Summary
光遺伝学は、幅広いアプリケーションを備えた強力なツールです。このプロトコルは、青色の光応答性TAEL/C120系を用いてゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成する方法を示している。
Abstract
誘導可能な遺伝子発現系は、生物学的プロセスを研究するための非常に貴重なツールです。光遺伝学的発現系は、誘導剤として光を用いた遺伝子発現タイミング、位置、振幅を精密に制御できる。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成するために光遺伝学的発現系が用いられる。このシステムは、細菌 E.リトオラリスからの自然発生する光活性化転写因子に基づいてTAELと呼ばれる設計された転写因子に依存する。青色光で照らされると、TAELは二量体化し、C120と呼ばれるその同結合調節要素に結合し、転写を活性化する。このプロトコルは、ユビキタス ubb プロモーターの制御下でTAEL転写因子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用する。同時に、C120調節エレメントは、蛍光レポーター遺伝子(GFP)の発現を駆動します。青色光を活性化するシンプルなLEDパネルを使用して、GFP発現の誘導は、最初に30分後の照明の後に検出することができ、3時間の光処理後に130倍以上の誘導のピークに達します。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)および蛍光顕微鏡法により評価することができます。この方法は、光遺伝学的遺伝子発現のための多目的かつ使いやすいアプローチです。
Introduction
誘導可能な遺伝子発現システムは、遺伝子発現量、タイミング、位置を制御するのに役立ちます。しかし、多細胞生物の空間的・時間的制御を正確に行うのも困難でした。時間制御は、最も一般的には、低分子化合物1 またはヒートショックプロモーター2の活性化を加えることによって達成される。それでも、どちらのアプローチもタイミング、誘導強度、およびオフターゲットのストレス応答の問題に対して脆弱です。空間制御は、主に組織特異的プロモーター3の使用によって達成されるが、このアプローチは、常に利用可能ではない適切なプロモーターまたは調節要素を必要とし、サブ組織レベルの誘導を助長しない。
このような従来のアプローチとは対照的に、光活性化光遺伝学的転写活性化剤は、遺伝子発現の空間的および時間的制御を細かくする可能性を有する。青色の光応答性TAEL/C120システムは、ゼブラフィッシュ胚5,6での使用に最適化された。このシステムは、細菌由来の細菌E.リソラリス7,8からの内因性光活性化転写因子に基づいている。TAEL/C120システムは、TAELと呼ばれる転写活性化剤で構成されており、これは、カル-TA4トランスアクティベートドメイン、青色光応答性LOV(光-酸素電圧センシング)ドメイン、およびらせん旋回らせん(HTH)DNA結合ドメイン5を含む。照射されると、LOVドメインは、2つのTAEL分子が二量体化し、TAEL応答性C120プロモーターに結合し、対象となる下流遺伝子の転写を開始することを可能にする立体構造変化を受ける5,8。TAEL/C120システムは、毒性を最小限に抑えた迅速かつ強い誘導を示し、いくつかの異なる光送達モダリティによって活性化することができます。最近、TAEL/C120系の改良は、核局在化シグナルをTAEL(TAEL-N)に加え、C120調節要素をcFos基底プロモーター(C120F)に結合させることによって行われた(図1A)。これらの改変は、誘導レベルを15倍以上6倍に改善した。
このプロトコルでは、TAEL/C120システムを活性化し、レポーター遺伝子GFPのユビキタス発現を誘導するために、シンプルなLEDパネルが使用されます。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いて転写レベルを測定することにより、蛍光強度を観察するか定量的に観察することにより、定性的にモニタリングすることができる。このプロトコルは 、In vivoでの遺伝子発現の堅牢な調節を可能にする、多目的で使いやすいツールとしてTAEL/C120システムを実証する。
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Protocol
この研究は、カリフォルニア大学マーセド校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。
1. ゼブラフィッシュの交差と胚のコレクション
- TAEL転写活性化剤またはC120制御レポーター遺伝子のいずれかを含む別々のトランスジェニックゼブラフィッシュラインを維持し、スプリアス活性化を最小限に抑えます。
- TAELとC120成分の両方を含む二重トランスジェニック胚を生成するために、標準的な方法9を使用して各ラインから6〜8個の成体ゼブラフィッシュを渡る(図1B)。
注:あるいは、両方の成分は、標準的な方法10を用いてmRNAまたはプラスミドDNAのマイクロインジェクションを通じて一過性に発現することができる。 - 卵水(蒸留水に溶解した60μg/mLインスタントオーシャン海塩)を含むペトリ皿に胚を収集し、テストする条件ごとに約30個の胚をテストします。
- 防光ボックスに皿を置くか、アルミホイルで覆い、周囲光による意図しない活性化を最小限に抑えます( 表1参照)。
2. グローバルな光誘導
- 青色光(465 nm)のLEDパネルを使用して、一度に複数の胚に青色光を活性化します。
- 胚を含むペトリ皿に対してLEDパネルを配置して、胚が受け取る光の実際の電力が光パワーとエネルギーメーターで測定される約1.5mW/cm2になるように配置する(図2A)。
- TAEL転写活性化剤5,8への光損傷のリスクを低減するために3時間以上照らす場合は、タイマーリレーを使用して1時間/1時間の間隔で光をパルスする。
注: イルミネーションの正確な持続時間は、特定のアプリケーションに合わせて最適化する必要があります。このプロトコルでは、30分、1時間、3時間、および6時間の照射持続時間の例が提供される。 - ペトリ皿の蓋を取り外して、結露による光の散乱を最小限に抑えます。
- コントロール胚を含むペトリ皿を防明箱に入れるか、暗いコントロールのためにアルミホイルで覆います。
qRT-PCRによる誘導の定量的評価
- 目的の活性化持続時間の後に、胚を照明から除去します。
- キットの指示に従ってRNA分離キットを使用して、30-50光活性化および30〜50個の暗い胚から総RNAを抽出します。
- 胚を1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移し、余分な卵水を取り除きます。リシスバッファーを追加し、プラスチックの害虫で胚を均質化します。
- ライセートをキット提供のコラムに移し、キットの指示に従います。直ちにステップ3.3に進むか、-20°C〜-80°Cで精製されたRNAを保存する。
- キットの指示に従って、cDNA合成キットを使用してcDNA合成に1 μgの総RNAを使用します。
- 薄肉の0.2 mL PCRチューブを取り、5x cDNA反応マスターミックス(最適化されたバッファ、オリゴdTおよびランダムプライマー、およびdTPsを含む)の4μLにRNAの1μgを加え、20倍逆転写酵素溶液の1μL、およびヌクレアーゼを含まない水を20μLの総体積に加えます。
- チューブをプログラムしたサーモサイクラーに、22°Cで10分間、42°Cで30分間、85°Cで5分間、4°Cで保持します。 直ちにステップ3.4に進むか、-20°CでcDNAを保存します。
- SYBRグリーン酵素マスターミックス、5倍希釈cDNA(ステップ3.3)、およびGFP用各プライマーの325 nMを含むqPCR反応を調製する。
注: このプロトコルで使用するプライマーは次のとおりです。GFPフォワード:5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3';GFP逆: 5'-GTCCTTTTGAAGTCGATGC-3';ef1aフォワード5'-カッグガカカキャットGCTGag-3';ef1a逆: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3')。 - リアルタイム PCR マシンで qPCR 反応を実行します。
注:PCRプログラム:最初の活性化は95°Cで10分、95°Cで30s、60°Cで30s、72°Cで1分の40サイクルが続きます。 - PCRが完了したら、溶融曲線解析を行い、反応特異性を決定します。各サンプルに対して 3 つの技術的な複製を実行します。
- 光活性化誘導を、2-ΔΔCt 法11を用いて、暗に保たれた胚に対するフォールド変化として計算する。統計的有意性は、統計ソフトウェアパッケージで決定することができます。
4. 蛍光顕微鏡による誘導の定性的評価
- 活性化の所望の持続時間の後に、照明から胚を除去する。
- ガラスうつ病スライドで0.01%トリカインを含む3%メチルセルロースでイメージング用の胚を固定化する。
- 標準GFPフィルタ設定を使用して、デジタルカメラに接続された蛍光体顕微鏡で蛍光画像と明視野画像を取得します。すべてのサンプルに同一の画像取得設定を使用します。
- 取得後の明視野画像と蛍光画像を画像処理ソフトウェアとマージします。
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Representative Results
このデモンストレーションでは、C120応答性GFPレポーターライン(Tg(C120F:GFP)ucm107)がユビキチンb(ubb)プロモーター(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)からTAEL-Nをユビキタスに表現するトランスジェニックラインと交差し、両方の要素を含む二重トランスジェニック胚を生成しました。24時間受精後、胚を青色光を活性化させることに曝され、1時間オン/1時間オフの頻度でパルスした。GFP発現の誘導は、30分、1時間、3時間、および6時間の後活性化時のqRT-PCRにより定量した(図2Bおよび表1)。暗い状態に保たれた対照兄弟胚と比較して、青色光暴露後30分でGFP発現の誘導が検出された。GFP発現のレベルは、その後、着実に6時間の後の活性化まで増加し続けた。
GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した(図2C-F)。バックグラウンドレベルを超えるGFP蛍光は、最初に3時間の後活性化で観察され、6時間後活性化時に顕著に明るくなった。対照的に、暗所に保存されたすべての時間ポイントに対するコントロール胚は、かなりのGFP蛍光を示さなかった(図2G-J)。
図1: TAEL/C120機能と実験設計の概略図( A)TAEL/C120系は、TAELと呼ばれる転写活性化剤と核局在性シグナル(TAEL-N)とC120と呼ばれるTAEL応答性調節要素からなる。TAEL依存性転写は、青色光の存在下では活動するが、暗い状態では活動しない。NLS、核局在化シグナル。(B) このプロトコルでは、トランスジェニックラインは TAEL-N を遍在的に表現し、Tg(tg)はC120 駆動 GFP レポーターライン(Tg(C120F:GFP)に交差して二重トランスジェニック胚を生成する。24 hpf から、胚はウェブベースの科学イラストツールで作成された最大6 h-イラストレーションの様々な期間、青色光の活性化にさらされています( 材料表を参照)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TAEL/C120を用いた光活性化遺伝子発現の代表的な結果(A)典型的な光活性化セットアップは、インキュベーターに配置された青色LED光源を含む。ゼブラフィッシュの胚を含むペトリ皿は、光源に対して相対的に配置されるため、光の受け取った電力は約1.5mW/cm2(点線)です。ペトリ皿のふたは光の飛散を最小にするために、光の活性化の間に取除かれる。(B)ブルーライトで活性化した後の示された時点でのqRT-PCRによるGFP mRNAレベルの定量化。データは、暗闇の中に保持される兄弟対照胚に対するGFP折り目誘導として提示される。ドットは生物学的複製(クラッチ)を表します。実線の水平バーは平均を表します。誤差範囲、標準偏差。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.一方向の分散分析はp値を決定した。(C-J)青色光にさらされた胚のGFP蛍光強度を示す代表的な画像(C-F)または暗い状態に保たれた(G-J)。蛍光画像(緑色)は、対応する明視野画像(グレースケール)とマージされています:スケールバー、500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| GFPフォールド誘導 ブルーライト (465 nm) |
GFPフォールド誘導 周囲光 |
||||||
| 時間ポスト照明 | 意味する | 上限 | 下限 | 意味する | 上限 | 下限 | p 値 |
| 30分 | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1時間 | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3時間 | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6時間 | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
表1:青色光と周囲光によるTAEL/C120誘導発現の比較 青色光(465nm)または周囲光を示された時間の活性化にさらした後のGFP mRNAレベルの折り畳み誘導を、暗中に保たれた兄弟胚を制御するように正規化した。mRNAレベルをqRT-PCRにより定量した。データは、平均折り畳み誘導+/- 上限と下限として報告されます。p値は複数の t-検定によって決定された。n = すべてのタイムポイントのための3クラッチ。
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Discussion
このプロトコルは、光遺伝学的TAEL/C120系を用い、青色光誘導性遺伝子発現を達成することを説明する。このシステムは、青色光で照明時に二量体化し、C120調節要素の下流の対象遺伝子の転写を活性化する転写活性化剤TAELで構成されています。GFPレポーターの誘導発現は、わずか30分の光暴露後に検出することができ、このアプローチは比較的速く応答性の高い動態を有することを示唆している。
いくつかの要因は、誘導レベルに影響を与えることができます。最も重要なのは、光を活性化する波長とパワーです。このプロトコルでは、1.5 W/cm2で配信される 465 nm の LED ライトが使用されました。短波長と長波長(それぞれ紫と緑の光)と低光パワーは、効果的に発現を活性化しません(データは示されていません)。一方、より多くの光パワーは、胚を光損なうリスクを高める。したがって、TAELシステムの使用を成功させるためには、活性化光は(1)可視光スペクトルの青色範囲で、(2)TAELの有効活性化と光損傷リスクの軽減のバランスを取るのに十分な電力でなければなりません。有効光パワーは実験条件によって異なる場合があるため、経験的に決定する必要があります。また、活性化する前に、ある程度の青色光を含む周囲光から胚を保護するために注意する必要があります。TAEL/C120依存性発現は、広域スペクトルの周囲光によって誘導され得ることがわかったが、青色光に比べてはるかに低いレベルではあるが(表1)。
GFPの発現は、最初に30分のイルミネーションの後にqPCRで検出することができますが、発現レベルは安定していません。それでも、彼らは光処理の3時間でピークに達するまで上昇し続け、その後、これらの高い発現レベルは最大6時間維持される。これらの結果は、波長および光パワーに加えて、TAEL/C120誘導発現レベルも、少なくともシステムが最大または飽和状態に達するまで、照明持続時間に依存することを示唆している。これらのqPCR結果とは対照的に、3時間の発光後までは高いGFP蛍光を定性的に観察せず、最大6時間の発光に対して蛍光強度が増加し続けています。qPCRと蛍光強度の観測の間の不一致は、GFPの合成、折り畳み、および成熟因子に必要な追加の時間によって説明される可能性が高く、対象遺伝子によって変化する可能性があります。したがって、アプリケーションによっては、照明の持続時間の最適化が必要になる場合があります。
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚を世界的に照らす青い光LEDパネルを使用してTAEL/ C120システムを活性化するための最も簡単な方法を提示した。この方法には、使いやすさと費用対効果の両方の利点があります。ただし、光の活性化は、必要に応じて空間的に制御することもできます。以前は、TAELによって誘発される表現は、複数のモダリティを使用して空間的に制限され、ユーザー定義の空間パターンの青色光5を提供することが実証されました。追加の空間特異性は、TAEL転写活性化剤6の発現を調節するために組織特異的プロモーターを使用して達成することができる。
光遺伝学的発現系は、薬物や熱ショック誘導性発現系と比較して、光誘発剤として光を用いることで、より良い空間的および時間的制御的な表現を提供する可能性がある。TAEL/C120に加えて、他の光活性化転写システムは12、13、14、15を開発した。しかし、TAEL/C120は、いくつかの理由からゼブラフィッシュ(および潜在的に他の多細胞系)での使用に特に適している可能性があります。まず、TAEL転写活性化剤は、必要な成分の数を簡素化するホモジマーとして機能します。また、TAELのようなLOVドメイン含有タンパク質は、光吸収16にフラビンクロモフォアを必要とする。この補因子は、動物細胞内に内因的に存在し、外因性発泡体を他のシステムと同様に添加する必要を除去する。最後に、活性化TAELは青色光8が存在しない場合に約30sの比較的短い半減期を有すると予測され、より正確なオン/オフ制御が可能になる。しかし、この短い半減期はまた、長期的または慢性的な発現が胚の長期的な照明を必要とすることを意味し、状況に応じて望ましくない場合もある。
要約すると、このプロトコルは、TAEL/C120システムが使いやすく、高速で応答性の高い動態を有し、 インビボ アプリケーションに特に適した青色光活性化遺伝子発現システムであることを示しています。
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Disclosures
利益相反は宣言されませんでした。
Acknowledgments
ステファン・マテルナとウーとマテルナの研究室のメンバーに、このプロトコルに関する有益な提案とコメントに感謝します。アンナ・リード、ケビン・ガードナー、ローラ・モッタ・メナに感謝し、このプロトコルを開発しながら貴重な議論と洞察を得た。この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金によって支えられた。R03 DK106358)とカリフォルニア大学がん研究調整委員会(CRN-20-636896)からS.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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