Summary
Detta protokoll har upprättats för att odla tetrahydrobiopterin (BH4) - och inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) -bristfälliga primära murina makrofager för att studera NO-redoxbiologi. Studien fokuserar på att minska potentiell förorening av BH4 och andra artefakter som finns i traditionella isolerings- och odlingsmetoder som kan förvirra experimentella resultat och tolkning av resultat.
Abstract
Makrofager härrör från hematopoetiska stamceller i hela kroppen, är centrala för inflammatoriska processer och deltar i medfödda och adaptiva immunsvar. In vitro-studier av makrofager kan genomföras genom ex vivo-odling från bukhinnan eller genom differentiering av myeloida benmärgsstamceller för att bilda benmärgs-härledda makrofager (BMDM). Ett vanligt tillvägagångssätt för makrofagdifferentiering från prekursorer innefattar användning av konditionerade medier från L929-celler (LCM). Detta medium är lätt att självproducera men lider av batchvariation, och dess beståndsdelar är odefinierade. På samma sätt används Foetal Bovine Serum (FBS) för att stödja tillväxt men innehåller en stor blandning av odefinierade molekyler som kan variera mellan satser. Dessa metoder är inte tillräckliga för studier av kväveoxidbiologi och redoxmekanismer eftersom de båda innehåller betydande mängder små molekyler som antingen stör redoxmekanismerna eller kompletterar nivåerna av kofaktorer, såsom tetrahydrobiopterin (BH4), som krävs för produktion av NO från inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS). I denna rapport presenterar vi ett optimerat protokoll som möjliggör kontroll av NO-redoxmiljön genom att minska nivåerna av exogent biopterin samtidigt som vi bibehåller förhållanden som är lämpliga för celltillväxt och differentiering. Tät kontroll av odlingsmediets sammansättning bidrar till att säkerställa experimentell reproducerbarhet och underlättar korrekt tolkning av resultaten. I detta protokoll erhölls BMDM från en GTP-cyklohydrolas (GCH)- bristfällig musmodell. Odling av BMDM utfördes med media som innehöll antingen (i) konditionerad LCM eller (ii) rekombinant M-CSF och GM-CSF för att producera minimala artefakter samtidigt som BH4 och NO-bristfälliga odlingsförhållanden erhölls - vilket möjliggjorde reproducerbar studie av NO-redoxbiologi och immunometabolism in vitro.
Introduction
Makrofager har etablerats som en intressant celltyp i en mängd olika sjukdomar och tillstånd, många till synes orelaterade till deras traditionella fokus på medfödd immunitet. Eftersom makrofagfysiologin är starkt beroende av vävnaden eller miljön de är bosatta i har många metoder och modeller uppstått för att studera deras funktion och de olika vägar som är inblandade. Historiskt sett dominerade makrofagcellinjer, såsom RAW264.7, fältet, men dessa har gradvis ersatts till förmån för olika primära cellmodeller. Till exempel kan murina makrofager isoleras från bukhinnesköljning efter behandling med tioglykolat. Samtidigt som de tillhandahåller en användbar modell för studier av vävnadsboende celler, har dessa peritoneala makrofager visat sig visa ett mer dämpat svar på olika yttre stimuli, vilket begränsar deras lämplighet för många nedströms applikationer1.
Som ett alternativ har benmärgshärledda makrofager (BMDM), härledda från myeloida stamceller i benmärgen, framträtt som en värdefull modell för att studera olika aspekter av makrofagbiologi, inklusive mognad och de olika klassiska fenotyperna associerade med makrofager, M0 (naiv, icke-aktiverad), M1 (proinflammatorisk, vanligtvis aktiverad med LPS / IFN) och M2 (pro-upplösning, vanligtvis aktiverad med IL-4)2, 3. Differentieringen av myeloida stamceller till BMDM är emellertid beroende av närvaron av makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) i odlingsmediet 4,5. Detta kan tillföras antingen i form av renat protein tillsatt till mediet eller från L929-konditionerade medier (LCM). Fördelarna med att använda BMDM (kostnad och effektivitet) måste vägas mot de begränsningar som deras känslighet för olika stimuli (cytokiner, metaboliska intermediärer och RNS / ROS) ger.
Tidigare data tyder på att innehållet i LCM är dåligt definierat och i sig varierande, vilket resulterar i att de är otillförlitliga och olämpliga för en mängd olika nedströmstillämpningar, särskilt de som specifikt rör NO- eller redoxbiologi, eftersom dessa kan påverkas starkt av närvaron av exogena föreningar6. Som sådan kräver detta detaljerade protokoll användning av väldefinierade DMEM: F12-medier med låg sats till batchvariation och tillsats av rekombinant murin M-CSF och GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). Dessutom ger fetalt bovint serum som vanligtvis används som ett komplement i vävnadsodlingsmedier ännu en källa till dåligt definierade föreningar och inneboende variation. Det är därför nödvändigt att kontrollera och optimera användningen av sådana tillsatser för att säkerställa en tillförlitlig odling av BMDM. Genom att använda en definierad lågendotoxinkälla för FBS och säkerställa att enstaka satser köps i bulk, definieras odlingsförhållandena på ett tillförlitligt sätt och reproducerbarheten säkerställs. Protokollet som beskrivs här har visat sig producera en makrofagkultur över 95% renhet när den bedöms för makrofagytmarkörerna CD45 och CD11b genom flödescytometri6.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och utfördes i enlighet med University of Oxfords etiska kommitté och UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Alla förfaranden överensstämde med Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU.
1. Isolering av benmärgsceller
- Offra vildtyp (C57BL / 6) eller Gch1-bristfälliga (R26-CreERT2Gchfl / fl) möss (10-16 veckor gamla) genom cervikal förskjutning och samla bakbenen.
OBS: Ingen preferens för något av könen görs. Åldersmatchade honor kommer att vara något mindre än sina manliga motsvarigheter, vilket påverkar det ursprungliga utbytet av utgångsmaterial.- Spraya mössen med 70% etanol för att minska risken för kontaminering.
- Gör ett litet snitt i buken med dissektionssax för att ta bort päls och hud från kroppen. Skala av huden för att exponera muskeln på bakbenen.
- Placera musen på buken och förflytta bakbenen genom att lyfta den från knäleden och placera tryck på höfterna. Förskjutningen kan kännas vid höftledet.
- Ta bort bakbenen genom att försiktigt skära genom muskeln vid höften, så att inga skador uppstår på lårbenet.
- Skär ovanför fotleden, ta bort foten och rengör eventuell kvarvarande hud från benet.
- Placera de dissekerade benen i ett 50 ml rör med 25 ml iskall PBS (inget antibiotikum krävs) och lägg det på is.
OBS: Flera djur kan dissekeras och benen hålls på is.
- Under sterila förhållanden i en vävnadsodlingskåpa, ta bort musklerna från benen och ta bort benens ändar för att exponera benmärgen.
- Placera benen i 70% etanol i 2 min för att minska kontaminering och tvätta bort eventuell päls eller rester.
- Överför benen till en ren, steril, bakteriologisk petriskål. Använd pincett och en skalpell för att ordentligt och försiktigt skrapa längs benen med sidan av bladet för att ta bort musklerna. Skär genom senor för att underlätta processen.
- Ta bort epifysen vid extremiteten av varje ben för att exponera benmärgen. Lårbenet skärs i vardera änden, strax under respektive leder.
- Tibia skärs på toppen, strax under knäleden och längst ner strax ovanför skärningspunkten med fibula.
- Spola benmärgen från benen med PBS och samla den i ett 50 ml sterilt rör.
- Fyll en 10 ml spruta med 10 ml PBS och fäst på en 25 G x 0,5 x 16 mm nål. Detta är tillräckligt för att spola alla ben från en mus.
- Sätt in nålen i benets medullära hålighet och spola försiktigt benmärgen ut med 1-2 ml PBS, kör nålen upp och ner genom benet för att säkerställa att all benmärg lossnar.
- Upprepa för alla ben, samla den spolade benmärgen i en ren petriskål.
- Använd en steril 1 ml spruta, disaggregera benmärgen genom att dra suspensionen in och ut ur sprutan 5-10 gånger tills eventuella klumpar bryts upp.
- Samla den disaggregerade benmärgen i 1 ml sprutan och passera den genom en 70 μM cellsil i ett rent 50 ml centrifugrör. Placera den uppsamlade benmärgen på is medan ytterligare prover samlas in.
OBS: Se protokollschemat i figur 1 - del 1.
2. Urval, differentiering och stimulering av BMDM
- För att frysa benmärgen för senare användning, pelletera benmärgen genom centrifugering vid 1000 x g i 5 min och återsuspendera i 2 ml FBS med lågt endotoxin innehållande 5% dimetylsulfoxid (DMSO).
- Centrifugera benmärgssuspensionen vid 1000 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT). En blodröd pellets kommer att bildas.
- Kassera supernatanten.
- Återsuspendera försiktigt pelletsen i 2 ml FBS med lågt endotoxin innehållande 5% DMSO och frys vid -80 ° C över natten innan den överförs till ångfas flytande kväve för långvarig lagring.
- För att använda benmärg omedelbart, lysa de röda blodkropparna innan du pläterar benmärgen.
- Centrifugera benmärgssuspensionen vid 1000 x g i 5 min vid RT. En blodröd pellets kommer att bildas.
- Resuspendera pelletsen i 3 ml 1x lysbuffert för röda blodkroppar och inkubera vid RT i 5 minuter.
- Tillsätt 10 ml PBS och centrifug vid 1000 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Platta cellerna för omedelbar användning genom att fortsätta från steg 2.3.5.
- Avfrostning av makrofagerna och återutnyttja i 3 ml pläteringsmedier innan cellerna pelleteras.
- Förbered DMEM: F12 innehållande 5% lågt endotoxin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin och 25 ng / ml M-CSF.
OBS: M-CSF och GM-CSF kan framställas genom återanvändning av torkat protein i sterilt vatten innehållande 0,1% steril BSA, och alikvoterna kan frysas vid -80 ° C för senare användning. - Tina upp den frysta cellsuspensionen snabbt vid 37 °C.
- Överför cellsuspensionen (0,5 ml) till ett rent, sterilt rör innehållande 3 ml av det beredda DMEM: F12-mediet.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 1000 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Resuspend pelletsen i 3 ml av det beredda DMEM: F12-mediet.
- Räkna cellerna med en föredragen metod.
- Förbered DMEM: F12 innehållande 5% lågt endotoxin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin och 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 0: Platta cellerna.
- Platta cellerna i icke-TC-belagda plastvaror i DMEM: F12-media innehållande 5% lågt endotoxin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin och 25 ng / ml M-CSF.
OBS: Representativa sådddensiteter beskrivs i tabell 1. Ett komplett par ben från en mus ger 15-20 miljoner prekursorceller. - Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 % CO2.
- Platta cellerna i icke-TC-belagda plastvaror i DMEM: F12-media innehållande 5% lågt endotoxin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin och 25 ng / ml M-CSF.
- Dag 5: Mata cellerna.
- Mata cellerna genom att tillsätta 50% av den ursprungliga volymen DMEM: F12-media innehållande 5% lågt endotoxin FBS, 1x penicillin / streptomycin, L-glutamin och 50 ng / ml M-CSF.
- Dag 6: Stimulera cellerna med GM-CSF.
- Tillsätt beredd GM-CSF till en slutlig koncentration av 50 ng / ml direkt till cellodlingsmediet på cellerna.
- Ersätt mediet med förberedd DMEM: F12.
- Ta bort alla medier från cellerna.
- Tvätta cellerna kort i förvärmd PBS.
- Tillsätt DMEM: F12-media innehållande 2% lågt endotoxin FBS, 1x penicillin/streptomycin, L-glutamin, 25 ng/ml M-CSF och 50 ng/ml GM-CSF.
- Aktivera makrofagerna till fenotyperna M0, M1 eller M2 med de stimuleringar som beskrivs i steg 2.7.5–2.7.7.
- M0 - Ingen stimulering krävs. Inkubera cellerna över natten i media.
- M1 - Stimulera cellerna med 100 ng / ml LPS och 10 ng / ml IFNγ (slutliga koncentrationer) över natten.
- M2 - Stimulera celler med 100 ng / ml IL-4 (slutlig koncentration) över natten.
- Dag 8: Skörda cellerna.
- Ta bort media från cellerna (samla upp media och frys vid -80 °C för nedströms analyser).
- Inkubera cellerna i iskall PBS (50% av medievolymen) i 5 min.
- Lossa cellerna från plattan med mild skrapning eller upprepad pipettering.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 2500 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Frys cellpelletsen vid -80 °C för senare användning.
OBS: Se protokollschema Figur 1 - Del 2.
Representative Results
Innan man demonstrerade effektiviteten av detta protokoll i makrofager, nitrit och BH4 nivåer bedömdes i media kompletterat med 10% FBS innehållande antingen 10% av LCM eller endast rekombinant M-CSF och GM-CSF. Nitrit, även om det länge betraktas som en slutprodukt av kväveoxidmetabolism, betraktas nu som fysiologisk lagring av kväveoxid, som kan återvinnas vid behov och därför ofta används som en indikator på kväveoxidbiotillgänglighet7. BH4 är en viktig kofaktor för NOS för NO-produktion. Som framgår av figur 2 hade media kompletterat med 10% FBS liknande nitritnivåer oavsett M-CSF / GM-CSF eller LCM. Mer variation mellan olika LCM-satser observerades emellertid. Denna observation gällde även BH4-mätningen. Faktum är att en sats LCM (batch #3) hade en betydligt högre nivå av BH4 än de andra två (batcherna #1 och #2). Dessutom innehöll LCM-satser betydligt mer biopterin än media kompletterat med 10% FBS och rekombinanta cytokiner. Signifikant variation av totala biopteriner mellan satser mättes också. Dessa resultat visar vikten av att använda en mindre variabel källa till M-CSF än LCM.
Dessutom innehöll media kompletterade med 10% FBS signifikant högre nivåer av nitrit jämfört med media som innehöll antingen 2% eller 5% FBS. Skillnaden mellan 10% och 5% var mycket signifikant (p < 0,05) för BH4. Liknande nivåer av biopteriner kvantifierades emellertid. Som jämförelse saknade OptiMEM + 0,2% BSA nitrit och BH4, vilket gjorde det till ett mycket rent och lämpligt medium. Men som beskrivits av Bailey et al., även om OptiMEM är tänkt att användas endast en gång över natten vid stimulering av makrofager, observerades celldöd på grund av svält. DMEM: F12 kompletterad med 2% fbs valdes för att övervinna detta problem, vilket möjliggör minimal nitrit- och BH4-kontaminering samtidigt som den innehåller tillräckligt med näringsämnen för att få friska celler. Trots att vissa nitrit detekteras är nivåerna försumbara (~ 0,2 μM) jämfört med LPS / IFN-stimulerade WT-makrofager (30-80 μM för 1 x 106 celler; data visas inte).
För att validera detta förbättrade protokoll med experimentella data presenteras här isolering och karakterisering av BMDM från en ny BH4-bristfällig musmodell, R26-CreERT2Gchfl / fl. BH4 produceras av GTP-cyklohydrolas I (Gch1) genen. Som visas i figur 3A leder brist på Gch1 till förlust av BH4 och det resulterande försvinnandet av NO och därefter nitrit, och en ökning av superoxidanjon som orsakar oxidativ stress som tidigare visats av McNeill et al.8. Även om detta protokoll redan har definierats väl och använts för att odla andra BH4-bristfälliga makrofager från olika Cre-system, såsom Gchfl / flT2C-modellen 6,8, är R26-CreERT2Gchfl / fl-modellen unik eftersom den använder den villkorliga aktiveringen av Cre-ERT2-systemet för att avlägsna Gch1-genen efter tamoxifenbehandling (Figur 3B, C). Detta möjliggör knockout vid olika tidpunkter och användning av intern kontroll i form av ett fordon kontra tamoxifenbehandling. I detta exempel behandlades cellerna med antingen antingen aveal (95 % etanol) eller 0,1/1,0 μM 4-OH tamoxifen dag 1 och 3 (både abitärt och tamoxifen utspätt 1:100 i media före 0,7/7,0 μL tillsatt till 1 ml av den befintliga odlingsvolymen).
Som framgår av figur 3D avskaffas GTPCH-proteinet efter Tamoxifen-behandling i R26-CreERT2Gchfl/fl-cellerna men inte i Gchfl/fl-cellerna . Viktigt är att både R26-CreERT2Gchfl / fl och Gchfl / fl kontrollceller fortfarande kan producera iNOS efter LPS / IFN-stimulering (figur 3B, C). Dessa förändringar i Gch1-genuttryck och den resulterande förändringen i GTPCH-protein ledde till signifikant störda intracellulära BH4-nivåer och dämpad produktion av nitrit. Som visas i figur 4 uppvisade BMDM isolerade och odlade från R26-CreERT2Gchfl/fl-möss signifikant minskad BH4-produktion och minskad nitritackumulering i media, jämfört med dem från kontroll GCHfl/fl-celler i närvaro av tamoxifen. På samma sätt visade samma celler odlade i LCM-medier också avskaffat Gch1-uttryck; även om dessa celler fortfarande producerade betydande mängder av både BH4 och nitrit efter knockout av Gch1-uttryck med 4 OH tamoxifen, möjligen på grund av kontaminering av media och FBS med BH4. Detta innebär en tydlig förbättring av den nya metoden, jämfört med att odla cellerna i L-cellinnehållande medier.
Ytterligare karakterisering av denna modell visar inga signifikanta skillnader i morfologi mellan icke-aktiverade (M0) Gchfl/fl och R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM vid dag 8 efter olika koncentrationer av tamoxifen. Som visas i figur 5 visar båda modellerna en liknande mängd vidhäftande celler gjorda av en rund form med långsträckta extremiteter, vanligtvis de egenskaper som förväntas av ostimulerade makrofager9.
Sammantaget visar dessa resultat att denna metod för isolering och odling av BMDM ger en ren population av celler som är lämpliga för odling av murina makrofager. Denna metod möjliggör odling av murina makrofager utan interferens av exogena föreningar som finns i vissa medieformuleringar.
Figur 1: Schematiskt diagram som illustrerar benmärgscellernas isolering (del 1) till urval, differentiering och stimulering av BMDM (del 2). (A) Under sterila förhållanden placeras dissekerade ben i en ren bakteriologisk petriskål efter att ha tvättats i 70% etanol. (B) Musklerna avlägsnas försiktigt med tång och skalpellskrapning längs benen. (C) Benens extremiteter skärs sedan av för att exponera benmärgen. (D) Benmärgen spolas från benen med hjälp av en 10 ml spruta fylld med 10 ml PBS genom att nålen sätts in i benets lumen. (E) Nålen körs upp och ner genom benet för att säkerställa att all benmärg lossnar. Benet ska se vitt och klart ut i det skedet med den lossnade benmärgen samlad i petriskålen. (F-G) Upprepa för alla ben, samla den disaggregerade benmärgen i 1 ml sprutan och passera den genom en 70 μm cellsil i ett rent 50 ml centrifugrör. Snurra ner och resuspendera celler i frysmedier för senare användning. Del 2 visar urval, differentiering och stimulering av BMDM Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Nitrit- och BH4-nivåer i DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF eller DMEM: F12+ L-cellmedia. (A) Nitrithalterna i olika medier mättes med griessanalysmetoden. (B) BH4- och biopterinnivåerna mättes i olika medier genom HPLC-kvantifiering med hjälp av en BH4-standard. Data uttrycks som medelvärdet (n = 3) ± SD. Data analyserades med hjälp av envägs ANOVA genom flera jämförelser. Symboler representerar p < 0,05 mellan grupper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Introduktion av R26CreERT2-modellen. (A) Schema som illustrerar BH4: s roll som NOS-kofaktor i redoxbiologi. (B) Schematisk detaljering av excisionen av de kritiska exonerna (2 och 3) i Gch1 på grund av de flankerande loxP-platserna och den villkorliga aktiveringen av Cre-ERT2 med tamoxifen i denna murina modell. C) PCR (representativt för n = 3 oberoende djur) som visar excision av det kritiska exomet när BMDM behandlas med tamoxifen. WT-möss producerar en 1030 bp PCR-produkt, medan i närvaro av Cre produceras en 1392 bp-produkt, vilket bekräftar excision av de kritiska exonerna. (D) Immunoblot av iNOS, GCH och B-tubulin (representativt för n = 3 oberoende djur). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Karakterisering av BH4-brist i makrofager. (A,B) qRT-PCR bekräftar förlust av Gch1-uttryck i R26-CreERT2Gchfl/fl-modellen behandlad med tamoxifen. Blå = Ny MCSF-metod, Grön = klassisk LCM-metod. (C,D) Analys av intracellulär BH4 med HPLC avslöjar att 0,1 μM och 1,0 μM är tillräckliga för att minska BH4-nivåerna avsevärt. (E, F) Mätning av nitrit i media med Griess-analysen visar att osamulerade BMDM inte producerar detekterbara nivåer av nitrit, medan Gchfl/fl och R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM producerar nitrit i närvaro av LPS/IFNγ. Signifikant minskar tamoxifenbehandling av R26-CreERT2Gchfl / fl signifikant nitritnivåerna i stimulerade BMDM. Data uttrycks som medelvärdet av (n = 3) ± SD. Data analyserades med hjälp av envägs ANOVA genom flera jämförelser. Symboler representerar p < 0,05 mellan grupper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av BMDM: s morfologi. Foton erhållna genom optisk mikroskopi av BMDM vid dag 8 med varierande behandling av tamoxifen. Skalan anges i bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Kultur maträtt | Medievolym | Sådd densitet |
| 12 bra rätter | 1 ml | 500 000 celler |
| 6 bra maträtt | 2 ml | 1 000 000 celler |
| 100 mm skål | 10 ml | 3 000 000 celler |
| 75 cm2 kolv | 15 ml | 5 000 000 celler |
Tabell 1: Representativa sådddensiteter.
Discussion
Detta BH4- och NO-bristfälliga BMDM-odlingsprotokoll har utformats för att undersöka NO-redoxbiologi i primära makrofager genom reduktion av tetrahydrobiopterin (BH4) och andra störande artefakter i syfte att förbättra tillförlitligheten och reproducerbarheten av resultat som erhållits från dessa experimentella modeller.
Kritiska steg inkluderar användningen av rätt plastvaror. Makrofagstamceller är vidhäftande celler och mycket klibbiga; Därför är användningen av icke-vävnadsodlingsbehandlade plattor (TC) avgörande för att välja och isolera dem från andra stamceller, som annars skulle kunna fästa och minska renheten. På skördedagen kräver lossning av makrofager från plattor iskall PBS, men att använda EDTA eller till och med skrapa celler mycket försiktigt kan utföras beroende på nedströmsapplikationen (lysed versused versus live cells experiment, till exempel). Särskild försiktighet bör också iakttas när det gäller kontaminering. Vid spolning av benmärgen kan potentiell korskontaminering med bakterier eller viruspartiklar från kvarvarande päls och hud uppstå. Det är då viktigt att vara så försiktig och steril som möjligt; därför uppmuntras att kasta dissekerade ben i 70% etanol i några minuter. På samma sätt rekommenderas starkt att använda antibiotika när man odlar makrofager.
En annan begränsning av detta protokoll härrör från cellpläteringsdensiteten vid dag 0. Spolad benmärg innehåller en mängd olika celler, som felaktigt kan räknas och inkluderas som makrofagstamtagare, vilket leder till ett falskt totalt cellantal. För att undvika efterföljande och potentiell variation kan isolerade makrofager försiktigt spolas med varm PBS vid dag 7 och ompläteras vid rätt densitet i 2% FBS DMEM: F12 minst 1 timme före stimulering för att möjliggöra vidhäftning.
Slutligen är det absolut nödvändigt att kontrollera nitritnivåerna med Griess-analys med hjälp av media från odlade makrofager för att analysera data. På plussidan är denna analys snabb och billig att utföra.
Som visas häri är detta anpassade protokoll ett mer definierat och förbättrat alternativ till det vanligare protokollet som används för att isolera och odla makrofager med hjälp av L-cellkonderade medier (LCM). Faktum är att en av de största problemen med att använda LCM när man studerar NO-redoxbiologi är dess betydande mängder biopteriner som detekteras, vilket leder till potentiella metaboliska förändringar10. Till exempel kan exogen BH4 snabbt fylla på bristfälliga modeller och fungera som en kofaktor för iNOS, vilket leder till oönskad produktion av kväveoxid. En annan nackdel med att använda LCM ligger i dess produktion - LCM är en blandning av kolonistimulerande faktorer, cytokiner och andra biprodukter som utsöndras direkt av L-929-celler, som alla kan påverka makrofagfysiologin6. Trots sitt stora utbud i M-CSF, som är avgörande för makrofagproliferation och överlevnad, ökar variationen av varje komponent från sats till sats risken för variation mellan experiment.
För att ta itu med båda problemen använder detta nya protokoll det väldefinierade DMEM: F12-mediet som innehåller låga nivåer av biopteriner till vilka en kontrollerad mängd renad M-CSF och GM-CSF tillsätts. Båda cytokinerna hjälper till med differentiering och tillväxt av makrofager. M-CSF leder särskilt till generering av BMDM från benmärgsstamceller genom att säkerställa differentiering av hematopoetiska stamceller till makrofager11. Dessutom har GM-CSF visat sig öka inflammatorisk cytokin- och NO-produktion när den tillsätts före stimulering, en verklig fördel när man studerar NO-redoxbiologi 12,13.
Den andra huvudfaktorn som denna nya metod adresserar är FBS, som vanligtvis används som en källa till näringsämnen som är nödvändiga för god hälsa och tillväxt av celler. I likhet med LCM innehåller FBS signifikanta nivåer av biopterin. Medan fullständig serumsvält av cellerna före stimulering initialt övervägdes med OptiMEM + 0,2% BSA, visade makrofager tecken på avskiljning, vilket indikerar minskad cellviabilitet enligt beskrivningen av Bailey et al.6. Men eftersom makrofager visade ett absolut krav på serum valdes Ultra-Low Endotoxin FBS från BioWest. Partier testades för biopteriner och valdes ut i förväg före bulkinköpet för att säkerställa en tillförlitlig och väldefinierad leverans. För att gå längre i målet att minska förorenande källor till biopteriner testades därför minskade koncentrationer av FBS. Istället för att använda 10% serum som vanligtvis används i cellodling hålls FBS-nivån till 5% under hela 7-dagars differentiering av benmärg till makrofager och reduceras ytterligare till 2% under stimulering över natten den sista dagen. Detta säkerställer försumbara nivåer av biopteriner som detekteras men tillräckligt med näringsämnen för god hälsa och vidhäftning av makrofager. Även om detta nyligen optimerade protokoll med rekombinant M-CSF resulterar i en mer kontrollerad miljö för odling och aktivering av primära makrofager, är den största begränsningen att denna metod är dyrare än att använda LCM-metoden.
Med hänsyn till alla dessa faktorer jämfördes sedan de två metoderna direkt. Viktigt är att det nyligen modifierade protokollet som presenteras häri med hjälp av rekombinant M-CSF och GM-CSF resulterade i ett mer reproducerbart system där mediet saknade att förorena BH4. Effekterna av detta var tvåfaldiga; BH4-bristfälliga celler saknade verkligen BH4, vilket resulterade i minimal detekterbar nitritackumulering i media efter stimulering till M1-status med LPS. Detta stod i kontrast till samma BMDM-celler odlade i LCM, där signifikant BH4 och nitrit detekterades.
Sammanfattningsvis ligger styrkan i denna metod i ansträngningen att kontrollera biopterinnivåer genom att noggrant bedöma varje parameter som kan påverka NO- och redoxsignalering i makrofager. I synnerhet säkerställer detta maximal reproducerbarhet och standardisering inom NO-redoxbiologiområdet.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av British Heart Foundation Intermediate Fellowship som tilldelades M.J.C. (FS/14/56/31049), British Heart Foundation Programme grants (RG/17/10/32859 och RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) och NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Center. Författarna vill också erkänna stöd från BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 och RE/18/3/34214)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
