsi41. Denne begrensningen kan potensielt omgås gjennom kateterbaserte lysleveringssystemer, noe som muliggjør aktivering dypt i vev. Siden kontrasten er akustisk, vil fordampning kunne avbildes på dybde som kan sammenlignes med ADV. En alternativ aktiveringsteknikk kan være magnetisk dråpefordampning, hvor magnetiske kontrastmidler som jernoksid nanopartikler er innkapslet i dråpen42. Dette vil tillate fordampning i hvilken som helst dybde.

I fremtiden kan protokollens evne til å avbilde og modulere den hyperekogene responsen til PFCnD samtidig brukes til flere applikasjoner der overvåking og manipulering av PFCnD er nødvendig. For eksempel kan lengre detekterbar tid forbedre bildekvaliteten til bilder med superoppløsning ved å gi større antall bilder til gjennomsnittet. Videre har mer presis kontroll av PFCnD potensial til å øke effektiviteten og sikkerheten til boblemedierte terapier som BBB-åpning og legemiddellevering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet delvis av Breast Cancer Research Foundation under tilskudd BCRF-20-043.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Persulfate (APS) VWR 97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 850365C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG) Avanti Polar Lipids 880120C Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur® VWR EM-1300 acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048 Sigma 405175 Infrared dye
L11-4v Verasonics - ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8" Qsonica LLC 4418 microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) VWR 97064-902 Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II Ophir-Spiricon 7Z01550 laser power meter
Perfluorohexane Fluoromed APF-60M perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets VWR 97062-732 Tablets used to make PBS
Q500 Qsonica LLC Q500-110 Probe sonicator
Silica gel Sigma-Aldrich 288500 2-25 μm particle size
Tempest 30 New wave research - Pulsed laser system
Vantage 128 Verasonics - research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd - Makes size measurements based on dynamic light scattering

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
  2. Lee, H., et al. Microbubbles used for contrast enhanced ultrasound and theragnosis: a review of principles to applications. Biomedical Engineering Letters. 7 (2), 59-69 (2017).
  3. Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (8), 4607-4612 (1998).
  4. Ishida, O., Maruyama, K., Sasaki, K., Iwatsuru, M. Size-dependent extravasation and interstitial localization of polyethyleneglycol liposomes in solid tumor-bearing mice. International Journal of Pharmaceutics. 190 (1), 49-56 (1999).
  5. Wong, Z. Z., Kripfgans, O. D., Qamar, A., Fowlkes, J. B., Bull, J. L. Bubble evolution in acoustic droplet vaporization at physiological temperature via ultra-high speed imaging. Soft Matter. 7 (8), 4009 (2011).
  6. Yu, J., Chen, X., Villanueva, F. S., Kim, K. Vaporization and recondensation dynamics of indocyanine green-loaded perfluoropentane droplets irradiated by a short pulse laser. Applied Physics Letters. 109 (24), 243701 (2016).
  7. Kripfgans, O. D., Fowlkes, J. B., Miller, D. L., Eldevik, O. P., Carson, P. L. Acoustic droplet vaporization for therapeutic and diagnostic applications. Ultrasound in Medicine & Biology. 26 (7), 1177-1189 (2000).
  8. Aliabouzar, M., Kumar, K. N., Sarkar, K. Acoustic vaporization threshold of lipid-coated perfluoropentane droplets. The Journal of the Acoustical Society of America. 143 (4), 2001-2012 (2018).
  9. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir. 27 (17), 10412-10420 (2011).
  10. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
  11. Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered nanodroplet vaporization for contrast-enhanced imaging. Nature Communications. 3 (1), 618 (2012).
  12. Strohm, E., Rui, M., Gorelikov, I., Matsuura, N., Kolios, M. Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradiation. Biomedical Optics Express. 2 (6), 1432 (2011).
  13. Wei, C., et al. Laser-induced cavitation in nanoemulsion with gold nanospheres for blood clot disruption: in vitro results. Optics Letters. 39 (9), 2599 (2014).
  14. Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: Dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2014).
  15. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 3671 (2014).
  16. Hannah, A. S., Luke, G. P., Emelianov, S. Y. Blinking phase-change nanocapsules enable background-free ultrasound imaging. Theranostics. 6 (11), 1866-1876 (2016).
  17. Santiesteban, D. Y., Hallam, K. A., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Color-coded perfluorocarbon nanodroplets for multiplexed ultrasound and photoacoustic imaging. Nano Research. 12 (4), 741-747 (2019).
  18. Luke, G. P., Hannah, A. S., Emelianov, S. Y. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets. Nano Letters. 16 (4), 2556-2559 (2016).
  19. Zhu, Y. I., Yoon, H., Zhao, A. X., Emelianov, S. Y. Leveraging the imaging transmit pulse to manipulate phase-change nanodroplets for contrast-enhanced ultrasound. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (4), 692-700 (2019).
  20. Yoon, H., Zhu, Y. I., Yarmoska, S. K., Emelianov, S. Y. Design and demonstration of a configurable imaging platform for combined laser, ultrasound, and elasticity imaging. IEEE Transactions on Medical Imaging. 38 (7), 1622-1632 (2019).
  21. Taylor, P. Ostwald ripening in emulsions. Advances in Colloid and Interface Science. 75 (2), 107-163 (1998).
  22. Freire, M. G., Dias, A. M. A., Coelho, M. A. Z., Coutinho, J. A. P., Marrucho, I. M. Aging mechanisms of perfluorocarbon emulsions using image analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 224-232 (2005).
  23. Yarmoska, S. K., Yoon, H., Emelianov, S. Y. Lipid shell composition plays a critical role in the stable size reduction of perfluorocarbon nanodroplets. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (6), 1489-1499 (2019).
  24. Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
  25. Lin, S., et al. Optically and acoustically triggerable sub-micron phase-change contrast agents for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging. Photoacoustics. 6, 26-36 (2017).
  26. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
  27. Shui, L., vanden Berg, A., Eijkel, J. C. T. Scalable attoliter monodisperse droplet formation using multiphase nano-microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics. 11 (1), 87-92 (2011).
  28. Jeong, W. -C., et al. Controlled generation of submicron emulsion droplets via highly stable tip-streaming mode in microfluidic devices. Lab on a Chip. 12 (8), 1446 (2012).
  29. Xu, X., et al. Microfluidic production of nanoscale perfluorocarbon droplets as liquid contrast agents for ultrasound imaging. Lab on a Chip. 17 (20), 3504-3513 (2017).
  30. Song, R., Peng, C., Xu, X., Zou, R., Yao, S. Facile fabrication of uniform nanoscale perfluorocarbon droplets as ultrasound contrast agents. Microfluidics and Nanofluidics. 23 (1), 12 (2019).
  31. Liedtke, S., Wissing, S., Müller, R. H., Mäder, K. Influence of high-pressure homogenisation equipment on nanodispersions characteristics. International Journal of Pharmaceutics. 196 (2), 183-185 (2000).
  32. Reznik, N., Williams, R., Burns, P. N. Investigation of vaporized submicron perfluorocarbon droplets as an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1271-1279 (2011).
  33. Grapentin, C., Barnert, S., Schubert, R. Monitoring the stability of perfluorocarbon nanoemulsions by cryo-TEM image analysis and dynamic light scattering. Plos One. 10 (6), 0130674 (2015).
  34. de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
  35. Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), 475-484 (2007).
  36. Hariri, A., et al. Polyacrylamide hydrogel phantoms for performance evaluation of multispectral photoacoustic imaging systems. Photoacoustics. 22, 100245 (2021).
  37. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the range of polyacrylamide gel stiffness for mechanobiology applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  38. Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the iec agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
  39. Madsen, E. L., Zagzebski, J. A., Banjavie, R. A., Jutila, R. E. Tissue mimicking materials for ultrasound phantoms. Medical Physics. 5 (5), 391-394 (1978).
  40. Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
  41. Kim, H., Chang, J. H. Multimodal photoacoustic imaging as a tool for sentinel lymph node identification and biopsy guidance. Biomedical Engineering Letters. 8 (2), 183-191 (2018).
  42. Zhou, Y., et al. Magnetic nanoparticle-promoted droplet vaporization for in vivo stimuli-responsive cancer theranostics. NPG Asia Materials. 8 (9), 313 (2016).

Tags

Bioengineering ultralyd perfluorkarbon nanodroplets nanodroplets kontrastmidler emulsjon nanopartikkel fotoakustisk faseendring
Formulering og akustisk modulering av optisk fordampede perfluorkarbon nanodråper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S.… More

Zhao, A., Lee, J., Emelianov, S. Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets. J. Vis. Exp. (173), e62814, doi:10.3791/62814 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter