Summary
Ce protocole a été établi pour cultiver des macrophages murins primaires déficients en tétrahydrobioptérine (BH4) et en oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) afin d’étudier la biologie du NO-redox. L’étude se concentre sur la réduction de la contamination potentielle du BH4 et d’autres artefacts trouvés dans les méthodes traditionnelles d’isolement et de culture qui peuvent confondre les résultats expérimentaux et l’interprétation des résultats.
Abstract
Les macrophages sont dérivés de cellules progénitrices hématopoïétiques dans tout le corps, sont au cœur des processus inflammatoires et participent aux réponses immunitaires innées et adaptatives. L’étude in vitro des macrophages peut être entreprise par culture ex vivo à partir du péritoine ou par différenciation des cellules progénitrices de la moelle osseuse myéloïde pour former des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM). Une approche courante de la différenciation des macrophages à partir des précurseurs implique l’utilisation de milieux conditionnés à partir de cellules L929 (LCM). Ce milieu est facile à autoproduire mais souffre de la variabilité des lots, et ses constituants sont indéfinis. De même, le sérum fœtal bovin (FBS) est utilisé pour soutenir la croissance, mais contient un vaste mélange de molécules indéfinies qui peuvent varier d’un lot à l’autre. Ces méthodes ne sont pas adéquates pour l’étude de la biologie de l’oxyde nitrique et des mécanismes redox car elles contiennent toutes deux des quantités substantielles de petites molécules qui interfèrent avec les mécanismes redox ou complètent les niveaux de cofacteurs, tels que la tétrahydrobioptérine (BH4), nécessaires à la production de NO à partir d’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS). Dans ce rapport, nous présentons un protocole optimisé permettant de contrôler l’environnement NO-redox en réduisant les niveaux de bioptérine exogène tout en maintenant des conditions propices à la croissance et à la différenciation cellulaires. Un contrôle strict de la composition des milieux de culture permet d’assurer la reproductibilité expérimentale et facilite l’interprétation précise des résultats. Dans ce protocole, les BMDM ont été obtenus à partir d’un modèle murin déficient en cyclohydrolase GTP (GCH). La culture de BMDM a été réalisée avec des milieux contenant soit (i) du LCM conditionné, soit (ii) du M-CSF et du GM-CSF recombinants pour produire un minimum d’artefacts tout en obtenant des conditions de culture déficientes en BH4 et en NO - permettant ainsi l’étude reproductible de la biologie et de l’immunométabolisme NO-redox in vitro.
Introduction
Les macrophages ont été établis comme un type cellulaire intéressant dans une grande variété de maladies et d’affections, dont beaucoup semblent sans rapport avec leur accent traditionnel sur l’immunité innée. Comme la physiologie des macrophages dépend fortement du tissu ou de l’environnement dans lequel ils résident, de nombreuses méthodes et modèles ont vu le jour pour étudier leur fonction et les différentes voies impliquées. Historiquement, les lignées cellulaires de macrophages, telles que RAW264.7, ont dominé le domaine, mais celles-ci ont été progressivement remplacées en faveur de divers modèles de cellules primaires. Par exemple, les macrophages murins peuvent être isolés du lavage péritonéal après un traitement au thioglycolate. Tout en fournissant un modèle utile pour l’étude des cellules résidentes des tissus, il a été démontré que ces macrophages péritonéaux démontrent une réponse plus modérée à divers stimuli externes, limitant ainsi leur adéquation à de nombreuses applications en aval1.
Comme alternative, les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), dérivés des cellules progénitrices myéloïdes dans la moelle osseuse, sont apparus comme un modèle précieux pour étudier divers aspects de la biologie des macrophages, y compris la maturation et les divers phénotypes classiques associés aux macrophages, M0 (naïf, non activé), M1 (pro-inflammatoire, généralement activé avec LPS / IFN) et M2 (pro-résolution, généralement activé avec IL-4)2, 3. L' Cependant, la différenciation des cellules progénitrices myéloïdes en BMDM dépend de la présence d’un facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) dans le milieude culture 4,5. Celle-ci peut être fournie soit sous forme de protéine purifiée ajoutée au milieu, soit à partir de milieu conditionné L929 (LCM). Les avantages de l’utilisation des BMDM (coût et efficacité) doivent être mis en balance avec les limites présentées par leur sensibilité à divers stimuli (cytokines, intermédiaires métaboliques et RNS/ROS).
Les données antérieures indiquent que les teneurs en LCM sont mal définies et intrinsèquement variables, ce qui les rend peu fiables et inadaptés à une variété d’applications en aval, en particulier celles spécifiquement liées au NO ou à la biologie redox, car celles-ci peuvent être fortement influencées par la présence de composés exogènes6. En tant que tel, ce protocole détaillé nécessite l’utilisation de milieux DMEM bien définis: F12 avec une faible variation de lot à lot et l’ajout de M-CSF murin recombinant et de GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). En outre, le sérum bovin fœtal généralement utilisé comme supplément dans les milieux de culture tissulaire fournit encore une autre source de composés mal définis et de variabilité inhérente. Il est donc nécessaire de contrôler et d’optimiser l’utilisation de tels additifs pour assurer la culture fiable des BMDM. En utilisant une source définie de FBS à faible teneur en endotoxines et en veillant à ce que des lots uniques soient achetés en vrac, que les conditions de culture soient définies de manière fiable et que la reproductibilité soit assurée. Il a été démontré que le protocole décrit ici produit une culture de macrophages supérieure à 95 % de pureté lorsqu’il est évalué pour les marqueurs de surface des macrophages CD45 et CD11b par cytométrie en flux6.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées et effectuées conformément au comité d’éthique de l’Université d’Oxford et à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) du ministère de l’Intérieur. Toutes les procédures étaient conformes à la directive 2010/63/UE du Parlement européen.
1. Isolement des cellules de la moelle osseuse
- Sacrifier des souris de type sauvage (C57BL/6) ou déficientes en Gch1 (R26-CreERT2Gchfl/fl) (âgées de 10 à 16 semaines) par luxation cervicale et recueillir les membres postérieurs.
REMARQUE: Aucune préférence pour l’un ou l’autre sexe n’est faite. Les femelles appariées selon l’âge seront légèrement plus petites que leurs homologues mâles, ce qui affectera le rendement initial du matériel de départ.- Vaporisez les souris avec de l’éthanol à 70% pour réduire le risque de contamination.
- Faites une petite coupure dans l’abdomen avec des ciseaux à dissection pour enlever la fourrure et la peau du corps. Pelez la peau pour exposer le muscle sur les membres postérieurs.
- Placez la souris sur son abdomen et disloquez les membres postérieurs en la soulevant de l’articulation du genou et en exerçant une pression sur les hanches. La luxation peut être ressentie au niveau de l’articulation de la hanche.
- Retirez les pattes postérieures en coupant soigneusement à travers le muscle de la hanche, en veillant à ce qu’aucun dommage ne se produise au fémur.
- Coupez au-dessus de l’articulation de la cheville, retirez le pied et nettoyez toute peau restante de la jambe.
- Placez les jambes disséquées dans un tube de 50 mL avec 25 mL de PBS glacé (aucun antibiotique requis) et placez-le sur de la glace.
REMARQUE: Plusieurs animaux peuvent être disséqués et les pattes maintenues sur la glace.
- Dans des conditions stériles dans une cagoule de culture tissulaire, retirez les muscles des jambes et retirez les extrémités des os pour exposer la moelle osseuse.
- Placez les jambes dans de l’éthanol à 70% pendant 2 min pour réduire la contamination et laver toute fourrure ou résidu.
- Transférer les jambes dans une boîte de Petri propre, stérile et bactériologique. Utilisez une pince et un scalpel pour gratter fermement et soigneusement le long des os avec le côté de la lame pour enlever les muscles. Coupez à travers les tendons pour faciliter le processus.
- Enlevez l’épiphyse à l’extrémité de chaque os pour exposer la moelle osseuse. Le fémur est coupé à chaque extrémité, juste à côté des articulations respectives.
- Le tibia est coupé en haut, juste à côté de l’articulation du genou, et en bas juste au-dessus du point d’intersection avec le péroné.
- Rincez la moelle osseuse des os avec du PBS et recueillez-la dans un tube stérile de 50 mL.
- Remplissez une seringue de 10 mL avec 10 mL de PBS et fixez-la à une aiguille de 25 G x 0,5 x 16 mm. Ceci est suffisant pour rincer tous les os d’une souris.
- Insérez l’aiguille dans la cavité médullaire de l’os et rincez doucement la moelle osseuse avec 1 à 2 mL de PBS, en faisant passer l’aiguille de haut en bas à travers l’os pour vous assurer que toute la moelle osseuse est délogée.
- Répétez pour tous les os, en recueillant la moelle osseuse rincée dans une boîte de Pétri propre.
- À l’aide d’une seringue stérile de 1 mL, désagrégez la moelle osseuse en tirant la suspension dans et hors de la seringue 5 à 10 fois jusqu’à ce que les grumeaux soient brisés.
- Recueillir la moelle osseuse désagrégée dans la seringue de 1 mL et la faire passer à travers une passoire cellulaire de 70 μM dans un tube centrifuge propre de 50 mL. Placez la moelle osseuse prélevée sur de la glace pendant que d’autres échantillons sont prélevés.
REMARQUE : Voir le schéma de protocole à la Figure 1 - Partie 1.
2. Sélection, différenciation et stimulation des BMDM
- Pour congeler la moelle osseuse pour une utilisation ultérieure, abattez la moelle osseuse par centrifugation à 1000 x g pendant 5 min et remettez en suspension dans 2 mL de FBS à faible teneur en endotoxine contenant 5% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Centrifuger la suspension de moelle osseuse à 1000 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Une pastille rouge sang va se former.
- Jetez le surnageant.
- Remettre en suspension délicatement la pastille dans 2 mL de FBS à faible teneur en endotoxine contenant 5 % de DMSO et congeler à -80 °C pendant la nuit avant de la transférer à l’azote liquide en phase vapeur pour un stockage à long terme.
- Pour utiliser la moelle osseuse immédiatement, lysez les globules rouges avant de plaquer la moelle osseuse.
- Centrifuger la suspension de moelle osseuse à 1000 x g pendant 5 min à RT. Une pastille rouge sang va se former.
- Remettre la pastille dans 3 mL de 1x tampon de lyse des globules rouges et incuber à RT pendant 5 min.
- Ajouter 10 mL de PBS et centrifuger à 1000 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant.
- Plaquez les cellules pour une utilisation immédiate en continuant à partir de l’étape 2.3.5.
- Décongeler les macrophages et remettre en suspension dans 3 mL de milieux de placage avant d’granuler les cellules.
- Préparer le DMEM : F12 contenant 5 % de FBS à faible teneur en endotoxines, 1 x pénicilline/streptomycine, L-glutamine et 25 ng/mL de M-CSF.
REMARQUE: M-CSF et GM-CSF peuvent être préparés en réutilisant des protéines séchées dans de l’eau stérile contenant 0,1% de BSA stérile, et les aliquotes peuvent être congelées à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. - Décongeler rapidement la suspension cellulaire congelée à 37 °C.
- Transférer la suspension cellulaire (0,5 mL) dans un tube propre et stérile contenant 3 mL du milieu DMEM: F12 préparé.
- Abattez les cellules par centrifugation à 1000 x g pendant 5 min à RT. Jetez le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille dans 3 mL du milieu DMEM : F12 préparé.
- Comptez les cellules selon une méthode préférée.
- Préparer le DMEM : F12 contenant 5 % de FBS à faible teneur en endotoxines, 1 x pénicilline/streptomycine, L-glutamine et 25 ng/mL de M-CSF.
- Jour 0 : Plaquer les cellules.
- Plaquer les cellules dans des articles en plastique non revêtus de TC dans du DMEM : milieu F12 contenant 5 % de FBS à faible teneur en endotoxines, 1 x pénicilline/streptomycine, L-glutamine et 25 ng/mL M-CSF.
NOTE : Les densités d’ensemencement représentatives sont décrites dans le tableau 1. Une paire complète de pattes d’une souris fournit 15 à 20 millions de cellules précurseurs. - Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Plaquer les cellules dans des articles en plastique non revêtus de TC dans du DMEM : milieu F12 contenant 5 % de FBS à faible teneur en endotoxines, 1 x pénicilline/streptomycine, L-glutamine et 25 ng/mL M-CSF.
- Jour 5: Nourrir les cellules.
- Nourrissez les cellules en ajoutant 50 % du volume initial de DMEM : milieu F12 contenant 5 % de FBS à faible teneur en endotoxines, 1 x pénicilline/streptomycine, L-glutamine et 50 ng/mL M-CSF.
- Jour 6: Stimuler les cellules avec GM-CSF.
- Ajouter le GM-CSF préparé à une concentration finale de 50 ng/mL directement dans le milieu de culture cellulaire sur les cellules.
- Remplacez le support par du DMEM : F12 préparé.
- Retirez tous les supports des cellules.
- Lavez brièvement les cellules dans du PBS préchauffé.
- Ajouter le DMEM : milieu F12 contenant 2 % de FBS à faible teneur en endotoxines, 1 x pénicilline/streptomycine, L-glutamine, 25 ng/mL M-CSF et 50 ng/mL GM-CSF.
- Activez les macrophages aux phénotypes M0, M1 ou M2 avec les stimulations décrites aux étapes 2.7.5-2.7.7.
- M0 - Aucune stimulation requise. Incuber les cellules pendant la nuit dans un milieu.
- M1 - Stimuler les cellules avec 100 ng/mL LPS et 10 ng/mL IFNγ (concentrations finales) pendant la nuit.
- M2 - Stimuler les cellules avec 100 ng / mL IL-4 (concentration finale) pendant la nuit.
- Jour 8 : Récoltez les cellules.
- Retirer les milieux des cellules (prélever les milieux et les congeler à -80 °C pour les essais en aval).
- Incuber les cellules dans du PBS glacé (50% du volume du média) pendant 5 min.
- Détachez les cellules de la plaque avec un grattage doux ou un pipetage répété.
- Abattez les cellules par centrifugation à 2500 x g pendant 5 min à RT. Jetez le surnageant.
- Congeler les pastilles de la cellule à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
REMARQUE : Voir schéma de protocole Figure 1 - Partie 2.
Representative Results
Avant de démontrer l’efficacité de ce protocole dans les macrophages, les niveaux de nitrite et de BH4 ont été évalués dans des milieux complétés par 10% de FBS contenant soit 10% de LCM, soit uniquement du M-CSF recombinant et du GM-CSF. Le nitrite, bien que longtemps considéré comme un produit final du métabolisme de l’oxyde nitrique, est maintenant considéré comme un stockage physiologique de l’oxyde nitrique, qui peut être recyclé si nécessaire et est donc souvent utilisé comme indicateur de la biodisponibilité de l’oxyde nitrique7. BH4 est un cofacteur essentiel de NOS pour la production de NO. Comme le montre la figure 2, les milieux complétés par 10 % de FBS présentaient des niveaux de nitrite similaires, indépendamment du M-CSF/GM-CSF ou du LCM. Cependant, une plus grande variabilité entre les différents lots de LCM a été observée. Cette observation s’appliquait également à la mesure BH4. En fait, un lot de LCM (lot n ° 3) avait un niveau significativement plus élevé de BH4 que les deux autres (lots n ° 1 et n ° 2). En outre, les lots de LCM contenaient significativement plus de bioptérine que les milieux complétés par 10% de FBS et de cytokines recombinantes. Une variabilité significative des bioptérines totales entre les lots a également été mesurée. Ces résultats démontrent l’importance d’utiliser une source de M-CSF moins variable que la LCM.
De plus, les milieux complétés par 10 % de FBS contenaient des niveaux significativement plus élevés de nitrite que les milieux contenant 2 % ou 5 % de FBS. La différence entre 10 % et 5 % était très significative (p < 0,05) pour BH4. Cependant, des niveaux similaires de bioptérines ont été quantifiés. En comparaison, OptiMEM + 0,2% de BSA était dépourvu de nitrite et de BH4, ce qui en fait un milieu très propre et approprié. Cependant, comme décrit par Bailey et al., bien qu’OptiMEM ne soit destiné à être utilisé qu’une seule fois pendant la nuit pour stimuler les macrophages, la mort cellulaire due à la famine a été observée. DMEM: F12 complété avec 2% de FBS a été choisi pour surmonter ce problème, permettant une contamination minimale par nitrite et BH4 tout en contenant suffisamment de nutriments pour obtenir des cellules saines. En effet, malgré la détection de certains nitrites, les niveaux sont négligeables (~0,2 μM) par rapport aux macrophages WT stimulés par LPS/IFN (30-80 μM pour 1 x 106 cellules ; données non présentées).
Pour valider ce protocole amélioré avec des données expérimentales, l’isolement et la caractérisation des BMDM à partir d’un nouveau modèle murin déficient en BH4, le R26-CreERT2Gchfl/fl est présenté ici. BH4 est produit par le gène GTP cyclohydrolase I (Gch1). Comme le montre la figure 3A, une carence en Gch1 entraîne une perte de BH4 et la disparition du NO et par la suite du nitrite, ainsi qu’une augmentation de l’anion superoxyde provoquant un stress oxydatif, comme l’ont démontré précédemment McNeill et al.8. Bien que ce protocole ait déjà été bien défini et utilisé pour cultiver d’autres macrophages déficients en BH4 à partir de différents systèmes Cre tels que le modèle Gchfl/flT2Cmodèle 6,8, le modèle R26-CreERT2Gchfl/fl est unique car il utilise l’activation conditionnelle du système Cre-ERT2 pour éliminer le gène Gch1 après un traitement au tamoxifène (Figure 3B, C). Cela permet l’élimination à différents moments et l’utilisation d’un contrôle interne sous la forme d’un véhicule vs traitement au tamoxifène. Dans cet exemple, les cellules ont été traitées avec du tamoxifène 4-OH véhicule (éthanol à 95 %) ou 0,1/1,0 μM μM aux jours 1 et 3 (le véhicule et le tamoxifène dilués 1:100 dans un milieu avant 0,7/7,0 μL ajoutés à 1 mL du volume de culture existant).
Comme le montre la figure 3D, la protéine GTPCH est abolie après un traitement au tamoxifène dans les cellules R26-CreERT2Gchfl/fl mais pas dans les cellules Gchfl/fl. Il est important de noter que les cellules de contrôle R26-CreERT2Gchfl/fl et Gchfl/fl sont toujours capables de produire des iNOS après stimulation LPS/IFN (Figure 3B,C). Ces changements dans l’expression du gène Gch1 et l’altération qui en a résulté dans la protéine GTPCH ont entraîné une perturbation significative des niveaux intracellulaires de BH4 et une diminution de la production de nitrite. Comme le montre la figure 4, les BMDM isolés et cultivés à partir de souris R26-CreERT2Gchfl/fl ont présenté une diminution significative de la production de BH4 et une diminution de l’accumulation de nitrite dans le milieu, par rapport à celles des cellulesfl/fl GCH témoins en présence de tamoxifène. De même, les mêmes cellules cultivées dans des milieux LCM ont également montré une expression de Gch1 abolie; bien que ces cellules aient encore produit des quantités importantes de BH4 et de nitrite après l’élimination de l’expression de Gch1 avec du tamoxifène 4 OH, peut-être en raison de la contamination des milieux et du FBS par du BH4. Cela représente une nette amélioration de la nouvelle méthode, par rapport à la culture des cellules dans des milieux contenant des cellules L.
Une caractérisation plus poussée de ce modèle ne démontre aucune différence significative de morphologie entre les BMDM Gchfl/fl non activés (M0) et les BMDM R26-CreERT2Gchfl/fl au jour 8 après différentes concentrations de tamoxifène. Comme le montre la figure 5, les deux modèles présentent une quantité similaire de cellules adhérentes de forme ronde avec des extrémités allongées, généralement les caractéristiques attendues des macrophages non stimulés9.
Pris ensemble, ces résultats démontrent que cette méthode d’isolement et de culture des BMDM fournit une population pure de cellules adaptées à la culture de macrophages murins. Cette méthode permet la culture de macrophages murins sans l’interférence de composés exogènes présents dans certaines formulations de milieux.
Figure 1 : Schéma illustrant l’isolement des cellules de la moelle osseuse (partie 1) à la sélection, à la différenciation et à la stimulation des BMDM (partie 2). (A) Dans des conditions stériles, les jambes disséquées sont placées dans une boîte de Pétri bactériologique propre après avoir été lavées dans de l’éthanol à 70 %. (B) Les muscles sont soigneusement enlevés à l’aide d’une pince et d’un grattage au scalpel le long des os. (C) Les extrémités des os sont ensuite coupées pour exposer la moelle osseuse. (D) La moelle osseuse est évacuée des os à l’aide d’une seringue de 10 mL remplie de 10 mL de PBS en insérant l’aiguille dans la lumière de l’os. (E) L’aiguille est passée de haut en bas à travers l’os pour s’assurer que toute la moelle osseuse est délogée. L’os doit apparaître blanc et clair à ce stade avec la moelle osseuse délogée recueillie dans la boîte de Pétri. (F-G) Répétez l’opération pour tous les os, en recueillant la moelle osseuse désagrégée dans la seringue de 1 mL, et faites-la passer à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube de centrifugeuse propre de 50 mL. Faites tourner et ressuspendez les cellules dans un milieu de congélation pour une utilisation ultérieure. La partie 2 montre la sélection, la différenciation et la stimulation des BMDM Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Niveaux de nitrite et de BH4 dans le DMEM : F12 + GM-CSF + M-CSF ou DMEM : F12+ milieu à cellules L. (A) Les niveaux de nitrite dans différents milieux ont été mesurés à l’aide de la méthode Griess Assay. (B) Les niveaux de BH4 et de bioptérines ont été mesurés dans différents milieux par quantification HPLC à l’aide d’une norme BH4. Les données sont exprimées comme la moyenne (n = 3) ± SD. Les données ont été analysées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle par de multiples comparaisons. Les symboles représentent p < 0,05 entre les groupes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Présentation du modèle R26CreERT2. (A) Schéma illustrant le rôle de BH4 en tant que cofacteur NOS dans la biologie redox. (B) Schéma détaillant l’excision des exons critiques (2 et 3) dans Gch1 en raison des sites loxP flanquants et de l’activation conditionnelle de Cre-ERT2 avec le tamoxifène dans ce modèle murin. (C) PCR (représentative de n = 3 animaux indépendants) démontrant l’excision de l’exon critique lorsque les BMDM sont traités avec du tamoxifène. Les souris WT produisent un produit PCR de 1030 bp, tandis qu’en présence du Cre, un produit de 1392 bp est produit, confirmant l’excision des exons critiques. (D) Immunoblot d’iNOS, de GCH et de B-tubuline (représentatif de n = 3 animaux indépendants). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation du déficit en BH4 dans les macrophages. (A,B) La qRT-PCR confirme la perte d’expression de Gch1 dans le modèle R26-CreERT2Gchfl/fl traité avec du tamoxifène. Bleu = Nouvelle méthode MCSF, Vert = méthode LCM classique. (C,D) L’analyse du BH4 intracellulaire par CLHP révèle que 0,1 μM et 1,0 μM sont suffisants pour diminuer significativement les niveaux de BH4. (E, F) La mesure du nitrite dans les milieux à l’aide du test Griess montre que les BMDM non stimulés ne produisent pas de niveaux détectables de nitrite, tandis que les BMDM Gchfl/fl et R26-CreERT2Gchfl/fl produisent du nitrite en présence de LPS/IFNγ. De manière significative, le traitement au tamoxifène du R26-CreERT2Gchfl/fl réduit considérablement les niveaux de nitrite dans les BMDM stimulés. Les données sont exprimées comme la moyenne de (n = 3) ± SD. Les données ont été analysées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle par plusieurs comparaisons. Les symboles représentent p < 0,05 entre les groupes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Comparaison de la morphologie des BMDM. Photos obtenues par microscopie optique des BMDM au Jour 8 avec le traitement variable du tamoxifène. L’échelle est indiquée dans l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Plat de culture | Volume multimédia | Densité d’ensemencement |
| Plat de 12 puits | 1 mL | 500 000 cellules |
| Plat à 6 puits | 2 mL | 1 000 000 cellules |
| Plat de 100 mm | 10 mL | 3 000 000 cellules |
| Flacon de 75 cm2 | 15 mL | 5 000 000 de cellules |
Tableau 1 : Densités d’ensemencement représentatives.
Discussion
Ce protocole de culture de BMDM déficient en BH4 et no NO a été conçu pour étudier la biologie du NO-redox dans les macrophages primaires grâce à la réduction de la tétrahydrobioptérine (BH4) et d’autres artefacts interférents dans le but d’améliorer la fiabilité et la reproductibilité des résultats obtenus à partir de ces modèles expérimentaux.
Les étapes critiques comprennent l’utilisation de la bonne vaisselle en plastique. Les progéniteurs de macrophages sont des cellules adhérentes et très collantes; par conséquent, l’utilisation de plaques traitées par culture non tissulaire (TC) est cruciale pour les sélectionner et les isoler d’autres cellules progénitrices, qui pourraient autrement fixer et réduire la pureté. Le jour de la récolte, le détachement des macrophages des plaques nécessite un PBS glacé, mais l’utilisation de l’EDTA ou même le grattage des cellules très doucement peut être effectué en fonction de l’application en aval (expérience sur les cellules lysées par rapport aux cellules vivantes, par exemple). Des précautions particulières doivent également être prises en ce qui concerne la contamination. Lors du rinçage de la moelle osseuse, une contamination croisée potentielle par des bactéries ou des particules virales provenant des restes de fourrure et de peau peut survenir. Il est alors essentiel d’être le plus prudent et stérile possible ; par conséquent, il est recommandé de plonger les jambes disséquées dans de l’éthanol à 70% pendant quelques minutes. De même, l’utilisation d’antibiotiques lors de la culture de macrophages est fortement recommandée.
Une autre limitation de ce protocole provient de la densité de placage cellulaire au jour 0. La moelle osseuse rincée contient une variété de cellules, qui peuvent être comptées à tort et incluses comme progéniteurs de macrophages, conduisant ainsi à un faux nombre total de cellules. Pour éviter la variabilité ultérieure et potentielle, les macrophages isolés peuvent être doucement rincés à l’aide de PBS chaud au jour 7 et replaqués à la densité correcte dans 2% FBS DMEM: F12 au moins 1 h avant la stimulation pour permettre l’adhérence.
Enfin, il est impératif de vérifier les niveaux de nitrite par essai de Griess à l’aide de milieux de macrophages cultivés pour analyser les données. Du côté positif, ce test est rapide et peu coûteux à effectuer.
Comme démontré ici, ce protocole personnalisé est une alternative plus définie et améliorée au protocole plus courant utilisé pour isoler et cultiver des macrophages à l’aide de milieux conditionnés par les cellules L (LCM). En effet, l’une des principales préoccupations de l’utilisation de la LCM lors de l’étude de la biologie NO-redox est ses quantités importantes de bioptérines détectées, conduisant à des changements métaboliques potentiels10. Par exemple, le BH4 exogène peut rapidement reconstituer les modèles déficients et agir comme cofacteur pour iNOS, conduisant à la production indésirable d’oxyde nitrique. Un autre inconvénient de l’utilisation de LCM réside dans sa production - LCM est un mélange de facteurs stimulant les colonies, de cytokines et d’autres sous-produits sécrétés directement par les cellules L-929, qui peuvent tous affecter la physiologie des macrophages6. Malgré son grand approvisionnement en M-CSF, essentiel à la prolifération et à la survie des macrophages, la variation de chaque composant d’un lot à l’autre augmente le risque de variabilité d’une expérience à l’autre.
Pour résoudre ces deux problèmes, ce nouveau protocole utilise le milieu DMEM: F12 bien défini contenant de faibles niveaux de bioptérines auxquels une quantité contrôlée de M-CSF purifié et de GM-CSF est ajoutée. Les deux cytokines aident à la différenciation et à la croissance des macrophages. Le M-CSF conduit notamment à la génération de DMOD à partir de cellules progénitrices de la moelle osseuse en assurant la différenciation des cellules souches hématopoïétiques en macrophages11. En outre, il a été démontré que le GM-CSF stimule la production de cytokines inflammatoires et de NO lorsqu’il est ajouté avant la stimulation, un réel avantage lors de l’étude de la biologie du NO-redox12,13.
L’autre facteur principal abordé par cette nouvelle méthode est celui du FBS, généralement utilisé comme source de nutriments essentiels à la bonne santé et à la croissance des cellules. Semblable à LCM, FBS contient des niveaux importants de bioptérine. Alors que la famine sérique complète des cellules avant la stimulation a été initialement envisagée à l’aide d’OptiMEM + 0,2% BSA, les macrophages ont montré des signes de détachement, indiquant une diminution de la viabilité cellulaire telle que décrite par Bailey et al.6. Cependant, comme les macrophages ont démontré un besoin absolu en sérum, l’endotoxine FBS ultra-faible de BioWest a été sélectionnée. Les lots ont été testés pour les bioptérines et présélectionnés avant l’achat en vrac pour assurer un approvisionnement fiable et bien défini. Pour aller plus loin dans l’objectif de réduire les sources polluantes de bioptérines, des concentrations réduites de FBS ont donc été testées. Au lieu d’utiliser 10% de sérum comme couramment utilisé en culture cellulaire, le taux de FBS est maintenu à 5% tout au long de la différenciation de 7 jours de la moelle osseuse en macrophages et réduit à 2% pendant la stimulation nocturne le dernier jour. Cela garantit des niveaux négligeables de bioptérines détectées, mais suffisamment de nutriments pour la bonne santé et l’adhérence des macrophages. Bien que ce protocole nouvellement optimisé utilisant le M-CSF recombinant se traduise par un environnement plus contrôlé pour la culture et l’activation des macrophages primaires, la principale limitation est que cette méthode est plus coûteuse que l’utilisation de la méthode LCM.
En tenant compte de tous ces facteurs, les deux méthodes ont ensuite été directement comparées. Il est important de noter que le protocole nouvellement modifié présenté ici à l’aide de M-CSF recombinant et de GM-CSF a abouti à un système plus reproductible où le milieu était dépourvu de BH4 contaminant. Les effets de cette situation étaient doubles; Les cellules déficientes en BH4 manquaient vraiment de BH4, ce qui entraînait une accumulation minimale détectable de nitrite dans le milieu après la stimulation au statut M1 avec LPS. Cela contrastait avec les mêmes cellules BMDM cultivées dans LCM, où des BH4 et des nitrites significatifs ont été détectés.
Pour conclure, la force de cette méthode réside dans l’effort de contrôler les niveaux de bioptérines en évaluant minutieusement chaque paramètre qui pourrait affecter la signalisation NO et redox dans les macrophages. En particulier, cela garantit une reproductibilité et une standardisation maximales dans le domaine de la biologie NO-redox.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la British Heart Foundation Intermediate Fellowship attribuée à M.J.C. (FS/14/56/31049), des subventions du programme de la British Heart Foundation (RG/17/10/32859 et RG/12/5/29576), wellcome Trust (090532/Z/09/Z) et le NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre. Les auteurs tiennent également à remercier le BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 et RE/18/3/34214)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
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