Summary
Dieses Protokoll wurde für die Kultur von Tetrahydrobiopterin (BH4)- und induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS)-defizienten primären murinen Makrophagen etabliert, um die NO-Redox-Biologie zu untersuchen. Die Studie konzentriert sich auf die Verringerung der potenziellen Kontamination von BH4 und anderen Artefakten, die in traditionellen Isolations- und Kulturmethoden gefunden werden, die experimentelle Ergebnisse und die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen können.
Abstract
Makrophagen werden aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im ganzen Körper gewonnen, sind zentral für entzündliche Prozesse und nehmen an angeborenen und adaptiven Immunantworten teil. Die In-vitro-Untersuchung von Makrophagen kann durch Ex-vivo-Kultur aus dem Peritoneum oder durch Differenzierung myeloischer Knochenmarkvorläuferzellen zur Bildung von aus dem Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) durchgeführt werden. Ein gängiger Ansatz zur Makrophagendifferenzierung von Vorläufern beinhaltet die Verwendung konditionierter Medien aus L929-Zellen (LCM). Dieses Medium ist leicht selbst herzustellen, leidet jedoch unter der Chargenvariabilität, und seine Bestandteile sind undefiniert. In ähnlicher Weise wird Foetal Bovine Serum (FBS) verwendet, um das Wachstum zu unterstützen, enthält aber eine große Mischung aus undefinierten Molekülen, die zwischen den Chargen variieren können. Diese Methoden sind für die Untersuchung der Stickoxidbiologie und der Redoxmechanismen nicht geeignet, da sie beide erhebliche Mengen an kleinen Molekülen enthalten, die entweder die Redoxmechanismen stören oder die Cofaktorspiegel wie Tetrahydrobiopterin (BH4) ergänzen, die für die Herstellung von NO aus induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) erforderlich sind. In diesem Bericht stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das die Kontrolle der NO-Redox-Umgebung ermöglicht, indem der exogene Biopterinspiegel reduziert und gleichzeitig Bedingungen aufrechterhalten werden, die für das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung geeignet sind. Die strenge Kontrolle der Zusammensetzung der Kulturmedien trägt zur Sicherstellung der experimentellen Reproduzierbarkeit bei und erleichtert die genaue Interpretation der Ergebnisse. In diesem Protokoll wurden BMDMs aus einem GTP-Cyclohydrolase (GCH)- mangelhaften Mausmodell erhalten. Die Kultur von BMDMs wurde mit Medien durchgeführt, die entweder (i) konditioniertes LCM oder (ii) rekombinantes M-CSF und GM-CSF enthielten, um minimale Artefakte zu erzeugen und gleichzeitig BH4- und NO-defiziente Kulturbedingungen zu erhalten - was eine reproduzierbare Untersuchung der NO-Redox-Biologie und des Immunmetabolismus in vitro ermöglichte.
Introduction
Makrophagen haben sich als interessanter Zelltyp in einer Vielzahl von Krankheiten und Zuständen etabliert, von denen viele scheinbar nichts mit ihrem traditionellen Fokus auf angeborene Immunität zu tun haben. Da die Makrophagenphysiologie stark von dem Gewebe oder der Umgebung abhängt, in der sie sich befinden, sind viele Methoden und Modelle entstanden, um ihre Funktion und die verschiedenen beteiligten Wege zu untersuchen. Historisch gesehen dominierten Makrophagenzelllinien wie RAW264.7 das Feld, aber diese wurden allmählich zugunsten verschiedener Primärzellmodelle ersetzt. Zum Beispiel können murine Makrophagen nach der Behandlung mit Thioglycolat aus der Peritonealspülung isoliert werden. Diese peritonealen Makrophagen stellen zwar ein nützliches Modell für die Untersuchung geweberesidenter Zellen dar, zeigen jedoch nachweislich eine gedämpftere Reaktion auf verschiedene äußere Reize, wodurch ihre Eignung für viele nachgelagerte Anwendungen eingeschränktwird 1.
Als Alternative haben sich Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs), die aus myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark gewonnen werden, als wertvolles Modell für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Makrophagenbiologie herausgestellt, einschließlich der Reifung und der verschiedenen klassischen Phänotypen, die mit Makrophagen assoziiert sind, M0 (naiv, nicht aktiviert), M1 (pro-entzündlich, normalerweise mit LPS / IFN aktiviert) und M2 (pro-auflösend, normalerweise mit IL-4 aktiviert)2. 3. Die Differenzierung myeloischer Vorläuferzellen in BMDMs ist jedoch abhängig vom Vorhandensein eines Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) in den Kulturmedien 4,5. Dieses kann entweder in Form von gereinigtem Protein, das dem Medium zugesetzt wird, oder aus L929-konditionierten Medien (LCM) geliefert werden. Die Vorteile der Verwendung von BMDMs (Kosten und Effizienz) müssen gegen die Einschränkungen abgewogen werden, die sich aus ihrer Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Reizen (Zytokine, metabolische Zwischenprodukte und RNS / ROS) ergeben.
Frühere Daten deuten darauf hin, dass die Gehalte an LCM schlecht definiert und intrinsisch variabel sind, was dazu führt, dass sie für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, insbesondere solche, die sich speziell auf die NO- oder Redoxbiologie beziehen, unzuverlässig und ungeeignet sind, da diese stark durch das Vorhandensein exogener Verbindungen beeinflusstwerden können 6. Daher erfordert dieses detaillierte Protokoll die Verwendung von genau definiertem DMEM: F12-Medien mit geringer Batch-zu-Batch-Variation und die Zugabe von rekombinantem murinem M-CSF und GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor). Darüber hinaus bietet fetales Rinderserum, das typischerweise als Ergänzung in Gewebekulturmedien verwendet wird, eine weitere Quelle für schlecht definierte Verbindungen und inhärente Variabilität. Es ist daher notwendig, die Verwendung solcher Additive zu kontrollieren und zu optimieren, um die zuverlässige Kultur von BMDMs zu gewährleisten. Durch die Verwendung einer definierten Low-Endotoxin-Quelle von FBS und die Sicherstellung, dass einzelne Chargen in großen Mengen gekauft werden, werden die Kulturbedingungen zuverlässig definiert und die Reproduzierbarkeit sichergestellt. Das hierin beschriebene Protokoll hat gezeigt, dass es eine Makrophagenkultur über 95% Reinheit erzeugt, wenn es für die Makrophagenoberflächenmarker CD45 und CD11b durch Durchflusszytometrie6 bewertet wird.
Protocol
Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikausschuss der Universität Oxford und dem UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986 genehmigt und durchgeführt. Alle Verfahren entsprachen der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments.
1. Isolierung von Knochenmarkzellen
- Opfern Sie Wildtyp- (C57BL/6) oder Gch1-defiziente (R26-CreERT2 Gchfl/fl) Mäuse (10-16 Wochen alt) durch Zervixdislokation und sammeln Sie die Hintergliedmassen.
HINWEIS: Es wird keine Präferenz für eines der beiden Geschlechter vorgenommen. Altersangepasste Weibchen werden etwas kleiner sein als ihre männlichen Gegenstücke, was sich auf die anfängliche Ausbeute des Ausgangsmaterials auswirkt.- Besprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol, um das Risiko einer Kontamination zu verringern.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in den Bauch mit einer Dissektionsschere, um Fell und Haut aus dem Körper zu entfernen. Ziehen Sie die Haut ab, um den Muskel an den Hinterbeinen freizulegen.
- Legen Sie die Maus auf ihren Bauch und verrenken Sie die Hintergliedmassen, indem Sie sie aus dem Kniegelenk heben und Druck auf die Hüften ausüben. Die Luxation ist am Hüftgelenk zu spüren.
- Entfernen Sie die Hinterbeine, indem Sie vorsichtig den Muskel an der Hüfte durchschneiden, um sicherzustellen, dass der Oberschenkelknochen nicht beschädigt wird.
- Über das Sprunggelenk schneiden, den Fuß entfernen und die verbleibende Haut vom Bein reinigen.
- Legen Sie die sezierten Beine in eine 50-ml-Röhre mit 25 ml eiskaltem PBS (kein Antibiotikum erforderlich) und legen Sie sie auf Eis.
HINWEIS: Mehrere Tiere können seziert und die Beine auf Eis gehalten werden.
- Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekulturhaube die Muskeln von den Beinen und entfernen Sie die Enden der Knochen, um das Knochenmark freizulegen.
- Legen Sie die Beine für 2 Minuten in 70% Ethanol, um die Kontamination zu reduzieren, und waschen Sie Fell oder Rückstände ab.
- Die Beine in eine saubere, sterile, bakteriologische Petrischale geben. Verwenden Sie eine Pinzette und ein Skalpell, um fest und vorsichtig an den Knochen mit der Seite der Klinge entlang zu kratzen, um die Muskeln zu entfernen. Schneiden Sie die Sehnen durch, um den Prozess zu erleichtern.
- Entfernen Sie die Epiphyse an der Extremität jedes Knochens, um das Knochenmark freizulegen. Der Femur wird an beiden Enden geschnitten, kurz vor den jeweiligen Gelenken.
- Die Tibia wird oben geschnitten, kurz vor dem Kniegelenk, und unten knapp über dem Schnittpunkt mit der Wadenbein.
- Spülen Sie das Knochenmark mit PBS aus den Knochen und sammeln Sie es in einem 50 ml sterilen Röhrchen.
- Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit 10 ml PBS und befestigen Sie sie an einer 25 G x 0,5 x 16 mm Nadel. Dies reicht aus, um alle Knochen von einer Maus zu spülen.
- Führen Sie die Nadel in die Markhöhle des Knochens ein und spülen Sie das Knochenmark vorsichtig mit 1-2 ml PBS aus, wobei Sie die Nadel durch den Knochen auf und ab führen, um sicherzustellen, dass das gesamte Knochenmark entfernt wird.
- Wiederholen Sie dies für alle Knochen und sammeln Sie das gespülte Knochenmark in einer sauberen Petrischale.
- Disaggregieren Sie mit einer sterilen 1-ml-Spritze das Knochenmark, indem Sie die Suspension 5-10 Mal in die Spritze hinein- und herausziehen, bis Klumpen aufgebrochen sind.
- Sammeln Sie das disaggregierte Knochenmark in der 1-ml-Spritze und führen Sie es durch ein 70-μM-Zellsieb in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie das gesammelte Knochenmark auf Eis, während weitere Proben gesammelt werden.
HINWEIS: Siehe Protokollschema in Abbildung 1 - Teil 1.
2. Auswahl, Differenzierung und Stimulation von BMDMs
- Um das Knochenmark für den späteren Gebrauch einzufrieren, pelletieren Sie das Knochenmark durch Zentrifugation bei 1000 x g für 5 min und resuspendieren Sie in 2 ml niedrigem Endotoxin-FBS, das 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält.
- Zentrifugieren Sie die Knochenmarksuspension bei 1000 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Es bildet sich ein blutrotes Pellet.
- Verwerfen Sie den Überstand.
- Das Pellet wird vorsichtig in 2 ml niedrigendotoxinhaltigem FBS mit 5% DMSO suspendiert und über Nacht bei -80 °C eingefroren, bevor es zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff mit Dampfphase überführt wird.
- Um das Knochenmark sofort zu verwenden, lysieren Sie die roten Blutkörperchen, bevor Sie das Knochenmark plattieren.
- Zentrifen Sie die Knochenmarksuspension bei 1000 x g für 5 min bei RT. Es bildet sich ein blutrotes Pellet.
- Resuspendiert das Pellet in 3 ml 1x roter Blutkörperchen-Lysepuffer und inkubieren bei RT für 5 min.
- Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 5 min bei RT. Verwerfen Sie den Überstand.
- Die Zellen werden zur sofortigen Verwendung mit der Platte versehen, indem Sie mit Schritt 2.3.5 fortfahren.
- Tauen Sie die Makrophagen auf und resuspendieren Sie in 3 ml Beschichtungsmedien, bevor Sie die Zellen pelletieren.
- Bereiten Sie DMEM vor: F12 mit 5% niedrigem Endotoxin-FBS, 1x Penicillin / Streptomycin, L-Glutamin und 25 ng / mL M-CSF.
HINWEIS: M-CSF und GM-CSF können hergestellt werden, indem getrocknetes Protein in sterilem Wasser mit 0,1% sterilem BSA resuspendiert wird, und die Aliquots können bei -80 ° C für die spätere Verwendung eingefroren werden. - Tauen Sie die gefrorene Zellsuspension bei 37 °C schnell auf.
- Die Zellsuspension (0,5 ml) wird in ein sauberes, steriles Röhrchen überführt, das 3 ml des vorbereiteten DMEM: F12-Mediums enthält.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 x g für 5 min bei RT. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendiert das Pellet in 3 ml des vorbereiteten DMEM: F12-Mediums.
- Zählen Sie die Zellen nach einer bevorzugten Methode.
- Bereiten Sie DMEM vor: F12 mit 5% niedrigem Endotoxin-FBS, 1x Penicillin / Streptomycin, L-Glutamin und 25 ng / mL M-CSF.
- Tag 0: Platten Sie die Zellen.
- Platten Sie die Zellen in nicht TC-beschichteter Kunststoffware in DMEM: F12-Medien mit 5% niedrigem Endotoxin-FBS, 1x Penicillin / Streptomycin, L-Glutamin und 25 ng / mL M-CSF.
HINWEIS: Repräsentative Aussaatdichten sind in Tabelle 1 beschrieben. Ein komplettes Beinpaar von einer Maus liefert 15-20 Millionen Vorläuferzellen. - Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5% CO2.
- Platten Sie die Zellen in nicht TC-beschichteter Kunststoffware in DMEM: F12-Medien mit 5% niedrigem Endotoxin-FBS, 1x Penicillin / Streptomycin, L-Glutamin und 25 ng / mL M-CSF.
- Tag 5: Füttere die Zellen.
- Füttern Sie die Zellen, indem Sie 50% des ursprünglichen Volumens von DMEM hinzufügen: F12-Medien mit 5% niedrigem Endotoxin-FBS, 1x Penicillin / Streptomycin, L-Glutamin und 50 ng / ml m-CSF.
- Tag 6: Stimulieren Sie die Zellen mit GM-CSF.
- Fügen Sie vorbereitetes GM-CSF bis zu einer Endkonzentration von 50 ng / ml direkt in die Zellkulturmedien auf den Zellen hinzu.
- Ersetzen Sie das Medium durch vorbereitetes DMEM: F12.
- Entfernen Sie alle Medien aus den Zellen.
- Waschen Sie die Zellen kurz in vorgewärmtem PBS.
- DMEM hinzufügen: F12-Medien mit 2% niedrigem Endotoxin-FBS, 1x Penicillin / Streptomycin, L-Glutamin, 25 ng / mL M-CSF und 50 ng / mL GM-CSF.
- Aktivieren Sie die Makrophagen der Phänotypen M0, M1 oder M2 mit den in den Schritten 2.7.5-2.7.7 beschriebenen Stimulationen.
- M0 - Keine Stimulation erforderlich. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in Medien.
- M1 - Stimulieren Sie die Zellen mit 100 ng/mL LPS und 10 ng/mL IFNγ (Endkonzentrationen) über Nacht.
- M2 - Stimulieren Sie die Zellen mit 100 ng / ml IL-4 (Endkonzentration) über Nacht.
- Tag 8: Ernten Sie die Zellen.
- Medien aus den Zellen entfernen (Medien sammeln und bei -80 °C für nachgeschaltete Assays einfrieren).
- Inkubieren Sie die Zellen in eiskaltem PBS (50% des Medienvolumens) für 5 min.
- Lösen Sie die Zellen von der Platte mit sanftem Schaben oder wiederholtem Pipettieren.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2500 x g für 5 min bei RT. Verwerfen Sie den Überstand.
- Die Zellpellets zur späteren Verwendung bei -80 °C einfrieren.
HINWEIS: Siehe Protokollschema Abbildung 1 - Teil 2.
Representative Results
Vor dem Nachweis der Wirksamkeit dieses Protokolls in Makrophagen wurden Nitrit- und BH4-Spiegel in Medien bewertet, die mit 10% FBS ergänzt wurden, die entweder 10% LCM oder nur rekombinantes M-CSF und GM-CSF enthielten. Obwohl Nitrit lange Zeit als Endprodukt des Stickoxidstoffwechsels galt, wird es heute als physiologische Speicherung von Stickoxid angesehen, das bei Bedarf recycelt werden kann und daher häufig als Indikator für die Bioverfügbarkeit von Stickoxid verwendetwird 7. BH4 ist ein wesentlicher Cofaktor von NOS für die NO-Produktion. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, wiesen Medien, die mit 10% FBS ergänzt wurden, unabhängig von M-CSF/GM-CSF oder LCM ähnliche Nitritspiegel auf. Es wurde jedoch eine größere Variabilität zwischen verschiedenen LCM-Chargen beobachtet. Diese Beobachtung galt auch für die BH4-Messung. Tatsächlich hatte eine Charge von LCM (Charge # 3) einen signifikant höheren BH4-Gehalt als die anderen beiden (Chargen # 1 und # 2). Darüber hinaus enthielten LCM-Chargen signifikant mehr Biopterin als Medien, die mit 10% FBS und rekombinanten Zytokinen ergänzt wurden. Die signifikante Variabilität der Gesamtbiopterine zwischen den Chargen wurde ebenfalls gemessen. Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig es ist, eine weniger variable Quelle von M-CSF als LCM zu verwenden.
Darüber hinaus enthielten Medien, die mit 10% FBS ergänzt wurden, signifikant höhere Nitritgehalte im Vergleich zu Medien, die entweder 2% oder 5% FBS enthielten. Die Differenz zwischen 10% und 5% war für BH4 hochsignifikant (p < 0,05). Ähnliche Konzentrationen von Biopterinen wurden jedoch quantifiziert. Im Vergleich dazu war OptiMEM + 0,2% BSA frei von Nitrit und BH4, was es zu einem sehr sauberen und geeigneten Medium machte. Wie von Bailey et al. beschrieben, sollte OptiMEM jedoch nur einmal über Nacht bei der Stimulation von Makrophagen verwendet werden, aber der Zelltod durch Hunger wurde beobachtet. DMEM: F12, ergänzt mit 2% FBS, wurde gewählt, um dieses Problem zu lösen, eine minimale Nitrit- und BH4-Kontamination zu ermöglichen und gleichzeitig genügend Nährstoffe zu enthalten, um gesunde Zellen zu erhalten. Trotz des nachgewiesenen Nitrits sind die Werte im Vergleich zu LPS/IFN-stimulierten WT-Makrophagen (30-80 μM für 1 x 106 Zellen; Daten nicht gezeigt) vernachlässigbar (~ 0,2 μM).
Um dieses verbesserte Protokoll mit experimentellen Daten, der Isolierung und Charakterisierung von BMDMs aus einem neuen BH4-defizienten Mausmodell, zu validieren, wird hier das R26-CreERT2 Gchfl/fl vorgestellt. BH4 wird durch das GTP-Cyclohydrolase-I-Gen (Gch1) erzeugt. Wie in Abbildung 3A gezeigt, führt ein Mangel an Gch1 zum Verlust von BH4 und dem daraus resultierenden Verschwinden von NO und anschließend Nitrit sowie zu einem Anstieg des Superoxidanions, der oxidativen Stress verursacht, wie zuvor von McNeill et al.8 gezeigt. Obwohl dieses Protokoll bereits gut definiert und verwendet wurde, um andere BH4-defiziente Makrophagen aus verschiedenen Cre-Systemen wie dem Gch fl/fl T2C-Modell 6,8 zu kultivieren, ist das R26-CreER T2 Gch fl/fl-Modelleinzigartig, da es die bedingte Aktivierung des Cre-ERT2-Systemsnutzt, um das Gch1-Gen nach einer Tamoxifen-Behandlung zu entfernen (Abbildung 3B, C). Dies ermöglicht Knockout zu verschiedenen Zeitpunkten und die Verwendung einer internen Kontrolle in Form einer Fahrzeug- vs. Tamoxifen-Behandlung. In diesem Beispiel wurden die Zellen an den Tagen 1 und 3 entweder mit Vehikel (95% Ethanol) oder 0,1/1,0 μM 4-OH Tamoxifen behandelt (sowohl Vehikel als auch Tamoxifenmaterial verdünnt 1:100 in Medien vor Zugabe von 0,7/7,0 μL zu 1 ml des vorhandenen Kulturvolumens).
Wie in Abbildung 3D zu sehen ist, wird das GTPCH-Protein nach der Behandlung mit Tamoxifen in den R26-CreERT2Gch fl/fl-Zellen abgeschafft, jedoch nicht in den Gch fl/fl-Zellen. Wichtig ist, dass sowohl R26-CreERT2Gch fl/fl als auch Gchfl/fl Kontrollzellen nach LPS/IFN-Stimulation immer noch in der Lage sind, iNOS zu produzieren (Abbildung 3B,C). Diese Veränderungen in der Gch1-Genexpression und die daraus resultierende Veränderung des GTPCH-Proteins führten zu signifikant gestörten intrazellulären BH4-Spiegeln und einer abgeschwächten Produktion von Nitrit. Wie in Abbildung 4 gezeigt, zeigten BMDMs, die aus R26-CreERT2 Gchfl/fl-Mäusen isoliert und kultiviert wurden, eine signifikant verringerte BH4-Produktion und eine verringerte Nitritakkumulation in den Medien im Vergleich zu denen aus Kontroll-GCH-fl/fl-Zellen in Gegenwart von Tamoxifen. In ähnlicher Weise zeigten die gleichen Zellen, die in LCM-Medien kultiviert wurden, auch eine abgeschaffte Gch1-Expression; obwohl diese Zellen nach dem Knockout der Gch1-Expression mit 4 OH-Tamoxifen immer noch signifikante Mengen an BH4 und Nitrit produzierten, möglicherweise aufgrund der Kontamination von Medien und FBS mit BH4. Dies stellt eine deutliche Verbesserung der neuen Methode dar, die Zellen in L-Zell-haltigen Medien zu kultivieren.
Die weitere Charakterisierung dieses Modells zeigt keine signifikanten Unterschiede in der Morphologie zwischen nicht aktivierten (M0) Gch fl/fl und R26-CreERT2Gch fl/fl BMDMs an Tag 8 nach unterschiedlichen Tamoxifenkonzentrationen. Wie in Abbildung 5 gezeigt, zeigen beide Modelle eine ähnliche Anzahl von adhärenten Zellen aus einer runden Form mit länglichen Extremitäten, typischerweise die Merkmale, die von nicht stimulierten Makrophagen erwartetwerden 9.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass diese Methode der Isolierung und Kultur von BMDMs eine reine Population von Zellen liefert, die für die Kultur von murinen Makrophagen geeignet sind. Diese Methode ermöglicht die Kultur von murinen Makrophagen ohne die Interferenz exogener Verbindungen, die in einigen Medienformulierungen vorhanden sind.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von Knochenmarkzellen (Teil 1) zur Auswahl, Differenzierung und Stimulation von BMDMs (Teil 2). (A) Unter sterilen Bedingungen werden sezierte Beine in eine saubere bakteriologische Petrischale gegeben, nachdem sie in 70% Ethanol gewaschen wurden. (B) Die Muskeln werden vorsichtig mit einer Pinzette und einem Skalpell entlang der Knochen entfernt. (C) Die Extremitäten der Knochen werden dann abgeschnitten, um das Knochenmark freizulegen. (D) Das Knochenmark wird mit einer 10-ml-Spritze, die mit 10 ml PBS gefüllt ist, aus den Knochen gespült, indem die Nadel in das Lumen des Knochens eingeführt wird. (E) Die Nadel wird durch den Knochen auf und ab geführt, um sicherzustellen, dass das gesamte Knochenmark entfernt wird. Der Knochen sollte in diesem Stadium weiß und klar erscheinen, wobei das gelöste Knochenmark in der Petrischale gesammelt wurde. (F-G) Wiederholen Sie dies für alle Knochen, sammeln Sie das disaggregierte Knochenmark in der 1-ml-Spritze und führen Sie es durch ein 70-μm-Zellsieb in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie Zellen in gefrierenden Medien zur späteren Verwendung herunter und resuspendieren Sie sie. Teil 2 zeigt die Auswahl, Differenzierung und Stimulation von BMDMs Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nitrit- und BH4-Spiegel in DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF oder DMEM: F12+ L-Zell-Medien. (A) Der Nitritgehalt in verschiedenen Medien wurde mit der Griess Assay-Methode gemessen. (B) BH4- und Biopterinspiegel wurden in verschiedenen Medien durch HPLC-Quantifizierung unter Verwendung eines BH4-Standards gemessen. Die Daten werden als Mittelwert (n = 3) ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA durch mehrfache Vergleiche analysiert. Symbole stellen p < 0,05 zwischen Gruppen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Einführung des Modells R26CreERT2 . (A) Schema zur Veranschaulichung der Rolle von BH4 als NOS-Cofaktor in der Redoxbiologie. (B) Schematische Darstellung der Exzision der kritischen Exons (2 und 3) in Gch1 aufgrund der flankierenden loxP-Stellen und der bedingten Aktivierung von Cre-ERT2 mit Tamoxifen in diesem murinen Modell. (C) PCR (repräsentativ für n = 3 unabhängige Tiere), die die Exzision des kritischen Exons nachweist, wenn BMDMs mit Tamoxifen behandelt werden. WT-Mäuse produzieren ein 1030-bp-PCR-Produkt, während in Gegenwart der Cre ein 1392-bp-Produkt hergestellt wird, das die Exzision der kritischen Exons bestätigt. (D) Immunoblot von iNOS, GCH und B-Tubulin (repräsentativ für n = 3 unabhängige Tiere). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Charakterisierung des BH4-Mangels in Makrophagen. (A,B) qRT-PCR bestätigt Verlust der Gch1-Expression im R26-CreERT2 Gchfl/fl-Modell, das mit Tamoxifen behandelt wurde. Blau = Neue MCSF-Methode, Grün = klassische LCM-Methode. (C,D) Die Analyse von intrazellulärem BH4 mittels HPLC zeigt, dass 0,1 μM und 1,0 μM ausreichen, um den BH4-Spiegel signifikant zu senken. (E, F) Die Messung von Nitrit in Medien mit dem Griess Assay zeigt, dass unstimulierte BMDMs keine nachweisbaren Nitritspiegel erzeugen, während Gch fl/fl und R26-CreERT2Gch fl/fl BMDMs Nitrit in Gegenwart von LPS/IFNγ produzieren. Signifikanterweise reduziert die Tamoxifen-Behandlung von R26-CreERT2 Gchfl/fl signifikant den Nitritspiegel in stimulierten BMDMs. Die Daten werden als Mittelwert von (n = 3) ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden mittels Einweg-ANOVA durch mehrfache Vergleiche analysiert. Symbole stellen p < 0,05 zwischen Gruppen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich der BMDMs-Morphologie. Fotos, die durch optische Mikroskopie von BMDMs am Tag 8 mit der unterschiedlichen Behandlung von Tamoxifen erhalten wurden. Der Maßstab wird im Bild angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Kulturgericht | Medienvolumen | Aussaatdichte |
| 12 gute Gerichte | 1 ml | 500.000 Zellen |
| 6 gut Gericht | 2 ml | 1.000.000 Zellen |
| 100 mm Schale | 10 ml | 3.000.000 Zellen |
| 75 cm2 Kolben | 15 ml | 5.000.000 Zellen |
Tabelle 1: Repräsentative Aussaatdichten
Discussion
Dieses BH4- und NO-defiziente BMDMs-Kulturprotokoll wurde entwickelt, um die NO-Redox-Biologie in primären Makrophagen durch Reduktion von Tetrahydrobiopterin (BH4) und anderen störenden Artefakten zu untersuchen, mit dem Ziel, die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse dieser experimentellen Modelle zu verbessern.
Zu den kritischen Schritten gehört die Verwendung des richtigen Kunststoffs. Makrophagen-Vorläuferzellen sind adhärente Zellen und sehr klebrig; Daher ist die Verwendung von mit Nicht-Gewebekultur (TC) behandelten Platten entscheidend für die Auswahl und Isolierung von anderen Vorläuferzellen, die sich sonst anlagern und die Reinheit reduzieren könnten. Am Erntetag erfordern ablösende Makrophagen von Platten eiskaltes PBS, aber die Verwendung von EDTA oder sogar Schabenzellen kann je nach nachgeschalteter Anwendung sehr schonend durchgeführt werden (z. B. Lysed versus Live-Cells-Experiment). Besondere Vorsicht ist auch bei der Kontamination geboten. Beim Ausspülen des Knochenmarks kann es zu einer möglichen Kreuzkontamination mit Bakterien oder Viruspartikeln aus übrig gebliebenem Fell und Haut kommen. Es ist dann wichtig, so vorsichtig und steril wie möglich zu sein; Daher wird empfohlen, sezierte Beine für einige Minuten in 70% Ethanol zu tauchen. Ebenso wird die Verwendung von Antibiotika beim Anbau von Makrophagen dringend empfohlen.
Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ergibt sich aus der Zellplattierungsdichte am Tag 0. Gespültes Knochenmark enthält eine Vielzahl von Zellen, die fälschlicherweise gezählt und als Makrophagenvorläufer eingeschlossen werden können, was zu einer falschen Gesamtzellzahl führt. Um die nachfolgende und potenzielle Variabilität zu vermeiden, können isolierte Makrophagen am Tag 7 vorsichtig mit warmem PBS gespült und mit der richtigen Dichte in 2%FBS DMEM: F12 mindestens 1 h vor der Stimulation neu plattiert werden, um eine Haftung zu ermöglichen.
Schließlich ist die Überprüfung der Nitritspiegel durch Griess Assay unter Verwendung von Medien aus gezüchteten Makrophagen unerlässlich, um Daten zu analysieren. Auf der positiven Seite ist dieser Assay schnell und kostengünstig durchzuführen.
Wie hierin gezeigt, ist dieses kundenspezifische Protokoll eine definiertere und verbesserte Alternative zu dem gebräuchlicheren Protokoll, das zur Isolierung und Kultivierung von Makrophagen unter Verwendung von L-Zell-konditionierten Medien (LCM) verwendet wird. In der Tat ist eines der Hauptanliegen bei der Verwendung von LCM bei der Untersuchung der NO-Redox-Biologie seine signifikanten Mengen an nachgewiesenen Biopterinen, was zu potenziellen metabolischen Veränderungen führt10. Zum Beispiel kann exogenes BH4 mangelhafte Modelle schnell auffüllen und als Cofaktor für iNOS fungieren, was zur unerwünschten Produktion von Stickstoffmonoxid führt. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von LCM liegt in seiner Produktion - LCM ist eine Mischung aus koloniestimulierenden Faktoren, Zytokinen und anderen Nebenprodukten, die direkt von L-929-Zellen abgesondert werden, die alle die Makrophagenphysiologie beeinflussen können6. Trotz seines großen Angebots an M-CSF, das für die Verbreitung und das Überleben von Makrophagen unerlässlich ist, erhöht die Variation jeder Komponente von Charge zu Charge das Risiko einer Variabilität zwischen den Experimenten.
Um beide Probleme anzugehen, verwendet dieses neue Protokoll das gut definierte DMEM: F12-Medium, das niedrige Mengen an Biopterinen enthält, denen eine kontrollierte Menge an gereinigtem M-CSF und GM-CSF zugesetzt wird. Beide Zytokine helfen bei der Differenzierung und dem Wachstum von Makrophagen. M-CSF führt insbesondere zur Bildung von BMDMs aus Knochenmark-Vorläuferzellen, indem es die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu Makrophagen sicherstellt11. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass GM-CSF die entzündliche Zytokin- und NO-Produktion steigert, wenn es vor der Stimulation hinzugefügt wird, ein echter Vorteil bei der Untersuchung der NO-Redox-Biologie12,13.
Der andere Hauptfaktor, den diese neue Methode anspricht, ist der von FBS, der normalerweise als Quelle von Nährstoffen verwendet wird, die für die Gesundheit und das Wachstum von Zellen unerlässlich sind. Ähnlich wie LCM enthält FBS signifikante Mengen an Biopterin. Während eine vollständige Serumverhungerung der Zellen vor der Stimulation zunächst mit OptiMEM + 0,2% BSA in Betracht gezogen wurde, zeigten Makrophagen Anzeichen einer Ablösung, was auf eine verminderte Zelllebensfähigkeit hinweist, wie von Bailey et al.6 beschrieben. Da Makrophagen jedoch einen absoluten Bedarf an Serum zeigten, wurde das Ultra-Low Endotoxin FBS von BioWest ausgewählt. Die Chargen wurden auf Biopterine getestet und vor dem Großeinkauf vorausgewählt, um eine zuverlässige und klar definierte Versorgung zu gewährleisten. Um das Ziel, die Schadstoffquellen von Biopterinen zu reduzieren, weiter zu gehen, wurden daher verringerte Konzentrationen von FBS getestet. Anstatt 10% Serum zu verwenden, wie es üblicherweise in der Zellkultur verwendet wird, wird der FBS-Spiegel während der 7-tägigen Differenzierung des Knochenmarks in Makrophagen auf 5% gehalten und während der nächtlichen Stimulation am letzten Tag weiter auf 2% reduziert. Dies gewährleistet einen vernachlässigbaren Gehalt an nachgewiesenen Biopterinen, aber genügend Nährstoffe für die gute Gesundheit und Adhärenz von Makrophagen. Obwohl dieses neu optimierte Protokoll mit rekombinantem M-CSF zu einer kontrollierteren Umgebung für die Kultur und Aktivierung primärer Makrophagen führt, besteht die Haupteinschränkung darin, dass diese Methode teurer ist als die Verwendung der LCM-Methode.
Unter Berücksichtigung all dieser Faktoren wurden die beiden Methoden dann direkt verglichen. Wichtig ist, dass das hier vorgestellte neu modifizierte Protokoll unter Verwendung von rekombinantem M-CSF und GM-CSF zu einem reproduzierbareren System führte, bei dem die Medien kein BH4 kontaminieren konnten. Die Auswirkungen davon waren zweifach; BH4-defizienten Zellen fehlte wirklich BH4, was zu einer minimalen nachweisbaren Nitritakkumulation in den Medien nach Stimulation des M1-Status mit LPS führte. Dies stand im Gegensatz zu den gleichen BMDM-Zellen, die in LCM kultiviert wurden, wo signifikantes BH4 und Nitrit nachgewiesen wurden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Stärke dieser Methode in der Anstrengung liegt, den Biopterinspiegel zu kontrollieren, indem jeder Parameter, der die NO- und Redoxsignalisierung in Makrophagen beeinflussen könnte, gründlich bewertet wird. Dies gewährleistet insbesondere eine maximale Reproduzierbarkeit und Standardisierung im Bereich der NO-Redox-Biologie.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das British Heart Foundation Intermediate Fellowship unterstützt, das M.J.C. (FS/14/56/31049), Zuschüsse des British Heart Foundation Programme (RG/17/10/32859 und RG/12/5/29576), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z) und das NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre gewährt wurden. Die Autoren danken auch der Unterstützung des BHF Centre of Research Excellence, Oxford (RE/13/1/30181 und RE/18/3/34214)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
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