Summary
Denne protokollen er etablert for å dyrke tetrahydrobiopterin (BH4)- og inducible nitrogenoksidsyntase (iNOS)-mangelfulle primære murinmakrofager for å studere NO-redoksbiologi. Studien fokuserer på å redusere potensiell kontaminering av BH4 og andre artefakter som finnes i tradisjonelle isolasjons- og kulturmetoder som kan forvirre eksperimentelle resultater og tolkning av resultater.
Abstract
Makrofager er avledet fra hematopoietiske stamceller i hele kroppen, er sentrale for inflammatoriske prosesser, og deltar i medfødte og adaptive immunresponser. In vitro studie av makrofager kan utføres av ex vivo kultur fra bukhinnen eller gjennom differensiering av myeloid benmarg stamceller for å danne benmarg-avledede makrofager (BMDMs). En vanlig tilnærming til makrofagdifferensiering fra forløpere innebærer bruk av betingede medier fra L929-celler (LCM). Dette mediet er lett å selvproduserte, men lider av batchvariabilitet, og dets bestanddeler er udefinerte. På samme måte brukes Foetal Bovine Serum (FBS) til å støtte vekst, men inneholder en stor blanding av udefinerte molekyler som kan variere mellom partier. Disse metodene er ikke tilstrekkelige for studiet av nitrogenoksidbiologi og redoksmekanismer, da de begge inneholder betydelige mengder små molekyler som enten forstyrrer redoksmekanismer eller supplerende nivåer av kofaktorer, som tetrahydrobiopterin (BH4), som kreves for produksjon av NO fra inducible nitrogenoksidsyntase (iNOS). I denne rapporten presenterer vi en optimalisert protokoll som muliggjør kontroll av NO-redoksmiljøet ved å redusere nivåene av eksogen biopterin samtidig som vi opprettholder forhold som er egnet for cellevekst og differensiering. Tett kontroll over kulturmediesammensetning bidrar til å sikre eksperimentell reproduserbarhet og letter nøyaktig tolkning av resultatene. I denne protokollen ble BMDMer hentet fra en GTP cyclohydrolase (GCH)- mangelfull musemodell. Kultur av BMDMs ble utført med medier som inneholder enten (i) betinget LCM, eller (ii) rekombinant M-CSF og GM-CSF for å produsere minimale artefakter mens de fikk BH4 og NO-mangelfulle kulturforhold - og dermed muliggjøre den reproduserbare studien av NO-redoks biologi og immunometabolisme in vitro.
Introduction
Makrofager har blitt etablert som en interessant celletype i et bredt spekter av sykdommer og forhold, mange tilsynelatende ikke relatert til deres tradisjonelle fokus på medfødt immunitet. Siden makrofagfysiologi er sterkt avhengig av vevet eller miljøet de er bosatt i, har det oppstått mange metoder og modeller for å studere deres funksjon og de ulike veiene som er involvert. Historisk dominerte makrofagcellelinjer, som RAW264.7, feltet, men disse har gradvis blitt erstattet til fordel for ulike primærcellemodeller. For eksempel kan murin makrofager isoleres fra bukenal lavage etter behandling med tioglykolat. Mens de gir en nyttig modell for studiet av vevsboende celler, har disse bukhinneale makrofagene vist seg å demonstrere en mer dempet respons på ulike ytre stimuli, og dermed begrense deres egnethet for mange nedstrøms applikasjoner1.
Som et alternativ, benmargsavledede makrofager (BMDMer), avledet fra myeloide stamceller i benmargen, har dukket opp som en verdifull modell for å studere ulike aspekter av makrofagbiologi, inkludert modning og de ulike klassiske fenotypene forbundet med makrofager, M0 (naiv, ikke-aktivert), M1 (proinflammatorisk, vanligvis aktivert med LPS / IFN) og M2 (pro-oppløsning, vanligvis aktivert med IL-4)2, 3. Differensiering av myeloide stamceller i BMDM-er er imidlertid avhengig av tilstedeværelsen av makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) i kulturmediene 4,5. Dette kan leveres enten i form av renset protein tilsatt til media eller fra L929-betingede medier (LCM). Fordelene ved å bruke BMDM-er (kostnad og effektivitet) må veies opp mot begrensningene som presenteres av deres følsomhet overfor ulike stimuli (cytokiner, metabolske mellomprodukter og RNS/ROS).
Tidligere data indikerer at innholdet i LCM er dårlig definert og iboende variabelt, noe som resulterer i at de er upålitelige og uegnet for en rekke nedstrømsapplikasjoner, spesielt de som er spesielt relatert til NO- eller redoksbiologi, da disse kan være sterkt påvirket av tilstedeværelsen av eksogene forbindelser6. Som sådan krever denne detaljerte protokollen bruk av veldefinerte DMEM: F12-medier med lav batch-til-batch-variasjon og tillegg av rekombinant murine M-CSF og GM-CSF (Granulocyte-makrofag kolonistimulerende faktor). Videre gir foster bovint serum vanligvis brukt som et supplement i vevskulturmedier nok en kilde til dårlig definerte forbindelser og iboende variasjon. Det er derfor nødvendig å kontrollere for og optimalisere bruken av slike tilsetningsstoffer for å sikre pålitelig kultur av BMDMer. Ved å bruke en definert lav endotoxinkilde for FBS og sikre at enkeltpartier massekjøpes, er kulturforholdene pålitelig definert, og reproduserbarhet sikres. Protokollen som er beskrevet her, har vist seg å produsere en makrofagkultur over 95% renhet når den vurderes for makrofagoverflatemarkørene CD45 og CD11b ved strømningscytometri6.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med University of Oxford etiske komité og UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Alle prosedyrer i samsvar med Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU.
1. Isolering av benmargceller
- Ofre wild-type (C57BL/6), eller Gch1-mangelfulle (R26-CreERT2Gchfl/fl) mus (10-16 uker gammel) ved cervical dislokasjon og samle bakre lemmer.
MERK: Ingen preferanse for noen av kjønn er laget. Alderstilpassede kvinner vil være litt mindre enn sine mannlige kolleger, noe som påvirker det første utbyttet av startmateriale.- Spray musene med 70% etanol for å redusere risikoen for forurensning.
- Lag et lite kutt i magen med disseksjonssaks for å fjerne pels og hud fra kroppen. Skrell huden av for å eksponere muskelen på bakre lemmer.
- Plasser musen på magen og forvrid bakre lemmer ved å løfte den fra kneleddet og legge press på hoftene. Dislokasjonen kan føles på hofteleddet.
- Fjern bakbenene ved å forsiktig skjære gjennom muskelen i hoften, slik at det ikke oppstår skade på lårbenet.
- Klipp over ankelleddet, fjern foten og rengjør eventuell gjenværende hud fra benet.
- Legg de dissekerte beina i et 50 ml rør med 25 ml iskald PBS (ingen antibiotika nødvendig) og legg det på is.
MERK: Flere dyr kan dissekeres, og beina holdes på is.
- Under sterile forhold i en vevskultur hette, fjern musklene fra bena og fjern endene av beinene for å eksponere benmargen.
- Plasser bena i 70% etanol i 2 min for å redusere forurensning og vaske av pels eller rester.
- Overfør bena til en ren, steril, bakteriologisk Petri-tallerken. Bruk tang og en skalpell for å skrape fast og forsiktig langs beinene med siden av bladet for å fjerne musklene. Skjær gjennom sener for å lette prosessen.
- Fjern epifysen i ekstremiteten til hvert bein for å eksponere benmargen. Lårbenet er kuttet i begge ender, like under de respektive leddene.
- Tibia er kuttet på toppen, like under kneleddet, og i bunnen like over skjæringspunktet med fibula.
- Skyll benmargen fra beinene med PBS og samle den i et 50 ml sterilt rør.
- Fyll en 10 ml sprøyte med 10 ml PBS og fest den til en 25 G x 0,5 x 16 mm nål. Dette er tilstrekkelig til å skylle alle beinene fra en mus.
- Sett nålen inn i beinets medullære hulrom og skyll benmargen forsiktig ut med 1-2 ml PBS, og løp nålen opp og ned gjennom beinet for å sikre at all benmarg løsnes.
- Gjenta for alle bein, samle spylt benmarg i en ren Petri parabolen.
- Bruk en steril 1 ml sprøyte, deaggregater benmargen ved å trekke suspensjonen inn og ut av sprøyten 5-10 ganger til noen klumper er brutt opp.
- Samle den oppsamlede benmargen i 1 ml-sprøyten og før den gjennom en 70 μM cellesil i et rent 50 ml sentrifugerør. Legg den oppsamlede benmargen på is mens ytterligere prøver samles inn.
MERK: Se protokollskjema i figur 1 - del 1.
2. Utvelgelse, differensiering og stimulering av BMDM-er
- For å fryse benmarg til senere bruk, pellet benmargen ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 min og resuspend i 2 ml lav endotoksin FBS som inneholder 5% Dimetylsulfoksid (DMSO).
- Sentrifuger benmargsfjæringen ved 1000 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). En blodrød pellets vil danne seg.
- Kast supernatanten.
- Resuspend pellet forsiktig i 2 ml lav endotoxin FBS som inneholder 5% DMSO og fryse ved -80 °C over natten før overføring til dampfaset flytende nitrogen for langvarig lagring.
- For å bruke benmarg umiddelbart, lyse de røde blodcellene før du plating benmargen.
- Sentrifuger benmargsfjæringen ved 1000 x g i 5 min ved RT. En blodrød pellets vil danne seg.
- Resuspend pellet i 3 ml 1x rød blodlegeme lysis buffer og inkubere ved RT i 5 min.
- Tilsett 10 ml PBS og sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten.
- Belagt cellene for umiddelbar bruk ved å fortsette fra trinn 2.3.5.
- Avriming av makrofagene og resuspend i 3 ml plating media før pelleting cellene.
- Forbered DMEM: F12 som inneholder 5% lav endotoxin FBS, 1x penicillin/streptomycin, L-glutamin og 25 ng/ml M-CSF.
MERK: M-CSF og GM-CSF kan tilberedes ved å resuspendere tørket protein i sterilt vann som inneholder 0,1% steril bsa, og aliquots kan fryses ved -80 °C for senere bruk. - Avriming av den frosne cellefjæringen raskt ved 37 °C.
- Overfør cellefjæringen (0,5 ml) til et rent, sterilt rør som inneholder 3 ml av den forberedte DMEM: F12-mediet.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 min ved RT. Kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 3 ml av den forberedte DMEM: F12 media.
- Tell cellene etter en foretrukket metode.
- Forbered DMEM: F12 som inneholder 5% lav endotoxin FBS, 1x penicillin/streptomycin, L-glutamin og 25 ng/ml M-CSF.
- Dag 0: Plate cellene.
- Plate cellene i ikke-TC-belagt plast ware i DMEM: F12 medier som inneholder 5% lav endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin, og 25 ng / ml M-CSF.
MERK: Representative såingstettheter er beskrevet i tabell 1. Et komplett par ben fra en mus gir 15-20 millioner forløperceller. - Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2.
- Plate cellene i ikke-TC-belagt plast ware i DMEM: F12 medier som inneholder 5% lav endotoksin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin, og 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 5: Mat cellene.
- Fôr cellene ved å legge til 50% av det opprinnelige volumet av DMEM: F12-medier som inneholder 5% lav endotoxin FBS, 1x penicillin/streptomycin, L-glutamin og 50 ng/ml M-CSF.
- Dag 6: Stimulere cellene med GM-CSF.
- Legg forberedt GM-CSF til en endelig konsentrasjon på 50 ng / ml direkte til cellekulturmediet på cellene.
- Erstatt mediet med klargjort DMEM: F12.
- Fjern alle medier fra cellene.
- Vask cellene kort i forvarmet PBS.
- Tilsett DMEM: F12-medier som inneholder 2 % lav endotoxin FBS, 1x penicillin/streptomycin, L-glutamin, 25 ng/ml M-CSF og 50 ng/ml GM-CSF.
- Aktiver makrofagene til M0-, M1- eller M2-fenotypene med stimuleringene som er beskrevet i trinn 2.7.5-2.7.7.
- M0 - Ingen stimulering nødvendig. Inkuber cellene over natten i media.
- M1 - Stimulere cellene med 100 ng/ml LPS og 10 ng/ml IFNγ (endelige konsentrasjoner) over natten.
- M2 - Stimulere celler med 100 ng/ml IL-4 (sluttkonsentrasjon) over natten.
- Dag 8: Høst cellene.
- Fjern medier fra cellene (samle medier og frys ved -80 °C for nedstrømsanalyser).
- Inkuber cellene i iskald PBS (50% av medievolumet) i 5 min.
- Løsne cellene fra platen med skånsom skraping eller gjentatt pipettering.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 2500 x g i 5 min ved RT. Kast supernatanten.
- Frys cellepellets ved -80 °C for senere bruk.
MERK: Se protokollskjema Figur 1 - Del 2.
Representative Results
Før du demonstrerte effektiviteten av denne protokollen i makrofager, nitritt og BH4-nivåer ble vurdert i medier supplert med 10% av FBS som inneholder enten 10% av LCM eller bare rekombinant M-CSF og GM-CSF. Nitritt, selv om det i lang tid anses som et sluttprodukt av nitrogenoksidmetabolisme, anses nå som fysiologisk lagring av nitrogenoksid, som kan resirkuleres når det er nødvendig og dermed ofte brukes som en indikator på nitrogenoksid biotilgjengelighet7. BH4 er en viktig kofaktor for NOS for NO-produksjon. Som vist i figur 2 hadde medier supplert med 10% FBS lignende nitrittnivåer uavhengig av M-CSF / GM-CSF eller LCM. Det ble imidlertid observert mer variasjon mellom ulike LCM-partier. Denne observasjonen gjaldt også BH4-målingen. Faktisk hadde en batch av LCM (batch # 3) et betydelig høyere nivå av BH4 enn de to andre (partier # 1 og # 2). Videre inneholdt LCM-partier betydelig mer biopterin enn medier supplert med 10% FBS og rekombinante cytokiner. Det ble også målt signifikant variasjon i totale biopteriner mellom partiene. Disse resultatene viser viktigheten av å bruke en mindre variabel kilde til M-CSF enn LCM.
Videre inneholdt medier supplert med 10% FBS betydelig høyere nivåer av nitritt sammenlignet med medier som inneholder enten 2% eller 5% av FBS. Forskjellen mellom 10% og 5% var svært signifikant (p < 0,05) for BH4. Imidlertid ble lignende nivåer av biopteriner kvantifisert. Til sammenligning var OptiMEM + 0,2% BSA blottet for nitritt og BH4, noe som gjorde det til et veldig rent og passende medium. Men som beskrevet av Bailey et al., selv om OptiMEM er ment å brukes bare en gang over natten når stimulerende makrofager, ble celledød på grunn av sult observert. DMEM: F12 supplert med 2% av FBS ble valgt for å overvinne dette problemet, slik at minimal nitritt og BH4-forurensning samtidig som den inneholder tilstrekkelige næringsstoffer for å oppnå sunne celler. Faktisk, til tross for at noe nitritt blir oppdaget, er nivåene ubetydelige (~ 0,2 μM) sammenlignet med LPS / IFN stimulerte WT-makrofager (30-80 μM for 1 x 106 celler; data ikke vist).
For å validere denne forbedrede protokollen med eksperimentelle data, isolasjon og karakterisering av BMDMer fra en ny BH4-mangelfull musemodell, presenteres R26-CreERT2Gchfl / fl her. BH4 er produsert av GTP cyclohydrolase I (Gch1) genet. Som vist i figur 3A fører mangel i Gch1 til tap av BH4 og den resulterende forsvinningen av NO og deretter nitritt, og en økning i superoksid anion forårsaker oksidativt stress som vist tidligere av McNeill et al.8. Selv om denne protokollen allerede er godt definert og brukt til å dyrke andre BH4-mangelfulle makrofager fra forskjellige Cre-system som Gchfl/flT2C-modellen 6,8, er R26-CreERT2Gchfl/fl-modellen unik da den benytter den betingede aktiveringen av Cre-ERT2-systemet for å fjerne Gch1-genet etter tamoxifenbehandling (figur 3B, C). Dette tillater knockout på ulike tidspunkter og bruk av internkontroll i form av et kjøretøy vs. tamoxifen behandling. I dette eksemplet ble celler behandlet med enten kjøretøy (95% etanol) eller 0,1/1,0 μM 4-OH tamoxifen på dag 1 og 3 (både kjøretøy og tamoksifen lager fortynnet 1:100 i media før 0,7/7,0 μL lagt til 1 ml av det eksisterende kulturvolumet).
Som vist i figur 3D avskaffes GTPCH-protein etter Tamoxifen-behandling i R26-CreERT2Gchfl/fl-cellene , men ikke i Gchfl/fl . Det er viktig at både R26-CreERT2Gchfl/fl og Gchfl/fl kontrollceller fortsatt kan produsere iNOS etter LPS/IFN-stimulering (figur 3B, C). Disse endringene i Gch1 genuttrykk og den resulterende endringen i GTPCH protein førte til betydelig forstyrret intracellulær BH4 nivåer og svekket produksjon av nitritt. Som vist i figur 4, bmdms isolert og dyrket fra R26-CreERT2Gchfl / fl mus viste betydelig redusert BH4 produksjon og redusert nitritt akkumulering i media, sammenlignet med de fra kontroll GCHfl / fl celler i nærvær av tamoxifen. På samme måte viste de samme cellene som ble dyrket i LCM-medier også avskaffet Gch1-uttrykk; selv om disse cellene fortsatt produserte betydelige mengder både BH4 og nitritt etter knockout av Gch1-uttrykk med 4 OH tamoxifen, muligens på grunn av forurensning av medier og FBS med BH4. Dette representerer en klar forbedring av den nye metoden, fremfor å dyrke cellene i L-celleholdige medier.
Videre karakterisering av denne modellen viser ingen signifikante forskjeller i morfologi mellom ikke-aktiverte (M0) Gchfl/fl og R26-CreERT2Gchfl/fl BMDMs på dag 8 etter forskjellige konsentrasjoner av tamoksifen. Som vist i figur 5, viser begge modellene en lignende mengde tilhengerceller laget av en rund form med langstrakte ekstremiteter, vanligvis funksjonene som forventes av ustimulerte makrofager9.
Samlet viser disse resultatene at denne metoden for isolasjon og kultur av BMDMer gir en ren populasjon av celler som passer for kulturen av murin makrofager. Denne metoden gjør det mulig for kulturen av murin makrofager uten forstyrrelse av eksogene forbindelser som er tilstede i noen medieformuleringer.
Figur 1: Skjematisk diagram som illustrerer benmargscelleisolasjon (del 1) til valg, differensiering og stimulering av BMDM-er (del 2). (A) Under sterile forhold plasseres dissekerte ben i en ren bakteriologisk petriskål etter å ha blitt vasket i 70% etanol. (B) Muskler fjernes forsiktig ved hjelp av tang og skalpellskraping langs beinene. (C) Ekstremitetene i beinene kuttes deretter av for å eksponere benmargen. (D) Benmargen skylles fra beinene ved hjelp av en 10 ml sprøyte fylt med 10 ml PBS ved å sette nålen inn i benets lumen. (E) Nålen kjøres opp og ned gjennom beinet for å sikre at all benmarg løsnes. Beinet skal virke hvitt og klart på det stadiet med det løsnede benmargen samlet i petriskålen. (F-G) Gjenta for alle bein, samle den oppsamlet benmargen i 1 ml sprøyte, og send den gjennom en 70 μm cellesil i et rent 50 ml sentrifugerør. Snurr ned og resuspend celler i frysemedier for senere bruk. Del 2 viser valg, differensiering og stimulering av BMDMer Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nitritt- og BH4-nivåer i DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF eller DMEM: F12+ L-cellemedier. (A) Nitrittnivåer i ulike medier ble målt ved hjelp av Griess Assay-metoden. (B) BH4- og biopterins-nivåer ble målt i forskjellige medier av HPLC-kvantifisering ved hjelp av en BH4-standard. Data uttrykkes som gjennomsnittet (n = 3) ± SD. Data ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA ved flere sammenligninger. Symboler representerer p < 0,05 mellom gruppene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Innføring av R26CreERT2-modellen. (A) Ordningen som illustrerer BH4s rolle som NOS-medfaktor i redoksbiologi. (B) Skjematisk detaljering av eksisjonen av de kritiske eksonene (2 og 3) i Gch1 på grunn av flanke loxP-anleggene og den betingede aktiveringen av Cre-ERT2 med tamoxifen i denne murine modellen. (C) PCR (representant for n = 3 uavhengige dyr) som demonstrerer eksisjon av den kritiske eksonen når BMDMer behandles med tamoksifen. WT-mus produserer et 1030 bp PCR-produkt, mens i nærvær av Cre produseres et 1392 bp-produkt som bekrefter eksisjon av de kritiske eksonene. (D) Immunoblot av iNOS, GCH og B-tubulin (representant for n = 3 uavhengige dyr). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av BH4-mangel i makrofager. (A,B) qRT-PCR bekrefter tap av Gch1-uttrykk i R26-CreERT2Gchfl/fl-modellen som behandles med tamoksifen. Blå = Ny MCSF-metode, Grønn = klassisk LCM-metode. (C,D) Analyse av intracellulær BH4 fra HPLC viser at 0,1 μM og 1,0 μM er tilstrekkelig til å redusere BH4-nivåene betydelig. (E, F) Måling av nitritt i medier ved hjelp av Griess-analysen viser at ustimulerte BMDM-er ikke produserer påvisbare nivåer av nitritt, mens Gchfl/fl og R26-CreERT2Gchfl/fl BMDMs produserer nitritt i nærvær av LPS/IFNγ. Betydelig, tamoxifen behandling av R26-CreERT2Gchfl / fl betydelig reduserer nitritt nivåer i stimulerte BMDMs. Data uttrykkes som gjennomsnittet av (n = 3) ± SD. Data ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA ved flere sammenligninger. Symboler representerer p < 0,05 mellom gruppene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av BMDMs morfologi. Bilder innhentet ved optisk mikroskopi av BMDM-er på dag 8 med varierende behandling av tamoksifen. Skala er angitt i bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kulturrett | Medievolum | Såing Tetthet |
| 12 brønnrett | 1 ml | 500 000 celler |
| 6 brønnrett | 2 ml | 1 000 000 celler |
| 100 mm tallerken | 10 ml | 3 000 000 celler |
| 75 cm2 kolbe | 15 ml | 5 000 000 celler |
Tabell 1: Representative såddtettheter.
Discussion
Denne BH4- og NO-mangelfulle BMDMs kulturprotokollen er designet for å undersøke NO-redoksbiologi i primære makrofager gjennom reduksjon av tetrahydrobiopterin (BH4) og andre forstyrrende artefakter med sikte på å forbedre påliteligheten og reproduserbarheten av resultater oppnådd fra disse eksperimentelle modellene.
Kritiske trinn inkluderer bruk av riktig plastvare. Makrofag forfedre er adherent celler og veldig klebrig; Derfor er bruk av ikke-vevskultur (TC) behandlede plater avgjørende for å velge og isolere dem fra andre stamceller, som ellers kunne feste og redusere renhet. På høstdagen krever løsrivelse av makrofager fra plater iskald PBS, men bruk av EDTA eller til og med skraping av celler veldig forsiktig kan utføres avhengig av nedstrømsapplikasjonen (for eksempel lysed versus live cells eksperiment). Det bør også utvises særlig forsiktighet vedrørende forurensning. Mens du skyller ut benmargen, kan det oppstå potensiell krysskontaminering med bakterier eller virale partikler fra rester av pels og hud. Det er da viktig å være så forsiktig og steril som mulig; derfor er det oppmuntret å stupe dissekerte ben i 70% etanol i noen minutter. På samme måte anbefales det på det sterkeste å bruke antibiotika mens du vokser makrofager.
En annen begrensning i denne protokollen oppstår fra cellebeleggtettheten på dag 0. Spylt benmarg inneholder en rekke celler, som feilaktig kan telles og inkluderes som makrofagforfedere, noe som fører til et falskt totalt cellenummer. For å unngå påfølgende og potensielle variasjoner, kan isolerte makrofager forsiktig skylles ved hjelp av varm PBS på dag 7 og re-belagt med riktig tetthet i 2% FBS DMEM: F12 minst 1 time før stimulering for å tillate overholdelse.
Til slutt er det viktig å sjekke nitrittnivåene av Griess-analyse ved hjelp av medier fra dyrkede makrofager for å analysere data. På plussiden er denne analysen rask og billig å utføre.
Som vist her, er denne tilpassede protokollen et mer definert og forbedret alternativ til den mer vanlige protokollen som brukes til å isolere og dyrke makrofager ved hjelp av L-cellekondisjonerte medier (LCM). Faktisk er en av de viktigste bekymringene ved bruk av LCM når man studerer NO-redoksbiologi dens betydelige mengder biopteriner oppdaget, noe som fører til potensielle metabolske endringer10. For eksempel kan eksogen BH4 raskt fylle opp mangelfulle modeller og fungere som en kofaktor for iNOS, noe som fører til uønsket produksjon av nitrogenoksid. En annen ulempe ved å bruke LCM ligger i produksjonen - LCM er en blanding av kolonistimulerende faktorer, cytokiner og andre biprodukter utskilt direkte av L-929-celler, som alle kan påvirke makrofagfysiologi6. Til tross for den store forsyningen i M-CSF, som er avgjørende for makrofagspredning og overlevelse, øker variasjonen av hver komponent fra batch til batch risikoen for variasjon på tvers av eksperimenter.
For å løse begge problemene bruker denne nye protokollen det veldefinerte DMEM: F12-mediet som inneholder lave nivåer av biopteriner som en kontrollert mengde renset M-CSF og GM-CSF legges til. Begge cytokinene bistår i differensiering og vekst av makrofager. M-CSF fører spesielt til generering av BMDMer fra benmargsforfedrederceller ved å sikre differensiering av hematopoietiske stamceller i makrofager11. I tillegg har GM-CSF vist seg å øke inflammatorisk cytokin- og NO-produksjon når den tilsetts før stimulering, en reell fordel ved studier av NO-redoksbiologi12,13.
Den andre hovedfaktoren denne nye metoden adresserer er FBS, vanligvis brukt som en kilde til næringsstoffer som er avgjørende for god helse og vekst av celler. I likhet med LCM inneholder FBS betydelige nivåer av biopterin. Mens fullstendig serum sult av cellene før stimulering først ble vurdert ved hjelp av OptiMEM + 0,2% BSA, viste makrofager tegn på løsrivelse, noe som indikerer redusert celle levedyktighet som beskrevet av Bailey et al.6. Men ettersom makrofager viste et absolutt krav til serum, ble Ultra-Low Endotoxin FBS fra BioWest valgt. Partier ble testet for biopteriner og forhåndsvalgt før bulkkjøpet for å sikre en pålitelig og veldefinert forsyning. For å gå videre i målet om å redusere forurensende kilder til biopteriner, ble derfor reduserte konsentrasjoner av FBS testet. I stedet for å bruke 10% serum som ofte brukes i cellekultur, holdes FBS-nivået til 5% gjennom 7-dagers differensiering av benmarg i makrofager og ytterligere redusert til 2% under nattstimulering på den siste dagen. Dette sikrer ubetydelige nivåer av biopteriner oppdaget, men nok næringsstoffer for god helse og overholdelse av makrofager. Selv om denne nylig optimaliserte protokollen ved hjelp av rekombinant M-CSF resulterer i et mer kontrollert miljø for kultur og aktivering av primære makrofager, er hovedbegrensningen at denne metoden er dyrere enn å bruke LCM-metoden.
Med tanke på alle disse faktorene ble de to metodene deretter direkte sammenlignet. Det er viktig at den nylig modifiserte protokollen som presenteres her, ved hjelp av rekombinant M-CSF og GM-CSF, resulterte i et mer reproduserbart system der mediet var blottet for å forurense BH4. Effektene av dette var todelt; BH4-mangelfulle celler manglet virkelig BH4, noe som resulterte i minimal påviselig nitrittakkumulering i media etter stimulering til M1-status med LPS. Dette var i motsetning til de samme BMDM-cellene som ble dyrket i LCM, hvor betydelig BH4 og nitritt ble oppdaget.
For å konkludere ligger styrken til denne metoden i arbeidet med å kontrollere biopterinsnivåer ved å grundig vurdere hver parameter som kan påvirke NO og redokssignalering i makrofager. Spesielt sikrer dette maksimal reproduserbarhet og standardisering innen NO-redoksbiologifeltet.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation Intermediate Fellowship tildelt M.J.C. (FS/14/56/31049), British Heart Foundation Program grants (RG/17/10/32859 og RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) og NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre. Forfatterne ønsker også å anerkjenne støtte fra BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 og RE/18/3/34214)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
