Summary
Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.
Abstract
نظم التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة العمليات البيولوجية. يمكن لأنظمة التعبير البصري أن توفر تحكما دقيقا في توقيت التعبير الجيني وموقعه وسعته باستخدام الضوء كعامل محفز. في هذا البروتوكول، يتم استخدام نظام التعبير البصري لتحقيق التعبير الجيني الخفيف القابل للانزدحام في أجنة حمار وحشي. يعتمد هذا النظام على عامل نسخ هندسي يسمى TAEL استنادا إلى عامل نسخ نشط للضوء بشكل طبيعي من بكتيريا E. litoralis. عندما تضيء مع الضوء الأزرق، TAEL dimerizes، يربط إلى عنصرها التنظيمي cognate يسمى C120، وينشط النسخ. يستخدم هذا البروتوكول أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا تعبر عن عامل نسخ TAEL تحت سيطرة مروج ubb في كل مكان. وفي الوقت نفسه، فإن العنصر التنظيمي C120 يدفع التعبير عن جين المراسل الفلوري (GFP). باستخدام لوحة LED بسيطة لتقديم الضوء الأزرق المنشط ، يمكن أولا اكتشاف تحريض تعبير GFP بعد 30 دقيقة من الإضاءة ويصل إلى ذروة التعريفي أكثر من 130 ضعفا بعد 3 ساعة من العلاج الخفيف. يمكن تقييم تحريض التعبير عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ومجهر الفلورسينس. هذه الطريقة هي نهج متعدد الاستخدامات وسهل الاستخدام للتعبير الجيني البصري.
Introduction
تساعد أنظمة التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك في التحكم في كمية التعبير الجيني وتوقيته وموقعه. ومع ذلك، كان تحقيق السيطرة المكانية والزمنية الدقيقة في الكائنات متعددة الخلايا أمرا صعبا. ويتحقق التحكم الزمني الأكثر شيوعا عن طريق إضافة مركبات جزيء صغير1 أو تفعيل المروجين صدمة الحرارة2. ومع ذلك، فإن كلا النهجين عرضة لقضايا التوقيت، وقوة الحث، والاستجابات الإجهادية خارج الهدف. ويتحقق التحكم المكاني بشكل رئيسي باستخدام المروجين3الخاصين بالأنسجة ، ولكن هذا النهج يتطلب مروجا مناسبا أو عنصرا تنظيميا ، وهو غير متوفر دائما ، ولا يؤدي إلى تحريض مستوى الأنسجة الفرعية.
وعلى النقيض من هذه النهج التقليدية، فإن المنشطات البصرية البصرية المنشطة للضوء لديها القدرة على التحكم المكاني والزمني الدقيق في التعبير الجيني4. تم تطوير نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء وتحسينه للاستخدام في أجنة حمار وحشي5،6. ويستند هذا النظام على عامل النسخ ضوء تنشيط الذاتية من البكتيريا E. litoralis7,8. يتكون نظام TAEL/C120 من منشط نسخي يسمى TAEL يحتوي على مجال تحويل Kal-TA4 ، ومجال LOV الأزرق المستجيب للضوء (استشعار الجهد الخفيف الأكسجين) ، ومجال ربط الحمض النووي الحلزوني (HTH)5. عندما مضيئة، والمجالات LOV الخضوع لتغيير تشكيلي يسمح اثنين من جزيئات TAEL لتعتيم، وربط إلى المروج C120 تستجيب TAEL، والشروع في نسخ من جين المصب منالفائدة 5،8. يعرض نظام TAEL/C120 تحريضا سريعا وقويا بأقل قدر من السمية ، ويمكن تنشيطه من خلال العديد من طرائق التسليم الخفيف المختلفة. وفي الآونة الأخيرة، أدخلت تحسينات على نظام TAEL/C120 بإضافة إشارة توطين نووية إلى TAEL (TAEL-N) وباقتران العنصر التنظيمي C120 بجهة تسويق أساسية cFos (C120F)(الشكل 1A). هذه التعديلات تحسين مستويات التعريفي بأكثر من 15 أضعاف6.
في هذا البروتوكول، يتم استخدام لوحة LED بسيطة لتنشيط نظام TAEL/C120 والحث على التعبير في كل مكان عن جين المراسل، GFP. يمكن رصد تحريض التعبير نوعيا من خلال مراقبة كثافة الفلورسينس أو كميا عن طريق قياس مستويات النسخ باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). هذا البروتوكول سوف تظهر نظام TAEL/C120 كأداة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام التي تمكن تنظيم قوي للتعبير الجيني في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا ميرسيد.
1. عبور حمار وحشي وجمع الأجنة
- الحفاظ على خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا منفصلة تحتوي إما على المنشط النسخ TAEL أو الجين مراسل C120 التي تسيطر عليها للحد من التنشيط زائفة.
- عبر 6-8 حمار وحشي الكبار من كل خط باستخدام أساليب قياسية9 لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة التي تحتوي على كل من TAEL و C120 المكونات (الشكل 1B).
ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن كلا المكونين بشكل عابر من خلال الميكروينيكشن الحمض النووي مرنا أو البلازميد باستخدام الأساليب القياسية10. - جمع الأجنة في أطباق بيتري التي تحتوي على ماء البيض (60 ميكروغرام / مل ملح البحر الفوري المحيط المذاب في الماء المقطر)، مع ما يقرب من 30 جنينا لكل حالة ليتم اختبارها.
- ضع الأطباق في صندوق مقاوم للضوء أو غطيها بورق الألومنيوم لتقليل التنشيط غير المقصود بواسطة الضوء المحيط (انظر الجدول 1).
2. تحريض الضوء العالمي
- استخدم لوحة LED ذات الضوء الأزرق (465 نانومتر) لتوصيل الضوء الأزرق المنشط إلى عدة أجنة في وقت واحد.
- ضع لوحة LED نسبة إلى أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة بحيث تكون القوة الفعلية للضوء التي تتلقاها الأجنة حوالي 1.5 كيلوواط /سم2 كما تقاس بالطاقة الخفيفة ومقياس الطاقة(الشكل 2A).
- نبض الضوء على فترات من 1 ساعة على / 1 ساعة قبالة باستخدام تتابع مؤقت إذا مضيئة لأكثر من 3 ساعة للحد من خطر photodamage إلى المنشط النسخ TAEL5،8.
ملاحظة: قد تحتاج المدة الدقيقة للإضاءة إلى تحسينها لتطبيقات معينة. في هذا البروتوكول، يتم توفير أمثلة لمدة الإضاءة من 30 دقيقة، 1 ساعة، 3 ساعة، و 6 ساعة. - إزالة أغطية طبق بيتري لتقليل تشتت الضوء من التكثيف.
- ضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة التحكم في صندوق مقاوم للضوء أو تغطيها بورق الألومنيوم للتحكم في الظلام.
3. التقييم الكمي للتحريض بواسطة qRT-PCR
- إزالة الأجنة من الإضاءة بعد مدة التنشيط المطلوبة.
- استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من 30-50 ضوء تنشيط و 30-50 الأجنة الداكنة باستخدام عدة العزل الجيش الملكي النيبالي بعد تعليمات عدة.
- نقل الأجنة إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وإزالة ماء البيض الزائد. إضافة تحلل العازلة وتجانس الأجنة مع الآفات البلاستيكية.
- نقل lysate إلى عمود مجموعة المقدمة ومتابعة مع تعليمات المجموعة. انتقل فورا إلى الخطوة 3.3 أو تخزين الحمض النووي الريبي المنقى عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية.
- استخدام 1 ميكروغرام مجموع الحمض النووي الريبي لتركيب cDNA باستخدام مجموعة توليف cDNA بعد تعليمات عدة.
- خذ أنبوب PCR ذو الجدران الرقيقة 0.2 مل ، وأضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى 4 ميكرولتر من مزيج التفاعل الرئيسي 5x cDNA (يحتوي على المخزن المؤقت الأمثل ، وoligo-dT والمبرمجين العشوائيين ، وdNTPs) ، و1 ميكرولتر من محلول النسخ العكسي 20x ، والمياه الخالية من النيوكلياز إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
- ضع الأنبوب في دراجة حرارية مبرمجة على النحو التالي: 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم اضغط على 4 درجات مئوية. انتقل فورا إلى الخطوة 3.4 أو تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية.
- إعداد ردود فعل qPCR التي تحتوي على مزيج رئيسي الإنزيم الأخضر SYBR، 5 أضعاف CDNA المخفف (الخطوة 3.3)، و 325 nM من كل التمهيدي لGFP.
ملاحظة: التمهيديات المستخدمة في هذا البروتوكول كما يلي. GFP إلى الأمام: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'؛ GFP عكس: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGGATGC-3'; ef1a إلى الأمام 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a عكس: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - نفذ ردود فعل qPCR في جهاز PCR في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: برنامج PCR: التنشيط الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يليه 40 دورة من 30 s عند 95 درجة مئوية، و 30 درجة مئوية عند 60 درجة مئوية، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية. - إجراء تحليل منحنى ذوبان مرة واحدة يتم الانتهاء من PCR لتحديد خصوصية رد الفعل. إجراء ثلاث نسخ متماثلة تقنية لكل عينة.
- حساب التعريفي الضوء تنشيط كما تغيير أضعاف بالنسبة للأجنة أبقى في الظلام باستخدام 2-ΔΔCt طريقة11. يمكن تحديد الأهمية الإحصائية من خلال حزمة برامج الإحصاءات.
4. التقييم النوعي للتحريض بواسطة المجهر الفلوري
- إزالة الأجنة من الإضاءة بعد المدة المطلوبة من التنشيط.
- شل حركة الأجنة للتصوير في 3٪ ميثيلسليلوز تحتوي على 0.01٪ tricaine في شرائح الاكتئاب الزجاجي.
- احصل على صور مضانة و brightfield على منظار مجسم فلوري متصل بكاميرا رقمية باستخدام إعدادات فلتر GFP القياسية. استخدم إعدادات الحصول على صورة متطابقة لكافة العينات.
- دمج الصور مشرق وفلورسينس بعد الاستحواذ مع برامج معالجة الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لهذه المظاهرة ، C120 استجابة GFP خط مراسل (TG (C120F : GFP)ucm107))عبرت مع خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن TAEL - N في كل مكان من ubiquitin ب (ubb) المروج (Tg(ubb:TAEL -N)ucm113))لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحتوي على كلا العنصرين. 24 ساعة بعد الإخصاب، تعرضت الأجنة لتنشيط الضوء الأزرق، نبض على تردد 1 ساعة على / 1 ساعة قبالة. تم تحديد تعريف تعبير GFP كميا بواسطة qRT-PCR عند 30 دقيقة و1 ساعة و3 ح و6 ساعة بعد التنشيط(الشكل 2B والجدول 1). بالمقارنة مع السيطرة على الأجنة الشقيقة المحفوظة في الظلام ، تم الكشف عن تحريض تعبير GFP في أقرب وقت 30 دقيقة بعد التعرض للضوء الأزرق. ثم واصلت مستويات التعبير GFP لزيادة تصل إلى 6 ساعة بعد التنشيط باطراد.
كما تم تقييم تعريف GFP نوعيا من خلال فحص كثافة الفلورسينس في نفس الوقت نقاط ما بعد التنشيط(الشكل 2C-F). لوحظت لأول مرة مضان GFP فوق مستويات الخلفية عند 3 ساعة بعد التنشيط وأصبحت أكثر إشراقا بشكل ملحوظ عند 6 ساعة بعد التنشيط. وعلى النقيض من ذلك، فإن مراقبة الأجنة لجميع النقاط الزمنية التي تم الاحتفاظ بها في الظلام لم تظهر أي مضان GFP ملحوظ(الشكل 2G-J).
الشكل 1:التخطيطي لوظيفة TAEL/C120 والتصميم التجريبي. (أ) يتكون نظام TAEL/C120 من منشط نسخي يسمى TAEL تنصهر في إشارة توطين نووية (TAEL-N) وعنصر تنظيمي يستجيب ل TAEL يسمى C120 إلى جانب مروج القاعدي cFos (C120F) الذي يقود التعبير عن جين الاهتمام. النسخ المعتمد على TAEL نشط في وجود الضوء الأزرق ولكن ليس في الظلام. NLS، إشارة توطين النووية. (ب) في هذا البروتوكول، يعبر خط المعدلة وراثيا TAEL-N في كل مكان (Tg(ubb:TAEL-N)) يتم عبورها إلى خط مراسل GFP C120 يحركها (Tg(C120F:GFP)) لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة. ابتداء من 24 حصان، تتعرض الأجنة لتفعيل الضوء الأزرق لفترات مختلفة تصل إلى 6 ح الرسوم التوضيحية التي تم إنشاؤها باستخدام أداة التوضيح العلم على شبكة الإنترنت (انظر جدول المواد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:النتائج التمثيلية للتعبير الجيني المنشط للضوء مع TAEL/C120. (A) يتضمن إعداد تنشيط الضوء النموذجي مصدر ضوء LED أزرق يوضع في حاضنة. يتم وضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة حمار وحشي نسبة إلى مصدر الضوء بحيث تكون قوة الضوء المستلمة حوالي 1.5 ميجاوات / سم2 (خط منقط). تتم إزالة أغطية طبق بيتري أثناء تنشيط الضوء لتقليل تشتت الضوء. (ب)تحديد كمي لمستويات مرنا GFP بواسطة qRT-PCR في النقاط الزمنية المشار إليها بعد التنشيط مع الضوء الأزرق. يتم تقديم البيانات على أنها تحريض أضعاف GFP نسبة إلى الأجنة التحكم الأشقاء أبقى في الظلام. تمثل النقاط التكرارات البيولوجية (براثن). تمثل الأشرطة الأفقية الصلبة المتوسط. أشرطة الخطأ، الانحراف المعياري. *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001. ANOVA أحادي الاتجاه تحديد قيم p. (C-J) صور تمثيلية تظهر كثافة مضان GFP للأجنة المعرضة للضوء الأزرق(C-F)أو تبقى في الظلام(G-J). تم دمج الصور الفلورية (الخضراء) مع صور brightfield المقابلة (تدرج الرمادي): أشرطة المقياس ، 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| GFP أضعاف التعريفي الضوء الأزرق (465 نانومتر) |
GFP أضعاف التعريفي الضوء المحيط |
||||||
| الوقت بعد الإضاءة | دني | الحد الأعلى | حد أدنى | دني | الحد الأعلى | حد أدنى | قيمة p |
| 30 دقيقة | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| ساعة واحدة | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 ساعة | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 ساعة | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
الجدول 1: مقارنة التعبير الناجم عن TAEL/C120 بالضوء الأزرق والمحيط. أضعاف التعريفي من مستويات مرنا GFP بعد التعرض لتفعيل الضوء الأزرق (465 نانومتر) أو الضوء المحيط لمقدار الوقت المشار إليه، تطبيع للسيطرة على الأجنة الشقيقة أبقى في الظلام. تم قياس مستويات الحمض النووي الريبي كميا بواسطة qRT-PCR. يتم الإبلاغ عن البيانات كمتوسط تعريف أضعاف +/- الحدود العليا والسفلى. تم تحديد قيم p بواسطة عدة t-tests. ن = 3 براثن لجميع النقاط الزمنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام نظام TAEL/C120 البصري لتحقيق التعبير الجيني الأزرق غير القابل للانخزال. يتكون هذا النظام من منشط النسخ ، TAEL ، الذي يتناقص عند الإضاءة مع الضوء الأزرق وينشط نسخ جين الفائدة في المصب لعنصر تنظيمي C120. يمكن الكشف عن التعبير المستحث لمراسل GFP بعد أقل من 30 دقيقة من التعرض للضوء ، مما يشير إلى أن هذا النهج يمتلك حركية سريعة وسريعة الاستجابة نسبيا.
يمكن أن تؤثر عدة عوامل على مستويات الحث. الأكثر أهمية هي الطول الموجي وقوة تنشيط الضوء. في هذا البروتوكول، تم استخدام 465 نانومتر أضواء LED تسليمها في 1.5 W/cm2. الأطوال الموجية الأقصر والأطول (الضوء الأرجواني والأخضر، على التوالي) وطاقة الضوء المنخفض لا تنشط التعبير بشكل فعال (البيانات غير مبينة). من ناحية أخرى، يزيد المزيد من الطاقة الخفيفة من خطر فوتودامينج الأجنة. وبالتالي، من أجل الاستخدام الناجح لنظام TAEL، يجب أن يكون تنشيط الضوء (1) في النطاق الأزرق من طيف الضوء المرئي و (2) في طاقة كافية لتحقيق التوازن بين التنشيط الفعال ل TAEL مع انخفاض مخاطر الفوتوداماج. قد تختلف قوة الضوء الفعالة تبعا للظروف التجريبية، وبالتالي قد تحتاج إلى تحديد تجريبي. كما يجب توخي الحذر لحماية الأجنة من الضوء المحيط، الذي يحتوي على كمية من الضوء الأزرق، قبل التنشيط. وقد تبين أن التعبير المعتمد على TAEL/C120 يمكن أن يكون ناجما عن الضوء المحيط واسع الطيف، وإن كان بمستويات أقل بكثير مقارنة بالضوء الأزرق فقط(الجدول 1).
في حين يمكن الكشف عن التعبير GFP أولا بواسطة qPCR بعد 30 دقيقة من الإضاءة ، فإن مستويات التعبير ليست ثابتة. ومع ذلك ، فإنها تستمر في الارتفاع حتى تصل إلى ذروتها في 3 ساعة من العلاج بالضوء ، وبعد ذلك يتم الحفاظ على مستويات التعبير العالية هذه لمدة تصل إلى 6 ساعة. وتشير هذه النتائج إلى أنه بالإضافة إلى الطول الموجي وطاقة الضوء، تعتمد مستويات التعبير الناجمة عن TAEL/C120 أيضا على مدة الإضاءة، على الأقل حتى يصل النظام إلى الحد الأقصى أو حالة التشبع. وعلى النقيض من نتائج qPCR هذه، فإننا لا نلاحظ نوعيا مضان GFP القابل للزيادة إلا بعد 3 ساعة من الإضاءة، وتستمر كثافة الفلورسينس في الزيادة لمدة تصل إلى 6 ساعة من الإضاءة. من المرجح أن يفسر التناقض بين ملاحظات كثافة qPCR والفلورسينس من خلال الوقت الإضافي اللازم لتركيب GFP ، والطي ، وعوامل النضج التي من المرجح أن تختلف اعتمادا على جين الاهتمام. لذلك، قد تكون هناك حاجة إلى بعض التحسين من مدة الإضاءة اعتمادا على التطبيق.
قدم هذا البروتوكول الطريقة الأكثر مباشرة لتفعيل نظام TAEL/C120 باستخدام لوحة LED ذات الضوء الأزرق لإلقاء الضوء على أجنة حمار وحشي على مستوى العالم. ولهذه المقاربة مزايا تتمثل في سهولة الاستخدام وفعالية التكلفة. ومع ذلك، يمكن أيضا التحكم في تنشيط الضوء مكانيا إذا لزم الأمر. وقد ثبت سابقا أن التعبير الناجم عن TAEL يمكن تقييده مكانيا باستخدام طرائق متعددة لتقديم ضوء أزرق محدد من قبل المستخدم ، منقوش مكانيا5. يمكن تحقيق خصوصية مكانية إضافية باستخدام مروجين خاصين بالأنسجة لتنظيم التعبير عن المنشط النسخي TAEL6.
بالمقارنة مع أنظمة التعبير عن المخدرات أو الحرارة التي لا يمكن التغلب عليها ، فإن أنظمة التعبير البصري يمكن أن توفر زيادة في التعبير عن التحكم المكاني والزمني بشكل أفضل باستخدام الضوء كعامل محفز. بالإضافة إلى TAEL/C120، تم تطوير أنظمة نسخية أخرى تعمل بالضوء12و13و14و15. ومع ذلك، TAEL/C120 قد تكون مناسبة بشكل خاص للاستخدام في حمار وحشي (ويحتمل أن تكون أنظمة متعددة الخلايا أخرى) لعدة أسباب. أولا، يعمل المنشط النسخي TAEL كمتجانس، والذي يبسط عدد المكونات المطلوبة. وبالإضافة إلى ذلك، LOV البروتينات التي تحتوي على المجال مثل TAEL تتطلب كروموفور فلافين لامتصاص الضوء16. هذا العامل المساعد موجود داخليا داخل الخلايا الحيوانية ، مما يزيل الحاجة إلى إضافة كروموفوري خارجي كما هو الحال مع الأنظمة الأخرى. وأخيرا، من المتوقع أن يكون TAEL تنشيط قصيرة نسبيا نصف العمر من حوالي 30 ق في غياب الضوء الأزرق8،مما يتيح أكثر دقة على / إيقاف السيطرة. ومع ذلك، فإن هذا النصف العمري القصير يعني أيضا أن التعبير طويل الأجل أو المزمن سيتطلب إضاءة طويلة الأجل للأجنة، وهو ما قد يكون أو لا يكون مرغوبا فيه اعتمادا على الظروف.
وباختصار، يوضح هذا البروتوكول أن نظام TAEL/C120 هو نظام تعبير جيني أزرق يعمل بالضوء وسهل الاستخدام، ويمتلك حركية سريعة وسريعة الاستجابة، وهو مناسب بشكل خاص لتطبيقات الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر ستيفان ماترنا وأعضاء مختبري وو وماتيرانا على الاقتراحات والتعليقات المفيدة على هذا البروتوكول. نشكر آنا ريد وكيفن غاردنر ولورا موتا مينا على المناقشات القيمة والرؤى أثناء تطوير هذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة؛ R03 DK106358) ولجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا (CRN-20-636896) إلى S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
