Summary
تم إنشاء هذا البروتوكول لزراعة رباعي هيدروبيوبتيرين (BH4) - وسينثاز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS) - البلاعم الفئرانية الأولية الناقصة لدراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال. تركز الدراسة على الحد من التلوث المحتمل ل BH4 وغيرها من القطع الأثرية الموجودة في طرق العزل والثقافة التقليدية التي قد تربك النتائج التجريبية وتفسير النتائج.
Abstract
تستمد البلاعم من الخلايا السلفية المكونة للدم في جميع أنحاء الجسم ، وهي مركزية في العمليات الالتهابية ، وتشارك في الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يمكن إجراء دراسة البلاعم في المختبر عن طريق زراعة خارج الجسم الحي من الصفاق أو من خلال تمايز الخلايا السلفية لنخاع العظم النخاعي لتشكيل البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs). ينطوي النهج الشائع لتمايز البلاعم عن السلائف على استخدام وسائط مشروطة من خلايا L929 (LCM). من السهل إنتاج هذه الوسائط ذاتيا ولكنها تعاني من تباين الدفعات ، ومكوناتها غير محددة. وبالمثل ، يستخدم مصل البقر الجنيني (FBS) لدعم النمو ولكنه يحتوي على مزيج كبير من الجزيئات غير المحددة التي قد تختلف بين الدفعات. هذه الطرق ليست كافية لدراسة بيولوجيا أكسيد النيتريك وآليات الأكسدة والاختزال لأنها تحتوي على كميات كبيرة من الجزيئات الصغيرة التي تتداخل إما مع آليات الأكسدة والاختزال أو مستويات تكميلية من العوامل المساعدة ، مثل رباعي هيدروبيوبتيرين (BH4) ، اللازمة لإنتاج NO من سينثاز أكسيد النيتريك القابل للتحريض (iNOS). في هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا محسنا يسمح بالتحكم في بيئة عدم الأكسدة والاختزال عن طريق تقليل مستويات البيوبتيرين الخارجي مع الحفاظ على الظروف المناسبة لنمو الخلايا والتمايز. تساعد الرقابة المشددة على تكوين الوسائط الثقافية على ضمان قابلية الاستنساخ التجريبي وتسهيل التفسير الدقيق للنتائج. في هذا البروتوكول ، تم الحصول على BMDMs من نموذج فأر سيكلوهيدرولاز GTP (GCH) - ناقص. تم إجراء استزراع BMDMs باستخدام وسائط تحتوي إما على (i) LCM مشروط ، أو (ii) مؤتلف M-CSF و GM-CSF لإنتاج الحد الأدنى من القطع الأثرية مع الحصول على ظروف ثقافة BH4 وعدم وجود نقص - مما يسمح بدراسة قابلة للتكرار لبيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال والتمثيل المناعي في المختبر.
Introduction
تم تأسيس البلاعم كنوع من الخلايا المثيرة للاهتمام في مجموعة واسعة من الأمراض والظروف ، ويبدو أن العديد منها لا علاقة له بتركيزها التقليدي على المناعة الفطرية. نظرا لأن فسيولوجيا البلاعم تعتمد اعتمادا كبيرا على الأنسجة أو البيئة التي يقيمون فيها ، فقد نشأت العديد من الطرق والنماذج لدراسة وظيفتها والمسارات المختلفة المعنية. تاريخيا ، هيمنت خطوط الخلايا البعوضية ، مثل RAW264.7 ، على المجال ، ولكن تم استبدالها تدريجيا لصالح نماذج الخلايا الأولية المختلفة. على سبيل المثال ، قد يتم عزل البلاعم الفئرانية من غسل الصفاق بعد العلاج بالثيوغليكولات. في حين توفر نموذجا مفيدا لدراسة الخلايا المقيمة في الأنسجة ، فقد ثبت أن هذه البلاعم البريتونية تظهر استجابة أكثر هدوءا لمختلف المحفزات الخارجية ، مما يحد من ملاءمتها للعديد من التطبيقات النهائية1.
كبديل ، ظهرت البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) ، المشتقة من الخلايا السلفية النخاعية في نخاع العظم ، كنموذج قيم لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا البلاعم ، بما في ذلك النضج والأنماط الظاهرية الكلاسيكية المختلفة المرتبطة بالبلاعم ، M0 (ساذجة ، غير منشطة) ، M1 (مؤيدة للالتهابات ، عادة ما يتم تنشيطها باستخدام LPS / IFN) و M2 (مؤيدة للدقة ، عادة ما يتم تنشيطها باستخدام IL-4)2 ، 3. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا السلفية النخاعية إلى BMDMs يعتمد على وجود عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) في وسائط الثقافة 4,5. يمكن توفير هذا إما في شكل بروتين نقي يضاف إلى الوسائط أو من الوسائط المشروطة L929 (LCM). يجب موازنة مزايا استخدام BMDMs (التكلفة والكفاءة) مقابل القيود التي تمثلها حساسيتها لمختلف المحفزات (السيتوكينات ، والمواد الوسيطة الأيضية ، و RNS / ROS).
تشير البيانات السابقة إلى أن محتويات LCM غير محددة بشكل جيد ومتغيرة في جوهرها ، مما يؤدي إلى كونها غير موثوقة وغير مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، وخاصة تلك المتعلقة تحديدا ببيولوجيا NO أو الأكسدة والاختزال ، لأنها قد تتأثر بشدة بوجود مركبات خارجيةالمنشأ 6. على هذا النحو ، يدعو هذا البروتوكول المفصل إلى استخدام DMEM محدد جيدا: وسائط F12 ذات تباين منخفض من دفعة إلى دفعة وإضافة الفئران المؤتلف M-CSF و GM-CSF (عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم). علاوة على ذلك ، يوفر مصل البقر الجنيني الذي يستخدم عادة كمكمل غذائي في وسائط زراعة الأنسجة مصدرا آخر للمركبات غير المحددة بشكل جيد والتباين المتأصل. لذلك ، من الضروري التحكم في استخدام هذه الإضافات وتحسينها لضمان الثقافة الموثوقة ل BMDMs. باستخدام مصدر محدد منخفض السموم الداخلية من FBS وضمان شراء دفعات واحدة بكميات كبيرة ، يتم تحديد ظروف الثقافة بشكل موثوق به ، ويتم ضمان قابلية التكاثر. وقد ثبت أن البروتوكول الموصوف هنا ينتج مزرعة بلاعم أعلى من نقاء 95٪ عند تقييمه لعلامات سطح البلاعم CD45 و CD11b بواسطة التدفق الخلوي6.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وتنفيذها وفقا للجنة الأخلاقية بجامعة أكسفورد وقانون الحيوانات (الإجراءات العلمية) لوزارة الداخلية البريطانية لعام 1986. تتوافق جميع الإجراءات مع التوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي.
1. عزل خلايا نخاع العظم
- التضحية بالنوع البري (C57BL/6) ، أو الفئران Gch1-deficient (R26-CreERT2Gch fl/ fl) (10-16 أسبوعا) عن طريق خلع عنق الرحم وجمع الأطراف الخلفية.
ملاحظة: لا يتم تفضيل أي من الجنسين. ستكون الإناث المتطابقات مع العمر أصغر قليلا من نظرائهن الذكور ، مما يؤثر على العائد الأولي للمواد الأولية.- رش الفئران بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل خطر التلوث.
- قم بعمل قطع صغير في البطن باستخدام مقص تشريح لإزالة الفراء والجلد من الجسم. قشر الجلد لكشف العضلات على الأطراف الخلفية.
- ضع الفأر على بطنه وخلع الأطراف الخلفية عن طريق رفعه من مفصل الركبة والضغط على الوركين. يمكن الشعور بالخلع في مفصل الورك.
- قم بإزالة الساقين الخلفيتين عن طريق قطع العضلات بعناية في الورك ، مما يضمن عدم حدوث أي ضرر لعظم الفخذ.
- قطع فوق مفصل الكاحل ، وإزالة القدم وتنظيف أي جلد المتبقية من الساق.
- ضع الساقين المشوهتين في أنبوب سعة 50 مل مع 25 مل من PBS البارد (بدون الحاجة إلى مضاد حيوي) وضعه على الجليد.
ملاحظة: يمكن تشريح متعددة، وإبقاء الأرجل على الجليد.
- في ظل الظروف المعقمة في غطاء زراعة الأنسجة ، قم بإزالة العضلات من الساقين وإزالة نهايات العظام لفضح نخاع العظام.
- ضع الساقين في 70٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة لتقليل التلوث وغسل أي فراء أو بقايا.
- انقل الساقين إلى طبق بتري نظيف ومعقم وبكتريولوجي. استخدم الملقط والمشرط لكشط العظام بقوة وبعناية مع جانب الشفرة لإزالة العضلات. قطع الأوتار لتسهيل العملية.
- إزالة المشاش في طرف كل عظم لفضح نخاع العظام. يتم قطع عظم الفخذ في أي من الطرفين ، على بعد مسافة قصيرة من المفاصل المعنية.
- يتم قطع الساق في الأعلى ، على بعد مسافة قصيرة من مفصل الركبة ، وفي الأسفل فوق نقطة التقاطع مع الشظية.
- اغسل نخاع العظم من العظام باستخدام PBS وقم بجمعه في أنبوب معقم سعة 50 مل.
- املأ حقنة سعة 10 مل ب 10 مل من PBS وقم بتوصيلها بإبرة 25 جم × 0.5 × 16 مم. هذا يكفي لطرد جميع العظام من فأر واحد.
- أدخل الإبرة في التجويف النخاعي للعظم واطرد نخاع العظم بلطف مع 1-2 مل من PBS ، وقم بتشغيل الإبرة لأعلى ولأسفل عبر العظم لضمان إزاحة كل نخاع العظم.
- كرر ذلك لجميع العظام ، وجمع نخاع العظم المحمر في طبق بتري نظيف.
- باستخدام حقنة معقمة سعة 1 مل ، قم بتصنيف نخاع العظم عن طريق سحب التعليق داخل وخارج المحقنة 5-10 مرات حتى يتم تفتيت أي كتل.
- جمع نخاع العظم المفصل في حقنة 1 مل وتمريره من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي نظيف 50 مل. ضع نخاع العظم الذي تم جمعه على الجليد بينما يتم جمع المزيد من العينات.
ملاحظة: انظر مخطط البروتوكول في الشكل 1 - الجزء 1 .
2. اختيار وتمايز وتحفيز BMDMs
- لتجميد نخاع العظم للاستخدام في وقت لاحق ، قم بتكسير نخاع العظم عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق وأعد التعليق في 2 مل من FBS منخفض السموم الداخلية يحتوي على 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
- جهاز طرد مركزي لتعليق نخاع العظم عند 1000 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). سوف تتشكل حبيبات حمراء دموية.
- تخلص من السوبرناتانت.
- أعد تعليق الكريات بلطف في 2 مل من FBS منخفض السموم الداخلية الذي يحتوي على 5٪ DMSO وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل نقله إلى النيتروجين السائل في مرحلة البخار للتخزين على المدى الطويل.
- لاستخدام نخاع العظم على الفور ، قم بتحليل خلايا الدم الحمراء قبل طلاء نخاع العظام.
- جهاز طرد مركزي لتعليق نخاع العظم عند 1000 × g لمدة 5 دقائق في RT. سوف تتشكل حبيبات حمراء دموية.
- أعد تعليق الكريات في 3 مل من 1x مخزن تحليل خلايا الدم الحمراء وحضانتها في RT لمدة 5 دقائق.
- أضف 10 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من supernatant.
- قم بلوحة الخلايا للاستخدام الفوري من خلال المتابعة من الخطوة 2.3.5.
- تذويب البلاعم وإعادة تعليقها في 3 مل من وسائط الطلاء قبل تكوير الخلايا.
- تحضير DMEM: F12 يحتوي على 5٪ من السموم الداخلية FBS منخفضة ، 1x البنسلين / الستربتومايسين ، L-الجلوتامين و 25 نانوغرام / مل M-CSF.
ملاحظة: يمكن تحضير M-CSF و GM-CSF عن طريق تعليق البروتين المجفف في ماء معقم يحتوي على 0.1٪ BSA معقم ، ويمكن تجميد ALIQUOTS عند -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقا. - قم بإذابة الجليد عن تعليق الخلايا المجمدة بسرعة عند 37 درجة مئوية.
- انقل تعليق الخلية (0.5 مل) إلى أنبوب نظيف ومعقم يحتوي على 3 مل من وسائط DMEM: F12 المحضرة.
- قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الفائقة.
- أعد تعليق الكريات في 3 مل من وسائط DMEM: F12 المعدة.
- عد الخلايا بالطريقة المفضلة.
- تحضير DMEM: F12 يحتوي على 5٪ من السموم الداخلية FBS منخفضة ، 1x البنسلين / الستربتومايسين ، L-الجلوتامين و 25 نانوغرام / مل M-CSF.
- اليوم 0: لوحة الخلايا.
- قم بصفيحة الخلايا في أدوات بلاستيكية غير مغلفة بتقنية TC في DMEM: وسائط F12 تحتوي على 5٪ من السموم الداخلية FBS منخفضة ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين ، و L-glutamine ، و 25 نانوغرام / مل M-CSF.
ملاحظة: يرد وصف لكثافات البذر التمثيلية في الجدول 1. يوفر زوج كامل من الأرجل من فأر واحد 15-20 مليون خلية سلائف. - احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- قم بصفيحة الخلايا في أدوات بلاستيكية غير مغلفة بتقنية TC في DMEM: وسائط F12 تحتوي على 5٪ من السموم الداخلية FBS منخفضة ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين ، و L-glutamine ، و 25 نانوغرام / مل M-CSF.
- اليوم 5: إطعام الخلايا.
- تغذية الخلايا عن طريق إضافة 50٪ من الحجم الأصلي من DMEM: وسائط F12 التي تحتوي على 5٪ منخفضة السموم الداخلية FBS ، 1x البنسلين / الستربتومايسين ، L-الجلوتامين ، و 50 نانوغرام / مل M-CSF.
- اليوم 6: تحفيز الخلايا باستخدام GM-CSF.
- أضف GM-CSF المحضر إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام / مل مباشرة إلى وسائط زراعة الخلايا على الخلايا.
- استبدل الوسائط ب DMEM: F12 المعدة.
- إزالة كافة الوسائط من الخلايا.
- اغسل الخلايا لفترة وجيزة في PBS المسخن مسبقا.
- إضافة DMEM: وسائط F12 تحتوي على 2٪ من السموم الداخلية منخفضة FBS ، 1x البنسلين / الستربتومايسين ، L-الجلوتامين ، 25 نانوغرام / مل M-CSF و 50 نانوغرام / مل GM-CSF.
- قم بتنشيط البلاعم إلى الأنماط الظاهرية M0 أو M1 أو M2 باستخدام المحفزات الموضحة في الخطوات 2.7.5-2.7.7.
- M0 - لا يوجد تحفيز مطلوب. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام.
- M1 - تحفيز الخلايا مع 100 نانوغرام / مل LPS و 10 نانوغرام / مل IFNγ (تركيزات نهائية) بين عشية وضحاها.
- M2 - تحفيز الخلايا مع 100 نانوغرام / مل IL-4 (التركيز النهائي) بين عشية وضحاها.
- اليوم 8: حصاد الخلايا.
- قم بإزالة الوسائط من الخلايا (جمع الوسائط وتجميدها عند -80 درجة مئوية للفحوصات النهائية).
- احتضن الخلايا في PBS البارد (50٪ من حجم الوسائط) لمدة 5 دقائق.
- افصل الخلايا عن اللوحة بكشط لطيف أو سحب متكرر.
- قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2500 × g لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من السوبرناتانت.
- قم بتجميد كريات الخلايا عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
ملاحظة: انظر مخطط البروتوكول الشكل 1 - الجزء 2.
Representative Results
قبل إثبات كفاءة هذا البروتوكول في مستويات البلاعم والنتريت وBH4 في الوسائط المكملة بنسبة 10٪ من FBS التي تحتوي إما على 10٪ من LCM أو فقط المؤتلف M-CSF و GM-CSF. النتريت ، على الرغم من اعتباره لفترة طويلة كمنتج نهائي لعملية التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك ، يعتبر الآن تخزينا فسيولوجيا لأكسيد النيتريك ، والذي يمكن إعادة تدويره عند الحاجة ، وبالتالي غالبا ما يستخدم كمؤشر على التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك7. BH4 هو عامل مساعد أساسي ل NOS لعدم الإنتاج. كما هو موضح في الشكل 2 ، كان للوسائط المكملة بنسبة 10٪ FBS مستويات نيتريت مماثلة بغض النظر عن M-CSF / GM-CSF أو LCM. ومع ذلك ، لوحظ المزيد من التباين بين دفعات LCM المختلفة. تنطبق هذه الملاحظة أيضا على قياس BH4. في الواقع ، كان لدى دفعة واحدة من LCM (الدفعة # 3) مستوى أعلى بكثير من BH4 من الدفعتين الأخريين (الدفعات # 1 و # 2). علاوة على ذلك، احتوت دفعات LCM على بيوبتيرين أكثر بكثير من الوسائط المكملة بنسبة 10٪ FBS والسيتوكينات المؤتلفة. كما تم قياس التباين الكبير في إجمالي البيوبتيرين بين الدفعات. توضح هذه النتائج أهمية استخدام مصدر M-CSF أقل تغيرا من LCM.
وعلاوة على ذلك، احتوت وسائل الإعلام المكملة بنسبة 10٪ FBS على مستويات أعلى بكثير من النتريت مقارنة بالوسائط التي تحتوي على 2٪ أو 5٪ من FBS. كان الفرق بين 10٪ و 5٪ كبيرا للغاية (p < 0.05) ل BH4. ومع ذلك ، تم تحديد مستويات مماثلة من البيوبتيرينات كميا. في المقابل ، كان OptiMEM + 0.2٪ BSA خاليا من النتريت و BH4 ، مما يجعله وسائط نظيفة ومناسبة للغاية. ومع ذلك ، كما وصفها بيلي وآخرون ، على الرغم من أن OptiMEM من المفترض أن يستخدم مرة واحدة فقط بين عشية وضحاها عند تحفيز البلاعم ، فقد لوحظ موت الخلايا بسبب الجوع. DMEM: تم اختيار F12 المكمل بنسبة 2٪ من FBS للتغلب على هذه المشكلة ، مما يسمح بالحد الأدنى من تلوث النتريت و BH4 مع احتوائه على ما يكفي من العناصر الغذائية للحصول على خلايا صحية. في الواقع ، على الرغم من اكتشاف بعض النتريت ، فإن المستويات لا تذكر (~ 0.2 ميكرومتر) مقارنة بالبلاعم WT المحفزة LPS / IFN (30-80 μM ل 1 × 106 خلايا ؛ البيانات غير معروضة).
للتحقق من صحة هذا البروتوكول المحسن باستخدام البيانات التجريبية ، وعزل وتوصيف BMDMs من نموذج الماوس الجديد الذي يعاني من نقص BH4 ، يتم عرض R26-CreERT2Gch fl/ fl هنا. يتم إنتاج BH4 بواسطة جين GTP cyclohydrolase I (Gch1). وكما هو مبين في الشكل 3 ألف، يؤدي النقص في Gch1 إلى فقدان BH4 وما ينتج عنه من اختفاء NO ومن ثم النتريت، وزيادة في أنيون الأكسيد الفائق مما يسبب الإجهاد التأكسدي كما هو موضح سابقا من قبل McNeill et al.8. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تعريفه جيدا بالفعل واستخدامه لزراعة البلاعم الأخرى التي تعاني من نقص BH4 من نظام Cre مختلف مثل نموذج Gch fl / fl T2C 6,8 ، إلا أن نموذج R26-CreER T2 Gch fl/ fl فريد من نوعه لأنه يستخدم التنشيط الشرطي لنظام Cre-ERT2لإزالة جين Gch1 بعد علاج تاموكسيفين (الشكل 3B ، ج). هذا يسمح بالضربة القاضية في نقاط زمنية مختلفة واستخدام الرقابة الداخلية في شكل مركبة مقابل علاج تاموكسيفين. في هذا المثال، عولجت الخلايا بأي من المركبتين (95٪ إيثانول) أو 0.1/1.0 ميكرومتر 4-OH تاموكسيفين في اليومين 1 و 3 (تم تخفيف كل من مخزون المركبة والتاموكسيفين بنسبة 1:100 في الوسائط قبل إضافة 0.7/7.0 ميكرولتر إلى 1 مل من حجم الثقافة الحالي).
كما هو موضح في الشكل 3D ، يتم إلغاء بروتين GTPCH بعد علاج تاموكسيفين في خلايا R26-CreERT2Gch fl / fl ولكن ليس في Gch fl/ fl. الأهم من ذلك ، أن كل من خلايا التحكمR26-CreER T2Gch fl / fl و Gchfl / fl لا تزال قادرة على إنتاج iNOS بعد تحفيز LPS/ IFN (الشكل 3B ، C). أدت هذه التغييرات في التعبير الجيني Gch1 والتغيير الناتج في بروتين GTPCH إلى اضطراب كبير في مستويات BH4 داخل الخلايا وإنتاج مخفف من النتريت. وكما هو مبين في الشكل 4، أظهرت أجهزة BMDM المعزولة والمستزرعة من الفئرانR26-CreER T2Gch fl/fl انخفاضا كبيرا في إنتاج BH4 وانخفاض تراكم النتريت في الوسائط، مقارنة بتلك الموجودة في خلايا GCH fl/fl الضابطة في وجود تاموكسيفين. وبالمثل ، أظهرت نفس الخلايا المستزرعة في وسائط LCM أيضا تعبيرا Gch1 ملغيا. على الرغم من أن هذه الخلايا لا تزال تنتج كميات كبيرة من كل من BH4 والنتريت بعد الضربة القاضية من التعبير Gch1 مع 4 OH تاموكسيفين ، ربما بسبب تلوث الوسائط و FBS مع BH4. وهذا يمثل تحسنا واضحا للطريقة الجديدة، على زراعة الخلايا في الوسائط المحتوية على الخلايا L.
يوضح التوصيف الإضافي لهذا النموذج عدم وجود اختلافات كبيرة في المورفولوجيا بين غير المنشط (M0) Gch fl / fl و R26-CreERT2Gch fl/ fl BMDMs في اليوم 8 بعد تركيزات مختلفة من تاموكسيفين. كما هو موضح في الشكل 5 ، يعرض كلا النموذجين كمية مماثلة من الخلايا الملتصقة المصنوعة من شكل دائري مع أطراف ممدودة ، وعادة ما تكون الميزات المتوقعة من البلاعم غير المحفزة9.
تظهر هذه النتائج مجتمعة أن طريقة عزل وزراعة BMDMs هذه توفر مجموعة نقية من الخلايا المناسبة لزراعة البلاعم الفئرانية. تسمح هذه الطريقة بزراعة البلاعم الفئرانية دون تدخل المركبات الخارجية الموجودة في بعض تركيبات الوسائط.
الشكل 1: مخطط تخطيطي يوضح عزل خلايا نخاع العظم (الجزء 1) لاختيار وتمايز وتحفيز BMDMs (الجزء 2). (أ) في ظل ظروف معقمة ، يتم وضع الأرجل المجزأة في طبق بتري بكتريولوجي نظيف بعد غسلها في 70٪ من الإيثانول. (ب) تتم إزالة العضلات بعناية باستخدام ملقط وكشط المشرط على طول العظام. (ج) ثم يتم قطع أطراف العظام لكشف نخاع العظام. (د) يتم مسح نخاع العظم من العظام باستخدام حقنة 10 مل مملوءة ب 10 مل من PBS عن طريق إدخال الإبرة في تجويف العظام. (ه) يتم تشغيل الإبرة صعودا وهبوطا عبر العظم لضمان إزاحة نخاع العظم بالكامل. يجب أن يظهر العظم أبيض وواضح في تلك المرحلة مع نخاع العظم الذي تم إزاحته والذي تم جمعه في طبق بتري. (F-G) كرر ذلك لجميع العظام ، وجمع نخاع العظم المفصل في حقنة 1 مل ، وتمريره عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي نظيف 50 مل. قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في وسائط التجميد لاستخدامها لاحقا. يوضح الجزء 2 اختيار BMDMs وتمايزها وتحفيزها يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مستويات النتريت و BH4 في DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF أو DMEM: F12 + وسائط الخلايا البديلة. (أ) تم قياس مستويات النتريت في وسائط مختلفة باستخدام طريقة فحص جريس. (ب) تم قياس مستويات BH4 والبيوبتيرينز في وسائط مختلفة عن طريق تحديد كمي HPLC باستخدام معيار BH4. يتم التعبير عن البيانات على أنها المتوسط (n = 3) ± SD. تم تحليل البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه من خلال مقارنات متعددة. تمثل الرموز p < 0.05 بين المجموعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقديم نموذج R26CreERT2 . (A) مخطط يوضح دور BH4 كعامل مساعد NOS في بيولوجيا الأكسدة والاختزال. (ب) مخطط يفصل استئصال الإكسونات الحرجة (2 و 3) في Gch1 بسبب مواقع loxP المحيطة والتنشيط الشرطي ل Cre-ERT2 مع تاموكسيفين في نموذج الفئران هذا. (ج) تفاعل البوليميراز المتسلسل (ممثل n = 3 مستقلة) مما يدل على استئصال الإكسون الحرج عندما يتم التعامل مع BMDMs مع تاموكسيفين. تنتج فئران WT منتجا PCR بقوة 1030 نقطة أساس ، بينما في وجود Cre ، يتم إنتاج منتج 1392 نقطة أساس ، مما يؤكد استئصال الإكسونات الحرجة. (د) اللطخة المناعية ل iNOS و GCH و B-tubulin (ممثل n = 3 مستقلة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف نقص BH4 في البلاعم. (أ، ب) يؤكد qRT-PCR فقدان تعبير Gch1 في طراز R26-CreERT2Gch fl/fl المعالج بتاموكسيفين. الأزرق = طريقة MCSF الجديدة ، الأخضر = طريقة LCM الكلاسيكية. (ج، د) يكشف تحليل BH4 داخل الخلايا بواسطة HPLC أن 0.1 ميكرومتر و 1.0 ميكرومتر كافية لتقليل مستويات BH4 بشكل كبير. (هاء، واو) يظهر قياس النتريت في الوسائط باستخدام فحص Griess أن BMDMs غير المحفزة لا تنتج مستويات يمكن اكتشافها من النتريت ، في حين أن Gch fl / fl و R26-CreERT2Gch fl /fl BMDMs تنتج النتريت في وجود LPS/ IFNγ. بشكل ملحوظ ، فإن معالجة تاموكسيفين ل R26-CreERT2Gch fl/ fl تقلل بشكل كبير من مستويات النتريت في BMDMs المحفزة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط (n = 3) ± SD. تم تحليل البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه من خلال مقارنات متعددة. تمثل الرموز p < 0.05 بين المجموعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة مورفولوجيا BMDMs. الصور التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري البصري ل BMDMs في اليوم 8 مع العلاج المتنوع للتاموكسيفين. يشار إلى المقياس في الصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| طبق ثقافي | حجم الوسائط | كثافة البذر |
| 12 طبق جيد | 1 مل | 500,000 خلية |
| 6 أطباق جيدة | 2 مل | 1,000,000 خلية |
| طبق 100 مم | 10 مل | 3,000,000 خلية |
| 75 سم2 قارورة | 15 مل | 5,000,000 خلية |
الجدول 1: كثافات البذر التمثيلية.
Discussion
تم تصميم بروتوكول زراعة BMDMs BH4 و NO-deficient للتحقيق في بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال في البلاعم الأولية من خلال الحد من رباعي هيدروبيوبتيرين (BH4) وغيرها من القطع الأثرية المتداخلة بهدف تعزيز موثوقية وتكرار النتائج التي تم الحصول عليها من هذه النماذج التجريبية.
وتشمل الخطوات الحاسمة استخدام الأواني البلاستيكية الصحيحة. أسلاف البلاعم هي خلايا ملتصقة ولزجة للغاية. لذلك فإن استخدام الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة (TC) أمر بالغ الأهمية في اختيارها وعزلها عن الخلايا السلفية الأخرى ، والتي يمكن أن تلتصق وتقلل من النقاء. في يوم الحصاد ، يتطلب فصل البلاعم عن الألواح PBS باردة الجليد ولكن باستخدام EDTA أو حتى كشط الخلايا بلطف شديد اعتمادا على التطبيق النهائي (تجربة lysed مقابل الخلايا الحية ، على سبيل المثال). وينبغي أيضا إيلاء عناية خاصة فيما يتعلق بالتلوث. أثناء طرد نخاع العظم ، قد يحدث تلوث متقاطع محتمل بالبكتيريا أو الجسيمات الفيروسية من الفراء المتبقي والجلد. ومن الضروري إذن توخي الحذر والعقم قدر الإمكان؛ وبالتالي يتم تشجيع الغطس الساقين تشريح في 70 ٪ من الإيثانول لبضع دقائق. وبالمثل ، يوصى بشدة باستخدام المضادات الحيوية أثناء زراعة البلاعم.
ينشأ قيد آخر لهذا البروتوكول من كثافة طلاء الخلايا في اليوم 0. يحتوي نخاع العظم المحمر على مجموعة متنوعة من الخلايا ، والتي يمكن حسابها بشكل خاطئ وتضمينها كأسلاف للبلاعم ، مما يؤدي إلى عدد إجمالي خاطئ للخلايا. لتجنب التباين اللاحق والمحتمل ، يمكن مسح البلاعم المعزولة بلطف باستخدام PBS الدافئ في اليوم 7 وإعادة طلائها بالكثافة الصحيحة في 2٪ FBS DMEM: F12 قبل 1 ساعة على الأقل من التحفيز للسماح بالالتصاق.
أخيرا ، يعد التحقق من مستويات النتريت عن طريق فحص Griess باستخدام الوسائط من البلاعم المزروعة أمرا ضروريا لتحليل البيانات. على الجانب الإيجابي ، هذا الفحص سريع وغير مكلف للإجراء.
كما هو موضح هنا ، يعد هذا البروتوكول المخصص بديلا أكثر تحديدا وتحسينا للبروتوكول الأكثر شيوعا المستخدم لعزل وزراعة البلاعم باستخدام الوسائط المشروطة بالخلايا L (LCM). في الواقع ، أحد المخاوف الرئيسية باستخدام LCM عند دراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال هو كميات كبيرة من البيوبتيرين المكتشفة ، مما يؤدي إلى تغييرات استقلابية محتملة10. على سبيل المثال ، يمكن ل BH4 الخارجي أن يجدد بسرعة النماذج الناقصة ويعمل كعامل مساعد ل iNOS ، مما يؤدي إلى إنتاج أكسيد النيتريك غير المرغوب فيه. عيب آخر لاستخدام LCM يكمن في إنتاجه - LCM هو مزيج من العوامل المحفزة للمستعمرة ، والسيتوكينات ، وغيرها من المنتجات الثانوية التي تفرزها مباشرة خلايا L-929 ، والتي يمكن أن تؤثر جميعها على فسيولوجيا البلاعم6. على الرغم من إمداداتها الكبيرة في M-CSF ، وهي ضرورية لانتشار البلاعم وبقائها ، فإن اختلاف كل مكون من دفعة إلى أخرى يزيد من خطر التباين عبر التجارب.
لمعالجة كلتا المشكلتين ، يستخدم هذا البروتوكول الجديد وسائط DMEM: F12 المحددة جيدا والتي تحتوي على مستويات منخفضة من البيوبتيرين التي تضاف إليها كمية خاضعة للرقابة من M-CSF و GM-CSF المنقى إليها. كل من السيتوكينات تساعد في تمايز ونمو البلاعم. يؤدي M-CSF بشكل خاص إلى توليد BMDMs من الخلايا السلفية لنخاع العظم من خلال ضمان تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى البلاعم11. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن GM-CSF يعزز السيتوكين الالتهابي ولا ينتج عند إضافته قبل التحفيز ، وهي فائدة حقيقية عند دراسة بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال12,13.
العامل الرئيسي الآخر الذي تعالجه هذه الطريقة الجديدة هو FBS ، الذي يستخدم عادة كمصدر للمغذيات الضرورية لصحة جيدة ونمو الخلايا. على غرار LCM ، يحتوي FBS على مستويات كبيرة من البيوبتيراين. في حين تم النظر في التجويع الكامل للخلايا في المصل قبل التحفيز في البداية باستخدام OptiMEM + 0.2٪ BSA ، أظهرت البلاعم علامات الانفصال ، مما يدل على انخفاض صلاحية الخلايا كما وصفها بيلي وآخرون 6. ومع ذلك ، نظرا لأن البلاعم أظهرت متطلبات مطلقة للمصل ، فقد تم اختيار FBS منخفض للغاية من السموم الداخلية من BioWest. تم اختبار الدفعات بحثا عن البيوبتيرين واختيارها مسبقا قبل الشراء بالجملة لضمان إمدادات موثوقة ومحددة جيدا. وللمضي قدما في الهدف المتمثل في الحد من المصادر الملوثة للبيوبتيرينز، تم اختبار تركيزات منخفضة من FBS. بدلا من استخدام مصل 10٪ كما هو شائع الاستخدام في زراعة الخلايا ، يتم الاحتفاظ بمستوى FBS إلى 5٪ طوال تمايز نخاع العظم لمدة 7 أيام إلى بلاعم ويتم تخفيضه إلى 2٪ أثناء التحفيز بين عشية وضحاها في اليوم الأخير. وهذا يضمن مستويات ضئيلة من البيوبتيرين المكتشفة ولكن ما يكفي من العناصر الغذائية لصحة جيدة والالتزام بالبلاعم. على الرغم من أن هذا البروتوكول المحسن حديثا باستخدام M-CSF المؤتلف يؤدي إلى بيئة أكثر تحكما لزراعة وتنشيط البلاعم الأولية ، فإن القيد الرئيسي هو أن هذه الطريقة أكثر تكلفة من استخدام طريقة LCM.
مع أخذ كل هذه العوامل في الاعتبار ، تمت مقارنة الطريقتين مباشرة. والأهم من ذلك، أن البروتوكول المعدل حديثا الوارد هنا باستخدام M-CSF المؤتلف و GM-CSF أدى إلى نظام أكثر قابلية للتكرار حيث كانت الوسائط خالية من تلوث BH4. وكانت آثار ذلك ذات شقين؛ كانت الخلايا التي تعاني من نقص BH4 تفتقر حقا إلى BH4 ، مما أدى إلى الحد الأدنى من تراكم النتريت القابل للكشف في الوسائط بعد التحفيز إلى حالة M1 مع LPS. كان هذا على النقيض من نفس خلايا BMDM المستزرعة في LCM ، حيث تم اكتشاف BH4 والنتريت الكبيرين.
في الختام ، تكمن قوة هذه الطريقة في جهد التحكم في مستويات البيوبتيرين من خلال تقييم شامل لكل معلمة يمكن أن تؤثر على إشارات NO والأكسدة والاختزال في البلاعم. على وجه الخصوص ، يضمن هذا أقصى قدر من الاستنساخ والتوحيد القياسي في مجال بيولوجيا عدم الأكسدة والاختزال.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل زمالة مؤسسة القلب البريطانية المتوسطة الممنوحة ل M.J.C. (FS/14/56/31049) ، ومنح برنامج مؤسسة القلب البريطانية (RG/17/10/32859 و RG/12/5/29576) ، و Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) ، ومركز أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (NIHR) مركز أكسفورد للبحوث الطبية الحيوية. يود المؤلفون أيضا أن ينوه بالدعم المقدم من مركز BHF للتميز البحثي ، أكسفورد (RE/13/1/30181 و RE/18/3/34214)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
