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Biochemistry

केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स की पूर्ण मात्रा

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62847
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Organic Chemistry, University of Freiburg, 2Medical Research Council, Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London

Summary

स्तनधारी कोशिका अर्क से इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट की पूर्ण मात्रा के लिए केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है।

Abstract

इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट (पीपी-इनएसपी) इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग अणुओं का एक महत्वपूर्ण समूह है। इनोसिटोल फॉस्फेट (इनएसपी) से प्राप्त, इन अणुओं में मायो-इनोसिटोल रिंग पर कम से कम एक ऊर्जावान पाइरोफॉस्फेट मोइटी की उपस्थिति होती है। वे यूकेरियोट्स में सर्वव्यापी रूप से मौजूद हैं और फॉस्फेट होमियोस्टेसिस, इंसुलिन संवेदनशीलता और सेलुलर ऊर्जा चार्ज का सर्वेक्षण करने वाले चयापचय दूतों के रूप में काम करते हैं। इन मेटाबोलाइट्स में क्रोमोफोर की अनुपस्थिति, बहुत अधिक चार्ज घनत्व और कम बहुतायत के कारण, उनके विश्लेषण के लिए रेडियोधर्मी ट्रेसर की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार यह जटिल और महंगा है। यहां, अध्ययन केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-ईएसआई-एमएस) द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं से इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट की पूर्ण और उच्च थ्रूपुट मात्रा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह विधि स्तनधारी कोशिकाओं में सभी जैविक रूप से प्रासंगिक पीपी-इंएसपी प्रजातियों की संवेदनशील प्रोफाइलिंग को सक्षम करती है, जिससे रेजियोइसोमर्स के बेसलाइन पृथक्करण को सक्षम किया जा सकता है। मामूली आइसोमर्स सहित पीपी-इनएसपी की पूर्ण सेलुलर सांद्रता, और कई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत एचसीटी 116 कोशिकाओं में उनके अस्थायी परिवर्तनों की निगरानी प्रस्तुत की जाती है।

Introduction

1993 1,2 में मायो-इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स (पीपी-इनएसपी) की प्रारंभिक खोजके बाद से, उनके जैवसंश्लेषण, टर्नओवरऔर कार्यों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट सर्वव्यापी रूप से यूकेरियोटिक कोशिकाओं4 में होते हैं और चयापचय सिग्नलिंग अणुओं के रूप में काम करते हैं, जैसे, फॉस्फेट होमियोस्टेसिस 5,6, इंसुलिन संवेदनशीलता7, कैल्शियम दोलन 8,9, वेसिकुलर ट्रैफिकिंग10, एपोप्टोसिस11, डीएनए मरम्मत12, प्रतिरक्षा सिग्नलिंग13 , और अन्य। इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स के नियंत्रण में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं की अधिकता उनके सेलुलर बहुतायत, उतार-चढ़ाव और स्थानीयकरण की गहरी समझ की मांग करती है।

यद्यपि INSP और PP-InsPs ने विषयों में ध्यान आकर्षित किया, उनकी बहुतायत का विश्लेषण नियमित रूप से 80 के दशक के दौरान विकसित एक विधि का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें ट्राइटिटेड इनोसिटोल के साथ लेबलिंग कोशिकाएं शामिल होती हैं, जो बाद में सिंटिलेशन काउंटिंग के साथ मजबूत आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी सैक्स-एचपीएलसी द्वारा निकाले गए पीपी-इनएसपी को हल करती हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित नए तरीकों को अभी भी महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करना पड़ता है: आठ फॉस्फेट इकाइयों के साथ इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट फॉस्फेट एस्टर और एनहाइड्राइड को परेशान करते हैं, जिससे आयनीकरण के दौरान एक महत्वपूर्ण नकारात्मक चार्ज और संभावित फॉस्फेट हानि होती है। स्तनधारियों में पाए जाने वाले पीपी-इनएसपी के चार प्रमुख प्रकार हैं (चित्रा 1): 1,5-(पीपी)2-इंएसपी 4 (या 1,5-इंएसपी8),5-पीपी-इनएसपी 5 (या 5-इनएसपी7), 1-पीपी-इनएसपी5 (या 1-इनएसपी7), और 5-पीपी-इन्स (1,3,4,6)पी4 (या 5-पीपी-इनएसपी4)3,14। पीपी-इनएसपी के शारीरिक स्तर आम तौर पर नैनो-से-कम-माइक्रोमोलर रेंज में होते हैं, जिसमें 5-पीपी-इनएसपी5 0.5 - 5 μM की सेलुलर सांद्रता के साथ सबसे प्रचुर मात्रा में होता है। 1,5-(PP)2-Insp4 और 1-PP-Insp5 को 5-PP-Insp5 पूल के लगभग 10% तक माना जाता है और कई कोशिकाओं15 में पता लगाना मुश्किल रहता है। एक मुक्त ओएच समूह के साथ 5-पीपी-इनएसपी4 बहुतायत में भी कम है और आमतौर पर केवल तभी पता लगाने योग्य हो जाता है जब फॉस्फेट हाइड्रोलेज़ को सोडियम फ्लोराइड (एनएएफ) 16 के साथ बाधित किया जाता है।

पीपी-इनएसपी का उच्च चार्ज घनत्व उनके पृथक्करण को मुश्किल बनाता है, और पीपी-इनएसपी रेजियोइसोमर्स की घटना इन प्रयासों को और जटिल बनाती है। नतीजतन, अधिकांश प्रयोग [3एच]-इनोसिटोल का उपयोग करके कोशिकाओं के चयापचय रेडियोधर्मी लेबलिंग द्वारा मात्रा निर्धारित करने पर निर्भर थे, क्योंकि मैट्रिक्स से पृष्ठभूमि को बाहर रखा गया है और उच्च संवेदनशीलता17,18 हासिल की गई है। हालांकि, यह विधि महंगी, समय लेने वाली है, और संबंधित पीपी-इंएसपी रेजियोइसोमर्स को ठीक से अलग करने की अनुमति नहीं देती है। इसके अलावा, [3एच]-इनोसिटोल लेबलिंग ग्लूकोज से अंतर्जात इनोसिटोल संश्लेषण के लिए जिम्मेदार नहीं है। एक पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) आधारित विधि एक व्यापक रूप से लागू सस्ती विकल्प है लेकिन इसकी संवेदनशीलता 19,20,21,22 में सीमित है। रेडियोलेबलिंग से बचने वाले अन्य दृष्टिकोण प्रकाशित किए गए हैं, जिनमें आयन क्रोमैटोग्राफी के बाद पोस्ट-कॉलम डेरिवेटाइजेशन यूवी-डिटेक्शन23, हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईएलआईसी) 24, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) 25 के साथ युग्मित कमजोर आयन एक्सचेंज (वैक्स) शामिल हैं। हालांकि, वे क्लासिक [3एच]-इनोसिटोल एसएएक्स-एचपीएलसी प्रोटोकॉल के बराबर नहीं हैं।

हाल ही में, केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-ईएसआई-एमएस) को इंएसपी और पीपी-इनएसपी चयापचय के विश्लेषण के लिए एक परिवर्तनकारी रणनीति के रूप में पेश किया गया था,जो 16 से ऊपर चर्चा की गई सभी आवश्यकताओं को पूरा करता है। परक्लोरिक एसिड द्वारा वर्तमान अत्याधुनिक इंएसपी निष्कर्षण के साथ संयुक्त टाइटेनियम डाइऑक्साइड मोतियों26 के साथ संवर्धन, सीई-ईएसआई-एमएस खमीर से लेकर पौधों और स्तनधारियों तक अब तक परीक्षण किए गए हर जीव में सफल रहा। सभी संभावित रिजियोइसोमर्स सहित इनएसपी और पीपी-इनएसपी की एक साथ प्रोफाइलिंग आसानी से हासिल की गई थी। स्थिर आइसोटोप-लेबल (एसआईएल) आंतरिक मानकों ने मैट्रिक्स प्रभावों के बावजूद, तेजी से और सटीक पूर्ण मात्रा को सक्षम किया। क्योंकि एमएस आइसोटोपिक द्रव्यमान अंतर को पकड़ सकता है, सीई-ईएसआई-एमएस को इंएसपी और पीपी-इनएसपी के कंपार्टमेंटल सेलुलर संश्लेषण मार्गों का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को [13सी6]-मायो-इनोसिटोल या [13सी6]-डी-ग्लूकोज के साथ खिलाकर।

यहां वर्णित सीई-ईएसआई-एमएस द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं से पीपी-इनएसपी और इंएसपी की पूर्ण मात्रा के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल है। प्रमुख 5-पीपी-इनएसपी5 आइसोमर के अलावा, 1,5-(पीपी)2-इनएसपी4 और 1-पीपी-इनएसपी 5 को भी इस अध्ययन में निर्धारित कियागया है, उनकी कम बहुतायत के बावजूद। विभिन्न प्रयोगशालाओं (एनआईएच, यूसीएल) से दो एचसीटी 116 सेल लाइनों का अध्ययन किया जाता है, और यह मान्य है कि एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच में पाए जाने वाले 1,5-(पीपी) 2-इनएसपी 4 के 7 गुना अधिक स्तर होते हैं, जबकि 5-पीपी-इनएसपी5 सांद्रता तुलनीय होती है। इसके अलावा, एचसीटी 116यूसीएल में 1-पीपी-इंएसपी5 संश्लेषण में काफी वृद्धि नहीं हुई है। इसके अलावा, सोडियम फ्लोराइड का उपयोग करके उनके डीफॉस्फोराइलेशन को अवरुद्ध करके पीपी-इनएसपी स्तरों की वृद्धि का मात्रात्मक अध्ययन किया जाता है।

Protocol

1. सीई-ईएसआई-एमएस सिस्टम स्थापित करना

  1. एक सीई-ईएसआई-एमएस सिस्टम स्थापित करें जिसमें एक वाणिज्यिक सीई सिस्टम शामिल है - और एक ट्रिपल क्वाड्रोपोल टेंडम मास स्पेक्ट्रोमीटर, जो एक एगिलेंट जेट स्ट्रीम (एजेएस) इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत से लैस है। एक सीई-ईएसआई-एमएस स्प्रेयर किट और एक आइसोक्रेटिक एलसी (लिक्विड क्रोमैटोग्राफी) पंप आवश्यक हैं।
  2. शीथ फ्लो 1: 100 स्प्लिटर (सीई-एमएस स्प्रेयर किट में शामिल) और आइसोक्रेटिक एलसी पंप आउटलेट को कनेक्ट करें।
  3. सुनिश्चित करें कि सीई सिस्टम इनलेट शीशी द्रव्यमान विश्लेषक के स्प्रेयर टिप के समान ऊंचाई पर है।
  4. पूरे सिस्टम को नियंत्रित करने और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए मासहंटर वर्कस्टेशन (संस्करण 10.1) या तुलनीय एमएस सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

2. बफर, केशिका और सीई-एमएस सिस्टम तैयार करना

  1. सीई रनिंग बफर तैयार करें: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 40 एमएम अमोनियम एसीटेट के पीएच को 9.0 तक समायोजित करें। एक 250 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क की सिफारिश की जाती है। 250 एमएल बफर को 0.2 μm छिद्र-आकार के झिल्ली फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें। केवल अल्ट्रा-शुद्ध विआयनीकृत पानी और एमएस-ग्रेड अभिकर्मकों का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
    नोट: इस बफर को कमरे के तापमान पर 2-3 सप्ताह या फ्रिज में कई महीनों तक रखा जा सकता है।
  2. शीथ तरल तैयार करें: 250 एमएल बोतल में 100 एमएल अल्ट्रा-शुद्ध पानी और 100 एमएल एलसी-एमएस ग्रेड आइसोप्रोपेनॉल मिलाएं। सप्ताह में कम से कम एक बार शीथ तरल बदलें। उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर को नियोजित करते समय शीथ तरल में द्रव्यमान संदर्भ जोड़ें।
  3. शीथ तरल स्थापित करें: 5 मिनट के लिए 5 एमएल / मिनट पर शुद्ध करें और प्रवाह दर को 1 एमएल / मिनट (सीई-एमएस स्प्रेयर में 10 μL / मिनट) पर सेट करें। पंप का दबाव सीए 180 बार पर होगा। सुनिश्चित करें कि रीसायकल ट्यूबिंग विलायक का पुन: उपयोग करने के लिए म्यान तरल बोतल में वापस जुड़ती है।
  4. केशिका तैयार करें: यूवी डिटेक्शन विंडो के साथ सीई-एमएस केशिका (50 μm और 365 μM o.d. 125 सेमी की लंबाई के साथ) खरीदें। उपयोगकर्ता विशेष वितरकों से बहुत सस्ता बार-फ्यूज्ड सिलिका केशिकाएं भी प्राप्त कर सकता है। 100 सेमी की लंबाई के साथ एक केशिका काटें। एक घूर्णन हीरे के ब्लेड के साथ एक केशिका कॉलम कटर के साथ दोनों केशिका सिरों को ठीक से काटें और हल्के से दोनों सिरों पर 2-3 सेमी पॉलीमाइड कोटिंग हटा दें। आइसोप्रोपेनॉल के साथ केशिका सतह को साफ करें।
  5. केशिका स्थापित करें: सीई-एमएस कैसेट में केशिका का मिलान करें। कैसेट बदलें बटन पर क्लिक करें और कैसेट को सीई डिवाइस में इंस्टॉल करें। केशिका का इनलेट छोर इलेक्ट्रोड की तुलना में लगभग 2 मिमी कम है। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान इनलेट एंड नमूने की सतह से कम है।
  6. केशिका को सक्रिय करें: पहले उपयोग से पहले, केशिका को 1 एम एनएओएच के साथ फ्लश करें, इसके बाद 10 मिनट के लिए पानी, और 15 मिनट के लिए सीई रनिंग बफर।
  7. सीई-एमएस स्प्रेयर में केशिका छोर डालें: धीरे से केशिका को सीई-एमएस स्प्रेयर में डालें और सुनिश्चित करें कि केशिका अंत स्प्रेयर टिप से लगभग 0.1 मिमी बाहर निकलता है। एक आवर्धक ग्लास और स्प्रेयर में समायोजन स्क्रू के साथ केशिका आउटलेट अंत का सटीक समायोजन करना सुनिश्चित करें। स्प्रेयर को आयन स्रोत में वापस डालें और समायोजन स्क्रू को छूने से बचें। इस कार्रवाई को करते समय MS स्टैंडबाय मोड पर है।
  8. ईएसआई स्प्रे की जांच करें: पूर्ण स्कैन मोड के तहत ईएसआई स्प्रेयर की स्थिरता की जांच करें। कुल आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम का उतार-चढ़ाव 5% के भीतर होना चाहिए।
  9. INSP मानकों के साथ एक परीक्षण रन करें: 10 s (10 nL) के लिए 50 mbar पर इंजेक्शन के साथ परीक्षण रन के लिए 2 μM InsP 3-InsP8 मानकों (मात्रात्मक 31P NMR15,27 द्वारा समायोजित) के मिश्रण का उपयोग करें। तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार विस्तृत ईएसआई और एमएस पैरामीटर सेट करें। CE धारा ca. 26 μA है। शिखर चौड़ाई लगभग 0.4-0.5 मिनट है। सुनिश्चित करें कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम से कम 400 तक पहुंच जाए।

3. स्तनधारी कोशिकाओं से घुलनशील इनोसिटोल फॉस्फेट का निष्कर्षण

नोट: एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाएं स्टीफन शियर्स28 से एक तरह का उपहार थीं। एचसीटी 116यूसीएल सेल सयार्डी की लैब26 से थे।

  1. बीज बोने की कोशिकाएं
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक 5% उच्च आर्द्रता सीओ2 वातावरण (जिसे आगे मानक स्थितियों के रूप में संदर्भित किया जाता है) में 37 डिग्री सेल्सियस पर टी 75 फ्लास्क में कल्चर एचसीटी 116एनआईएच या एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाएं।
    2. एचसीटी 116एनआईएच और एचसीटी 116यूसीएल स्टॉक संस्कृतियों को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (5 एमएल) के साथ धोएं और कोशिकाओं को ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइन टेट्रासिटिक एसिड (ईडीटीए) (3 एमएल, 0.25%) के साथ मानक परिस्थितियों में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे पूरी तरह से अलग न हो जाएं। माध्यम (7 एमएल) जोड़कर ट्रिप्सिन गतिविधि को बुझाएं, कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें, और सेंट्रीफ्यूज (200 एक्स जी, 3 मिनट)।
    3. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और कोशिकाओं को मध्यम (10 एमएल) में फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण के माध्यम से व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    4. कोशिकाओं (प्रति परख 6 मिलियन एचसीटी 116 कोशिकाओं) को 150 मिमी डिश में बीज दें और कुल मिलाकर 20 एमएल सेल कल्चर माध्यम को समायोजित करें। डिश में कोशिकाओं के समान वितरण को प्राप्त करने के लिए बीज बोने से पहले माध्यम और कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रीमिक्स करें। सेल नंबर द्वारा सामान्यीकरण की आवश्यकता होने पर एक समानांतर डिश तैयार करें।
    5. 72 घंटे के लिए मानक परिस्थितियों में कोशिकाओं को कल्चर करें। कोशिकाएं लगभग 80% -90% संगम तक पहुंच जाएंगी।
  2. एनएएफ और सेल कटाई के साथ इनोसिटोल फॉस्फेट के स्तर का मॉड्यूलेशन
    1. एनएएफ उपचार: माध्यम में कटाई से 1 घंटे पहले एनएएफ (10 एमएम) जोड़ें। प्लेट/पिपेटिंग को घुमाकर माध्यम को मिलाएं और मानक परिस्थितियों में 60 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. एनएएफ उपचार के बाद, कोशिकाओं से माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    3. कोशिकाओं को पीबीएस (5 एमएल, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ दो बार धोएं और पीबीएस को डिश से पूरी तरह से हटा दें।
    4. परक्लोरिक एसिड (पीए) (1 एमएल, 1 एम, 4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें। पीए के साथ पूरी सतह को कवर करना सुनिश्चित करें (प्रोटीन अवक्षेपित होने पर कोशिकाएं सफेद हो जाएंगी)। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झुकाव तालिका पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. पीए को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और सेंट्रीफ्यूजेशन (17,000 x g, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा दूषित मलबे को हटा दें। InsPs के खींचने के लिए तैयारTiO 2 मोतियों में सुपरनैटेंट जोड़ें।
    6. डीएसिडिफिकेशन के लिए पीबीएस (5 एमएल, आरटी) के साथ पोस्ट-निष्कर्षण डिश को दो बार धोएं; पकवान से पीबीएस को पूरी तरह से हटा दें।
    7. सेल लाइसिस बफर (1.5 एमएल, आरटी; 0.1 एम एनएओएच में 0.1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट [एसडीएस] के अतिरिक्त प्लेट पर प्रोटीन को घुलनशील करें। पकवान को 15 मिनट के लिए एक झुकाव मेज पर रखें। सेल लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज (17,000 x g, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें। अंशांकन मानक के रूप में गोजातीय सीरम एल्बुमिन का उपयोग करके डीसी प्रोटीन परख के माध्यम से प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनैटेंट स्टोर करें (आमतौर पर, एक 150 मिमी डिश में लगभग 10 मिलीग्राम प्रोटीन होता है)।
    8. समानांतर व्यंजनों से सेल संख्याओं का निर्धारण: चरण 3.1.2 (150 मिमी डिश के लिए 5 एमएल ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करें) में वर्णित ट्रिप्सिन के माध्यम से समानांतर डिश की कोशिकाओं को काटें और माध्यम को हटा दें। पीबीएस (5 एमएल) में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, ठीक से मिलाएं, और कोशिकाओं की गिनती करें। प्रतिनिधि सेल गणना प्राप्त करने के लिए प्रत्यक्ष शमन के माध्यम से फसल से ठीक पहले इस चरण को करें। इसके अतिरिक्त, एक उपयुक्त विधि के साथ कोशिकाओं की मात्रा को मापें (उदाहरण के लिए, एक मल्टीसाइज़र मशीन के साथ)।
  3. इनोसिटोल फॉस्फेट का टीआईओ2 संवर्धन
    नोट: फॉस्फोराइलेटेड यौगिकों के अम्लीय अपघटन से बचने के लिए, बर्फ पर क्षालन तक सभी संवर्धन चरणों का प्रदर्शन करें, और सभी अभिकर्मकों को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। निष्कर्षण के लिए समय को कम से कम (1.5-2 घंटे) रखें। 1 एम पीए के साथ सभी निष्कर्षण चरणों का प्रदर्शन करें।
    1. मोतियों की तैयारी: डीडीएच2 ओ (1 एमएल) और सेंट्रीफ्यूज (3,500 x g, 1 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ TiO2मोती (5 मिलीग्राम प्रति नमूना) धोएं। ddH2O निकालें और पीए (1 एमएल) के साथ मोतियों को धो लें। सेंट्रीफ्यूजेशन (3,500 x g, 1 मिनट, 4 °C) द्वारा पीए निकालें। पीए (50 μL प्रति नमूना) में मोतियों को फिर से निलंबित करें।
    2. मोती निलंबन, भंवर में फॉस्फोराइलेटेड यौगिकों (खंड 3.2, चरण 3.2.5 की तुलना करें) युक्त सुपरनैटेंट जोड़ें, और फिर नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए घुमाएं।
    3. नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें (3,500 x g, 1 मिनट, 4 °C) और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। मोतियों को पीए (500 μL) और सेंट्रीफ्यूज (3,500 x g, 1 मिनट, 4 °C) के साथ धोएं। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और धोने के चरण को दोहराएं।
    4. मोतियों में NH4OH (200 μL, 3%) जोड़ें और पुन: निलंबित करें। नमूने को 5 मिनट के लिए घुमाएं।
    5. नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें (3,500 x g, 1 मिनट) और सुपरनैटेंट को एक नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. क्षालन चरण 3.3.4 और 3.3.5 को दोहराएं और एलुएंट को मिलाएं। मोतियों को त्याग दें।
    7. किसी भी अघुलनशील अवशेषों को हटाने के लिए संयुक्त एलुएंट (17,000 x g, 1 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. वैक्यूम वाष्पीकरण (70 मिनट, 60 डिग्री सेल्सियस, वी-एक्यू) के तहत सतह पर तैरने वाले को पूरी तरह से सुखाएं। इनएसपी युक्त सूखे अर्क में डीडीएच2ओ (50 μL) जोड़ें। भंवर पूरी तरह से भंग होने तक नमूने को मिश्रण करने के लिए। सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण तक नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. सीई-ईएसआई-एमएस रन का प्रदर्शन

  1. आंतरिक मानकों का मिश्रण तैयार करें जिसमें 40 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4, 80 μM [13C6]5-PP-InsP5, 80 μM [13C6]1-PP-InsP5, 400 μM [13C6]Insp6 और 400 μM [13 C6]Ins(1,3,4,6)P5 हो। एक प्रमाणित संदर्भ मानक, यानी, फॉस्फोएसिटिक एसिड की सहायता से मात्रात्मक 31पी और 1एच एनएमआर द्वारा एसआईएल आईएस समाधानों की सांद्रता निर्धारित करें।
    नोट: 96% से अधिक शुद्धता वाले उपरोक्त सभी एसआईएल आंतरिक मानकों (आईएस) को फिडलर समूह15,27 द्वारा संश्लेषित और प्रदान किया गया था। न्यूक्लियोटाइड के समान, ये आईएस कई क्रिस्टल पानी के अणुओं और विविध काउंटर आयनों को ले जा सकते हैं। पदार्थ का वजन करने और एकाग्रता की गणना करने के बजाय, मात्रात्मक 31 पी एनएमआर द्वारा 13सी6 मानक समाधानोंके एकाग्रता निर्धारण की सिफारिश की जाती है।
  2. सीई नमूना शीशी में आंतरिक मानकों के मिश्रण के 0.5 μL के साथ नमूने के 10 μL मिलाएं। 2 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13C6]5-PP-InsP5, 4 μM [13C6]1-PP-InsP5, 20 μM [13C6]InsP6] Ins(1,3,4,5,6)P5 नमूनों के अंदर अंतिम सांद्रता हैं।
  3. पुनःपूर्ति प्रणाली का उपयोग करते समय, बोतल बदलें बटन पर क्लिक करें, तैयार 250 एमएल सीई रनिंग बफर को इलेक्ट्रोलाइट बोतल में डालें, और क्लीन ट्यूब पर क्लिक करें। पुनःपूर्ति सुई को पानी की शीशी में रखें।
  4. तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार ईएसआई और एमएस पैरामीटर सेट करें। इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट मानकों के मिश्रण के साथ स्रोत ऑप्टिमाइज़र का उपयोग करके स्रोत मापदंडों को अनुकूलित करें। सभी मानकों के साथ मासहंटर ऑप्टिमाइज़र का उपयोग करके एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) सेटिंग्स प्राप्त करें। विभिन्न इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए ईएसआई और एमएस / एमएस सेटिंग्स समायोजित करें।
  5. INSP अर्क के लिए एक रन निष्पादित करें और परिणाम की जांच करें (चित्रा 2)। अधिक नमूने होने पर एक अनुक्रम सेट करें।
  6. माप के बाद एमएस को स्टैंडबाय मोड पर रहने दें। एलसी पंप को बंद न करें। शीथ तरल का प्रवाह स्प्रेयर सुई की रक्षा करता है। शीथ तरल आपूर्ति नहीं होने पर सीई-ईएसआई-एमएस स्प्रेयर को एलसी-ईएसआई-एमएस स्प्रेयर से बदलें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. मात्रात्मक विश्लेषण (QQQ के लिए) सॉफ्टवेयर खोलें, सभी नमूनों के लिए एक बैच बनाएँ।
  2. अधिग्रहित MRM डेटा से एक नई विधि बनाएँ। आंतरिक मानकों के रूप में [13सी6] इंएसपी सेट करें - (आईएसटीडी)। एमआरएम यौगिक सेटअप, अवधारण समय सेटअप, ISTD सेटअप, एकाग्रता सेटअप और क्वालीफायर सेटअप की जाँच करें। विधि को वर्तमान बैच पर लागू करने के लिए सत्यापन और निकास पास करें. विधि सहेजें।
  3. जांचें कि बैच में प्रत्येक शिखर ठीक से एकीकृत है या नहीं; अन्यथा, मैन्युअल रूप से शिखर को एकीकृत करें।
  4. परिणामों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें। ज्ञात सांद्रता के साथ एसआईएल आईएस की संबंधित चरम प्रतिक्रिया के साथ विश्लेषण शिखर प्रतिक्रिया की तुलना करके इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट की मात्रा निर्धारित करें। सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक अंशांकन वक्रों को रैखिक सीमा के साथ 5-पीपी-इनएसपी5, आईएनएसपी6, और आईएनएस (1,3,4,5,6)पी5 के लिए तालिका 2 में दिखाया गया है।
    नोट: सैद्धांतिक अंशांकन वक्र को लागू करने की पूर्व शर्त लक्षित विश्लेषणों के उच्च गुणवत्ता वाले समस्थानिक पैटर्न का उपयोग और विश्वसनीय एकाग्रता के साथ है। रैखिक सीमा का मूल्यांकन करें। पूर्ण मात्रा के लिए एक अंशांकन वक्र आवश्यक है जब उपर्युक्त समस्थानिक मानकों का पूर्ण अधिग्रहण अव्यावहारिक है।
  5. INSP निकालने के समाधान और इसकी मात्रा में मापा एकाग्रता के साथ, पूर्ण मात्रा की गणना करें। इसके अलावा, सेल गणना या प्रोटीन सामग्री द्वारा मात्रा को सामान्य करें। सेल गणना और एचसीटी 116 (1.68 एफएल) की औसत सेल मात्रा के आधार पर सेलुलर एकाग्रता की गणना करें।

Representative Results

यहां दिखाए गए परिणाम सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण की क्षमता को चित्रित करने का लक्ष्य रखते हैं। रिपोर्ट किए गए आंकड़े तकनीकी रूप से निर्दोष सीई-ईएसआई-एमएस रन के वर्णनात्मक हैं। सबसे पहले, इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट मानकों (चित्रा 1) और एक स्तनधारी कोशिका निकालने (चित्रा 2) का मिश्रण प्रस्तुत किया जाता है। दूसरे, दो एचसीटी 116 सेल लाइनों (चित्रा 3) और एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116 (चित्रा 4) कोशिकाओं की तुलना प्रदान की जाती है।

2 μM की सांद्रता पर इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट मानकों के निकाले गए आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम (ईआईई) चित्र 1 में दिखाए गए हैं। स्तनधारियों में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स का चयापचय उनकी सरलीकृत संरचनाओं के साथ डाला जाता है। स्तनधारियों में चार इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट, 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4, 5-पीपी-इनएसपी5, 1-पीपी-इनएसपी 5, और5-पीपी-इन्स (1,3,4,6)पी4 वर्णित विधि का उपयोग करके अच्छी तरह से प्रतिष्ठित हैं। एचसीटी 116यूसीएल के सीई-ईएसआई-एमएस रन को चित्र 2 में दर्शाया गया है। स्थिर आइसोटोप-लेबल (एसआईएल) आंतरिक मानकों की सहायता से, ज्ञात एकाग्रता के स्पाइक्ड-इन एसआईएल के साथ सिग्नल प्रतिक्रिया की तुलना करके एक पूर्ण मात्रा आसानी से प्राप्त की जा सकती है। InsP5 से (PP)2-Insp4 तक इनोसिटोल फॉस्फेट के एकीकृत EIEs और उनके समस्थानिक पैटर्न के गैर-एकीकृत EIEs प्रदर्शित किए जाते हैं। छह तकनीकी दोहराव से सभी विश्लेषणों के आरएसडी 4% के भीतर हैं। मापा एकाग्रता और अर्क की मात्रा के साथ, विश्लेषणों की मात्रा की गणना की जा सकती है। सेल की गिनती और सेल की मात्रा, या प्रोटीन सामग्री के साथ, पूर्ण सेलुलर एकाग्रता (μM) या प्रोटीन सामग्री (pmol / mg प्रोटीन) द्वारा सामान्यीकृत मात्रा आमतौर पर इस तरह के विश्लेषण के अंतिम परिणाम हैं।

पहले के एक अध्ययन के अनुसार, अलग-थलग एचसीटी 116 कोशिकाओं के दो बैचों में इंएसपी8 स्तरों की भिन्नता होती है, एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं29 की तुलना में इंएसपी8 का 6 गुना अधिक स्तर होता है। सीई-एमएस विधि के साथ, एचसीटी 116एनआईएच में 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4 को आसानी से परिमाणित किया जा सकता है (चित्रा 3), और एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच की तुलना में इंएसपी8 के 7 गुना उच्च स्तर होते हैं। इसके अलावा, एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4 का महत्वपूर्ण संचय काफी वृद्धि 1-पीपी-इनएसपी5 द्वारा समानांतर है, जिसे अब मात्रात्मक रूप से चित्रा 3 में दिखाया गया है।

पीपी-इनएसपी का स्तर सोडियम फ्लोराइड का उपयोग करके उनके डीफॉस्फोराइलेशन को रोककर बढ़ता है। एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं के सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण ने -5-पीपी-इनएसपी5 ऊंचाई के साथ-साथ इंएसपी6 में कमी और 5-पीपी-इन्स (1,3,4,6) पी4 (चित्रा 4) की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, INSP8 स्तरों की ऊंचाई ध्यान देने योग्य है, जबकि 1-PP-Insp5 कुछ हद तक कम हो जाती है। 1-पीपी-इनएसपी5 एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116एनआईएच में पूरी तरह से अनुपस्थित नहीं है, लेकिन ज्यादातर या तो पता लगाने या मात्रा निर्धारित करने की सीमा के तहत है।

Figure 1
चित्रा 1: वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण में इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट मानकों के विशिष्ट निकाले गए आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम (ईआईई)। प्रत्येक विश्लेषण की सांद्रता 2 μM है। इंजेक्शन नमूना मात्रा ca. 10 nL है जिसमें 10 सेकंड के लिए 50 mbar पर एक इंजेक्शन होता है। इंसर्ट स्तनधारियों में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट के चयापचय को दिखाते हैं। आईपीपीके: इनोसिटोल पेंटाकिसफॉस्फेट 2-काइनेज, आईपी 6 के: इनोसिटोल हेक्साकिसफॉस्फेट काइनेज, पीपीआईपी 5 के: डिफॉस्फोइनोसिटोल पेंटाकिसफॉस्फेट किनेज, डीआईपीपी 1: डिफॉस्फोइनोसिटोलपोलीफॉस्फेट फॉस्फोहाइड्रोलेस 1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं का प्रतिनिधि इंएसपी प्रोफाइल। (ए) एचसीटी 116एनआईएच में मुख्य इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट के ईआईई और स्पाइक्ड एसआईएल आईएसएस 2 μM [13C6]1,5-(PP)2-Insp 4 (1), 4 μM [13C6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13C6]InsP 6 (4), 20 μM [13C6]InsP6 (4), 20 और 20 μM [13C6] Ins (1,3,4,5,6)P5 (5). सीई-ईएसआई-एमएस द्वारा इंएसपी विश्लेषण के छह तकनीकी दोहराव दिखाते हैं, डेटा को एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (बी) मानव सेल लाइनों एचसीटी 116यूसीएल में पीपी-इनएसपी और इंएसपी की सेलुलर एकाग्रता और (सी) पीपी-इनएसपी और इनएसपी राशि प्रोटीन सामग्री द्वारा सामान्यीकृत होती है। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसईएम ± साधन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: दो अलग-अलग एचसीटी 116 कोशिकाओं के बीच INSP 8 स्तरों में भिन्नता। (ए) एचसीटी 116 यूसीएल और एचसीटी 116 एनआईएच में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट के ईआईई। एचसीटी 116यूसीएल में आईएसपी8 एचसीटी 116एनआईएच की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक प्रचुर मात्रा में है। (बी) दोनों एचसीटी116 कोशिकाओं में इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट और इनएसपी 6 (%) का अनुपात। एचसीटी 116यूसीएल कोशिकाओं में एचसीटी 116एनआईएच की तुलना में आईएसपी8 का 7 गुना अधिक स्तर होता है, जबकि 5-पीपी-इंएसपी5 स्तर बराबर होते हैं। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसईएम ± साधन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एनएएफ उपचार के साथ एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं में इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट का स्तर। (ए) सोडियम फ्लोराइड उपचार (एनएएफ, 10 एमएम) के साथ एचसीटी 116एनआईएच में इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट के ईआईई। 1,5-(पीपी)2-इनएसपी 4, 5-पीपी-इनएसपी 5, और 5-पीपी-इन्स (1,3,4,6)पी4 सहित इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट का स्तर एनएएफ का उपयोग करके उनके डीफॉस्फोराइलेशन को अवरुद्ध करके बढ़ता है। (बी) अनुपचारित और एनएएफ-उपचारित एचसीटी 116एनआईएच कोशिकाओं में इनोसिटोल (पायरो) फॉस्फेट का स्तर (मात्रा प्रोटीन सामग्री द्वारा सामान्यीकृत होती है)। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसईएम ± साधन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: CE-ESI-MS पैरामीटर सेटिंग्स। स्रोत पैरामीटर और iFunnel पैरामीटर स्रोत और iFunnel ऑप्टिमाइज़र द्वारा अनुकूलित किए जाते हैं। इनोसिटोल (पाइरो) फॉस्फेट के लिए एमएसएम पैरामीटर सेटिंग्स मासहंटर ऑप्टिमाइज़र द्वारा अनुकूलित की जाती हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक प्रतिगमन समीकरण। [13C6]5-PP-InsP5 [13C6] InsP6, और [13C6] Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 की सांद्रता क्रमशः 4 μM, 20 μM, और 20 μM है। प्रतिगमन समीकरण के लिए, 5-PP-InsP5 एकाग्रता 0.04 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10, 3, 4, 5, 5) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 24 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 24 μM पर है। InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.4, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 24 μM, 24 μM, InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.4, 5, 6) P 5 एकाग्रता 0.2 μM, 2 μM, 0.5 μM, 24 μM पर है। InsP 6 और Ins (1, 3, 4, 5, 6) P5 एकाग्रता 0.2 μM, 0.4 μM, 2.5 m, 24 μM, 24 μM, InsP6 और Ins (1, 3, 4, 40 μM, 80 μM, 120 μm. x एकाग्रता है, y (क्षेत्र Insp)12C/(क्षेत्र Insp)13C है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां प्रस्तुत स्तनधारी कोशिकाओं में अत्यधिक चार्ज इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट की मात्रा के लिए एक व्यावहारिक और संवेदनशील विधि है। इस विश्लेषण दृष्टिकोण को परक्लोरिक एसिड के साथ वर्तमान अत्याधुनिक इंएसपी निष्कर्षण के साथ संयोजित करने के बाद टीआईओ2 के साथ संवर्धन, सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण के अभूतपूर्व फायदे हैं। इसकी थ्रूपुट, संवेदनशीलता, स्थिरता, पूर्ण मात्रा, आइसोमर पहचान और मैट्रिक्स इन-निर्भरता के संबंध में, यह विधि अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में अलग है। यह प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं पर लागू होता है, लेकिन वास्तव में यह रणनीति कई अलग-अलग नमूनों (जैसे, खमीर, पौधे, परजीवी, माउस ऊतक, आदि) में सफल होती है।

लागू निष्कर्षण प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल अर्क16,19 से पीपी-इनएसपी और आईएनएसपी 6 को पूरी तरह से पुनर्प्राप्त करता है। यह कई अन्य आयनिक मेटाबोलाइट्स, विशेष रूप से फॉस्फेट युक्त प्रजातियों, जैसे, चीनी फॉस्फेट और न्यूक्लियोटाइड को भी निकाल देगा। इस प्रोटोकॉल के साथ उपयोगकर्ता के विश्लेषणों के लिए वसूली और अपघटन का मूल्यांकन आवश्यक होगा।

आम तौर पर, सीई-ईएसआई-एमएस सिस्टम सुचारू रूप से चलता है और इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके हर हफ्ते लगभग 200 नमूने समायोजित कर सकता है। एचपीएलसी के विपरीत, हालांकि, सीई को लंबे समय तक विशेषज्ञों और विशेष व्यक्तियों के लिए एक विधि के रूप में माना जाता है, जिसने इसके बाजार को प्रतिबंधित कर दिया और इसके आवेदन को सीमित कर दिया। इस प्रकार, एक सीई-ईएसआई-एमएस डिवाइस आमतौर पर विश्लेषणात्मक संकायों में अनुपस्थित होता है। जो लोग सीई-ईएसआई-एमएस विश्लेषण करना चाहते हैं, उनके पास शायद सीई अनुभव की कमी है और वे समस्या निवारण में अधिक समय बिताएंगे। यहां, महत्वपूर्ण कदमों पर प्रकाश डाला गया है। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण केशिका कटौती की गुणवत्ता है। ईएसआई स्प्रे की संवेदनशीलता और स्थिरता ज्यादातर प्रथम श्रेणी के केशिका कटौती पर निर्भर करती है। दूसरे, केशिका आउटलेट अंत स्प्रेयर टिप से ठीक 0.1 मिमी बाहर होना चाहिए। स्प्रेयर सुई और सीई केशिका अक्षीय दिशा में होनी चाहिए। ईएसआई स्प्रे की गुणवत्ता मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है; पुनरावृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए तकनीकी रन किए जाने चाहिए।

वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, पीपी-इनएसपी के लिए मात्रा (एलओक्यू) की सीमा 40 एनएम है जिसमें 10 सेकंड (10 एनएल) के लिए 50 एमबार पर इंजेक्शन है। विधि संवेदनशीलता को और बढ़ाने के लिए कई दृष्टिकोण हैं। सबसे पहले, 20 एस (40 एनएल) के लिए 100 एमबार पर एक इंजेक्शन अभी भी एक अच्छा चरम आकार और रेजियोइसोमर्स 5-पीपी-इनएसपी5 और 1-पीपी-इनएसपी5 के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन का परिणाम होगा। दूसरे, INSP अर्क को पानी की थोड़ी मात्रा में भंग किया जा सकता है। तीसरा, मात्रा निर्धारित करने के लिए कम एमआरएम संक्रमण का उपयोग करते समय रहने का समय बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, अल्ट्रा-लो शीथ तरल प्रवाह का उपयोग करके सीई-एमएस आयन स्रोत संवेदनशीलता में काफी वृद्धि करेगा।

पीएच 9 के साथ सीई रनिंग बफर इनएसपी6-इनएसपी 8 के बीच सबसे अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। पीएच को 9.7 तक बढ़ाते समय, InsP 3-Insp 6 के बीच रिज़ॉल्यूशन में काफी सुधार होगा। उत्कृष्ट रिज़ॉल्यूशन के कारण, थ्रूपुट को और बढ़ाने के लिए 72 सेमी की छोटी केशिका लंबाई की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, 40 डिग्री सेल्सियस पर एक उच्च सीई कैसेट तापमान जलीय इलेक्ट्रोफोरेटिक बफर की चिपचिपाहट को कम करता है और ईओएफ के तहत उनके आंदोलन को तेज करता है। विभिन्न शोध मांगों के अनुसार, इस पद्धति के संशोधन इंएसपी और पीपी-इनएसपी विश्लेषण को और सुविधाजनक बना सकते हैं। इसलिए, वर्णित सीई-ईएसआई-एमएस प्रोटोकॉल में सिग्नलिंग अणुओं के इस बहुमुखी परिवार में नए शोध के रास्ते खोलने की क्षमता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (एचजेजे को अनुदान समझौता संख्या 864246) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है। डीक्यू ब्रिगिट-श्लीबेन-लैंग-प्रोग्रामम से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है। एएस एमआरसी कार्यक्रम अनुदान एमआर / टी028904/1 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
1.5 mL microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 -
15 cm tissue culture dishes Thermo Fisher 168381 -
2.0 mL microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 623201 -
50 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 -
96-well plates Thermo Fisher 260836 for the DC protein assay
CE fused silica capillary CS Chromatographie 105180 50 µM i.d. 360 µM o.d.
Pipette tips Starlab I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips
Serological pipets TPP 94550, 94525, 94010, 94005 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes
T75 flasks TPP 90076 -
Chemicals and Reagents
NaOH AppliChem A6829,0500 sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200056 -
Ammonium acetate Thermo Fisher 1677373 HPLC grade
BSA Thermo Fisher 23209 albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation
DC protein assay Biorad 5000116 DC protein assay reagents package
DMEM Gibco 41966029 high glucose, pyruvate
FBS Gibco 10270106, 10500064 (heat inactivated) 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH
Isopropanol Carl Roth AE73.2 99.95% LC-MS grade
NH4OH, 10% Carl Roth 6756.1 for preparation of 3% NH4OH
PBS Gibco 10010015 -
Perchloric acid, 70% Carl Roth 9216.1 for preparation of 1 M perchloric acid
SDS SERVA 20760.02 for preparation of cell lysis buffer
Sodium fluoride Sigma Aldrich S7920 -
TiO2 beads GL Sciences 5020-75000 5 µm particle size
Trypan blue solution Gibco 15250061 trypan blue stain (0.4%)
Ultrapure (Type 1) water Milli-Q ZRQSVP3WW model: Direct-Q 3 UV Water Purification System
Equipment
Analytical balance Mettler Toledo 30105893 model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample)
Automated cell counter Logos Biosystems L40002 model: LUNA-II Automated Cell Counter
Benchtop centrifuge Hettich 1401 model: UNIVERSAL 320
Benchtop centrifuge with cooling VWR 521-1647P model: Microstar 17R
CE system Agilent G7100A -
CE/MS Adapter Kit Agilent G1603A -
CE/MS Sprayer Kit Agilent G1607A -
Cell counting slides Logos Biosystems L12001 LUNA Cell Counting Slides
Centrifugal evaporator Eppendorf 5305000304 model: Concentrator plus complete system
ESI source Agilent AJS ESI -
Super Support Film Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo 647
Humidified incubator Binder 9040-0088 model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells
Ice box - - should provide enough space for samples, dishes, etc.
Isocratic LC system Agilent G7110B 1260 Iso Pump model: Infinity II Quaternary system
MSD Agilent G6495C triple quadrupole
Multiplate reader Tecan 30086375 model: SPARK 10 M
Pipette filler Thermo Fisher 10072332 for serological pipettes
Pipettes Brand 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 various pipettes
Rotator Labnet H5500 model: Mini LabRoller Rotator
Shortix capillary column cutter SGT S0020 -
Test tube shaker (vortex mixer) Carl Roth HXH6.1 model: Rotilabo-Mini Vortex
Tilt table Labnet S0600 model: EDURO MiniMix Nutating Mixer
Water bath Thermo Fisher FSGPD05 model: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter Workstation Agilent Version 10.1 -
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition Agilent Version 10.1 -
MassHunter Workstation Optimizer Agilent Version 10.1 -
MassHunter Workstation Qualitative Analysis Agilent Version 10.0 -
QQQ Quantitaion Analysis Agilent Version 10.1 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जैव रसायन अंक 174
केशिका वैद्युतकणसंचलन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इनोसिटोल पाइरोफॉस्फेट्स की पूर्ण मात्रा
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Qiu, D., Eisenbeis, V. B., Saiardi,… More

Qiu, D., Eisenbeis, V. B., Saiardi, A., Jessen, H. J. Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (174), e62847, doi:10.3791/62847 (2021).

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