Summary
Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.
Abstract
İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri biyolojik süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Optogenetik ekspresyon sistemleri, indükleyici madde olarak ışığı kullanarak gen ekspresyon zamanlaması, konumu ve genliği üzerinde hassas kontrol sağlayabilir. Bu protokolde zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik bir ifade sistemi kullanılmaktadır. Bu sistem, E. litoralisbakterisinden doğal olarak meydana gelen ışıkla aktive edilmiş transkripsiyon faktörüne dayanan TAEL adı verilen tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüne dayanır. Mavi ışıkla aydınlatıldığında TAEL küçültür, C120 adı verilen konyak düzenleyici elemanına bağlanır ve transkripsiyonu etkinleştirir. Bu protokol, her yerde bulunan ubb promotörünün kontrolü altında TAEL transkripsiyon faktörünü ifade eden transgenik zebra balığı embriyolarını kullanır. Aynı zamanda, C120 düzenleyici elemanı floresan bir muhabir geninin (GFP) ekspresyonunu yönlendirir. Mavi ışığı etkinleştirmek için basit bir LED panel kullanarak, GFP ekspresyonunun indüksiyonu ilk olarak 30 dakikalık aydınlatmadan sonra tespit edilebilir ve 3 saatlik ışık işleminden sonra 130 kat indüksiyondan daha yüksek bir tepeye ulaşır. Ekspresyon indüksiyonu nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve floresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem optogenetik gen ekspresyasyonu için çok yönlü ve kullanımı kolay bir yaklaşımdır.
Introduction
İndükleyici gen ekspresyon sistemleri gen ekspresyonunun miktarını, zamanlamasını ve yerini kontrol etmeye yardımcıdır. Bununla birlikte, çok hücreli organizmalarda tam olarak mekansal ve zamansal kontrole ulaşmak zor olmuştur. Zamansal kontrol en yaygın olarak küçük moleküllü bileşikler1 veya ısı şoku organizatörlerinin aktivasyonu ile elde edilir2. Yine de, her iki yaklaşım da zamanlama, indüksiyon gücü ve hedef dışı stres yanıtları sorunlarına karşı savunmasızdır. Mekansal kontrol esas olarak dokuya özgü promotörlerin kullanılmasıyla elde edilir3, ancak bu yaklaşım her zaman mevcut olmayan uygun bir promotör veya düzenleyici eleman gerektirir ve alt doku seviyesi indüksiyonu için elverişli değildir.
Bu tür geleneksel yaklaşımların aksine, ışıkla aktive edilmiş optogenetik transkripsiyonel aktivatörler gen ekspresyonunun daha ince uzamsal ve zamansal kontrolü potansiyeline sahiptir4. Mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemi zebra balığı embriyolarında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve optimize edilmiştir5,6. Bu sistem, E. litoralis7,8bakterisinden endojen ışıkla aktive edilmiş bir transkripsiyon faktörüne dayanmaktadır. TAEL/C120 sistemi, Kal-TA4 transaktivasyon etki alanı, mavi ışığa duyarlı LOV (ışık-oksijen-voltaj algılama) etki alanı ve sarmal dönüş sarmal (HTH) DNA bağlayıcı etki alanı5içeren TAEL adlı transkripsiyonel bir aktivatörden oluşur. Aydınlatıldığında, LOV etki alanları, iki TAEL molekülünün küçültmesine, TAEL duyarlı bir C120 promotörüne bağlanmasına ve ilgi çekici bir aşağı akış geninin transkripsiyonunu başlatmasına izin veren konformasyonel bir değişikliğe uğrar5,8. TAEL/C120 sistemi minimum toksisite ile hızlı ve sağlam indüksiyon sergiler ve birkaç farklı ışık dağıtım yöntemi ile etkinleştirilebilir. Son zamanlarda, TAEL/C120 sisteminde iyileştirmeler, TAEL'e (TAEL-N) nükleer bir yerelleştirme sinyali eklenerek ve C120 düzenleyici elemanı bir cFos bazal promotörüne (C120F) kaptırarak yapılmıştır (Şekil 1A). Bu değişiklikler indüksiyon seviyelerini 15 kattan fazla artırdı6.
Bu protokolde, TAEL/C120 sistemini etkinleştirmek ve bir muhabir geni olan GFP'nin her yerde ifadesini teşvik etmek için basit bir LED panel kullanılır. Ekspresyon indüksiyonu, floresan yoğunluğu gözlemlenerek veya nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak transkript seviyeleri ölçülerek nitel olarak izlenebilir. Bu protokol, TAEL/C120 sistemini, genekspresyonunun in vivo olarak sağlam bir şekilde düzenlenmesini sağlayan çok yönlü, kullanımı kolay bir araç olarak gösterecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Kaliforniya Merced Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçek gerçekleştirildi.
1. Zebra balığı geçişi ve embriyo toplama
- Sahte aktivasyonu en aza indirmek için TAEL transkripsiyonel aktivatör veya C120 kontrollü muhabir geni içeren ayrı transgenik zebra balığı hatlarını koruyun.
- Hem TAEL hem de C120 bileşenlerini içeren çift transgenik embriyo üretmek için standart yöntemler9 kullanarak her hattan 6-8 yetişkin zebra balığını çaprazlama (Şekil 1B).
NOT: Alternatif olarak, her iki bileşen de standart yöntemler kullanılarak mRNA veya plazmid DNA'nın mikroenjeksiyon yoluyla geçici olarak ifade edilebilir10. - Yumurta suyu (damıtılmış suda çözünmüş 60 μg/mL Instant Ocean deniz tuzu) içeren Petri kaplarında, test edilecek durum başına yaklaşık 30 embriyo ile embriyoları toplayın.
- Ortam ışığının istenmeyen aktivasyonunu en aza indirmek için bulaşıkları ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin veya alüminyum folyo ile örtün (bkz. Tablo 1).
2. Küresel ışık indüksiyonu
- Aynı anda birkaç embriyoya aktif mavi ışık vermek için mavi ışık (465 nm) LED panel kullanın.
- LED paneli embriyo içeren Petri kaplarına göre konumlandırın, böylece embriyolar tarafından alınan ışığın gerçek gücü, bir ışık gücü ve enerji ölçer ile ölçülen yaklaşık1,5 mW / cm 2 olacaktır (Şekil 2A).
- TAEL transkripsiyonel aktivatör5,8'e fotodamage riskini azaltmak için 3 saatten fazla aydınlatıyorsa, ışığı bir zamanlayıcı rölesi kullanarak 1 saataçık/1saat kapalı aralıklarla darbeler.
NOT: Aydınlatma süresinin belirli uygulamalar için optimize edilmesi gerekebilir. Bu protokolde 30 dk, 1 saat, 3 saat ve 6 saat aydınlatma süresi örnekleri verilmiştir. - Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın.
- Kontrol embriyoları içeren Petri kaplarını ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin veya koyu kontroller için alüminyum folyo ile örtün.
3. qRT-PCR ile indüksiyonun nicel değerlendirmesi
- İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın.
- Kitin talimatlarını takip eden bir RNA izolasyon kiti kullanarak 30-50 ışıkla aktive edilmiş ve 30-50 koyu embriyodan toplam RNA çıkarın.
- Embriyoları 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın. Lizis tamponu ekleyin ve embriyoları plastik bir pestle homojenize edin.
- Lisat'ı kit tarafından sağlanan bir sütuna aktarın ve kitin talimatlarına devam edin. Hemen 3.3 adımına geçin veya saflaştırılmış RNA'yı -20 °C ila -80 °C'de saklayın.
- Kitin talimatlarını takip eden bir cDNA sentez kiti kullanarak cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanın.
- İnce duvarlı 0,2 mL PCR tüpü alın, 4 μL 5x cDNA reaksiyon ana karışımına (optimize edilmiş tampon, oligo-dT ve rastgele astarlar ve dNTP'ler içeren), 1 μL 20x ters transkriptaz çözeltisi ve toplam 20 μL hacme çekirdeksiz su ekleyin.
- Tüpü aşağıdaki gibi programlanmış bir termosiklete yerleştirin: 10 dakika için 22 °C, 30 dakika için 42 °C, 5 dakika için 85 °C ve ardından 4 °C'de tutun. Hemen 3.4 adımına geçin veya cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
- SYBR yeşil enzim ana karışımı, 5 kat seyreltilmiş cDNA (adım 3.3) ve GFP için her astarın 325 nM'si içeren qPCR reaksiyonları hazırlayın.
NOT: Bu protokolde kullanılan primerler aşağıdaki gibi. GFP ileri: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP ters: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a ileri 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a ters: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - QPCR reaksiyonlarını gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin.
NOT: PCR programı: 10 dakika boyunca 95 °C'de ilk aktivasyon, ardından 95 °C'de 30 sn 40 döngü, 60 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dk. - Reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için PCR tamamlandığında bir eriyik eğrisi analizi gerçekleştirin. Her örnek için üç teknik çoğaltma gerçekleştirin.
- Işıkla aktive indüksiyonu, 2-ΔΔCt yöntemi11kullanılarak karanlıkta tutulan embriyolara göre kat değişimi olarak hesaplayın. İstatistiksel önemi bir istatistik yazılım paketi ile belirlenebilir.
4. Floresan mikroskopi ile indüksiyonun nitel değerlendirilmesi
- İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın.
- Cam çökelti slaytlarında %0.01 trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin.
- Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereomikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Tüm örnekler için aynı görüntü alma ayarlarını kullanın.
- Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu gösteri için, her iki elementi de içeren çift transgenik embriyo üretmek için her yerde bulunan b (ubb) promotöründen (Tg(ubb:TAEL-N) ucm113 )) TAEL-N'yi her yerde ifade eden transgenik bir çizgi ile C120 duyarlı bir GFP muhabir hattı (Tg (C120F:GFP)ucm107) geçildi. Döllenme sonrası 24 saat, embriyolar mavi ışığı aktive etmeye maruz kaldı, 1 saat açık/1 saat kapalı bir frekansta nabız attı. GFP ekspresyonunun indüksiyonu qRT-PCR ile 30 dk, 1 h, 3 h ve 6 h aktivasyon sonrası ölçüldü (Şekil 2B ve Tablo 1). Karanlıkta tutulan kardeş embriyoların kontrolü ile karşılaştırıldığında, mavi ışığa maruz kaldıktan 30 dakika sonra GFP ekspresyonunun indüksiyonu tespit edildi. GFP ifade düzeyleri daha sonra aktivasyon sonrası 6 h'ye kadar artmaya devam etti.
GFP indüksiyonu da aktivasyon sonrası aynı zamanda floresan yoğunluğu incelenerek niteliksel olarak değerlendirildi (Şekil 2C-F). Arka plan seviyelerinin üzerindeki GFP floresan ilk olarak aktivasyon sonrası 3 saat olarak gözlendi ve aktivasyon sonrası 6 saat sonra belirgin şekilde daha parlak hale geldi. Buna karşılık, karanlıkta tutulan tüm zaman noktaları için kontrol embriyoları kayda değer bir GFP floresan sergilemedi (Şekil 2G-J).
Şekil 1: TAEL/C120 fonksiyonunun şeması ve deneysel tasarım. (A) TAEL/C120 sistemi, nükleer lokalizasyon sinyaline (TAEL-N) kaynaşmış TAEL adı verilen transkripsiyonel bir aktivatörden ve ilgi çekici bir genin cFos bazal promotörü (C120F) sürüş ifadesiyle birleştirilmiş C120 adlı TAEL duyarlı bir düzenleyici unsurdan oluşur. TAEL'e bağımlı transkripsiyon mavi ışığın varlığında aktiftir, ancak karanlıkta değildir. NLS, nükleer bölgeleme sinyali. (B) Bu protokolde, çift transgenik embriyo üretmek için tael-N'yi her yerde ifade eden transgenik bir çizgi (Tg(ubb:TAEL-N)) C120 tahrikli bir GFP muhabir hattına (Tg (C120F:GFP)geçilir. 24 hpf'den başlayarak, embriyolar web tabanlı bir bilim illüstrasyon aracıyla oluşturulan 6 h illüstrasyona kadar çeşitli sürelerde mavi ışığı etkinleştirmeye maruz kalır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TAEL/C120 ile ışıkla aktive gen ekspresyonunun temsili sonuçları. (A) Tipik bir ışık aktivasyon kurulumu, bir inkübatöre yerleştirilen mavi bir LED ışık kaynağı içerir. Zebra balığı embriyoları içeren petri kapları ışık kaynağına göre konumlandırılmıştır, böylece alınan ışık gücü yaklaşık 1,5 mW /cm2 'dir (noktalı çizgi). Petri kabı kapakları, ışık saçılmalarını en aza indirmek için ışık aktivasyonu sırasında çıkarılır. (B) GFP mRNA seviyelerinin mavi ışıkla aktivasyondan sonra belirtilen zaman noktalarında qRT-PCR ile ölçülmesi. Veriler, karanlıkta tutulan kardeş kontrol embriyolarına göre GFP kat indüksiyonu olarak sunulur. Noktalar biyolojik çoğalır (kavramalar) temsil eder. Düz yatay çubuklar ortalamayı temsil eder. Hata çubukları, standart sapma. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Tek yönlü ANOVA belirlenen p değerleri. (C-J) Mavi ışığa (C-F) maruz kalan veya karanlıkta tutulan embriyoların GFP floresan yoğunluğunu gösteren temsili görüntüler (G-J). Floresan görüntüler (yeşil) ilgili brightfield görüntüleri (gri tonlamalı) ile birleştirildi: ölçek çubukları, 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| GFP Kat İndüksiyonu Mavi ışık (465 nm) |
GFP Kat İndüksiyonu Ortam ışığı |
||||||
| Zaman Sonrası Aydınlatma | Demek | Üst sınır | Alt sınır | Demek | Üst sınır | Alt sınır | p değeri |
| 30 dk | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 saat | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 saat | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 saat | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tablo 1: TAEL/C120 kaynaklı ifadenin mavi ve ortam ışığı ile karşılaştırılması. GFP mRNA seviyelerinin indüksiyonunu, karanlıkta tutulan kardeş embriyoları kontrol etmek için normalleştirilen, belirtilen süre boyunca mavi ışığın (465 nm) veya ortam ışığının aktivesine maruz kaldıktan sonra katlayın. mRNA düzeyleri qRT-PCR ile ölçülmektedir. Veriler ortalama kat indüksiyon +/- üst ve alt limitler olarak rapor edilir. p değerleri birden çok t -testile belirlendi. n = Tüm zaman noktaları için 3 kavrama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, mavi ışık indüklüze gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik TAEL/C120 sisteminin kullanımını açıklar. Bu sistem, mavi ışıkla aydınlatıldıktan sonra küçülen ve bir C120 düzenleyici elemanının aşağı akışa giren bir ilgi geninin transkripsiyonunu etkinleştiren transkripsiyonel bir aktivatör olan TAEL'den oluşur. Bir GFP muhabirinin indüklenmiş ifadesi, 30 dakika kadar kısa bir ışık maruziyeti sonrasında tespit edilebilir, bu da bu yaklaşımın nispeten hızlı ve duyarlı kinetiklere sahip olduğunu düşündürmektedir.
Çeşitli faktörler indüksiyon seviyelerini etkileyebilir. En kritik olanı ışığı aktive etmenin dalga boyu ve gücü. Bu protokolde 1,5 W/cm2'de teslim edilen 465 nm LED ışık kullanılmıştır. Daha kısa ve daha uzun dalga boyları (sırasıyla mor ve yeşil ışık) ve düşük ışık gücü ifadeyi etkili bir şekilde etkinleştirmez (veriler gösterilmez). Öte yandan, daha fazla ışık gücü embriyoların fotodamaging riskini artırır. Bu nedenle, TAEL sisteminin başarılı kullanımı için, ışığın etkinleştirilmesi (1) görünür ışık spektrumunun mavi aralığında ve (2) TAEL'in fotodamage riskinin azaltılmasıyla etkili aktivasyonunu dengelemek için yeterli güçte olmalıdır. Etkili ışık gücü deneysel koşullara bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir. Ayrıca, aktivasyondan önce embriyoları bir miktar mavi ışık içeren ortam ışığından korumaya da özen edilmelidir. TAEL/C120'ye bağımlı ifadenin, yalnızca mavi ışığa kıyasla çok daha düşük seviyelerde de olsa geniş spektrumlu ortam ışığı ile indüklenebildiği bulunmuştur(Tablo 1).
GFP ifadesi ilk olarak 30 dakikalık aydınlatmadan sonra qPCR tarafından algılanabilirken, ifade seviyeleri sabit değildir. Yine de, 3 saat ışık tedavisinde zirveye ulaşana kadar yükselmeye devam ederler, daha sonra bu yüksek ifade seviyeleri 6 saate kadar korunur. Bu sonuçlar, dalga boyu ve ışık gücüne ek olarak, TAEL/C120 kaynaklı ifade seviyelerinin de en azından sistem maksimum veya doygunluk durumuna ulaşana kadar aydınlatma süresine bağlı olduğunu göstermektedir. Bu qPCR sonuçlarının aksine, 3 saat aydınlatmadan sonrasına kadar kayda değer GFP floresanını niteliksel olarak gözlemlemiyoruz ve floresan yoğunluğu 6 saate kadar aydınlatma için artmaya devam ediyor. qPCR ve floresan yoğunluğu gözlemleri arasındaki tutarsızlık, büyük olasılıkla ilgi genine bağlı olarak değişmesi muhtemel GFP sentezi, katlama ve olgunlaşma faktörleri için gereken ek süre ile açıklanmaktadır. Bu nedenle, uygulamaya bağlı olarak aydınlatma süresinin bir miktar optimizasyonu gerekebilir.
Bu protokol, zebra balığı embriyolarını küresel olarak aydınlatmak için mavi ışıklı bir LED panel kullanarak TAEL/C120 sistemini etkinleştirmek için en basit yöntemi sundu. Bu yaklaşım hem kullanım kolaylığı hem de maliyet etkinliği avantajlarına sahiptir. Bununla birlikte, gerekirse ışık aktivasyonu da mekansal olarak kontrol edilebilir. Daha önce TAEL kaynaklı ifadenin, kullanıcı tanımlı, mekansal desenli mavi ışık5sunmak için birden fazla modalite kullanılarak mekansal olarak kısıtlanabileceği gösterilmiştir. TAEL transkripsiyonel aktivatör6'nınekspresyonunu düzenlemek için dokuya özgü promotörler kullanılarak ek mekansal özgüllük elde edilebilir.
İlaç veya ısı şoku indükleyici ifade sistemleri ile karşılaştırıldığında, optogenetik ekspresyon sistemleri potansiyel olarak ışığı indükleyici madde olarak kullanarak daha iyi uzamsal ve zamansal kontrol aşırı ekspresyonu sunar. TAEL/C120'ye ek olarak, diğer ışıkla aktive edilmiş transkripsiyonel sistemlergeliştirilmiştir 12,13,14,15. Bununla birlikte, TAEL/C120 çeşitli nedenlerden dolayı zebra balıklarında (ve potansiyel olarak diğer çok hücreli sistemlerde) kullanım için özellikle uygun olabilir. İlk olarak, TAEL transkripsiyonel aktivatör, gerekli bileşenlerin sayısını basitleştiren bir homodimer olarak işlev eder. Ek olarak, TAEL gibi LOV alan adı içeren proteinler ışık emilimi için bir flavin kromofor gerektirir16. Bu kofaktör hayvan hücrelerinde endojen olarak bulunur ve diğer sistemlerde olduğu gibi ekzojen bir kromofor ekleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Son olarak, etkinleştirilen TAEL'in mavi ışık8'inyokluğunda yaklaşık 30 sn'lik nispeten kısa bir yarı ömrlüye sahip olduğu tahmin edilir ve bu da daha hassas açık /kapalı kontrol sağlar. Bununla birlikte, bu kısa yarı ömür aynı zamanda uzun süreli veya kronik ifadenin embriyoların uzun süreli aydınlatılmasını gerektireceği anlamına gelir, bu da koşullara bağlı olarak istenebilir veya istenmeyebilir.
Özetle, bu protokol TAEL/C120 sisteminin kullanımı kolay, hızlı ve duyarlı kinetiklere sahip ve özellikle in vivo uygulamalar için çok uygun olan mavi ışıkla etkinleştirilen bir gen ekspresyon sistemi olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan edildi.
Acknowledgments
Stefan Materna'ya ve Woo ve Materna laboratuvarlarının üyelerine bu protokolle ilgili yararlı öneriler ve yorumlar için teşekkür ederiz. Anna Reade, Kevin Gardner ve Laura Motta-Mena'ya bu protokolü geliştirirken değerli tartışmalar ve içgörüler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH; R03 DK106358) ve Kaliforniya Üniversitesi Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (CRN-20-636896) 'a S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
