Summary
Optogenetica is een krachtig hulpmiddel met uiteenlopende toepassingen. Dit protocol demonstreert hoe licht-induceerbare genexpressie in zebravisembryo's kan worden bereikt met behulp van het blauw licht-responsieve TAEL / C120-systeem.
Abstract
Induceerbare genexpressiesystemen zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van biologische processen. Optogenetische expressiesystemen kunnen nauwkeurige controle bieden over de timing, locatie en amplitude van genexpressie met behulp van licht als het inducerende agens. In dit protocol wordt een optogenetisch expressiesysteem gebruikt om licht-induceerbare genexpressie te bereiken in zebravisembryo's. Dit systeem vertrouwt op een gemanipuleerde transcriptiefactor genaamd TAEL op basis van een natuurlijk voorkomende lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis. Wanneer het wordt verlicht met blauw licht, dimt TAEL, bindt het zich aan het verwante regulerende element C120 en activeert het transcriptie. Dit protocol maakt gebruik van transgene zebravisembryo's die de TAEL-transcriptiefactor tot expressie komen onder controle van de alomtegenwoordige ubb-promotor. Tegelijkertijd drijft het C120-regulerende element de expressie van een fluorescerend reporter-gen (GFP) aan. Met behulp van een eenvoudig LED-paneel om activerend blauw licht te leveren, kan de inductie van GFP-expressie eerst worden gedetecteerd na 30 minuten verlichting en bereikt een piek van meer dan 130-voudige inductie na 3 uur lichtbehandeling. Expressie-inductie kan worden beoordeeld door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is een veelzijdige en eenvoudig te gebruiken aanpak voor optogenetische genexpressie.
Introduction
Induceerbare genexpressiesystemen helpen de hoeveelheid, timing en locatie van genexpressie te beheersen. Het bereiken van exacte ruimtelijke en temporele controle in meercellige organismen was echter een uitdaging. Temporele controle wordt meestal bereikt door toevoeging van verbindingen met kleine moleculen1 of activering van hitteschokpromotors2. Toch zijn beide benaderingen kwetsbaar voor problemen met timing, inductiesterkte en stressreacties buiten het doel. Ruimtelijke controle wordt voornamelijk bereikt door het gebruik van weefselspecifieke promotors3, maar deze aanpak vereist een geschikt promotor- of regulerend element, dat niet altijd beschikbaar is en niet bevorderlijk is voor inductie op subweefselniveau.
In tegenstelling tot dergelijke conventionele benaderingen hebben lichtgeactiveerde optogenetische transcriptionele activatoren het potentieel voor fijnere ruimtelijke en temporele controle van genexpressie4. Het blauw licht-responsieve TAEL/C120 systeem is ontwikkeld en geoptimaliseerd voor gebruik in zebravis embryo's5,6. Dit systeem is gebaseerd op een endogene lichtgeactiveerde transcriptiefactor van de bacterie E. litoralis7,8. Het TAEL/C120-systeem bestaat uit een transcriptionele activator genaamd TAEL die een Kal-TA4-transactivatiedomein, een blauw licht-responsief LOV-domein (light-oxygen-voltage sensing) en een helix-turn-helix (HTH) DNA-bindend domeinbevat 5. Wanneer ze worden verlicht, ondergaan de LOV-domeinen een conformatieverandering waardoor twee TAEL-moleculen kunnen dimmeriseren, binden aan een TAEL-responsieve C120-promotor en transcriptie van een downstream-gen van belang kunnen initiëren5,8. Het TAEL/C120-systeem vertoont een snelle en robuuste inductie met minimale toxiciteit en kan worden geactiveerd door verschillende lichtafgiftemodaliteiten. Onlangs zijn verbeteringen aan het TAEL/C120-systeem aangebracht door een nucleair lokalisatiesignaal toe te voegen aan TAEL (TAEL-N) en door het C120-regulerende element te koppelen aan een cFos basale promotor (C120F) (Figuur 1A). Deze aanpassingen verbeterden de inductieniveaus met meer dan 15-voudig6.
In dit protocol wordt een eenvoudig LED-paneel gebruikt om het TAEL/C120-systeem te activeren en de alomtegenwoordige expressie van een reporter-gen, GFP, te induceren. Expressie-inductie kan kwalitatief worden gemonitord door fluorescentie-intensiteit te observeren of kwantitatief door transcriptniveaus te meten met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Dit protocol demonstreert het TAEL/C120-systeem als een veelzijdig, gebruiksvriendelijk hulpmiddel dat een robuuste regulatie van genexpressie in vivomogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California Merced.
1. Zebraviskruising en embryoverzameling
- Onderhoud afzonderlijke transgene zebravislijnen die de TAEL-transcriptionele activator of het C120-gecontroleerde reporter-gen bevatten om onechte activering te minimaliseren.
- Kruis 6-8 volwassen zebravissen van elke lijn met behulp van standaardmethoden9 om dubbele transgene embryo's te produceren die zowel de TAEL- als de C120-componenten bevatten(figuur 1B).
OPMERKING: Als alternatief kunnen beide componenten tijdelijk tot expressie worden gebracht door micro-injectie van mRNA of plasmide-DNA met behulp van standaardmethoden10. - Verzamel embryo's in petrischalen met eiwater (60 μg / ml Instant Ocean zeezout opgelost in gedestilleerd water), met ongeveer 30 embryo's per aandoening die moeten worden getest.
- Plaats de schotels in een lichtdichte doos of dek af met aluminiumfolie om onbedoelde activering door omgevingslicht te minimaliseren (zie tabel 1).
2. Globale lichtinductie
- Gebruik een blauw licht (465 nm) LED-paneel om activerend blauw licht aan meerdere embryo's tegelijk te leveren.
- Plaats het LED-paneel ten opzichte van de petrischalen met embryo's zo dat de werkelijke lichtkracht die door de embryo's wordt ontvangen ongeveer 1,5 mW / cm2 is, gemeten door een lichtvermogens- en energiemeter (figuur 2A).
- Pulseer het licht met intervallen van 1 uur aan / 1 uur uit met behulp van een timerrelais als het langer dan 3 uur verlicht om het risico op fotoschade voor de TAEL transcriptionele activator5,8te verminderen.
OPMERKING: De exacte duur van de verlichting moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor specifieke toepassingen. In dit protocol worden voorbeelden gegeven van verlichtingsduur van 30 minuten, 1 uur, 3 uur en 6 uur. - Verwijder de deksels van petrischaaltjes om lichtverstrooiing door condensatie te minimaliseren.
- Plaats petrischaaltjes met controle-embryo's in een lichtdichte doos of dek af met aluminiumfolie voor donkere controles.
3. Kwantitatieve beoordeling van inductie door qRT-PCR
- Verwijder embryo's van verlichting na de gewenste activeringsduur.
- Extraheer totaal RNA uit 30-50 lichtgeactiveerde en 30-50 donkere embryo's met behulp van een RNA-isolatiekit volgens de instructies van de kit.
- Breng embryo's terug naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en verwijder overtollig eiwater. Voeg lysisbuffer toe en homogeniseer de embryo's met een plastic stamper.
- Breng het lysaat over naar een door de kit meegeleverde kolom en ga verder met de instructies van de kit. Ga onmiddellijk verder met stap 3.3 of bewaar gezuiverd RNA bij -20 °C tot -80 °C.
- Gebruik 1 μg totaal RNA voor cDNA-synthese met behulp van een cDNA-synthesekit volgens de instructies van de kit.
- Neem een dunwandige 0,2 ml PCR-buis, voeg 1 μg RNA toe aan 4 μL 5x cDNA-reactiemastermix (met geoptimaliseerde buffer, oligo-dT en willekeurige primers en dNTPs), 1 μL 20x reverse transcriptase-oplossing en nucleasevrij water tot een totaal volume van 20 μL.
- Plaats de buis in een thermocycler die als volgt is geprogrammeerd: 22 °C gedurende 10 minuten, 42 °C gedurende 30 minuten, 85 °C gedurende 5 minuten en houd deze vervolgens op 4 °C. Ga onmiddellijk verder met stap 3.4 of bewaar cDNA bij -20 °C.
- Bereid qPCR-reacties voor die SYBR groene enzymmastermix, 5-voudig verdund cDNA (stap 3.3) en 325 nM van elke primer voor GFP bevatten.
OPMERKING: Primers die in dit protocol als volgt worden gebruikt. GFP voorwaarts: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP omgekeerd: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a voorwaarts 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a omgekeerd: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'). - Voer qPCR-reacties uit in een real-time PCR-machine.
OPMERKING: PCR-programma: initiële activering bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 95 °C, 30 s bij 60 °C en 1 min bij 72 °C. - Voer een smeltcurveanalyse uit zodra de PCR is voltooid om de reactiespecifiekheid te bepalen. Voer drie technische replicaties uit voor elk monster.
- Bereken lichtgeactiveerde inductie als vouwverandering ten opzichte van embryo's die in het donker worden gehouden met behulp van de 2-ΔΔCt-methode 11. Statistische significantie kan worden bepaald met een statistisch softwarepakket.
4. Kwalitatieve beoordeling van inductie door fluorescentiemicroscopie
- Verwijder de embryo's uit de verlichting na de gewenste activeringsduur.
- Immobiliseer embryo's voor beeldvorming in 3% methylcellulose met 0,01% tricaïne in glazen depressieglaasjes.
- Verkrijg fluorescentie- en brightfieldbeelden op een fluorescerende stereomicroscoop die is aangesloten op een digitale camera met behulp van standaard GFP-filterinstellingen. Gebruik identieke instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen voor alle voorbeelden.
- Voeg brightfield- en fluorescentiebeelden na de acquisitie samen met beeldverwerkingssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor deze demonstratie werd een C120-responsieve GFP-reporterlijn (Tg (C120F: GFP)ucm107) gekruistmet een transgene lijn die TAEL-N alomtegenwoordig uitdrukt van de ubiquitine b (ubb) promotor (Tg (ubb: TAEL-N)ucm113)) om dubbele transgene embryo's te produceren die beide elementen bevatten. 24 uur na de bevruchting werden de embryo's blootgesteld aan het activeren van het blauwe licht, gepulseerd met een frequentie van 1 uur op / 1 uur uit. Inductie van GFP-expressie werd gekwantificeerd door qRT-PCR na 30 minuten, 1 uur, 3 uur en 6 uur na activering(figuur 2B en tabel 1). Vergeleken met controlebroer-embryo's die in het donker werden gehouden, werd inductie van GFP-expressie gedetecteerd zodra 30 minuten na de blootstelling aan blauw licht. De niveaus van GFP-expressie bleven vervolgens tot 6 uur na activering gestaag toenemen.
GFP-inductie werd ook kwalitatief beoordeeld door de fluorescentie-intensiteit op dezelfde tijdstippen na activering te onderzoeken (figuur 2C-F). GFP-fluorescentie boven achtergrondniveaus werd voor het eerst waargenomen na 3 uur na activering en werd merkbaar helderder na 6 uur na activering. Controle-embryo's voor alle tijdstippen die in het donker werden gehouden, vertoonden daarentegen geen merkbare GFP-fluorescentie (Figuur 2G-J).
Figuur 1: Schema van TAEL/C120-functie en experimenteel ontwerp. (A) Het TAEL/C120-systeem bestaat uit een transcriptionele activator genaamd TAEL gefuseerd met een nucleair lokalisatiesignaal (TAEL-N) en een TAEL-responsief regulerend element genaamd C120 gekoppeld aan een cFos basale promotor (C120F) die de expressie van een gen van belang aandrijft. TAEL-afhankelijke transcriptie is actief in de aanwezigheid van blauw licht, maar niet in het donker. NLS, nucleair lokalisatiesignaal. (B) In dit protocol wordt een transgene lijn TAEL-N alomtegenwoordig (Tg(ubb:TAEL-N)) gekruist naar een C120-aangedreven GFP-reporterlijn(Tg(C120F:GFP)) om dubbele transgene embryo's te produceren. Vanaf 24 hpf worden de embryo's blootgesteld aan activerend blauw licht voor verschillende duur tot 6 uur-illustraties gemaakt met een webgebaseerde wetenschappelijke illustratietool (zie Tabel met materialen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van lichtgeactiveerde genexpressie met TAEL/C120. (A) Een typische lichtactiveringsopstelling omvat een blauwe LED-lichtbron die in een incubator wordt geplaatst. Petrischalen met zebravisembryo's worden ten opzichte van de lichtbron zo geplaatst dat het ontvangen lichtvermogen ongeveer 1,5 mW/cm2 (stippellijn) is. Petrischaaldeksels worden verwijderd tijdens lichtactivering om lichtverstrooiing te minimaliseren. (B) Kwantificering van GFP-mRNA-niveaus door qRT-PCR op de aangegeven tijdstippen na activering met blauw licht. Gegevens worden gepresenteerd als GFP-vouwinductie ten opzichte van embryo's van broers en zussen die in het donker worden gehouden. Stippen vertegenwoordigen biologische replicaties (koppelingen). Massieve horizontale balken vertegenwoordigen het gemiddelde. Foutbalken, standaarddeviatie. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Eenrichtings-ANOVA bepaalde p-waarden. (C-J) Representatieve beelden met GFP-fluorescentie-intensiteit van embryo's blootgesteld aan blauw licht (C-F) of in het donker gehouden (G-J). Fluorescerende beelden (groen) zijn samengevoegd met overeenkomstige brightfield-afbeeldingen (grijswaarden): schaalbalken, 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| GFP Vouw inductie Blauw licht (465 nm) |
GFP Vouw inductie Omgevingslicht |
||||||
| Tijd Na-verlichting | Bedoelen | Bovengrens | Ondergrens | Bedoelen | Bovengrens | Ondergrens | p-waarde |
| 30 min. | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 u | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 u | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 u | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
Tabel 1: Vergelijking van TAEL/C120-geïnduceerde expressie door blauw en omgevingslicht. Vouwinductie van GFP-mRNA-niveaus na blootstelling aan activerend blauw licht (465 nm) of omgevingslicht gedurende de aangegeven hoeveelheid tijd, genormaliseerd om embryo's van broers en zussen in het donker te beheersen. mRNA-niveaus werden gekwantificeerd door qRT-PCR. Gegevens worden gerapporteerd als gemiddelde vouwinductie +/- boven- en ondergrenzen. p-waarden werden bepaald door meerdere t-tests. n = 3 koppelingen voor alle tijdstippen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van het optogenetische TAEL/C120-systeem om blauw licht-induceerbare genexpressie te bereiken. Dit systeem bestaat uit een transcriptionele activator, TAEL, die dimeriseert bij verlichting met blauw licht en transcriptie activeert van een gen van belang stroomafwaarts van een C120-regulerend element. Geïnduceerde expressie van een GFP-reporter kan worden gedetecteerd na slechts 30 minuten blootstelling aan licht, wat suggereert dat deze aanpak relatief snelle en responsieve kinetiek bezit.
Verschillende factoren kunnen de inductieniveaus beïnvloeden. Het meest kritisch zijn de golflengte en het vermogen van het activeren van licht. In dit protocol werden 465 nm LED-lampen gebruikt die werden geleverd bij 1,5 W/cm2. Kortere en langere golflengten (respectievelijk paars en groen licht) en een lager lichtvermogen activeren de expressie niet effectief (gegevens worden niet weergegeven). Aan de andere kant verhoogt meer lichtkracht het risico op fotodamaging van de embryo's. Voor een succesvol gebruik van het TAEL-systeem moet het activerende licht dus (1) in het blauwe bereik van het zichtbare lichtspectrum en (2) voldoende vermogen hebben om een effectieve activering van TAEL in evenwicht te brengen met een verminderd risico op fotoschade. Effectief lichtvermogen kan variëren afhankelijk van experimentele omstandigheden en moet dus mogelijk empirisch worden bepaald. Er moet ook voor worden gezorgd dat embryo's worden beschermd tegen omgevingslicht, dat een bepaalde hoeveelheid blauw licht bevat, vóór activering. Het is gebleken dat TAEL/C120-afhankelijke expressie kan worden geïnduceerd door breedspectrum omgevingslicht, zij het op veel lagere niveaus in vergelijking met alleen blauw licht(tabel 1).
Hoewel GFP-expressie voor het eerst kan worden gedetecteerd door qPCR na 30 minuten verlichting, zijn de expressieniveaus niet stabiel. Toch blijven ze stijgen totdat ze een piek bereiken bij 3 uur lichtbehandeling, waarna deze hoge expressieniveaus tot 6 uur worden gehandhaafd. Deze resultaten suggereren dat, naast golflengte en lichtvermogen, TAEL/C120-geïnduceerde expressieniveaus ook afhankelijk zijn van de verlichtingsduur, ten minste totdat het systeem een maximale of verzadigingstoestand bereikt. In tegenstelling tot deze qPCR-resultaten, observeren we kwalitatief geen merkbare GFP-fluorescentie tot na 3 uur verlichting, en de fluorescentie-intensiteit blijft toenemen tot 6 uur verlichting. De discrepantie tussen de qPCR- en fluorescentie-intensiteitswaarnemingen wordt waarschijnlijk verklaard door de extra tijd die nodig is voor GFP-synthese, vouwing en rijpingsfactoren die waarschijnlijk variëren afhankelijk van het gen van belang. Daarom kan enige optimalisatie van de verlichtingsduur nodig zijn, afhankelijk van de toepassing.
Dit protocol presenteerde de meest eenvoudige methode voor het activeren van het TAEL / C120-systeem met behulp van een blauwlicht LED-paneel om zebravisembryo's wereldwijd te verlichten. Deze aanpak heeft de voordelen van zowel gebruiksgemak als kosteneffectiviteit. De lichtactivering kan echter ook ruimtelijk worden geregeld als dat nodig is. Eerder werd aangetoond dat TAEL-geïnduceerde expressie ruimtelijk kon worden beperkt met behulp van meerdere modaliteiten om door de gebruiker gedefinieerd, ruimtelijk patroon blauw licht te leveren5. Extra ruimtelijke specificiteit kan worden bereikt met behulp van weefselspecifieke promotors om de expressie van de TAEL transcriptionele activator te reguleren6.
In vergelijking met medicijn- of hitteschok-induceerbare expressiesystemen bieden optogenetische expressiesystemen mogelijk een betere ruimtelijke en temporele controle overexpressie door licht als inducerend middel te gebruiken. Naast TAEL/C120 zijn er nog andere lichtgeactiveerde transcriptiesystemen ontwikkeld12,13,14,15. TAEL/C120 kan echter om verschillende redenen bijzonder geschikt zijn voor gebruik in zebravissen (en mogelijk andere meercellige systemen). Ten eerste functioneert de TAEL transcriptionele activator als een homodimeer, wat het aantal vereiste componenten vereenvoudigt. Bovendien vereisen LOV-domeinbevattende eiwitten zoals TAEL een flavine chromofoor voor lichtabsorptie16. Deze cofactor is endogeen aanwezig in dierlijke cellen, waardoor het niet nodig is om een exogene chromofoor toe te voegen zoals bij andere systemen. Ten slotte wordt voorspeld dat geactiveerd TAEL een relatief korte halfwaardetijd van ongeveer 30 s zal hebben in afwezigheid van blauw licht8,waardoor een nauwkeurigere aan / uit-regeling mogelijk is. Deze korte halfwaardetijd betekent echter ook dat langdurige of chronische expressie langdurige verlichting van embryo's vereist, wat al dan niet wenselijk kan zijn, afhankelijk van de omstandigheden.
Samenvattend toont dit protocol aan dat het TAEL/C120-systeem een door blauw licht geactiveerd genexpressiesysteem is dat gemakkelijk te gebruiken is, een snelle en responsieve kinetiek bezit en bijzonder geschikt is voor in vivo toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
We bedanken Stefan Materna en leden van de Woo- en Materna-laboratoria voor nuttige suggesties en opmerkingen over dit protocol. We bedanken Anna Reade, Kevin Gardner en Laura Motta-Mena voor waardevolle discussies en inzichten tijdens het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) en de University of California Cancer Research Coordinating Committee (CRN-20-636896) aan S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
