Summary
En procedure for kapillær elektroforese elektrosprayionisering massespektrometri til absolut kvantificering af inositolpyrophosphater fra pattedyrcelleekstrakter er beskrevet.
Abstract
Inositolpyrophosphater (PP-InsPs) er en vigtig gruppe af intracellulære signalmolekyler. Afledt af inositolphosphater (InsPs) har disse molekyler tilstedeværelsen af mindst en energisk pyrophosphatdel på myo-inositolringen. De eksisterer allestedsnærværende i eukaryoter og fungerer som metaboliske budbringere, der undersøger fosfathomeostase, insulinfølsomhed og cellulær energiladning. På grund af fraværet af en kromofor i disse metabolitter, en meget høj ladningstæthed og lav overflod kræver deres analyse radioaktivt sporstof, og det er derfor indviklet og dyrt. Her præsenterer undersøgelsen en detaljeret protokol til at udføre absolut og høj gennemstrømningskvantificering af inositolpyrophosphater fra pattedyrceller ved kapillær elektroforese elektrosprayioniseringsmassespektrometri (CE-ESI-MS). Denne metode muliggør følsom profilering af alle biologisk relevante PP-InsPs-arter i pattedyrceller, hvilket muliggør baseline-adskillelse af regioisomerer. Absolutte cellulære koncentrationer af PP-InsPs, herunder mindre isomerer, og overvågning af deres tidsmæssige ændringer i HCT116-celler under flere eksperimentelle betingelser præsenteres.
Introduction
Siden den første opdagelse af myo-inositolpyrophosphater (PP-InsPs) i 19931,2, er der gjort betydelige fremskridt med at belyse deres biosyntese, omsætning og funktioner3. Inositolpyrophosphater forekommer allestedsnærværende i eukaryote celler4 og tjener som metaboliske signalmolekyler, der er kritisk involveret i f.eks. fosfathomeostase5,6, insulinfølsomhed7, calciumoscillationer 8,9, vesikulær handel 10, apoptose 11, DNA-reparation12, immunsignalering 13 , og andre. Overfloden af vigtige processer under kontrol af inositolpyrophosphater kræver en dybere forståelse af deres cellulære overflod, udsving og lokalisering.
Selvom InsP'er og PP-InsP'er tiltrak opmærksomhed på tværs af discipliner, udføres analysen af deres overflod rutinemæssigt ved hjælp af en metode udviklet i 80'erne, der består af mærkning af celler med tritieret inositol, der løser de ekstraherede PP-InsP'er ved stærk anionbyttekromatografi Sax-HPLC med efterfølgende scintillationstælling. Nyere metoder baseret på massespektrometri står stadig over for betydelige udfordringer: inositolpyrophosphater med op til otte fosfatenheder har fosfatestere og anhydrider, hvilket fører til en betydelig negativ ladning og potentielt fosfattab under ionisering. Der findes fire hovedtyper af PP-InsP'er hos pattedyr (figur 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (eller 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (eller 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (eller 1-InsP7) og 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (eller5-PP-InsP 4)3,14. De fysiologiske niveauer af PP-InsP'er er typisk i nano- til lavmikromolære områder, med 5-PP-InsP 5 som den mest rigelige med cellulære koncentrationer på 0,5 - 5 μM. 1,5-(PP)2-InsP 4 og 1-PP-InsP 5 menes at være op til omkring 10% af 5-PP-InsP 5-puljen og forbliver vanskelig at spore i mange celler15. 5-PP-InsP4 med en fri OH-gruppe er endnu lavere i overflod og bliver normalt kun detekterbar, når phosphathydrolaser hæmmes med natriumfluorid (NaF)16.
Den høje ladningstæthed af PP-InsP'er gør deres adskillelse vanskelig, og forekomsten af PP-InsP-regioisomerer komplicerer disse bestræbelser yderligere. Som følge heraf var de fleste eksperimenter afhængige af kvantificering ved metabolisk radioaktiv mærkning af celler ved hjælp af [3H] -inositol, da baggrund fra matrixen er udelukket, og høj følsomhed opnås17,18. Denne metode er imidlertid dyr, tidskrævende og tillader ikke korrekt at skelne mellem relaterede PP-InsP-regioisomerer. Desuden, [3H]-inositol mærkning ikke redegøre for endogene inositol syntese fra glucose. En polyacrylamid gelelektroforese (PAGE) -baseret metode er et bredt anvendt billigt alternativ, men begrænset i sin følsomhed 19,20,21,22. Andre tilgange, der undgår radiomærkning, er blevet offentliggjort, herunder ionkromatografi efterfulgt af UV-detektion efter kolonneafledning23, hydrofil interaktionskromatografi (HILIC)24 eller svag anionbytning (WAX) kombineret med massespektrometri (MS)25. De er dog (endnu) ikke på niveau med den klassiske [3H]-inositol SAX-HPLC-protokol.
For nylig blev kapillær elektroforese elektrosprayioniseringsmassespektrometri (CE-ESI-MS) introduceret som en transformativ strategi til analyse af InsPs og PP-InsPs metabolisme, der opfylder alle krav diskuteret ovenfor16. Kombineret med den nuværende avancerede InsP-ekstraktion med perchlorsyre efterfulgt af berigelse med titandioxidperler26 lykkedes det CE-ESI-MS at få alle organismer, der hidtil er testet, fra gær til planter og pattedyr. Samtidig profilering af InsP'er og PP-InsP'er, herunder alle mulige regioisomerer, blev let opnået. Stabile isotopmærkede (SIL) interne standarder muliggjorde en hurtig og præcis absolut kvantificering, uanset matrixeffekter. Fordi MS kan fange isotopiske masseforskelle, kan CE-ESI-MS også anvendes til at studere opdelte cellulære synteseveje for InsPs og PP-InsPs, f.eks. ved at fodre celler med [13 C 6] -myo-inositol eller [13C6]-D-glucose.
Beskrevet her er en detaljeret trin-for-trin protokol for den absolutte kvantificering af PP-InsP'er og InsP'er fra pattedyrceller af CE-ESI-MS. Bortset fra den store 5-PP-InsP 5-isomer, 1,5-(PP)2-InsP 4 og 1-PP-InsP5 er også kvantificeret i denne undersøgelse, på trods af deres lavere forekomst. To HCT116-cellelinjer fra forskellige laboratorier (NIH, UCL) undersøges, og det valideres, at HCT116UCL-celler indeholder 7 gange højere niveauer af 1,5-(PP)2-InsP 4 end fundet i HCT116NIH, mens 5-PP-InsP5-koncentrationer er sammenlignelige. Derudover øges 1-PP-InsP5-syntese i HCT116UCL ikke signifikant. Stigningen i PP-InsP-niveauer ved at blokere deres dephosphorylering ved anvendelse af natriumfluorid undersøges kvantitativt.
Protocol
1. Oprettelse af CE-ESI-MS-systemet
- Opret et CE-ESI-MS-system bestående af et kommercielt CE-system - og et tredobbelt quadrupole tandem massespektrometer, udstyret med en Agilent Jet Stream (AJS) elektrosprayionisering (ESI) kilde. Et CE-ESI-MS sprøjtesæt og en isokratisk LC (væskekromatografi) pumpe er påkrævet.
- Tilslut kappestrømmen 1:100 splitter (inkluderet i CE-MS sprøjtesættet) og den isokratiske LC-pumpeudgang.
- Sørg for, at hætteglasset med CE-systemets indløb har samme højde som masseanalysatorens sprøjtespids.
- Brug MassHunter Workstation (version 10.1) eller sammenlignelig MS-software til at styre hele systemet og til dataindsamling og analyse.
2. Forberedelse af buffer-, kapillær- og CE-MS-system
- Forbered CE-løbebuffer: Juster pH-værdien på 40 mM ammoniumacetat til 9,0 med ammoniumhydroxid. En 250 ml volumetrisk kolbe anbefales. Filtrer bufferen på 250 ml med membranfiltre på størrelse med 0,2 μm. Sørg for kun at bruge ultrarent deioniseret vand og reagenser af MS-kvalitet.
BEMÆRK: Denne buffer kan opbevares ved stuetemperatur i 2-3 uger eller i flere måneder i køleskab. - Forbered kappevæske: Bland 100 ml ultrarent vand og 100 ml LC-MS isopropanol i en 250 ml flaske. Skift kappevæsken mindst en gang om ugen. Tilsæt massereference i kappevæsken, når du anvender et massespektrometer med høj opløsning.
- Installer kappevæske: Rens ved 5 ml / min i 5 minutter og indstil strømningshastigheden til 1 ml / min (10 μL / min ind i CE-MS-sprøjten). Pumpetrykket vil være på ca. 180 bar. Sørg for, at genbrugsslangen tilsluttes tilbage i kappevæskeflasken for at genbruge opløsningsmidlet.
- Forbered kapillær: Køb en CE-MS-kapillær (50 μm i.d. og 365 μM o.d. med en længde på 125 cm) med et UV-detektionsvindue. Brugeren kan også få meget billigere bar-smeltede silicakapillærer fra specialiserede distributører. Skær en kapillær med en længde på 100 cm. Skær begge kapillærender korrekt med en kapillærsøjleskærer med et roterende diamantblad og fjern 2-3 cm polyimidbelægning i begge ender med en lighter. Rengør kapillæroverfladen med isopropanol.
- Installer kapillær: Match kapillæren i CE-MS-kassetten. Klik på knappen Skift kassette , og installer kassetten i CE-enheden. Kapillærens indløbsende er ca. 2 mm lavere end elektroden. Sørg for, at indløbsenden er lavere end prøvens overflade under injektionsprocessen.
- Aktivér kapillær: Før første brug skylles kapillæren med 1 M NaOH, efterfulgt af vand i 10 min. og CE-løbebuffer i 15 min.
- Indsæt kapillærenden i CE-MS-sprøjten: Sæt forsigtigt kapillæren i CE-MS-sprøjten, og sørg for, at kapillærenden stikker ca. 0,1 mm ud af sprøjtespidsen. Sørg for at foretage præcis justering af kapillærudløbets ende med et forstørrelsesglas og justeringsskruen i sprøjten. Sæt sprøjten tilbage i ionkilden, og undgå at røre ved justeringsskruen. MS er i standbytilstand, når denne handling udføres.
- Kontroller ESI-sprayen: Kontroller ESI-sprøjtens stabilitet under fuld scanningstilstand. Udsvinget i de samlede ionelektroferogrammer skal være inden for 5%.
- Udfør en testkørsel med InsP-standarder: Anvend en blanding af 2 μM InsP 3-InsP 8-standarder (justeret med kvantitativ 31P NMR 15,27) til testkørsler med en injektion ved 50 mbar i 10 s (10 nL). Angiv de detaljerede ESI- og MS-parametre som vist i tabel 1. CE-strøm er ca. 26 μA. Topbredden er omkring 0,4-0,5 min. Sørg for, at signal/støj-forholdet når mindst 400.
3. Ekstraktion af opløselige inositolphosphater fra pattedyrceller
BEMÆRK: HCT116NIH-celler var en venlig gave fra Stephen Shears28. HCT116UCL-celler var fra Saiardi's Lab26.
- Såning af celler
- Kultur HCT116NIH eller HCT116UCL celler i T75 kolber ved 37 ° C i en 5% høj luftfugtighed CO2 atmosfære (yderligere benævnt standardbetingelser) i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovin serum (FBS).
- HCT116NIH - og HCT116UCL-stamkulturerne vaskes med fosfatbufferet saltvand (PBS) (5 ml), og cellerne inkuberes med trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (3 ml, 0,25%) under standardbetingelser, indtil de er helt løsrevet. Sluk trypsinaktivitet ved at tilføje medium (7 ml), samle cellerne i et centrifugerør og centrifuge (200 x g, 3 min).
- Supernatanten fjernes, og cellerne gensuspenderes i medium (10 ml). Tæl cellerne og bestem levedygtigheden via trypanblå udelukkelse.
- Cellerne (6 millioner HCT116-celler pr. analyse) indsås i en 150 mm skål, og der justeres i alt 20 ml cellekulturmedium. Forbland mediet og cellerne i et centrifugerør inden såning for at opnå en ligelig fordeling af cellerne i skålen. Forbered en parallel skål, når normalisering efter cellenummer er påkrævet.
- Kultur cellerne under standardbetingelser i 72 timer. Cellerne vil nå omkring 80% -90% sammenløb.
- Modulering af inositolphosphatniveauer med NaF og cellehøst
- NaF-behandling: Tilsæt NaF (10 mM) 1 time før høst i mediet. Bland mediet ved at hvirvle pladen/pipetten og inkuber cellerne i 60 minutter under standardbetingelser.
- Efter NaF-behandlingen skal du fjerne mediet fra cellerne og placere cellerne på is.
- Cellerne vaskes to gange med PBS (5 ml, 4 °C), og PBS fjernes helt fra fadet.
- Der tilsættes perchlorsyre (PA) (1 ml, 1 m, 4 °C). Sørg for at dække hele overfladen med PA (cellerne bliver hvide, når proteiner udfældes). Inkuber cellerne i 10 minutter på et vippebord ved 4 °C.
- Pa opsamles i et centrifugerør, og det forurenende affald fjernes ved centrifugering (17.000 x g, 5 min., 4 °C). Tilsæt supernatanten til de forberedte TiO2 perler til udtrækning af InsPs.
- Skålen efter ekstraktion vaskes to gange med PBS (5 ml, r.t.) til afsyring; fjern PBS helt fra fadet.
- Opløses proteinerne på pladen ved tilsætning af cellelysebuffer (1,5 ml, r.t.; 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS] i 0,1 M NaOH). Inkuber fadet i 15 min på et vippebord ved r.t. Cellelysatet overføres til et centrifugerør og centrifuge (17.000 x g, 5 min., 4 °C). Supernatanten opbevares ved -80 °C, indtil proteinkoncentrationen bestemmes via DC-proteinassayet ved hjælp af bovin serumalbumin som kalibreringsstandard (normalt indeholder en 150 mm skål ca. 10 mg proteiner).
- Bestemmelse af celletal fra parallelle retter: Cellerne i parallelskålen høstes via trypsin som beskrevet i trin 3.1.2 (brug 5 ml trypsin-EDTA til 150 mm skålen) og fjern mediet. Resuspender cellepelleten i PBS (5 ml), bland korrekt, og tæl cellerne. Udfør dette trin lige før høst via direkte slukning for at opnå repræsentative celletal. Derudover måles mængden af cellerne med en passende metode (f.eks. Med en multisizer-maskine).
- TiO2 tilsætning af inositolphosphater
BEMÆRK: For at undgå sur nedbrydning af phosphorylerede forbindelser skal du udføre alle berigelsestrinnene indtil eluering på is og afkøle alle reagenser til 4 °C. Hold tiden for ekstraktionen til et minimum (1,5-2 timer). Udfør alle ekstraktionstrin med 1 M PA.- Klargøring af perler: TiO 2-perler (5 mg pr. prøve) vaskes med ddH2O (1 ml) og centrifuge (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Fjern ddH2O og vask perlerne med PA (1 ml). PA fjernes ved centrifugering (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Resuspender perlerne i PA (50 μL pr. Prøve).
- Supernatanten indeholdende phosphorylerede forbindelser (jf. punkt 3.2, trin 3.2.5) tilsættes perlesuspensionen, hvirvelstrømmen, og prøven roteres derefter i 20 minutter ved 4 °C.
- Prøven centrifugeres (3 500 x g, 1 min, 4 °C), og supernatanten kasseres. Perlerne vaskes med PA (500 μL) og centrifuge (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Kassér supernatanten og gentag vasketrinnet.
- Tilsæt NH4OH (200 μL, 3%) til perlerne og resuspender. Prøven drejes i 5 minutter ved r.t.
- Prøven centrifugeres (3.500 x g, 1 min.), og supernatanten overføres til et nyt centrifugerør.
- Elueringstrin 3.3.4 og 3.3.5 gentages, og elueringstrinnene kombineres. Kassér perlerne.
- De kombinerede eluenter centrifugeres (17.000 x g, 1 min., 4 °C) for at fjerne eventuelle uopløselige rester.
- Tør supernatanten helt under vakuumfordampning (70 min, 60 °C, V-AQ). Tilsæt ddH2O (50 μL) til de tørrede ekstrakter indeholdende InsPs. Vortex for at blande prøven, indtil den er helt opløst. Prøven opbevares ved -20 °C indtil CE-ESI-MS-analysen.
4. Udførelse af CE-ESI-MS-kørsler
- Der fremstilles en blanding af interne standarder indeholdende 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 og 400 μM [13 C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Koncentrationerne af SIL IS-opløsninger bestemmes ved kvantitativ 31P og 1H NMR ved hjælp af en certificeret referencestandard, dvs. phosphoeddikesyre.
BEMÆRK: Alle ovenstående SIL interne standarder (IS) med renheder højere end 96% blev syntetiseret og leveret af Fiedler gruppe 15,27. Ligesom med nukleotider kunne disse IS'er bære mange krystalvandmolekyler og forskellige modioner. I stedet for at veje stoffet og beregne koncentrationen anbefales koncentrationsbestemmelse af 13C6 standardopløsninger ved kvantitativ 31P NMR. - 10 μL af prøven blandes med 0,5 μL blanding af interne standarder i et hætteglas med CE-prøver. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 og 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 er de endelige koncentrationer inde i prøverne.
- Når du bruger genopfyldningssystemet, skal du klikke på knappen Skift flaske , sætte den forberedte 250 ml CE-løbende buffer i elektrolytflasken og klikke på Rengør rør. Opbevar genopfyldningsnålen i et vandhætteglas.
- Indstil ESI- og MS-parametre som vist i tabel 1. Optimer kildeparametrene ved hjælp af en Source Optimizer med en blanding af inositolpolyphosphatstandarder. Få indstillingerne for multireaktionsovervågning (MRM) ved hjælp af Masshunter Optimizer med alle standarder. Juster ESI- og MS/MS-indstillingerne for forskellige instrumenter.
- Udfør en kørsel for InsP-ekstrakterne, og kontroller resultatet (figur 2). Indstil en sekvens, når der er flere prøver.
- Lad MS være i standbytilstand efter målinger. Sluk ikke for LC-pumpen. Strømmen af kappevæske beskytter sprøjtenålen. Udskift CE-ESI-MS-sprøjten med en LC-ESI-MS-sprøjte, når der ikke er væsketilførsel af skede.
5. Dataanalyse
- Åbn kvantitativ analyse (for QQQ) software, opret en batch for alle prøver.
- Opret en ny metode ud fra de erhvervede MRM-data. Indstil [13C6]InsPs som interne standarder - (ISTD). Kontroller MRM-sammensat opsætning, opsætning af retentionstid, ISPD-opsætning, koncentrationsopsætning og kvalifikatoropsætning. Bestå valideringen og afslut for at anvende metoden på den aktuelle batch. Gem metoden.
- Kontroller, om hver top i batchen er korrekt integreret; Ellers skal du manuelt integrere toppen.
- Eksportér resultaterne til et regneark. Kvantificeringen af inositol (pyro)phosphater udføres ved at sammenligne analysandens toprespons med det respektive maksimale respons af SIL IS med kendte koncentrationer. Teoretiske og eksperimentelle kalibreringskurver er vist i tabel 2 for 5-PP-InsP 5, InsP 6 og Ins(1,3,4,5,6)P 5 med det lineære område.
BEMÆRK: Forudsætningen for teoretisk kalibreringskurve er brugen af et isotopmønster af høj kvalitet af målrettede analytter og med troværdig koncentration. Evaluer det lineære interval. En kalibreringskurve er afgørende for absolut kvantificering, når den fulde erhvervelse af ovennævnte isotopstandarder er upraktisk. - Med den målte koncentration i InsP-ekstraktopløsningen og dens volumen beregnes de absolutte mængder. Normaliser endvidere mængden efter celletal eller proteinindhold. Beregn cellekoncentrationen baseret på celletal og gennemsnitligt cellevolumen af HCT116 (1,68 fL).
Representative Results
De resultater, der vises her, har til formål at illustrere potentialet i CE-ESI-MS-analysen. De rapporterede tal er beskrivende for en teknisk fejlfri CE-ESI-MS-kørsel. For det første præsenteres en blanding af inositolpyrophosphatstandarder (figur 1) og et pattedyrcelleekstrakt (figur 2). For det andet er der en sammenligning af to HCT116-cellelinjer (figur 3) og NaF-behandlede HCT116-celler (figur 4).
Ekstraherede ionelektroferogrammer (EIE'er) af inositol (pyro) fosfatstandarder i en koncentration på 2 μM er vist i figur 1. Metabolisme af inositolpyrophosphater hos pattedyr med deres forenklede strukturer indsættes. De fire inositolpyrophosphater hos pattedyr, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 og5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 er godt kendetegnet ved hjælp af den beskrevne metode. En CE-ESI-MS-kørsel af HCT116UCL er afbildet i figur 2. Ved hjælp af stabile isotopmærkede (SIL) interne standarder kan en absolut kvantificering let opnås ved at sammenligne signalresponsen med den indspikede SIL af kendt koncentration. De integrerede EIE'er for inositolphosphatet fra InsP5 til (PP)2-InsP 4 og ikke-integrerede EIE'er af deres isotopmønstre vises. RSD'er for alle analytter fra seks tekniske gentagelser ligger inden for 4%. Med den målte koncentration og mængden af ekstrakter kan mængden af analytter beregnes. Med celletal og cellevolumen eller proteinindhold er absolut cellulær koncentration (μM) eller mængde normaliseret med proteinindhold (pmol / mg protein) almindeligvis de endelige resultater af en sådan analyse.
Ifølge en tidligere undersøgelse har to partier af divergerede HCT116-celler en variation af InsP 8-niveauer, HCT116UCL-celler indeholder 6 gange højere niveauer af InsP8 end HCT116NIH-celler 29. Med CE-MS-metoden kunne 1,5-(PP)2-InsP 4 i HCT116 NIH let kvantificeres (figur 3), og HCT116UCL-celler indeholder 7 gange højere niveauer af InsP8 end i HCT116NIH. Derudover er signifikant akkumulering af 1,5-(PP)2-InsP 4 i HCT116UCL-celler parallelt med en signifikant øget 1-PP-InsP5, som nu er kvantitativt vist i figur 3.
PP-InsPs niveauer øges ved at hæmme deres dephosphorylering ved hjælp af natriumfluorid. CE-ESI-MS-analyse af NaF-behandlede HCT116NIH-celler viste -5-PP-InsP 5-forhøjelsen sammen med en reduktion i InsP 6 og et udseende af 5-PP-Ins (1,3,4,6)P 4 (figur 4). Desuden er forhøjelsen af InsP8-niveauer mærkbar, mens 1-PP-InsP5 falder til en vis grad. 1-PP-InsP5 er ikke helt fraværende i NaF-behandlet HCT116NIH, men for det meste enten under detektionsgrænsen eller kvantificeringen.
Figur 1: Typiske ekstraherede ionelektroferogrammer (EIE'er) af inositol (pyro) fosfatstandarder i CE-ESI-MS-analyse ved hjælp af den beskrevne protokol. Koncentrationen af hver analysand er 2 μM. Injiceret prøvevolumen er ca. 10 nL med en injektion ved 50 mbar i 10 s. Indsatser viser metabolismen af inositolpyrophosphater hos pattedyr. IPPK: inositol pentakisphosphat 2-kinase, IP6K: inositol hexakisphosphatkinase, PPIP5K: diphosphoinositol pentakisphosphatkinase, DIPP1: diphosphoinositolpolyphosphatphosphohydrolase 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ InsP-profil af HCT116 UCL-celler. A) EIE'er for de vigtigste inositol (pyro)phosphater i HCT116NIH og spikede SIL IS'er 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4) og 20 μM [13C 6]Ins (1,3,4,5,6)P 5 (5). Indsatser viser seks tekniske gentagelser af InsP-analyse af CE-ESI-MS, data præsenteres som middel ± SD. (B) Cellulær koncentration af PP-InsP'er og InsP'er i humane cellelinjer HCT116UCL og (C) PP-InsPs og InsPs mængde normaliseret med proteinindhold. Data er midler ± SEM fra tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Variation i InsP8-niveauer mellem to divergerede HCT116-celler. A) EIE'er af inositolpyrophosphat i HCT116 UCL og HCT116NIH. InsP8 i HCT116UCL er markant mere rigelig end i HCT116NIH. (B) Forholdet mellem inositolpyrophosphat og InsP6 (%) i begge HCT116-celler. HCT116UCL-celler indeholder 7 gange højere niveauer af InsP8 sammenlignet med i HCT116NIH, mens 5-PP-InsP5-niveauerne er ens. Data er midler ± SEM fra tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Inositol (pyro) fosfatniveauer i HCT116NIH-celler med NaF-behandling. A) EIE'er af inositol (pyro)phosphat i HCT116NIH med natriumfluoridbehandling (NaF, 10 mM). Niveauer af inositolpyrophosphat, herunder 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, og5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 øges ved at blokere deres dephosphorylering ved hjælp af NaF. (B) Inositol (pyro) fosfatniveauer (mængder normaliseres efter proteinindhold) i ubehandlede og NaF-behandlede HCT116NIH-celler. Data er midler ± SEM fra tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: CE-ESI-MS parameterindstillinger. Kildeparameter og iFunnel-parametre optimeres af Source og iFunnel Optimizer. MSM-parameterindstillinger for inositol (pyro) fosfater er optimeret af MassHunter Optimizer. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Teoretisk og eksperimentel regressionsligning. Koncentration af [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 og [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 er henholdsvis 4 μM, 20 μM og 20 μM. For regressionsligning er 5-PP-InsP 5-koncentrationen ved 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP6 og Ins (1, 3, 4, 5, 6)P 5 koncentration er ved 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM,5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x er koncentration, y er (Area InsP)12C/(Area InsP)13C. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Præsenteret her er en praktisk og følsom metode til kvantificering af højt ladede inositolpyrophosphater i pattedyrceller. Ved at kombinere denne analysemetode med den nuværende avancerede InsP-ekstraktion med perchlorsyre efterfulgt af berigelse med TiO2 har CE-ESI-MS-analyse hidtil usete fordele. Med hensyn til dens gennemstrømning, følsomhed, stabilitet, absolut kvantificering, isomeridentifikation og matrixafhængighed skiller denne metode sig ud sammenlignet med andre tilgange. Denne protokol gælder for pattedyrceller, men faktisk lykkes denne strategi i mange forskellige prøver (f.eks. Gær, planter, parasitter, musevæv osv.).
Den anvendte ekstraktionsprotokol genvinder PP-InsPs og InsP6 fuldstændigt fra pattedyrcelleekstrakter16,19. Det vil også ekstrahere mange andre anioniske metabolitter, især fosfatholdige arter, f.eks. sukkerphosphater og nukleotider. Evaluering af gendannelse og nedbrydning for brugerens analytter med denne protokol ville være nødvendig.
Generelt kører CE-ESI-MS-systemet problemfrit og kan rumme omkring 200 prøver hver uge ved hjælp af denne protokol. I modsætning til HPLC er CE imidlertid blevet betragtet som en metode for eksperter og specialiserede personer i lang tid, hvilket begrænsede dets marked og begrænsede dets anvendelse. Således er en CE-ESI-MS-enhed normalt fraværende i analytiske fakulteter. Folk, der ønsker at udføre CE-ESI-MS-analyse, mangler sandsynligvis CE-erfaring og vil bruge mere tid på fejlfinding. Her fremhæves de kritiske trin. Først og fremmest er kvaliteten af kapillærsnittet. Følsomheden og stabiliteten af ESI-spray er for det meste afhængig af et førsteklasses kapillærsnit. For det andet skal kapillærudløbets ende være nøjagtigt 0,1 mm ud af sprøjtespidsen. Sprøjtenålen og CE-kapillæren skal være i aksial retning. Kvaliteten af ESI-sprayen er afgørende for kvantificeringen; Tekniske kørsler skal udføres for at evaluere repeterbarheden.
Med den beskrevne protokol er kvantificeringsgrænsen (LOQ) for PP-InsPs 40 nM med en injektion ved 50 mbar i 10 s (10 nL). Der er flere tilgange til yderligere at øge metodefølsomheden. For det første vil en injektion ved 100 mbar i 20 s (40 nL) stadig resultere i en god topform og tilstrækkelig opløsning til regioisomerer 5-PP-InsP 5 og 1-PP-InsP5. For det andet kan InsP-ekstrakter opløses i en mindre mængde vand. For det tredje kan opholdstiden øges, når der anvendes færre MRM-overgange til kvantificering. Derudover vil en CE-MS-ionkilde, der bruger ultra-lav kappevæskestrøm, øge følsomheden betydeligt.
CE-løbebufferen med pH 9 giver den bedste opløsning mellem InsP6-InsP 8. Når pH øges til 9,7, forbedres opløsningen blandt InsP3-InsP 6 betydeligt. På grund af den fremragende opløsning anbefales en kortere kapillærlængde på 72 cm for yderligere at øge gennemstrømningen. Desuden nedsætter en højere CE-kassettetemperatur ved 40 °C viskositeten af den vandige elektroforetiske buffer og fremskynder deres bevægelse under EOF. I henhold til forskellige forskningskrav kan ændringer af denne metode yderligere lette InsPs og PP-InsPs analyse. Derfor har de beskrevne CE-ESI-MS-protokoller potentialet til at åbne nye forskningsveje i denne mangesidede familie af signalmolekyler.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 864246 til HJJ). DQ anerkender den økonomiske støtte fra Brigitte-Schlieben-Lange-Programm. AS er støttet af MRC-programtilskuddet MR/T028904/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | - |
| 15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | - |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | - |
| 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | - |
| 96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
| CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
| Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
| Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
| T75 flasks | TPP | 90076 | - |
| Chemicals and Reagents | |||
| NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | - |
| Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
| BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
| DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
| DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
| FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
| Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
| NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
| PBS | Gibco | 10010015 | - |
| Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
| SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | - |
| TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
| Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
| Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
| Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
| Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
| CE system | Agilent | G7100A | - |
| CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | - |
| CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | - |
| Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
| Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
| ESI source | Agilent | AJS ESI | - |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
| Ice box | - | - | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
| Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
| MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
| Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
| Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
| Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
| Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
| Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | - |
| Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
| Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
| Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
| Software | |||
| MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | - |
| QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | - |
References
- Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
- Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
- Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
- Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
- Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
- Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).
- Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).
- Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).
- Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
- Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580 (2009).
- Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
- Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
- Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).
- Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).
- Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
- Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).
