Summary
Um procedimento para espectrometria de massa por ionização por eletrospray de eletroforese capilar para a quantificação absoluta de pirofosfatos de inositol de extratos de células de mamíferos é descrito.
Abstract
Os pirofosfatos de inositol (PP-InsPs) são um importante grupo de moléculas de sinalização intracelular. Derivadas de fosfatos de inositol (InsPs), essas moléculas apresentam a presença de pelo menos uma porção de pirofosfato energético no anel de mio-inositol. Eles existem onipresente em eucariotas e operam como mensageiros metabólicos pesquisando a homeostase do fosfato, a sensibilidade à insulina e a carga de energia celular. Devido à ausência de um cromóforo nesses metabólitos, uma densidade de carga muito alta e baixa abundância, sua análise requer marcador radioativo e, portanto, é complicada e cara. Aqui, o estudo apresenta um protocolo detalhado para realizar quantificação absoluta e de alto rendimento de pirofosfatos de inositol de células de mamíferos por espectrometria de massa por eletroforese capilar por eletrospray de ionização de massa (CE-ESI-MS). Este método permite o perfil sensível de todas as espécies de PP-InsPs biologicamente relevantes em células de mamíferos, permitindo a separação basal de regioisômeros. Concentrações celulares absolutas de PP-InsPs, incluindo isômeros menores, e monitoramento de suas alterações temporais em células HCT116 sob várias condições experimentais são apresentados.
Introduction
Desde a descoberta inicial dos pirofosfatos de mio-inositol (PP-InsPs) em 1993 1,2, progressos significativos foram feitos para elucidar sua biossíntese, rotatividade e funções3. Os pirofosfatos de inositol ocorrem onipresente em células eucarióticas4 e servem como moléculas de sinalização metabólica criticamente envolvidas, por exemplo, homeostase de fosfato5,6, sensibilidade à insulina7, oscilações de cálcio8,9, tráfico vesicular 10, apoptose 11, reparo de DNA 12, sinalização imunológica 13 , entre outros. A infinidade de processos importantes sob o controle de pirofosfatos de inositol exige uma compreensão mais profunda de sua abundância celular, flutuação e localização.
Embora InsPs e PP-InsPs tenham atraído a atenção em todas as disciplinas, a análise de sua abundância é rotineiramente realizada usando um método desenvolvido durante os anos 80, consistindo em marcar células com inositol tritiado, resolvendo os PP-InsPs extraídos por forte cromatografia de troca de ânions Sax-HPLC com subsequente contagem de cintilação. Novos métodos baseados em espectrometria de massa ainda enfrentam desafios significativos: pirofosfatos de inositol com até oito unidades de fosfato abrigam ésteres de fosfato e anidridos, levando a uma carga negativa significativa e perda potencial de fosfato durante a ionização. Existem quatro tipos principais de PP-InsPs encontrados em mamíferos (Figura 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (ou 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (ou 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (ou 1-InsP7) e 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (ou5-PP-InsP 4)3,14. Os níveis fisiológicos de PP-InsPs estão tipicamente na faixa nano a micromolar baixa, com 5-PP-InsP 5 como o mais abundante com concentrações celulares de 0,5 - 5 μM. Acredita-se que 1,5-(PP)2-InsP 4 e 1-PP-InsP 5 sejam até cerca de 10% do pool de 5-PP-InsP5 e permaneçam difíceis de rastrear em muitas células15. O 5-PP-InsP4 com grupo OH livre é ainda menor em abundância e geralmente só se torna detectável quando as hidrolases de fosfato são inibidas com fluoreto de sódio (NaF)16.
A alta densidade de carga dos PP-InsPs dificulta sua separação, e a ocorrência de regioisomers PP-InsP complica ainda mais esses esforços. Como resultado, a maioria dos experimentos baseou-se na quantificação por marcação radioativa metabólica de células usando [3H]-inositol, uma vez que o fundo da matriz é excluído e alta sensibilidade é alcançada17,18. No entanto, esse método é caro, demorado e não permite distinguir adequadamente os regioisômeros PP-InsP relacionados. Além disso, a marcação de [3H]-inositol não é responsável pela síntese endógena de inositol a partir da glicose. Um método à base de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é uma alternativa de baixo custo amplamente aplicada, mas limitada em sua sensibilidade 19,20,21,22. Outras abordagens que evitam a radiomarcação foram publicadas, incluindo cromatografia iônica seguida de derivatização pós-coluna detecção UV23, cromatografia de interação hidrofílica (HILIC)24 ou troca ânion fraca (WAX) acoplada à espectrometria de massas (MS)25. No entanto, eles não estão (ainda) a par com o clássico [3H]-inositol SAX-HPLC protocolo.
Recentemente, a espectrometria de massas por ionização por eletrospray de eletroforese capilar (CE-ESI-MS) foi introduzida como estratégia transformadora para a análise do metabolismo de InsPs e PP-InsPs, atendendo a todos os requisitos discutidos acima16. Combinado com a atual extração InsP de última geração por ácido perclórico seguido de enriquecimento com contas de dióxido de titânio26, o CE-ESI-MS teve sucesso em todos os organismos testados até agora, de leveduras a plantas e mamíferos. O perfil simultâneo de InsPs e PP-InsPs, incluindo todos os possíveis regioisômeros, foi facilmente alcançado. Os padrões internos estáveis marcados com isótopos (SIL) permitiram uma quantificação absoluta rápida e precisa, independentemente dos efeitos da matriz. Como a EM pode capturar diferenças de massa isotópicas, a CE-ESI-MS também pode ser aplicada para estudar as vias de síntese celular compartimentadas de InsPs e PP-InsPs, por exemplo, alimentando células com [13 C 6]-mio-inositol ou [13C6]-D-glicose.
Descrito aqui está um protocolo passo-a-passo detalhado para a quantificação absoluta de PP-InsPs e InsPs de células de mamíferos por CE-ESI-MS. Além do principal isômero 5-PP-InsP 5, 1,5-(PP)2-InsP 4 e 1-PP-InsP5 também são quantificados neste estudo, apesar de sua menor abundância. Duas linhagens celulares de HCT116 de diferentes laboratórios (NIH, UCL) são estudadas, e é validado que as células HCT116UCL contêm níveis 7 vezes mais altos de 1,5-(PP)2-InsP 4 do que os encontrados no HCT116NIH, enquanto as concentrações de 5-PP-InsP5 são comparáveis. Além disso, a síntese de 1-PP-InsP5 na LCU HCT116não é significativamente aumentada. Além disso, o aumento dos níveis de PP-InsP bloqueando sua desfosforilação usando fluoreto de sódio é estudado quantitativamente.
Protocol
1. Configuração do sistema CE-ESI-MS
- Configure um sistema CE-ESI-MS que consiste em um sistema CE comercial - e um espectrômetro de massa em tandem quadrupolo triplo, equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) Agilent Jet Stream (AJS). Um kit de pulverização ce-esi-ms e uma bomba isocrática LC (Cromatografia Líquida) são necessários.
- Conecte o divisor de fluxo da bainha 1:100 (incluído no kit de pulverizador CE-MS) e a saída isocrática da bomba LC.
- Certifique-se de que o frasco para injetáveis de entrada do sistema CE está à mesma altura que a ponta do pulverizador do analisador de massa.
- Utilize o MassHunter Workstation (Versão 10.1) ou software MS comparável para controlar todo o sistema e para aquisição e análise de dados.
2. Preparação do sistema tampão, capilar e CE-MS
- Preparar o tampão de funcionamento CE: Ajustar o pH do acetato de amónio 40 mM para 9,0 com hidróxido de amónio. Recomenda-se um balão aferido de 250 ml. Filtre os 250 ml de tampão com filtros de membrana do tamanho de poros de 0,2 μm. Certifique-se de usar apenas água deionizada ultrapura e reagentes de grau MS.
NOTA: Este tampão pode ser mantido à temperatura ambiente por 2-3 semanas ou por vários meses em uma geladeira. - Preparar o líquido da bainha: Misture 100 mL de água ultrapura e 100 mL de isopropanol de grau LC-MS em um frasco de 250 mL. Troque o líquido da bainha pelo menos uma vez por semana. Adicione referência de massa ao líquido da bainha ao empregar um espectrômetro de massa de alta resolução.
- Instale o líquido da bainha: Purge a 5 mL/min por 5 min e defina a taxa de fluxo em 1 mL/min (10 μL/min no pulverizador CE-MS). A pressão da bomba será de cerca de 180 bar. Certifique-se de que a tubulação de reciclagem se conecte novamente ao frasco de líquido da bainha para reutilizar o solvente.
- Preparar capilar: Compre um capilar CE-MS (50 μm i.d. e 365 μM o.d. com um comprimento de 125 cm) com uma janela de detecção UV. O usuário também pode obter capilares de sílica fundidos em barra muito mais baratos de distribuidores especializados. Corte um capilar com um comprimento de 100 cm. Corte corretamente ambas as extremidades capilares com um cortador de coluna capilar com uma lâmina de diamante rotativa e remova 2-3 cm de revestimento de poliimida em ambas as extremidades com um isqueiro. Limpe a superfície capilar com isopropanol.
- Instalar capilar: Combine o capilar no CE-MS. Clique no botão Alterar e instale o no dispositivo CE. A extremidade de entrada do capilar é cerca de 2 mm mais baixa que o eletrodo. Certifique-se de que a extremidade de entrada é inferior à superfície da amostra durante o processo de injeção.
- Ativar capilar: Antes do primeiro uso, lave o capilar com 1 M de NaOH, seguido de água por 10 minutos e tampão de funcionamento CE por 15 minutos.
- Insira a extremidade capilar no pulverizador CE-MS: Coloque suavemente o capilar no pulverizador CE-MS e certifique-se de que a extremidade capilar se projete aproximadamente 0,1 mm para fora da ponta do pulverizador. Certifique-se de fazer um ajuste preciso da extremidade de saída capilar com uma lupa e o parafuso de ajuste no pulverizador. Insira o pulverizador de volta na fonte de íons e evite tocar no parafuso de ajuste. O MS está no modo de espera ao executar esta operação.
- Verifique o spray ESI: Verifique a estabilidade do pulverizador ESI no modo de varredura completa. A flutuação dos eletroferogramas de íons totais deve estar dentro de 5%.
- Executar um teste com padrões InsP: Empregar uma mistura de 2 μM InsP3-InsP 8 padrões (ajustado pelo quantitativo 31P NMR 15,27) para ensaios com uma injeção a 50 mbar por 10 s (10 nL). Defina os parâmetros ESI e MS detalhados, conforme mostrado na Tabela 1. A corrente CE é de cerca de 26 μA. A largura do pico é de cerca de 0,4-0,5 min. Certifique-se de que a relação sinal-ruído atinja pelo menos 400.
3. Extração de fosfatos de inositol solúveis de células de mamíferos
NOTA: As células HCT116NIH foram um presente gentil de Stephen Shears28. As células HCT116UCL eram do Laboratório26 de Saiardi.
- Células semeadoras
- Cultura de células HCT116NIH ou HCT116UCL em frascos T75 a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de alta umidade de 5% (também referida como condições padrão) no meio de águia modificado (DMEM) da Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Lavar as culturas de estoque de HCT116NIH e HCT116UCL com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5 mL) e incubar as células com ácido tetraacético tripsina-etilenodiamina (EDTA) (3 mL, 0,25%) em condições padrão até que estejam completamente separadas. Tempere a atividade da tripsina adicionando meio (7 mL), colete as células em um tubo de centrífuga e centrifuga (200 x g, 3 min).
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em meio (10 mL). Conte as células e determine a viabilidade através da exclusão azul de tripano.
- Semar as células (6 milhões de células HCT116 por ensaio) em um prato de 150 mm e ajustar 20 mL de meio de cultura celular no total. Pré-misture o meio e as células em um tubo de centrífuga antes da semeadura para obter uma distribuição igual das células no prato. Prepare um prato paralelo quando a normalização por número de célula for necessária.
- Cultivar as células em condições padrão por 72 h. As células atingirão cerca de 80% a 90% de confluência.
- Modulação dos níveis de fosfato de inositol com NaF e colheita celular
- Tratamento com NaF: Adicionar NaF (10 mM) 1 h antes de colher no meio. Misture o meio rodopiando a placa/pipetagem e incube as células por 60 minutos em condições padrão.
- Após o tratamento com NaF, remova o meio das células e coloque as células no gelo.
- Lave as células duas vezes com PBS (5 mL, 4 °C) e remova completamente o PBS do prato.
- Adicionar ácido perclórico (PA) (1 ml, 1 M, 4 °C). Certifique-se de cobrir toda a superfície com PA (as células ficarão brancas à medida que as proteínas se precipitarem). Incubar as células durante 10 minutos sobre uma mesa de inclinação a 4 °C.
- Recolher o PA num tubo de centrífuga e remover os detritos contaminantes por centrifugação (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Adicione o sobrenadante às contas TiO2 preparadas para o pulldown de InsPs.
- Lavar a antena pós-extração duas vezes com PBS (5 mL, r.t.) para desacidificação; remova completamente o PBS do prato.
- Solubilizar as proteínas na placa através da adição de tampão de lise celular (1,5 mL, r.t.; dodecil sulfato de sódio a 0,1% [SDS] em 0,1 M de NaOH). Incube o prato por 15 min em uma mesa inclinada em r.t. Transferir o lisado celular para um tubo de centrífuga e centrífuga (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Conservar o sobrenadante a -80 °C até que a concentração de proteína seja determinada através do ensaio de proteína CC utilizando albumina sérica bovina como padrão de calibração (normalmente, um prato de 150 mm contém cerca de 10 mg de proteínas).
- Determinação do número de células a partir de pratos paralelos: Colha as células do prato paralelo através de tripsina, conforme descrito no passo 3.1.2 (utilizar 5 ml de tripsina-EDTA para o prato de 150 mm) e remover o meio. Ressuspeite a pastilha celular em PBS (5 mL), misture adequadamente e conte as células. Execute esta etapa logo antes da colheita através de têmpera direta para obter contagens de células representativas. Além disso, meça o volume das células com um método apropriado (por exemplo, com uma máquina multidimensionadora).
- TiO2 enriquecimento de fosfatos de inositol
NOTA: Para evitar a decomposição ácida de compostos fosforilados, execute todas as etapas de enriquecimento até a eluição no gelo e resfrie todos os reagentes a 4 °C. Mantenha o tempo para a extração a um mínimo (1,5-2 h). Execute todas as etapas de extração com 1 M PA.- Preparação de grânulos: Lavar as contas de TiO 2 (5 mg por amostra) com ddH2O (1 mL) e centrífuga (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Retire o ddH2O e lave as contas com PA (1 mL). Remover PA por centrifugação (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Ressuspender as esferas em PA (50 μL por amostra).
- Adicionar o sobrenadante contendo compostos fosforilados (comparar o ponto 3.2, passo 3.2.5) à suspensão do talão, vórtice, e girar a amostra durante 20 minutos a 4 °C.
- Centrifugar a amostra (3,500 x g, 1 min, 4 °C) e eliminar o sobrenadante. Lavar os grânulos com PA (500 μL) e centrífuga (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Descarte o sobrenadante e repita a etapa de lavagem.
- Adicione NH4OH (200 μL, 3%) às contas e ressuscite. Girar a amostra durante 5 minutos a r.t.
- Centrifugar a amostra (3.500 x g, 1 min) e transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga.
- Repita os passos de eluição 3.3.4 e 3.3.5 e combine os eluentes. Descarte as contas.
- Centrifugar os eluentes combinados (17.000 x g, 1 min, 4 °C) para remover quaisquer resíduos insolúveis.
- Secar completamente o sobrenadante sob evaporação a vácuo (70 min, 60 °C, V-AQ). Adicionar ddH2O (50 μL) aos extractos secos que contenham InsPs. Vórtice para misturar a amostra até que esteja completamente dissolvida. Conservar a amostra a -20 °C até à análise CE-ESI-MS.
4. Executando as execuções CE-ESI-MS
- Preparar uma mistura de padrões internos contendo 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 e 400 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Determinar as concentrações de soluções SIL IS por RMN quantitativas de 31P e 1H, com o auxílio de um padrão de referência certificado, ou seja, ácido fosfoacético.
NOTA: Todos os padrões internos (SI) SIL acima do SIL com purezas superiores a 96% foram sintetizados e fornecidos pelo grupo Fiedler15,27. Assim como acontece com os nucleotídeos, esses SI podem transportar muitas moléculas de água cristalina e diversos contra-íons. Em vez de pesar a substância e calcular a concentração, recomenda-se a determinação da concentração de 13C6 soluções-padrão por RMN quantitativa de 31P. - Misturar 10 μL da amostra com 0,5 μL de mistura de padrões internos num frasco para injetáveis CE para amostras. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 e 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 são as concentrações finais dentro das amostras.
- Ao usar o sistema de reabastecimento, clique no botão Alterar garrafa , coloque os 250 mL preparados de tampão de execução CE no frasco de eletrólitos e clique em Limpar tubos. Mantenha a agulha de reposição em um frasco para injetáveis de água.
- Defina os parâmetros ESI e MS conforme mostrado na Tabela 1. Otimize os parâmetros da fonte usando um otimizador de fonte com uma mistura de padrões de polifosfato de inositol. Obtenha as configurações de monitoramento de reações múltiplas (MRM) usando o Masshunter Optimizer com todos os padrões. Ajuste as configurações ESI e MS/MS para instrumentação diferente.
- Execute uma execução para as extrações InsP e verifique o resultado (Figura 2). Defina uma sequência quando houver mais amostras.
- Deixe o MS estar no modo de espera após as medições. Não desligue a bomba LC. O fluxo de líquido da bainha protege a agulha do pulverizador. Substitua o pulverizador CE-ESI-MS por um pulverizador LC-ESI-MS quando não houver fornecimento de líquido da bainha.
5. Análise dos dados
- Abra o software de Análise Quantitativa (para QQQ), crie um lote para todas as amostras.
- Crie um novo método a partir dos dados MRM adquiridos. Defina o [13C6]InsPs como padrões internos - (ISTD). Verifique a configuração do composto MRM, a configuração do tempo de retenção, a configuração do ISDD, a configuração de concentração e a configuração do qualificador. Passe na validação e saia para aplicar o método ao lote atual. Salve o método.
- Verifique se cada pico no lote está devidamente integrado; caso contrário, integre manualmente o pico.
- Exporte os resultados para uma planilha. Realizar a quantificação de inositol (piro)fosfatos comparando a resposta de pico do analito com a respectiva resposta de pico de SIL IS com concentrações conhecidas. As curvas de calibração teóricas e experimentais são apresentadas na Tabela 2 para 5-PP-InsP 5, InsP 6 e Ins(1,3,4,5,6)P 5 com a faixa linear.
NOTA: A pré-condição para a aplicação da curva de calibração teórica é a utilização de um padrão isotópico de alta qualidade de analitos visados e com concentração credível. Avalie o intervalo linear. Uma curva de calibração é essencial para a quantificação absoluta quando a aquisição completa dos padrões isotópicos acima mencionados é impraticável. - Com a concentração medida na solução de extracto de InsP e o seu volume, calcular as quantidades absolutas. Além disso, normalize a quantidade por contagem de células ou conteúdo de proteína. Calcular a concentração celular com base na contagem de células e no volume celular médio de HCT116 (1,68 fL).
Representative Results
Os resultados aqui apresentados visam ilustrar o potencial da análise CE-ESI-MS. Os números relatados são descritivos de uma execução tecnicamente impecável do CE-ESI-MS. Primeiramente, apresenta-se uma mistura de padrões de pirofosfato de inositol (Figura 1) e um extrato de células de mamíferos (Figura 2). Em segundo lugar, é fornecida uma comparação de duas linhagens celulares de HCT116 (Figura 3) e HCT116 tratadas com NaF (Figura 4).
Os eletroferogramas de íons extraídos (EIEs) dos padrões de inositol (piro)fosfato a uma concentração de 2 μM são mostrados na Figura 1. O metabolismo dos pirofosfatos de inositol em mamíferos com suas estruturas simplificadas é inserido. Os quatro pirofosfatos de inositol em mamíferos, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 e5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 são bem distinguidos usando o método descrito. Uma execução ce-esi-ms de HCT116UCL é representada na Figura 2. Com o auxílio de padrões internos estáveis marcados com isótopos (SIL), uma quantificação absoluta pode ser prontamente alcançada comparando a resposta do sinal com o SIL cravado de concentração conhecida. Os EIEs integrados do fosfato de inositol de InsP5 a (PP)2-InsP 4 e EIEs não integrados de seus padrões isotópicos são exibidos. Os RSDs de todos os analitos de seis repetições técnicas estão dentro de 4%. Com a concentração medida e o volume de extractos, a quantidade de analitos pode ser calculada. Com a contagem de células e o volume celular, ou conteúdo proteico, a concentração celular absoluta (μM) ou a quantidade normalizada pelo teor de proteína (pmol/mg de proteína) são comumente os resultados finais de tal análise.
De acordo com um estudo anterior, dois lotes de células HCT116 divergentes têm uma variação dos níveis de InsP 8, as células HCT116UCL contêm níveis 6 vezes mais elevados de InsP8 do que as células HCT116NIH 29. Com o método CE-MS, 1,5-(PP)2-InsP 4 no HCT116 NIH poderia ser facilmente quantificado (Figura 3), e as células HCT116UCL contêm níveis 7 vezes maiores de InsP8 do que no HCT116NIH. Além disso, o acúmulo significativo de 1,5-(PP)2-InsP 4 em células HCT116UCL é paralelo a um aumento significativo de 1-PP-InsP5, que agora é mostrado quantitativamente na Figura 3.
Os níveis de PP-InsPs aumentam inibindo sua desfosforilação usando fluoreto de sódio. A análise CE-ESI-MS de células de HCT116 NIH tratadas comNaF demonstrou a elevação de -5-PP-InsP 5, juntamente com uma redução naInsIns6 e um aparecimento de 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (Figura 4). Além disso, a elevação dos níveis de InsP8 é perceptível, enquanto o 1-PP-InsP5 diminui até certo ponto. O 1-PP-InsP5 não está completamente ausente no HCT116NIH tratado com NaF, mas principalmente sob o limite de detecção ou quantificação.
Figura 1: Eletroferogramas de íons extraídos típicos (EIEs) de padrões de inositol (piro)fosfato na análise CE-ESI-MS usando o protocolo descrito. A concentração de cada substância a analisar é de 2 μM. O volume da amostra injectada é de cerca de 10 nL com uma injeção a 50 mbar durante 10 s. Inserções mostram o metabolismo de pirofosfatos de inositol em mamíferos. IPPK: inositol pentakisfosfato 2-quinase, IP6K: inositol hexakisphosphate quinase, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfato quinase, DIPP1: difosfoinositolpolifosfato fosfohidrolase 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfil representativo do InsP das célulasUCL HCT116. (A) EIEs dos principais inositol (piro)fosfatos no HCT116NIH e SIL ISs cravados 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), e 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). As inserções mostram seis repetições técnicas da análise de InsP por CE-ESI-MS, os dados são apresentados como meios ± SD. (B) Concentração celular de PP-InsPs e InsPs em linhagens celulares humanas HCT116UCL e (C) PP-InsPs e InsPs quantidade normalizada pelo teor de proteína. Os dados são meios ± MEV de três experimentos independentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Variação nos níveis de InsP8 entre duas células HCT116 divergentes. (A) EIEs de pirofosfato de inositol em HCT116 UCL e HCT116NIH. InsP8 em HCT116UCL é marcadamente mais abundante do que em HCT116NIH. (B) Proporção de pirofosfato de inositol para InsP6 (%) em ambas as células HCT116. As células HCT116UCL contêm níveis 7 vezes mais elevados de InsP8 em comparação com o HCT116NIH, enquanto os níveis de 5-PP-InsP5 são iguais. Os dados são meios ± MEV de três experimentos independentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Níveis de inositol (piro)fosfato em células HCT116NIH, com tratamento com NaF. (A) EIEs de inositol (piro)fosfato em HCT116NIH com tratamento com fluoreto de sódio (NaF, 10 mM). Os níveis de pirofosfato de inositol, incluindo 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 e5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 aumentam através do bloqueio de sua desfosforilação usando NaF. (B) Níveis de inositol (piro)fosfato (as quantidades são normalizadas pelo teor de proteína) em célulasde HCT116 NIH não tratadas e tratadas com NaF. Os dados são meios ± MEV de três experimentos independentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Configurações de parâmetros CE-ESI-MS. O parâmetro Source e os parâmetros iFunnel são otimizados pelo Source e pelo iFunnel Optimizer. Configurações de parâmetros MSM para inositol (piro)fosfatos são otimizados pelo MassHunter Optimizer. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Equação de regressão teórica e experimental. A concentração de [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 e [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 é de 4 μM, 20 μM e 20 μM, respectivamente. Para a equação de regressão, a concentração de 5-PP-InsP 5 está em 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 e Ins (1, 3, 4, 5,6)A concentração de P 5 está em 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM,5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x é concentração, y é (Área InsP)12C/(Área InsP)13C. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Discussion
Apresentado aqui é um método prático e sensível para a quantificação de pirofosfatos de inositol altamente carregados em células de mamíferos. Combinando essa abordagem de análise com a atual extração InsP de última geração com ácido perclórico, seguida de enriquecimento com TiO2, a análise CE-ESI-MS tem vantagens sem precedentes. Com relação à sua taxa de transferência, sensibilidade, estabilidade, quantificação absoluta, identificação de isômeros e independência de matriz, esse método se destaca em comparação com outras abordagens. Este protocolo é aplicável a células de mamíferos, mas de fato essa estratégia é bem-sucedida em muitas amostras diferentes (por exemplo, leveduras, plantas, parasitas, tecidos de camundongos, etc.).
O protocolo de extração aplicado recupera totalmente PP-InsPs e InsP6 de extratos celulares de mamíferos16,19. Ele também extrairá muitos outros metabólitos aniônicos, particularmente espécies contendo fosfato, por exemplo, fosfatos de açúcar e nucleotídeos. Seria necessária a avaliação da recuperação e decomposição dos analitos do usuário com este protocolo.
Geralmente, o sistema CE-ESI-MS funciona sem problemas e pode acomodar cerca de 200 amostras por semana usando este protocolo. Ao contrário da HPLC, porém, a CE tem sido considerada um método para especialistas e pessoas especializadas por um longo tempo, o que restringiu seu mercado e limitou sua aplicação. Assim, um dispositivo CE-ESI-MS geralmente está ausente nas faculdades analíticas. As pessoas que desejam realizar a análise CE-ESI-MS provavelmente não têm experiência em CE e passarão mais tempo solucionando problemas. Aqui, as etapas críticas são destacadas. Em primeiro lugar e acima de tudo é a qualidade do corte capilar. A sensibilidade e a estabilidade do spray ESI dependem principalmente de um corte capilar de primeira classe. Em segundo lugar, a extremidade de saída capilar deve estar exatamente 0,1 mm fora da ponta do pulverizador. A agulha do pulverizador e o capilar CE devem estar na direção axial. A qualidade do spray ESI é fundamental para a quantificação; Execuções técnicas devem ser realizadas para avaliar a repetibilidade.
Com o protocolo descrito, o limite de quantificação (LOQ) para PP-InsPs é de 40 nM com uma injeção a 50 mbar por 10 s (10 nL). Existem várias abordagens para aumentar ainda mais a sensibilidade do método. Em primeiro lugar, uma injeção a 100 mbar por 20 s (40 nL) ainda resultará em uma boa forma de pico e resolução suficiente para regioisomers 5-PP-InsP 5 e 1-PP-InsP5. Em segundo lugar, os extratos de InsP podem ser dissolvidos em uma quantidade menor de água. Em terceiro lugar, o tempo de permanência poderia ser aumentado ao usar menos transições de MRM para quantificação. Além disso, uma fonte de íons CE-MS usando fluxo líquido de bainha ultra-baixo aumentaria significativamente a sensibilidade.
O tampão de execução CE com pH 9 fornece a melhor resolução entre InsP6-InsP 8. Ao aumentar o pH para 9,7, a resolução entre InsP3-InsP 6 melhorará significativamente. Devido à excelente resolução, recomenda-se um comprimento capilar mais curto, de 72 cm, para aumentar ainda mais o rendimento. Além disso, uma temperatura mais alta do CE a 40 °C diminui a viscosidade do tampão eletroforético aquoso e acelera seu movimento sob EOF. De acordo com diferentes demandas de pesquisa, modificações desse método podem facilitar ainda mais a análise de InsPs e PP-InsPs. Portanto, os protocolos CE-ESI-MS descritos têm o potencial de abrir novos caminhos de pesquisa para essa família multifacetada de moléculas sinalizadoras.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Investigação (CEI) no âmbito do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (convenção de subvenção n.º 864246, para a HJJ). A DQ reconhece o apoio financeiro do Programa Brigitte-Schlieben-Lange. O AS é apoiado pela concessão do programa MRC MR/T028904/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | - |
| 15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | - |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | - |
| 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | - |
| 96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
| CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
| Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
| Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
| T75 flasks | TPP | 90076 | - |
| Chemicals and Reagents | |||
| NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | - |
| Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
| BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
| DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
| DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
| FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
| Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
| NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
| PBS | Gibco | 10010015 | - |
| Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
| SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | - |
| TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
| Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
| Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
| Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
| Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
| CE system | Agilent | G7100A | - |
| CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | - |
| CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | - |
| Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
| Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
| ESI source | Agilent | AJS ESI | - |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
| Ice box | - | - | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
| Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
| MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
| Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
| Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
| Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
| Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
| Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | - |
| Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
| Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
| Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
| Software | |||
| MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | - |
| QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | - |
References
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