Summary
Dit protocol is vastgesteld voor het kweken van tetrahydrobiopterine (BH4) - en induceerbare stikstofmonoxidesynthase (iNOS) - deficiënte primaire murine macrofagen om NO-redox biologie te bestuderen. De studie richt zich op het verminderen van potentiële besmetting van BH4 en andere artefacten gevonden in traditionele isolatie- en kweekmethoden die experimentele uitkomsten en interpretatie van resultaten kunnen verstoren.
Abstract
Macrofagen zijn afgeleid van hematopoëtische voorlopercellen door het hele lichaam, staan centraal in ontstekingsprocessen en nemen deel aan aangeboren en adaptieve immuunresponsen. In vitro onderzoek van macrofagen kan worden uitgevoerd door ex vivo kweek uit het peritoneum of door differentiatie van myeloïde beenmergvoorlopercellen om beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's) te vormen. Een gemeenschappelijke benadering van macrofaagdifferentiatie van precursoren omvat het gebruik van geconditioneerde media uit L929-cellen (LCM). Dit medium is gemakkelijk zelf te produceren, maar lijdt aan batchvariabiliteit en de bestanddelen zijn ongedefinieerd. Op dezelfde manier wordt Foetal Bovine Serum (FBS) gebruikt om de groei te ondersteunen, maar bevat het een enorm mengsel van ongedefinieerde moleculen die kunnen variëren tussen batches. Deze methoden zijn niet geschikt voor de studie van stikstofmonoxidebiologie en redoxmechanismen, omdat ze beide aanzienlijke hoeveelheden kleine moleculen bevatten die ofwel interfereren met redoxmechanismen of niveaus van cofactoren aanvullen, zoals tetrahydrobiopterine (BH4), die nodig zijn voor de productie van NO uit induceerbare stikstofmonoxidesynthase (iNOS). In dit rapport presenteren we een geoptimaliseerd protocol dat controle van de NO-redoxomgeving mogelijk maakt door de niveaus van exogene biopterine te verlagen met behoud van omstandigheden die geschikt zijn voor celgroei en differentiatie. Strikte controle van de samenstelling van cultuurmedia helpt experimentele reproduceerbaarheid te garanderen en vergemakkelijkt een nauwkeurige interpretatie van de resultaten. In dit protocol werden BMDM's verkregen uit een GTP cyclohydrolase (GCH)-deficiënt muismodel. Kweek van BMDM's werd uitgevoerd met media die ofwel (i) geconditioneerde LCM bevatten, of (ii) recombinante M-CSF en GM-CSF om minimale artefacten te produceren terwijl BH4- en NO-deficiënte cultuuromstandigheden werden verkregen - waardoor de reproduceerbare studie van NO-redoxbiologie en immunometabolisme in vitro mogelijk werd.
Introduction
Macrofagen zijn vastgesteld als een interessant celtype in een breed scala aan ziekten en aandoeningen, waarvan vele schijnbaar niets te maken hebben met hun traditionele focus op aangeboren immuniteit. Omdat macrofaagfysiologie sterk afhankelijk is van het weefsel of de omgeving waarin ze zich bevinden, zijn er veel methoden en modellen ontstaan om hun functie en de verschillende betrokken paden te bestuderen. Historisch gezien domineerden macrofaagcellijnen, zoals RAW264.7, het veld, maar deze zijn geleidelijk vervangen ten gunste van verschillende primaire celmodellen. Muizenmacrofagen kunnen bijvoorbeeld worden geïsoleerd uit peritoneale lavage na behandeling met thioglycolaat. Hoewel het een nuttig model biedt voor de studie van weefselbewonende cellen, is aangetoond dat deze peritoneale macrofagen een meer ingetogen reactie op verschillende externe stimuli vertonen, waardoor hun geschiktheid voor veel downstream-toepassingen wordt beperkt1.
Als alternatief zijn van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's), afgeleid van myeloïde voorlopercellen in het beenmerg, naar voren gekomen als een waardevol model voor het bestuderen van verschillende aspecten van macrofaagbiologie, waaronder rijping en de verschillende klassieke fenotypen geassocieerd met macrofagen, M0 (naïef, niet-geactiveerd), M1 (pro-inflammatoir, meestal geactiveerd met LPS / IFN) en M2 (pro-resolutie, meestal geactiveerd met IL-4)2, 3. De differentiatie van myeloïde voorlopercellen in BMDM's is echter afhankelijk van de aanwezigheid van macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) in de kweekmedia 4,5. Dit kan worden geleverd in de vorm van gezuiverd eiwit toegevoegd aan de media of uit L929 geconditioneerde media (LCM). De voordelen van het gebruik van BMDM's (kosten en efficiëntie) moeten worden afgewogen tegen de beperkingen die worden gepresenteerd door hun gevoeligheid voor verschillende stimuli (cytokines, metabole tussenproducten en RNS / ROS).
Uit eerdere gegevens blijkt dat de inhoud van LCM slecht gedefinieerd en intrinsiek variabel is, waardoor ze onbetrouwbaar en ongeschikt zijn voor een verscheidenheid aan downstream-toepassingen, met name die welke specifiek betrekking hebben op NO- of redoxbiologie, aangezien deze sterk kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van exogene verbindingen6. Als zodanig vereist dit gedetailleerde protocol het gebruik van goed gedefinieerde DMEM: F12-media met lage batch-tot-batchvariatie en de toevoeging van recombinant murine M-CSF en GM-CSF (Granulocyte-macrofaagkoloniestimulerende factor). Bovendien biedt foetaal runderserum dat meestal wordt gebruikt als supplement in weefselkweekmedia nog een andere bron van slecht gedefinieerde verbindingen en inherente variabiliteit. Het is daarom noodzakelijk om het gebruik van dergelijke additieven te controleren en te optimaliseren om de betrouwbare cultuur van BMDM's te waarborgen. Door gebruik te maken van een gedefinieerde lage endotoxinebron van FBS en ervoor te zorgen dat afzonderlijke batches in bulk worden gekocht, worden de kweekomstandigheden betrouwbaar gedefinieerd en wordt de reproduceerbaarheid gewaarborgd. Van het hierin beschreven protocol is aangetoond dat het een macrofaagcultuur van meer dan 95% zuiverheid produceert wanneer het wordt beoordeeld voor de macrofaagoppervlakmarkers CD45 en CD11b door flowcytometrie6.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische commissie van de Universiteit van Oxford en de Uk Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Alle procedures voldeden aan richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement.
1. Isolatie van beenmergcellen
- Offer wild-type (C57BL/6), of Gch1-deficiënte (R26-CreERT2Gchfl/fl) muizen (10-16 weken oud) op door cervicale dislocatie en verzamel de achterpoten.
OPMERKING: Er wordt geen voorkeur voor beide geslachten gemaakt. Leeftijdsgematchte vrouwtjes zullen iets kleiner zijn dan hun mannelijke tegenhangers, wat de initiële opbrengst van uitgangsmateriaal beïnvloedt.- Spuit de muizen met 70% ethanol om het risico op besmetting te verminderen.
- Maak een kleine snede in de buik met een dissectieschaar om de vacht en huid van het lichaam te verwijderen. Pel de huid af om de spier op de achterpoten bloot te leggen.
- Plaats de muis op zijn buik en ontwricht de achterpoten door deze uit het kniegewricht te tillen en druk op de heupen uit te oefenen. De dislocatie is voelbaar bij het heupgewricht.
- Verwijder de achterpoten door voorzichtig door de spier bij de heup te snijden, zodat er geen schade aan het dijbeen optreedt.
- Snijd boven het enkelgewricht, verwijder de voet en reinig de resterende huid van het been.
- Plaats de ontlede poten in een buis van 50 ml met 25 ml ijskoude PBS (geen antibioticum nodig) en plaats deze op ijs.
OPMERKING: Meerdere dieren kunnen worden ontleed en de poten kunnen op ijs worden gehouden.
- Verwijder onder steriele omstandigheden in een weefselkweekkap de spieren van de benen en verwijder de uiteinden van de botten om het beenmerg bloot te leggen.
- Plaats de poten gedurende 2 minuten in 70% ethanol om vervuiling te verminderen en eventuele vacht of resten af te wassen.
- Breng de poten over in een schone, steriele, bacteriologische petrischaal. Gebruik een tang en een scalpel om stevig en voorzichtig langs de botten te schrapen met de zijkant van het mes om de spieren te verwijderen. Snijd pezen door om het proces te vergemakkelijken.
- Verwijder de epifyse aan het uiteinde van elk bot om het beenmerg bloot te leggen. Het dijbeen is aan beide uiteinden gesneden, net onder de respectieve gewrichten.
- Het scheenbeen is aan de bovenkant gesneden, net onder het kniegewricht, en aan de onderkant net boven het snijpunt met het kuitbeen.
- Spoel het beenmerg van de botten met PBS en verzamel het in een steriele buis van 50 ml.
- Vul een spuit van 10 ml met 10 ml PBS en bevestig deze aan een naald van 25 G x 0,5 x 16 mm. Dit is voldoende om alle botten van één muis te spoelen.
- Steek de naald in de medullaire holte van het bot en spoel het beenmerg voorzichtig weg met 1-2 ml PBS, waarbij de naald op en neer door het bot loopt om ervoor te zorgen dat al het beenmerg wordt losgemaakt.
- Herhaal dit voor alle botten en verzamel het gespoelde beenmerg in een schone petrischaal.
- Gebruik een steriele spuit van 1 ml om het beenmerg uit te splitsen door de suspensie 5-10 keer in en uit de spuit te trekken totdat eventuele knobbels zijn afgebroken.
- Verzamel het gedesaggregeerde beenmerg in de spuit van 1 ml en breng het door een celzeef van 70 μM in een schone centrifugebuis van 50 ml. Plaats het verzamelde beenmerg op ijs terwijl verdere monsters worden verzameld.
OPMERKING: Zie protocolschema in figuur 1 - deel 1.
2. Selectie, differentiatie en stimulatie van BMDM's
- Om beenmerg in te vriezen voor later gebruik, pelleteert u het beenmerg door centrifugering bij 1000 x g gedurende 5 minuten en resuspendeert u in 2 ml laag endotoxine FBS met 5% dimethylsulfoxide (DMSO).
- Centrifugeer de beenmergsuspensie bij 1000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Er zal zich een bloedrode pellet vormen.
- Gooi het supernatant weg.
- Resuspend de pellet voorzichtig in 2 ml low-endotoxine FBS met 5% DMSO en vries deze 's nachts in bij -80 °C voordat u overgaat in vloeibare stikstof in de dampfase voor langdurige opslag.
- Om beenmerg onmiddellijk te gebruiken, lyseer de rode bloedcellen voordat u het beenmerg platlegt.
- Centrifugeer de beenmergsuspensie bij 1000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Er zal zich een bloedrode pellet vormen.
- Resuspend de pellet in 3 ml 1x rode bloedcel lysisbuffer en incubeer bij RT gedurende 5 min.
- Voeg 10 ml PBS toe en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg.
- Plaats de cellen voor onmiddellijk gebruik door verder te gaan vanaf stap 2.3.5.
- Ontdooi de macrofagen en resuspend in 3 ml platingmedia voordat u de cellen pelleteert.
- Bereid DMEM voor: F12 met 5% laag endotoxine FBS, 1x penicilline / streptomycine, L-glutamine en 25 ng / ml M-CSF.
OPMERKING: M-CSF en GM-CSF kunnen worden bereid door gedroogd eiwit te resuspenderen in steriel water dat 0,1% steriel BSA bevat, en de aliquots kunnen worden ingevroren bij -80 °C voor later gebruik. - Ontdooi de bevroren celsuspensie snel bij 37 °C.
- Breng de celsuspensie (0,5 ml) over in een schone, steriele buis met 3 ml van de bereide DMEM: F12-media.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 1000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg.
- Resuspend de pellet in 3 ml van de bereide DMEM: F12 media.
- Tel de cellen volgens een voorkeursmethode.
- Bereid DMEM voor: F12 met 5% laag endotoxine FBS, 1x penicilline / streptomycine, L-glutamine en 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 0: Plaat de cellen.
- Plaat de cellen in niet-TC-gecoate plastic waren in DMEM: F12-media met 5% laag endotoxine FBS, 1x penicilline / streptomycine, L-glutamine en 25 ng / ml M-CSF.
OPMERKING: Representatieve zaaidichtheden zijn beschreven in tabel 1. Een compleet paar poten van één muis levert 15-20 miljoen voorlopercellen. - Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2.
- Plaat de cellen in niet-TC-gecoate plastic waren in DMEM: F12-media met 5% laag endotoxine FBS, 1x penicilline / streptomycine, L-glutamine en 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 5: Voed de cellen.
- Voed de cellen door 50% van het oorspronkelijke volume DMEM toe te voegen: F12-media met 5% laag endotoxine FBS, 1x penicilline / streptomycine, L-glutamine en 50 ng / ml M-CSF.
- Dag 6: Stimuleer de cellen met GM-CSF.
- Voeg geprepareerde GM-CSF toe aan een eindconcentratie van 50 ng/ml rechtstreeks aan de celkweekmedia op de cellen.
- Vervang de media door voorbereide DMEM: F12.
- Verwijder alle media uit de cellen.
- Was de cellen kort in voorverwarmd PBS.
- DMEM toevoegen: F12-media met 2% laag endotoxine FBS, 1x penicilline / streptomycine, L-glutamine, 25 ng / ml M-CSF en 50 ng / ml GM-CSF.
- Activeer de macrofagen naar de M0-, M1- of M2-fenotypen met de stimulaties die worden beschreven in stappen 2.7.5-2.7.7.
- M0 - Geen stimulatie nodig. Incubateer de cellen 's nachts in media.
- M1 - Stimuleer de cellen met 100 ng / ml LPS en 10 ng / ml IFNγ (eindconcentraties) gedurende de nacht.
- M2 - Stimuleer cellen met 100 ng / ml IL-4 (eindconcentratie) 's nachts.
- Dag 8: Oogst de cellen.
- Verwijder de media uit de cellen (verzamel media en vries in bij -80 °C voor downstream-assays).
- Incubeer de cellen in ijskoude PBS (50% van het mediavolume) gedurende 5 minuten.
- Maak de cellen los van de plaat met zacht schrapen of herhaald pipetteren.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 2500 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg.
- Vries de celkorrels in bij -80 °C voor later gebruik.
OPMERKING: Zie protocolschema Figuur 1 - Deel 2.
Representative Results
Alvorens de efficiëntie van dit protocol in macrofagen aan te tonen, werden nitriet- en BH4-niveaus beoordeeld in media aangevuld met 10% FBS met 10% LCM of alleen recombinant M-CSF en GM-CSF. Nitriet, hoewel lange tijd beschouwd als een eindproduct van het stikstofmonoxidemetabolisme, wordt nu beschouwd als fysiologische opslag van stikstofmonoxide, dat kan worden gerecycled wanneer dat nodig is en daarom vaak wordt gebruikt als een indicator van de biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide7. BH4 is een essentiële cofactor van NOS voor NO-productie. Zoals te zien is in figuur 2, hadden media aangevuld met 10% FBS vergelijkbare nitrietspiegels, ongeacht M-CSF/GM-CSF of LCM. Er werd echter meer variabiliteit tussen verschillende LCM-batches waargenomen. Deze waarneming gold ook voor de BH4-meting. In feite had één batch LCM (batch # 3) een significant hoger niveau van BH4 dan de andere twee (batches # 1 en # 2). Bovendien bevatten LCM-batches significant meer biopterine dan media aangevuld met 10% FBS en recombinante cytokines. Significante variabiliteit van totale biopterinen tussen batches werd ook gemeten. Deze resultaten tonen het belang aan van het gebruik van een minder variabele bron van M-CSF dan LCM.
Bovendien bevatten media aangevuld met 10% FBS significant hogere niveaus van nitriet in vergelijking met media die 2% of 5% FBS bevatten. Het verschil tussen 10% en 5% was zeer significant (p < 0,05) voor BH4. Vergelijkbare niveaus van biopterinen werden echter gekwantificeerd. Ter vergelijking: OptiMEM + 0,2% BSA was verstoken van nitriet en BH4, waardoor het een zeer schoon en geschikt medium was. Echter, zoals beschreven door Bailey et al., hoewel OptiMEM bedoeld is om slechts eenmaal 's nachts te worden gebruikt bij het stimuleren van macrofagen, werd celdood als gevolg van uithongering waargenomen. DMEM: F12 aangevuld met 2% van FBS werd gekozen om dit probleem te overwinnen, waardoor minimale nitriet- en BH4-verontreiniging mogelijk is terwijl het voldoende voedingsstoffen bevat om gezonde cellen te verkrijgen. Inderdaad, ondanks dat er wat nitriet wordt gedetecteerd, zijn de niveaus verwaarloosbaar (~ 0,2 μM) in vergelijking met LPS / IFN-gestimuleerde WT-macrofagen (30-80 μM voor 1 x 106 cellen; gegevens niet getoond).
Om dit verbeterde protocol te valideren met experimentele gegevens, de isolatie en karakterisering van BMDM's van een nieuw BH4-deficiënt muismodel, wordt hier de R26-CreERT2Gchfl / fl gepresenteerd. BH4 wordt geproduceerd door het GTP cyclohydrolase I (Gch1) gen. Zoals te zien is in figuur 3A, leidt een tekort aan Gch1 tot verlies van BH4 en het daaruit voortvloeiende verdwijnen van NO en vervolgens nitriet, en een toename van superoxide-anion dat oxidatieve stress veroorzaakt, zoals eerder aangetoond door McNeill et al.8. Hoewel dit protocol al goed is gedefinieerd en gebruikt om andere BH4-deficiënte macrofagen uit verschillende Cre-systemen zoals het Gchfl / flT2C-model 6,8 te kweken, is het R26-CreERT2Gchfl / fl-model uniek omdat het de voorwaardelijke activering van het Cre-ERT2-systeem gebruikt om het Gch1-gen te verwijderen na tamoxifenbehandeling (Figuur 3B, C). Dit maakt knock-out op verschillende tijdstippen en het gebruik van interne controle in de vorm van een voertuig versus tamoxifenbehandeling mogelijk. In dit voorbeeld werden cellen behandeld met medium (95% ethanol) of 0,1/1,0 μM 4-OH tamoxifen op dag 1 en 3 (zowel vehikel als tamoxifenvoorraad verdund 1:100 in media vóór 0,7/7,0 μL toegevoegd aan 1 ml van het bestaande kweekvolume).
Zoals te zien is in figuur 3D, wordt GTPCH-eiwit afgeschaft na behandeling met Tamoxifen in de R26-CreERT2Gchfl/fl-cellen, maar niet in de Gchfl/fl-cellen. Belangrijk is dat zowel R26-CreERT2Gchfl/fl als Gchfl/fl controlecellen nog steeds in staat zijn om iNOS te produceren na LPS/IFN stimulatie (Figuur 3B,C). Deze veranderingen in Gch1-genexpressie en de resulterende verandering in GTPCH-eiwit leidden tot significant verstoorde intracellulaire BH4-niveaus en verzwakte de productie van nitriet. Zoals te zien is in figuur 4, vertoonden BMDM's geïsoleerd en gekweekt uit R26-CreERT2Gchfl/fl-muizen een significant verminderde BH4-productie en verminderde nitrietophoping in de media, vergeleken met die van controle-GCHfl/fl-cellen in aanwezigheid van tamoxifen. Evenzo vertoonden dezelfde cellen gekweekt in LCM-media ook een afgeschafte Gch1-expressie; hoewel deze cellen nog steeds aanzienlijke hoeveelheden bh4 en nitriet produceerden na knock-out van Gch1-expressie met 4 OH tamoxifen, mogelijk als gevolg van de besmetting van media en FBS met BH4. Dit is een duidelijke verbetering van de nieuwe methode, ten opzichte van het kweken van de cellen in L-celbevattende media.
Verdere karakterisering van dit model toont geen significante verschillen in morfologie tussen niet-geactiveerde (M0) Gchfl/fl en R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM's op dag 8 na verschillende concentraties tamoxifen. Zoals te zien is in figuur 5, vertonen beide modellen een vergelijkbare hoeveelheid aanhangende cellen gemaakt van een ronde vorm met langwerpige ledematen, typisch de kenmerken die worden verwacht van niet-gestimuleerde macrofagen9.
Samen tonen deze resultaten aan dat deze methode van isolatie en kweek van BMDM's een zuivere populatie van cellen biedt die geschikt zijn voor de kweek van muizenmacrofagen. Deze methode maakt de kweek van murine macrofagen mogelijk zonder de interferentie van exogene verbindingen die aanwezig zijn in sommige mediaformuleringen.
Figuur 1: Schematisch diagram dat de isolatie van beenmergcellen (deel 1) illustreert voor de selectie, differentiatie en stimulatie van BMDM's (deel 2). (A) Onder steriele omstandigheden worden ontleedde benen in een schone bacteriologische petrischaal geplaatst na te zijn gewassen in 70% ethanol. (B) Spieren worden zorgvuldig verwijderd met behulp van een tang en scalpelschrapen langs de botten. (C) De uiteinden van de botten worden dan afgesneden om het beenmerg bloot te leggen. (D) Het beenmerg wordt uit de botten gespoeld met behulp van een spuit van 10 ml gevuld met 10 ml PBS door de naald in het lumen van het bot in te brengen. (E) De naald wordt op en neer door het bot geleid om ervoor te zorgen dat al het beenmerg wordt losgemaakt. Het bot moet er in dat stadium wit en helder uitzien met het losgeraakte beenmerg verzameld in de petrischaal. (F-G) Herhaal dit voor alle botten, verzamel het gedesaggregeerde beenmerg in de spuit van 1 ml en breng het door een celzeef van 70 μm in een schone centrifugebuis van 50 ml. Spin-down en resuspend cellen in vriesmedia voor later gebruik. Deel 2 toont de selectie, differentiatie en stimulatie van BMDM's Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nitriet- en BH4-niveaus in DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF of DMEM: F12 + L-celmedia. (A) Nitrietniveaus in verschillende media werden gemeten met behulp van de Griess Assay-methode. (B) BH4- en biopterinenniveaus werden gemeten in verschillende media door HPLC-kwantificering met behulp van een BH4-standaard. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde (n = 3) ± SD. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA door meerdere vergelijkingen. Symbolen vertegenwoordigen p < 0,05 tussen groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Introductie van het R26CreERT2-model. (A) Schema ter illustratie van de rol van BH4 als NOS-cofactor in de redoxbiologie. (B) Schematische detaillering van de excisie van de kritische exonen (2 en 3) in Gch1 als gevolg van de flankerende loxP-locaties en de voorwaardelijke activering van Cre-ERT2 met tamoxifen in dit murinemodel. (C) PCR (representatief voor n = 3 onafhankelijke dieren) die excisie van het kritische exon aantoont wanneer BMDM's worden behandeld met tamoxifen. WT-muizen produceren een 1030 bp PCR-product, terwijl in aanwezigheid van de Cre een 1392 bp-product wordt geproduceerd, wat de excisie van de kritieke exonen bevestigt. (D) Immunoblot van iNOS, GCH en B-tubuline (representatief voor n = 3 onafhankelijke dieren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van BH4-deficiëntie in macrofagen. (A,B) qRT-PCR bevestigt het verlies van Gch1-expressie in het R26-CreERT2Gchfl/fl-model behandeld met tamoxifen. Blauw = Nieuwe MCSF-methode, Groen = klassieke LCM-methode. (C,D) Analyse van intracellulaire BH4 door HPLC laat zien dat 0,1 μM en 1,0 μM voldoende zijn om de BH4-niveaus aanzienlijk te verlagen. (E, F) Meting van nitriet in media met behulp van de Griess-test toont aan dat niet-gestimuleerde BMDM's geen detecteerbare nitrietniveaus produceren, terwijl Gchfl/fl en R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM's nitriet produceren in aanwezigheid van LPS/IFNγ. Het is veelbetekenend dat tamoxifenbehandeling vanR26-CreER T2Gchfl/fl de nitrietspiegels in gestimuleerde BMDM's aanzienlijk verlaagt. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde van (n = 3) ± SD. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA door meerdere vergelijkingen. Symbolen vertegenwoordigen p < 0,05 tussen groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van bmdm-morfologie. Foto's verkregen door optische microscopie van BMDM's op dag 8 met de variërende behandeling van tamoxifen. Schaal wordt aangegeven in de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Cultuur Gerecht | Mediavolume | Zaaidichtheid |
| 12 goede gerechten | 1 ml | 500.000 cellen |
| 6 goede gerechten | 2 ml | 1.000.000 cellen |
| 100 mm schotel | 10 ml | 3.000.000 cellen |
| 75 cm2 kolf | 15 ml | 5.000.000 cellen |
Tabel 1: Representatieve zaaidichtheden.
Discussion
Dit BH4- en NO-deficiënte BMDM-kweekprotocol is ontworpen om NO-redoxbiologie in primaire macrofagen te onderzoeken door reductie van tetrahydrobiopterine (BH4) en andere storende artefacten met als doel de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van resultaten verkregen uit deze experimentele modellen te verbeteren.
Kritische stappen zijn onder meer het gebruik van de juiste plastic waren. Macrofaagvoorlopers zijn aanhangende cellen en zeer kleverig; daarom is het gebruik van met niet-weefselkweek (TC) behandelde platen cruciaal bij het selecteren en isoleren van andere voorlopercellen, die anders de zuiverheid zouden kunnen hechten en verminderen. Op de oogstdag vereist het loskoppelen van macrofagen van platen ijskoude PBS, maar het gebruik van EDTA of zelfs het heel voorzichtig schrapen van cellen kan worden uitgevoerd, afhankelijk van de downstream-toepassing (bijvoorbeeld lysed versus live cells experiment). Bijzondere aandacht moet ook worden besteed aan besmetting. Tijdens het wegspoelen van het beenmerg kan mogelijke kruisbesmetting met bacteriën of virale deeltjes van overgebleven vacht en huid optreden. Het is dan essentieel om zo voorzichtig en steriel mogelijk te zijn; vandaar dat het onderdompelen van ontlede benen in 70% ethanol gedurende enkele minuten wordt aangemoedigd. Evenzo wordt het gebruik van antibiotica tijdens het kweken van macrofagen ten zeerste aanbevolen.
Een andere beperking van dit protocol komt voort uit de celplatingdichtheid op dag 0. Gespoeld beenmerg bevat een verscheidenheid aan cellen, die ten onrechte kunnen worden geteld en opgenomen als macrofaagvoorlopers, wat leidt tot een vals totaal celnummer. Om de daaropvolgende en potentiële variabiliteit te voorkomen, kunnen geïsoleerde macrofagen voorzichtig worden gespoeld met behulp van warme PBS op dag 7 en opnieuw worden geplateerd met de juiste dichtheid in 2% FBS DMEM: F12 ten minste 1 uur vóór stimulatie om hechting mogelijk te maken.
Ten slotte is het controleren van de nitrietniveaus door Griess-assay met behulp van media van gekweekte macrofagen noodzakelijk om gegevens te analyseren. Aan de positieve kant is deze test snel en goedkoop uit te voeren.
Zoals hierin wordt aangetoond, is dit aangepaste protocol een meer gedefinieerd en verbeterd alternatief voor het meer gebruikelijke protocol dat wordt gebruikt om macrofagen te isoleren en te cultiveren met behulp van L-cel geconditioneerde media (LCM). Inderdaad, een van de belangrijkste zorgen met behulp van LCM bij het bestuderen van NO-redox biologie is de aanzienlijke hoeveelheden biopterinen gedetecteerd, wat leidt tot potentiële metabole veranderingen10. Exogene BH4 kan bijvoorbeeld snel gebrekkige modellen aanvullen en fungeren als een cofactor voor iNOS, wat leidt tot de ongewenste productie van stikstofmonoxide. Een ander nadeel van het gebruik van LCM ligt in de productie ervan - LCM is een mengsel van koloniestimulerende factoren, cytokines en andere bijproducten die rechtstreeks worden uitgescheiden door L-929-cellen, die allemaal de macrofaagfysiologie kunnen beïnvloeden6. Ondanks het grote aanbod in M-CSF, essentieel voor macrofaagproliferatie en overleving, verhoogt de variatie van elk onderdeel van batch tot batch het risico op variabiliteit tussen experimenten.
Om beide problemen aan te pakken, maakt dit nieuwe protocol gebruik van de goed gedefinieerde DMEM: F12-media met lage niveaus van biopterinen waaraan een gecontroleerde hoeveelheid gezuiverde M-CSF en GM-CSF wordt toegevoegd. Beide cytokines helpen bij de differentiatie en groei van macrofagen. M-CSF leidt vooral tot het genereren van BMDM's uit beenmergvoorlopercellen door de differentiatie van hematopoëtische stamcellen in macrofagen te verzekeren11. Bovendien is aangetoond dat GM-CSF inflammatoir cytokine en NO-productie stimuleert wanneer het voorafgaand aan stimulatie wordt toegevoegd, een echt voordeel bij het bestuderen van NO-redoxbiologie12,13.
De andere belangrijke factor die deze nieuwe methode aanpakt, is die van FBS, meestal gebruikt als een bron van voedingsstoffen die essentieel zijn voor de goede gezondheid en groei van cellen. Net als LCM bevat FBS significante niveaus van biopterine. Terwijl volledige serumafbraak van de cellen vóór stimulatie aanvankelijk werd overwogen met OptiMEM + 0,2% BSA, vertoonden macrofagen tekenen van onthechting, indicatief voor verminderde levensvatbaarheid van de cel zoals beschreven door Bailey et al.6. Omdat macrofagen echter een absolute behoefte aan serum aantoonden, werd de Ultra-Low Endotoxin FBS van BioWest geselecteerd. Batches werden getest op biopterinen en vooraf geselecteerd vóór de bulkaankoop om een betrouwbare en goed gedefinieerde levering te garanderen. Om verder te gaan in het streven om vervuilende bronnen van biopterinen te verminderen, werden daarom verlaagde concentraties FBS getest. In plaats van 10% serum te gebruiken zoals vaak gebruikt in celkweek, wordt het FBS-niveau gedurende de 7-daagse differentiatie van beenmerg in macrofagen op 5% gehouden en verder verlaagd tot 2% tijdens nachtelijke stimulatie op de laatste dag. Dit zorgt voor verwaarloosbare niveaus van gedetecteerde biopterinen, maar voldoende voedingsstoffen voor de goede gezondheid en therapietrouw van macrofagen. Hoewel dit nieuw geoptimaliseerde protocol met behulp van recombinant M-CSF resulteert in een meer gecontroleerde omgeving voor de kweek en activering van primaire macrofagen, is de belangrijkste beperking dat deze methode duurder is dan het gebruik van de LCM-methode.
Rekening houdend met al deze factoren, werden de twee methoden vervolgens direct vergeleken. Belangrijk is dat het nieuw gewijzigde protocol dat hierin wordt gepresenteerd met behulp van recombinant M-CSF en GM-CSF resulteerde in een meer reproduceerbaar systeem waarbij de media verstoken waren van contaminerende BH4. De effecten hiervan waren tweeledig; BH4-deficiënte cellen misten echt BH4, wat resulteerde in minimale detecteerbare nitrietaccumulatie in de media na stimulatie tot M1-status met LPS. Dit in tegenstelling tot diezelfde BMDM-cellen gekweekt in LCM, waar significante BH4 en nitriet werden gedetecteerd.
Tot slot ligt de kracht van deze methode in de inspanning om de biopterinenniveaus te beheersen door elke parameter grondig te beoordelen die NO- en redoxsignalering in macrofagen zou kunnen beïnvloeden. Dit zorgt met name voor maximale reproduceerbaarheid en standaardisatie op het gebied van NO-redoxbiologie.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de British Heart Foundation Intermediate Fellowship toegekend aan M.J.C. (FS/14/56/31049), British Heart Foundation Programme grants (RG/17/10/32859 en RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) en het NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre. De auteurs willen ook de steun van het BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 en RE/18/3/34214) erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
