Summary
Het protocol beschrijft de vorming van robuuste en biocompatibele DNA-beladen microcapsules als gemultiplexte in vitro biosensoren die verschillende liganden kunnen volgen.
Abstract
We introduceren een protocol voor de bereiding van met DNA beladen zijdefibroïnemicrocapsules via de Layer-by-Layer (LbL) assemblagemethode op offerende bolvormige kernen. Na adsorptie van een eerste laag en DNA-plasmiden werd de vorming van robuuste microcapsules vergemakkelijkt door β-vellen in de secundaire zijdestructuur te induceren tijdens acute uitdroging van een enkele zijdelaag. Vandaar dat de gelaagdheid plaatsvond via meerdere waterstofbindingen en hydrofobe interacties. Na adsorptie van meerlaagse schillen kunnen de kernschilstructuren verder worden gefunctionaliseerd met gouden nanodeeltjes (AuNP's) en/of antilichamen (IgG) om te worden gebruikt voor teledetectie en/of gerichte toediening. Het aanpassen van verschillende belangrijke parameters tijdens sequentiële depositie van belangrijke macromoleculen op silicakernen, zoals de aanwezigheid van een polymeerprimer, de concentratie van DNA en zijde-eiwit, evenals een aantal geadsorbeerde lagen, resulteerde in biocompatibele, DNA-beladen microcapsules met variabele permeabiliteit en DNA-belastingen. Bij het oplossen van silicakernen toonde het protocol de vorming aan van holle en robuuste microcapsules met DNA-plasmiden geïmmobiliseerd op het binnenoppervlak van het capsulemembraan. Het creëren van een selectief doorlaatbaar biocompatibel membraan tussen de DNA-plasmiden en de externe omgeving bewaarde het DNA tijdens langdurige opslag en speelde een belangrijke rol in de verbeterde outputrespons van ruimtelijk beperkte plasmiden. De activiteit van DNA-sjablonen en hun toegankelijkheid werden getest tijdens in vitro transcriptie- en translatiereacties (celvrije systemen). DNA-plasmiden die coderen voor RNA-oplichtende aptameren en riboswitches werden met succes geactiveerd met overeenkomstige analyten, zoals werd gevisualiseerd tijdens de lokalisatie van fluorescerend gelabelde RNA-transcripten of GFPa1-eiwit in de schaalmembranen.
Introduction
Het gebied van synthetische biologie biedt unieke mogelijkheden om detectiemogelijkheden te ontwikkelen door gebruik te maken van natuurlijke mechanismen die door micro-organismen zijn ontwikkeld om hun omgeving en potentiële bedreigingen te monitoren. Belangrijk is dat deze detectiemechanismen meestal gekoppeld zijn aan een reactie die deze micro-organismen beschermt tegen schadelijke blootstelling, genexpressie reguleert om negatieve effecten te verminderen of inname van giftige materialen te voorkomen. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om deze micro-organismen te ontwikkelen om sensoren met hele cellen te maken die profiteren van deze natuurlijke reacties, maar ze opnieuw richten om nieuwe doelen te herkennen en / of een meetbaar signaal te produceren dat kan worden gemeten voor kwantificeringsdoeleinden (meestal fluorescentie)1,2. Momenteel wijzen zorgen over het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGO's), met name bij introductie in het milieu of het menselijk lichaam, als gevolg van lekkage van hele cellen of een deel van hun genetisch materiaal, zelfs als het is ingekapseld in een polymeermatrix, erop dat alternatieve manieren nodig zijn om deze detectiebenaderingen te benutten3.
Een krachtige aanpak om de voordelen van op micro-organismen gebaseerde detectie te benutten zonder de zorg voor de inzet van GGO's is het gebruik van in vitro transcriptie/translatie (IVTT) systemen. Vanuit een praktisch perspectief bestaan IVTT-systemen uit een mengsel dat de meeste celcomponenten in een actieve toestand bevat en dat op verschillende manieren uit cellen is "geëxtraheerd", waaronder ultrasoonapparaat, kralenkloppen of andere4. Het eindproduct van dit proces is een biochemisch reactiemengsel dat al is geoptimaliseerd om transcriptie en translatie uit te voeren en dat kan worden gebruikt om verschillende sensoren in een "open vat" -formaat te testen, zonder de beperkingen die gepaard gaan met het gebruik van hele cellen (membraandiffusie, transformatie-efficiëntie, celtoxiciteit, enz.). Belangrijk is dat verschillende sensorcomponenten kwantitatief kunnen worden toegevoegd en hun effect kan worden bestudeerd door verschillende optische en spectrometrische technieken, zoals we hebben aangetoond5. Het is opgevallen dat de prestaties van IVTT-systemen inconsistent kunnen zijn; Recente studies hebben echter benaderingen aangetoond om hun voorbereiding en karakterisering te standaardiseren, wat van grote hulp is bij het bestuderen van hun prestaties in sensorontwerp6. Onlangs zijn veel voorbeelden van IVTT-systemen die worden gebruikt om op papier gebaseerde assays te maken door de lyofilisatie van hun componenten in papieren matrices gedemonstreerd, waaronder detectie van zware metaalionen, geneesmiddelen, quorumdetectie-elementen en andere 7,8,9. Een opwindende toepassingsruimte voor IVTT-gebaseerde sensoren is hun gebruik in detectietoepassingen in verschillende soorten omgevingen, waaronder bodem, water en het menselijk lichaam. Om deze IVTT-systemen in deze uitdagende omgevingen te implementeren, moet een inkapselingsbenadering worden geïmplementeerd om de IVTT-componenten te bevatten en te beschermen tegen degradatie.
De meest voorkomende inkapselingsbenaderingen voor IVTT-systemen omvatten het gebruik van lipidecapsules, micellen, polymersomen en andere nauw gesloten microcontainers10,11,12. Een nadeel van deze aanpak is de noodzaak om passieve of actieve mechanismen in te bouwen om materialen in en uit de containers te transporteren om communicatie met de externe omgeving mogelijk te maken en detectiemogelijkheden te bieden. Om enkele van deze problemen op te lossen, rapporteert de studie hier een methode die een eenvoudige maar effectieve aanpak biedt om de coderingsmaterialen voor verschillende sensorontwerpen in te kapselen die in IVTT-systemen moeten worden uitgedrukt. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van Layer-by-Layer (LbL) depositie van een biopolymeer in de aanwezigheid van de plasmiden van belang om holle microcapsules met hoge porositeit te creëren, waardoor het beschermde genetische materiaal kan interageren met de verschillende componenten van de IVTT van keuze. De studie toonde aan dat ingekapselde plasmiden transcriptie en translatie konden sturen wanneer ze binnen deze polymere matrix werden geactiveerd, zoals blijkt uit de respons van een plasmide-gecodeerde aptamer en een riboswitch op hun overeenkomstige doelen. Bovendien beschermt deze LbL-coating de plasmiden maandenlang zonder speciale bewaarcondities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Constructie van plasmidevector.
- Construeer een plasmidevector (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) door amplificatie van de coderende sequentie van een theofylline riboswitch (ThyRS) gekoppeld aan GFPa1 van pJ201:23976-RS-GFPa1 vector (ontworpen en gemaakt door DNA2.0) en insertie in E. coli expressievector, pSAL13. Gebruik voorwaartse (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') en omgekeerde (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') primers om de coderende sequentie van ThyRS in combinatie met GFPa1 te versterken en voer een PCR-reactie uit in 50 μL volume met behulp van DNA-polymerase volgens het protocol van de fabrikant14.
- Bereid een 1% agarosegel uit 0,5 g agarose, 50 ml TAE-buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA, pH 8,0) en 3 μL DNA-kleuring.
- Meng 5 μL aliquot van het PCR-versterkte product met 5 μL RNase/DNase-vrij water en 2 μL 6x gel-loading kleurstof en analyseer door agarose-gelelektroforese. Laad een DNA-ladder (0,1-10,0 kb) als referentie. Laat de gel op 120 V lopen totdat de kleurstoflijn bijna de bodem van de gel heeft bereikt.
- Visualiseer de DNA-fragmenten met behulp van een UV-transilluminator-beeldvormingssysteem om te controleren op de juiste grootte van DNA15.
- Zuiver het PCR-product met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens protocol16 van de fabrikant.
- Verwerk het PCR-product en de pSAL-expressievector met KpnI- en BlpI-restrictie-enzymen in een reactie van 15 μl, die 10 μl PCR-product of plasmidevector (concentratie 20-50 ng/μl), 1,5 μl 10x enzymbuffer, 1 μl van elk enzym en 1,5 μl RNase/DNase-vrij water bevat, bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Voeg 3 μL 6x gel-ladende kleurstof toe aan het reactiemengsel en scheid de verteerde fragmenten op een 1% agarose-gel zoals beschreven in stap 1.3-1.5.
- Zuiver de DNA-fragmenten met behulp van een gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant16.
- Ligate het verteerde PCR-product in een verteerde gelineariseerde plasmidevector, pSAL, met behulp van T4 DNA-ligase en aangevulde ligasebuffer in een 10 μL-reactie met 3-20 fmol van de verteerde vector, 9-60 fmol van het verteerde PCR-product, 2 μL ligasebuffer, 1 μL (1 eenheid) T4 DNA-ligase en DNase / RNase-vrij water. Incubeer de ligatiereactie bij 25 °C gedurende 3 uur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het totale DNA-gehalte in het reactiemengsel 0,01-0,1 μg is. - Transformeer E. coli DH5α-competente cellen met 10 ng van het ligatiereactiemengsel volgens het protocol van de fabrikant17.
- Kweek de getransformeerde cellen 's nachts bij 37 °C op LB-agarplaten aangevuld met ampicilline (100 μg/ml).
- Pluk 3-4 bacteriekolonies van de plaat en breng elk van hen aseptisch over in 5 ml LB-media aangevuld met ampicilline (100 μg / ml). Kweek de culturen 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 225 tpm.
- Pellet de nachtculturen door centrifugeren op 11 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik een zuiveringskit om de plasmiden te zuiveren volgens protocol16 van de fabrikant.
- Controleer de sequenties van de gezuiverde plasmiden door DNA-sequencing. De plasmidekaart en de volgorde van de resulterende constructie (pSALv-RS-GFPa1) zijn weergegeven in figuur 1.
2. Grootschalige DNA-zuivering.
- Transformeer de plasmidevector pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (coderend voor theofylline riboswitch gekoppeld aan GFPa1 reportergen) of pET28c-F30-2xBroccoli (5,4 kb) (coderend voor Broccoli aptamer) in E. coli DH5α competente cellen volgens het protocol van de fabrikant17.
- Kweek de getransformeerde cellen 's nachts bij 37 °C op LB-agarplaten aangevuld met ampicilline (100 μg / ml) voor cellen getransformeerd met pSALv-RS-GFPa1 of kanamycine (50 μg / ml) voor cellen getransformeerd met pET28c-F30-2x Broccoli.
- Pluk 3-4 bacteriekolonies van de plaat en breng elke kolonie aseptisch over in 5 ml LB-media aangevuld met het juiste antibioticum (100 μg / ml ampicilline of 50 μg / ml kanamycine). Kweek de culturen 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 225 tpm.
- Gebruik 3 ml van de nachtcultuur om te enten in 150 ml LB aangevuld met het juiste antibioticum (100 μg / ml ampicilline of 50 μg / ml kanamycine) en laat de culturen 's nachts groeien bij 37 ° C in een schuddende incubator bij 225 tpm.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij ≥3400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Gebruik een zuiveringskit om de plasmiden te zuiveren volgens protocol16 van de fabrikant.
- Elueer het DNA met 0,5 ml zuiver DNase/RNase-vrij water. Meet de DNA-concentratie en bereid 1 ml DNA-stockoplossingen (100 ng/μL). Bewaar de buisjes met DNA bij 4 °C tot verder gebruik.
3. Extractie van zijdefibroïne en bereiding van uitgangsmaterialen.
- Bereid een waterige oplossing van gereconstitueerd zijdefibroïne (SF) eiwit uit Bombyx mori zijderupscocons volgens de elders in detail beschreven procedure om 10% van de Silk-LiBr-oplossing18 te vertegenwoordigen.
- Bepaal de uiteindelijke concentratie van de waterige SF-oplossing. Pipetteer 0,5 ml zijdeoplossing op een petrischaal van 60 mm, laat deze drogen bij 60 °C en meet het gewicht van droge zijdefilm. Deel het drooggewicht door 0,5 ml om het gewichtspercentage per volume te berekenen.
- Verdun de geconcentreerde zijdeoplossing met DNase/RNase-vrij gedestilleerd water door langzaam water toe te voegen via een serologische pipet om een eindconcentratie van 1 mg/ml te verkrijgen. Bewaar de oplossing bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
- Bereid fluorescerend gelabelde zijdefibroïne voor met behulp van een antilichaametiketteringskit. Gebruik 1 ml 2 mg / ml zijdefibroïne-oplossing om de N-terminale α-aminogroepen van het eiwit te koppelen aan een NHS-ester-geactiveerde derivatenkleurstof volgens het protocol van de fabrikant19.
- Bereid 50 ml polyethyleenimine (PEI) waterige oplossing met een concentratie van 6 mg / ml, pas de pH aan op 4 met HCl (1 M). Filtreer de oplossing door een steriel membraan van 0,2 μm. Opslag is mogelijk bij omgevingsomstandigheden gedurende maanden.
- Bereid SiO2-kernen voor. Pipetteer 300 μL SiO2 deeltjes in een 2 ml microcentrifugebuis. Was de microdeeltjes twee keer met 1 ml DNase/RNase-vrij water door centrifugeren op 0,2 x g gedurende 1 minuut.
4. Voer laag-voor-laag afzetting uit van een priemlaag, DNA-plasmiden en zijdelagen.
- Om de PEI-primelaag op de SiO2-microdeeltjes af te zetten, voegt u 1 ml PEI-oplossing toe aan de gesponnen pellet uit stap 3.6 en roert u het mengsel onder omgevingsomstandigheden op een thermomixer bij 800 tpm gedurende 15 minuten. Was de deeltjes vier keer met 1 ml DNase/RNase-vrij gedeïoniseerd water door centrifugatie op 0,2 x g gedurende 1 minuut.
- Om de afzetting van de DNA-laag uit te voeren, voegt u 1 ml van de waterige oplossing van DNA-plasmiden uit stap 2.7 toe aan de PEI-geprimeerde microdeeltjes en roert u het mengsel voorzichtig bij 4 °C op een thermomixer bij 800 tpm gedurende 15 minuten. Om microcapsules met verschillende DNA-belastingen te bereiden, past u de concentratie DNA-plasmiden aan van 50-200 ng / μL met behulp van DNase / RNase-vrij gedestilleerd water en gebruikt u 1 ml van deze oplossingen om het DNA af te zetten. Verzamel de microdeeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 min.
- Markeer de buizen voor DNA-plasmiden die coderen voor theofylline riboswitch in combinatie met GFPa1 als ThyRS-GFPa1 en DNA-plasmiden die coderen voor Broccoli-aptamer als BrocApt.
OPMERKING: Bewaar de microcentrifugebuizen met DNA op ijs. - Verwijder het supernatant voorzichtig en was de microdeeltjes vier keer met 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water, waarbij het supernatant na centrifugatie telkens 1 minuut bij 0,2 x g wordt weggegooid. Voer alle experimenten uit bij kamertemperatuur (RT), tenzij anders aangegeven.
- Om de afzetting van de zijdevezellaag uit te voeren, voegt u 1 ml van de gereconstitueerde waterige SF-oplossing uit stap 3.3 toe aan de DNA-geadsorbeerde microdeeltjes, vortex u voorzichtig en roert u het mengsel bij 10 °C op de thermomixer bij 750 tpm gedurende 15 minuten. Verzamel de microdeeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C, verwijder het supernatant en was ze vervolgens eenmaal met 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water. Herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg.
OPMERKING: Houd tijdens het experiment de oplossing van zijde op ijs om temperatuurgeïnduceerde gelatie te voorkomen. - Behandel de deeltjes geleidelijk met methanol om β-sheet vorming in zijde-eiwitstructuur te induceren. Voeg eerst 0,5 ml DNase / RNase gedestilleerd water toe, vortex de microcentrifugebuis en voeg vervolgens 0,5 ml 100% methanol toe. Schud de deeltjes op de thermomixer voorzichtig bij 10 °C gedurende 5 minuten. Verzamel de deeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
- Behandel de deeltjes met methanol om de vorming van β-sheets te bevorderen en zorg voor een sterke fysieke adsorptie van de zijdelaag. Voeg 1 ml 100% methanol toe. Schud de deeltjes op de thermomixer voorzichtig bij 750 rpm gedurende 10 minuten bij 10 °C.
- Verzamel de deeltjes door centrifugeren bij 0,2 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C en was ze tweemaal met 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water elke keer, gooi het supernatant weg en draai voorzichtig voor de volgende centrifugatie.
- Herhaal stap 4,5-4,8 20 keer om zijde meerlaagse kernschaalstructuren te verkrijgen. Gebruik voor de laatste depositiestap fluorescerend gelabelde zijde uit stap 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
- Voer de laatste wasstap uit en bewaar de microdeeltjes in 1 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water onder omgevingsomstandigheden.
OPMERKING: Om aggregatie van deeltjes tijdens afzetting van zijdelagen te voorkomen, voert u een visuele inspectie uit van de deeltjessuspensie en pipet u deze op en neer met behulp van een pipetpunt van 1 ml om de homogene deeltjesverdeling te bevorderen. - Bereken het aantal DNA-plasmidekopieën ingekapseld in elke microcapsule, N-DNA met behulp van vergelijking 1:
(1)
Waarbij N = 6,769 × 1011 - het aantal SiO 2-kernen dat wordt gebruikt voor inkapseling. Bereken het uit een standaardcurve voor bekende concentraties van silicadeeltjes met behulp van seriële verdunningen en absorptie A 320 bij λ =320 nm;
C- initiële concentratie van DNA gebruikt voor adsorptie
V- het volume DNA dat wordt gebruikt voor adsorptie
0.8- DNA-adsorptie-efficiëntie op de kernen
Mw- Molecuulgewicht van DNA-plasmide
NA- Avogadro's nummer (6.022 × 1023)
(1)5. Oplossen van kernen om zijden microcapsules te verkrijgen.
- Bereid 8% fluorwaterstofzuur (HF) oplossing, pH 5,5, door stockoplossing (48%) te verdunnen met gedestilleerd water. Schaf een centrifugebuis van 50 ml aan. Pipet voorzichtig 5 ml HF en voeg 25 ml gedestilleerd water toe om 8% HF-oplossing te verkrijgen.
LET OP: HF is een zeer corrosief zuur en kan ernstige brandwonden aan de weefsels veroorzaken. Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het hanteren en gebruiken van HF voor de experimenten. Houd u aan de Standard Operating Procedure (SOP) voor het juiste gebruik en de juiste behandeling van HF die door de organisatie is ontwikkeld om ongewenste ongevallen met morsen te voorkomen. Gebruik geen glazen containers om HF-zuur te verdunnen. Gebruik de chemische kap om deze stap van het protocol uit te voeren. - Los SiO2-kernen op door 1,5 ml 8% HF-oplossing toe te voegen aan gepelleteerde kern-schil microdeeltjes uit stap 4.10. Draai zachtjes en laat kernen 's nachts oplossen onder omgevingsomstandigheden met zacht schudden bij 450 tpm.
OPMERKING: Om morsen van HF te voorkomen, gebruikt u enttape om de microcentrifugebuis af te dichten. Gebruik een chemische kap om deze stap van het protocol uit te voeren. - Bereid een glazen bekerglas van 2 L gevuld met 2 L gedeïoniseerd water. Breng microcapsules-oplossing over naar dialyseapparaten (50 kDa MWCO) en dialyseer ze tegen gedeïoniseerd water met een herhaalde verandering van het water om de 3 uur gedurende de volgende 3 dagen.
OPMERKING: Verzamel het supernatant tijdens de eerste drie uitwisselingen van water en gooi de oplossing weg volgens het vastgestelde protocol voor gevaarlijke afvalstoffen. - Gebruik een pipet van 1 ml om de suspensie van dialyseapparaten over te brengen naar nieuwe microcentrifugebuizen van 2 ml om de microcapsules op te vangen.
OPMERKING: Bewaar de waterige oplossingen van microcapsules gedurende meerdere jaren onder omgevingsomstandigheden.
6. Beeldvorming van zijde fibroïne microcapsules met behulp van confocale laser scanning microscoop (CLSM).
- Voer DNA-kleuring uit met behulp van een DNA-kleurstof.
- Breng 300 μL holle zijde fibroïne microcapsules over in een verse microcentrifugebuis van 1 ml. Voeg 500 μL RNase/DNase-vrij gedestilleerd water toe.
- Voeg 5 μL van de DNA-kleurstof toe, kort vortex, en incubeer bij RT gedurende 2 uur beschermd tegen licht.
- Voer vier wasstappen uit door te centrifugeren bij 0,1 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C elke keer, waarbij voorzichtig 400 μL van het supernatant wordt verwijderd en aangevuld met 400 μL RNase/DNase-vrij gedestilleerd water.
- Voer de beeldvorming van zijden capsules uit op omgekeerde confocale systemen die zijn uitgerust met drie grote lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm) met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief van 100x (NA 1,49). Breng 100 μL van het capsulemonster over in een enkele put van 8-goed gekamerde glasglaasjes, laat capsules 20-30 minuten bezinken voordat ze worden afgebeeld.
OPMERKING: Kleurstoffen zijn erg gevoelig voor fotobleaching. Bescherm de monsters door de dia's af te dekken met aluminiumfolie.
7. Schatting van de permeabiliteit van holle microcapsules met behulp van de MWCO-methode (Molecular weight cut-off).
- Bereid 2 ml elk van FITC-gelabelde dextran fluorofooroplossingen (20 μM, diH 2 O) van verschillende Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa en2MDa).
- Pipetteer 100 μL van de suspensie van capsules in een enkele put van een glazen schuifplaat. Analyseer elk microcapsuleontwerp (PEI-concentratie, laadaantal DNA-plasmiden, de concentratie van zijdefibroïne en het aantal lagen) afzonderlijk.
- Voeg aan elke put 300 μL van de specifieke fluorofooroplossing toe vanaf de laagste Mw tot de hoogste, zodat elke put overeenkomt met de specifieke fluorofooroplossing. Meng door op en neer te pipetteren en laat het mengsel gedurende 1 uur bij RT incuberen totdat de diffusie van fluorofooroplossingen in evenwicht is.
- Breng de dia over naar een confocale laserscanmicroscoop (CLSM) en beeld elke put af met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief van 100x bij excitatie λ = 488 nm.
- Identificeer het interessegebied door het brandpuntsvlak aan te passen om ervoor te zorgen dat de capsules verschijnen in de vorm van cirkels met de grootste diameter. Dit gebeurt meestal bij het bekijken van de monsters dichter bij de bodem van de put wanneer capsules sediment als gevolg van de zwaartekracht.
- Verzamel verschillende afbeeldingen van microcapsulemonsters door de dia in XY-richting te bewegen. Leg afbeeldingen vast om rekening te houden met maximaal 100-150 capsules voor elk monster.
- Gebruik ImageJ-software om de permeabiliteit van het membraan van de capsule in elkeM-w fluorofooroplossing te analyseren door fluorescentie-intensiteiten binnen en buiten de capsules te vergelijken. Teken daarvoor een interessegebied (ROI) in de vorm van een cirkel om de omtrek van de capsule te schetsen en klik op Analyseren / Meten om de fluorescentie-intensiteit binnenin te meten. Tabel de gegevens in een spreadsheet. Voer deze bewerking uit voor elke microcapsule voor een totaal van 200-300 capsules.
- Beoordeel de fluorescentie-intensiteit van buitenaf op dezelfde manier door de ROI te schetsen en de intensiteit buiten de capsules te meten. Voer 3-5 metingen uit voor statistische analyse.
- Om statistische analyse uit te voeren, vergelijkt u de fluorescentie-intensiteiten binnen en buiten de capsules met behulp van een gepaarde t-test (p < 0,05).
- Gebruik de conversietabel 2 om de permeabiliteit van microcapsules te schatten op basis van de hydrodynamische radii voor FITC-Dextran met variabele Mw.
8. In vitro activering van synthetische theofylline riboswitch in zijden microcapsules
- Bereid 1 ml theofylline stockoplossing (100 mM, DMSO). Bereid het E. coli S30-extractsysteem voor circulair DNA door de componenten gedurende 40 minuten op ijs te ontdooien.
- Verkrijg een 0,5 ml DNase/RNase-vrije microcentrifugebuis. Voer in vitro transcriptie/translatiereactie uit, combineer de celvrije componenten met een monster van microcapsules in de volgende volgorde (50 μL totaal volume): S30 premix zonder aminozuren (20 μL); S30-extract, cirkelvormig (15 μL); compleet aminozurenmengsel (5 μL); holle microcapsules met ThyRS-GFPa1-plasmiden uit stap 4.10 (9 μl); en theofylline, 100 mM DMSO (1 μL).
OPMERKING: Nadat u alle componenten hebt toegevoegd, draait u de buis kort en verzamelt u het monster tijdens een korte centrifugatie bij 0,2 × g gedurende een paar seconden. - Incubeer de buis bij 30 °C gedurende 4 uur en controleer de fluorescentie op een plaatlezer met behulp van excitatie bij λ = 488 nm en emissie bij GFP/FITC-filter (510 nm ± 20 nm).
- Beeld de capsules op elk LCSM-systeem met behulp van 488 nm- en 561 nm-lasers. Verkrijg beelden van de beste kwaliteit met behulp van een 100x olie-onderdompelingsobjectief en 8-goed gekamerde dia's.
9. In vitro activering van broccoli aptamer in zijde microcapsules
- Bereid 1 ml stamoplossing van DFHBI-1T-kleurstof (30 μM, diH2O). Bereid de PURE (eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen) celvrije systeemreactiekit door de componenten gedurende 40 minuten op ijs te ontdooien.
- Verkrijg een 0,5 ml DNase/RNase-vrije microcentrifugebuis. Voer in vitro transcriptiereactie uit door celvrije reactiecomponenten te combineren met een monster van microcapsules in de volgende volgorde (50 μL totaal volume): oplossing A (20 μL); oplossing B (15 μL); holle microcapsules met BrocApt-plasmiden uit stap 4.10 (14 μl); en DFHBI-1T kleurstof (1 μL).
OPMERKING: Nadat u alle componenten hebt toegevoegd, draait u de buis kort en verzamelt u het monster tijdens een korte centrifugatie bij 0,2 × g gedurende een paar seconden. - Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 6 uur en controleer de fluorescentie op een plaatlezer met behulp van excitatie bij λex = 470 nm en emissie bij λem = 510 nm ± 20 nm.
- Beeld de capsules op elk LCSM-systeem met behulp van 488 nm- en 561 nm-lasers. Verkrijg beelden van de beste kwaliteit met behulp van een 100x olie-onderdompelingsobjectief en 8-well coverglass chambered slides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier richt de studie zich op de functionaliteit van DNA-sjablonen die coderen voor verschillende sensorontwerpen (twee soorten RNA-gereguleerde transcriptie / translatie-elementen) na inkapseling in zijden eiwitcapsules. Microcapsules werden bereid via templated Layer-by-Layer (LbL) assemblage van de belangrijkste componenten: een prime-laag, DNA-plasmiden die sensorontwerpen coderen en zijdefibroïnebiopolymeer (figuur 2). Depositie van macromoleculen op een gelaagde manier maakt het mogelijk om de permeabiliteit van het capsulemembraan te regelen op basis van inter- en intramoleculaire interacties tussen de geabsorbeerde lagen en de dikte van de schaal. De instelbare permeabiliteit van het systeem bood het potentieel om de diffusie van essentiële moleculen te beheersen en tegelijkertijd de diffusie van grote ongewenste macromoleculen door het capsulemembraante beperken 20.
Homogeen in grootte (4,5 μm) en robuuste zijdefibroïne microcapsules met een schaaldikte van ~ 500 nm (20 lagen) in een gehydrateerde toestand kunnen worden geproduceerd wanneer het protocol correct wordt gevolgd (figuur 3) 21. De LbL-benadering maakte het mogelijk om de laadcapaciteit van DNA-sjablonen af te stemmen op basis van de initiële concentratie van de plasmiden. De optimale DNA-belasting kan worden bereikt door de initiële concentratie van DNA-sjablonen te variëren van 50-200 ng / μL. Tabel 1 vertegenwoordigt het aantal DNA-kopieën dat in een enkele microcapsule wordt bewaard na voltooiing van LbL-inkapseling en werd berekend voor elk sensorontwerp op basis van de initiële DNA-concentraties en Mw van DNA-plasmiden volgens vergelijking 1. De optimale DNA-laadcapaciteit werd bereikt met respectievelijk 32 en 20 DNA-kopieën voor ThyRS- en BrocApt-sensorontwerpen. De beoordeling van de laadcapaciteit was belangrijk om een nauwkeurige schatting te hebben van de ingekapselde DNA-concentraties om deze te kunnen titreren tijdens IVTT-activering van de sensoren door meer geconcentreerde capsulemonsters toe te voegen.
De permeabiliteit van de capsulehulzen kan systematisch worden geanalyseerd door de MWCO-methode te volgen. De methode schat de poriegrootte van het membraan op basis van het molecuulgewicht van opgeloste moleculen die niet door het capsulemembraan konden dringen. Door microcapsules te onderwerpen aan variabeleM-w fluorofoormoleculen en confocale beeldvorming uit te voeren in het brandpuntsvlak dat overeenkomt met de grootste diameter over meerdere capsules, kan de permeabiliteit van de schaalmembranen worden beoordeeld. ImageJ-analyse maakt het mogelijk om de fluorescentie-intensiteiten binnen en buiten de capsules te schatten en volledig permeabele (buiten en binnen fluorofoorintensiteiten waren vergelijkbaar), gedeeltelijk permeabel (50% -70% van de capsules had een lagere fluorescentie binnen in vergelijking met buiten) en niet-permeabele (binnen fluorofoorintensiteit was lager in vergelijking met buitenintensiteit) membranen te identificeren (figuur 4). Door Mw om te zetten in hydrodynamische straal voor elke fluorofoor kan de maaswijdte van het capsulemembraan worden geschat (tabel 2).
Selectieve permeabiliteit van eiwitcapsules kan worden bereikt tijdens systematische optimalisatie van het LbL-depositieprotocol door gebruik te maken van variabele concentraties van een priemlaag (van 0-6 mg / ml), de concentratie van een zijdefibroïne (van 0,5-2 mg / ml) en het aantal afgezette lagen (van 10-25) totdat optimale permeabiliteit is bereikt. In dit protocol werd optimale permeabiliteit tussen 25-32 nm bereikt met 6 mg / ml PEI als eerste laag en 20 lagen van 1 mg / ml zijdefibroïne afgezet tijdens LbL-assemblage (figuur 4). Dit permeabiliteitsbereik was ideaal voor de componenten van het IVTT-systeem om door de capsuleschaal te sijpelen. Typisch, de grootste moleculaire complexen van elk IVTT-systeem zijn prokaryote ribosomale eenheden, 30S en 50S, die, wanneer gebonden door mRNA in een ribosomaal complex, kunnen bereiken tot ~ 20 nm in grootte22. De structuur van de ontwikkelde microcapsules-schalen lijkt op een sterk verweven netwerk van zijdevezellagen die fysiek zijn verknoopt door blokken met β vellen die tijdens de assemblage van LbL worden geproduceerd. Deze membraanstructuur is semi-permeabel: zeer doorlaatbaar voor kleine moleculen (bijv. Ionen, aminozuren, peptiden, suikers, enz.) en beperkt tot grote moleculen (bijv. Eiwitten met een hoog molecuulgewicht, glycoproteïnen, cellen, enz.) die alleen percolatie van moleculen met een hydrodynamische straal van minder dan 25 nm mogelijk maken. Vandaar dat zijdefibroïnemicrocapsules met optimale DNA-belasting en membraanpermeabiliteit kunnen worden gebruikt als bioreactordragers voor IVTT-activering.
De transcriptionele en translationele activiteit van ThyRS- en BrocApt-ontwerpsensoren kan worden getest met behulp van in de handel verkrijgbare IVTT-systemen. ThyRS vereist translationele activering van het reportergen in aanwezigheid van theofyllineligand. Activering van synthetische ThyRS omvat verschillende stappen om genexpressie te initiëren, waaronder mRNA-synthese, de conformatieverandering van mRNA-sequentie bij binding aan de analyt, afgifte van de ribosoombindingsplaats en de synthese van het reporter GFPa1-eiwit. Al deze stappen vereisen vrije diffusie van de IVTT-componenten door het capsulemembraan. Het voorgestelde ontwerp van met DNA beladen zijden fibroïnemicrocapsules verbeterde de activeringsparameters van RNA-gereguleerde sensorontwerpen: zowel de expressiekinetiek als de fluorescentie-output waren significant hoger in vergelijking met het vrije niet-geïmmobiliseerde DNA (figuur 5A). De CLSM-beeldvorming bevestigde ook succesvolle GFPa1-genactivering in capsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor ThyRS-sequenties (figuur 5B-D).
Als alternatief werd de activering van het BrocApt-sensorontwerp uitgevoerd in het IVTT-systeem dat T7 E. coli-promotor gekoppelde transcriptie / translatie ondersteunt in aanwezigheid van DHFBI-1T-kleurstof . De fluorescentie-output werd geïnitieerd na binding van de fluorogene kleurstof aan de mRNA-sequentie. Belangrijk is dat het uitgangssignaal van zijden microcapsules enkele vouwen hoger was in vergelijking met niet-ingekapselde DNA-monsters van equivalente concentraties (figuur 6). Daarom kunnen zijden fibroïnemicrocapsules de essentiële functionaliteit van DNA-gecodeerde sensorelementen behouden, wat belangrijk kan zijn voor het ontwerp van nieuwe soorten in vitro biosensorplatforms voor snelle en gevoelige detectie van interessante analyten.
Figuur 1: Plasmidekaart en sequentie van pSALv-RS-GFPa1 . (A) Het plasmide bevat theofylline riboswitch (ThyRS) sequentie geplaatst stroomopwaarts van GFPa1 coderend gen onder de controle van ptac promotor, β-lactamase (bla) coderend gen dat verantwoordelijk is voor resistentie tegen ampicilline. (B) De ptac-promotorsequentie wordt vetgedrukt en onderstreept weergegeven; Theofylline riboswitch sequentie wordt weergegeven in vet cursief; GFPa1-coderingsvolgorde wordt vetgedrukt weergegeven; De reeksen van restrictiesites zijn onderstreept. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de bereiding van microcapsules met behulp van de Layer-by-Layer benadering. Ongerepte SiO2-kernen werden eerst gefunctionaliseerd met PEI-polymeer, gevolgd door de sequentiële afzetting van DNA-plasmiden die coderen voor verschillende sensorontwerpen en zijdefibroïnelagen totdat het gewenste aantal zijde-eiwitlagen is geadsorbeerd. Holle ongerepte microcapsules met verschillende DNA-sensorontwerpen kunnen worden geproduceerd door opofferingskernen op te lossen. Activering van elk biosensorontwerp ingekapseld in de microcapsule kan worden bereikt tijdens IVTT-reacties in aanwezigheid van overeenkomstige liganden. Deze figuur is herdrukt uit Drachuk, I. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microscopiestudies voor DNA-geladen microcapsules. (A) Cross-sectionele 2D en (B) Gerenderde 3D confocale microscopiebeelden van holle (SF)20 microcapsules geladen met DNA-plasmiden die coderen voor ThyRS (32 DNA-kopieën/capsule) en geproduceerd uit 6 mg/ml PEI-geprimeerde SiO2-kernen. Autofluorescentie van zijden fibroïnecapsules (DAPI-kanaal, blauw) en gekleurd DNA (FITC-kanaal, groen) werden toegepast om de lokalisatie van DNA-plasmiden te identificeren en de dikte van het capsulemembraan te schatten. Inzet in (A) vertegenwoordigt intensiteitsprofielen voor DNA- en zijdefibroïneschelpen over de capsule. Schaalbalk: 2 μm. Inzet in (B) vertegenwoordigt het intensiteitsprofiel voor zijde-eiwit over de capsulehuls. Membraandikte werd gemeten als de lengte bij halve intensiteitspiek. De verwerking van de dwarsdoorsnedebeelden en 3D-rendering werd uitgevoerd met behulp van NIS-beeldvormingssoftware op het Nikon C2+ systeem. Deze figuur is herdrukt uit Drachuk, I. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schatting van de membraandoorlaatbaarheid voor zijden microcapsules met behulp van de MWCO-methode. Selectieve CLSM-representatieve fluorescerende beelden van holle zijdefibroïnemicrocapsules onderworpen aan FITC-Dextrans-oplossingen van verschillende Mw (20 μM, diH2O). Capsules werden bereid met een verschillend aantal lagen en PEI-concentraties. Een toename van de concentratie van een priemlaag leidt tot een verhoogde colloïdale stabiliteit van microcapsules met meer doorlaatbare schillen, terwijl de eliminatie van de priemlaag aggregatie van capsules met minder doorlaatbare schaalmembranen veroorzaakt. Schaalbalk: 5 μm. Deze figuur is herdrukt uit Drachuk, I. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Activering van ThyRS-sensorontwerp in silk fibroin microcapsules. (A) Kinetiek voor GFPa1-expressie tijdens ThyRS-activering van DNA-plasmiden geladen in 20-laagse SF-microcapsules (roodgekleurde lijnen) en controle niet-ingekapseld DNA (blauwgekleurde lijnen). Van boven naar beneden waren de concentraties DNA in een monstervolume (50 μL) 6,5 ng/μL, 4,5 ng/μL, 2,5 ng/μL en 0 ng/μL en komen overeen met de veranderingen in kleurintensiteiten. (B) CLSM-afbeeldingen van zijden fibroïnecapsules geladen met 32 DNA-kopieën per capsule. Schaalbalk: 5 μm. (C) Het beeld komt overeen met dwarsdoorsnede-intensiteitsprofielen die overeenkomen met afbeelding (B) over twee capsules (witte lijn in B). De rode lijn vertegenwoordigt zijden capsules en de groene lijn vertegenwoordigt GFPa1 uitgedrukt in capsules. (D) De afbeelding toont gerenderde 3D-zijden capsules geladen met 32 kopieën van DNA na incubatie in het IVTT-systeem. Groene fluorescentie komt overeen met het GFPa1-signaal en rode fluorescentie komt overeen met fluorescerend gelabelde zijdelagen. Schaalbalk: 2 μm. ThyRS-activering werd uitgevoerd met theofylline (2 mM, DMSO) tijdens de incubatie van microcapsules in het IVTT-systeem (S30-extract). Deze figuur is herdrukt uit Drachuk, I. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Activering van BroccApt in silk fibroin microcapsules. Vergelijking van transcriptiekinetiek werd uitgevoerd voor 20-laagse zijden microcapsules geladen met 30 DNA-kopieën per capsule (roodgekleurde lijnen) en controle niet-ingekapseld DNA (blauwgekleurde lijnen). Van boven naar beneden waren de concentraties ingekapseld DNA in een monster: 3,6 ng/μL, 2 ng/μL, 1 ng/μL en 0 ng/μL en komen overeen met de veranderingen in kleurintensiteiten. Concentraties van niet-ingekapseld DNA waren: 20 ng/μL, 10 ng/μL, 5 ng/μL en 0 ng/μL en komen overeen met de veranderingen in kleurintensiteiten. Activering werd uitgevoerd met DHBFI-1T (100 μM, diH2O) tijdens incubatie in het PURE celvrije systeem. Deze figuur is herdrukt uit Drachuk, I. et al.21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| DNA-sensorontwerp | Initiële DNA-concentratie (ng/μL) | Aantal DNA-kopieën per capsule (DNA/capsule) |
| 50 | 16 | |
| ThyRS | 100 | 32 |
| 150 | 48 | |
| 200 | 64 | |
| 50 | 10 | |
| BrocApt | 100 | 20 |
| 150 | 30 | |
| 200 | 40 |
Tabel 1: DNA-kopienummer per capsule voor elk DNA-ontwerp. Het kopienummer werd berekend volgens vergelijking 1 en was gecorreleerd aan de initiële concentratie van DNA-plasmiden, retentieaffiniteit van DNA-sequenties tijdens het LbL-depositieproces en de lengte van DNA-plasmiden.
| Mw van FITC-Dextran (kDa) | Hydrodynamische straal (nm) |
| 4 | 1.4 |
| 20 | 3.3 |
| 40 | 4.5 |
| 70 | 6 |
| 150 | 8.5 |
| 250 | 10 |
| 500 | 14 |
| 2,000 | 18 |
Tabel 2: Fysische eigenschappen van FITC-dextrans. Hydrodynamische straal voor elke fluorofoor werd gebruikt om de permeabiliteit van holle zijdefibroïnemicrocapsules te schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selectief doorlatende hydrogel-microcapsules geladen met verschillende soorten DNA-gecodeerde sensorontwerpen kunnen volgens dit protocol worden bereid. Een van de onderscheidende kenmerken van de LbL-benadering is het vermogen om de complexiteit van microcapsules aan te passen tijdens de bottom-up assemblage, die meestal begint met de adsorptie van moleculaire soorten op offersjablonen. Door de concentraties van de initiële componenten, pH-omstandigheden en het aantal lagen zorgvuldig aan te passen, kunnen microcapsules met verschillende DNA-belastingsparameters, functionaliteit en instelbare permeabiliteit worden bereid23. Om de veelzijdigheid van de capsules te versterken, kan verdere functionalisering van het schaaloppervlak met AuNPs en IgG worden bereikt om biocompatibele sensordragers voor in vivo diagnostiek te implementeren. Beide alternatieve routes zijn afhankelijk van de unieke moleculaire structuur van de zijdefibroïne. In situ reductie van Au3+ ionen kan worden bereikt door de aanwezigheid van tyrosineresiduen (5,3% mol.) die metaalionen kunnen reduceren in aanwezigheid van een optimale reductiebuffer. De conjugatie van specifieke antilichamen aan het oppervlak van AuNPs-gefunctionaliseerde eiwitmicrocapsules kan worden gedaan via de implementatie van carbodiimide-activeringschemie. Beide stappen vereisen een zorgvuldige ontwikkeling en optimalisatie van het protocol om de juiste functionaliteit van de biosensorcapsules voor toekomstige toepassingen te bereiken. Om deze microcapsules bijvoorbeeld te gebruiken als "slimme" toedieningssystemen, waarbij een moleculaire lading wordt afgeleverd op specifieke stimuli (zoals pH of chemische signalen), moeten specifieke eigenschappen van deze capsules worden gekarakteriseerd en afgestemd, waaronder leveringsefficiëntie, retentietijd, toedieningsweg en ziektemodelbehandelingen.
De DNA-geladen microcapsules werden gekenmerkt door de CLSM-techniek en fluorescentiemetingen. Andere karakteriseringsmethoden zoals atoomkrachtmicroscopie (AFM), cryogene elektronentomografie (CEM) en directe stochastische reconstructie superresolutiemicroscopie (dSTORM) kunnen echter worden toegepast om specifieke structuren van de microcapsules te differentiëren, inclusief individuele vezels, nanodomeinen en lokalisatie van DNA-plasmiden24,25,26.
Het ontwikkelde protocol benadrukt het gebruik van zijdefibroïnebiopolymeer als een biocompatibel netwerkmateriaal dat de tertiaire structuur van geladen DNA-plasmiden behoudt. De stabiliteit van geïmmobiliseerde DNA-sequenties binnen het zijdefibroïnenetwerk vindt plaats via hydrofobe interacties en / of waterstofbinding, die een beschermende micro-omgeving bieden tegen pH-inactivatie, oxidatie of hydrolyse27. Bovendien bieden de β-kristallijne domeinen van zijdefibroïne een unieke mechanische barrière, waardoor de beweging van ingesloten macromoleculen wordt beperkt en wordt voorkomen dat DNA-plasmiden worden afgebroken tijdens opslag in waterige oplossingen.
De semi-permeabele aard van zijdefibroïnemicrocapsules geladen met DNA-sjablonen creëerde unieke ruimtelijke en fysisch-chemische omstandigheden voor de IVTT-reacties. Transcriptioneel en translationeel geactiveerd RNA-aptameer en riboswitch geïmmobiliseerd in zijden fibroïnemicrocapsules waren in staat om een uitgangssignaal te produceren dat minstens drie keer hoger was in vergelijking met vrije niet-geïmmobiliseerde sensoren. Bovendien kan de immobilisatie van DNA-sjablonen in microcapsules de activiteit van ingekapselde sensoren aanzienlijk verbeteren tot voorbij de detectielimiet van niet-ingekapselde sensoren. Terwijl niet-ingekapselde sensoren een minimale respons hadden bij lage DNA-concentraties, hadden de ingekapselde sensoren een zeer duidelijke outputrespons, die gemakkelijk kan worden getitreerd om de subtiele veranderingen in DNA-concentraties weer te geven. Het verbeterde responssignaal van ingekapselde reporters was waarschijnlijk te wijten aan onbeperkte diffusie van de componenten van IVTT-machines en verminderde mobiliteit van DNA-plasmiden. Verschillende studies hebben erkend dat de opbrengst van eiwitsynthese in celvrije reacties afhankelijk is van de macromoleculaire omgeving28,29. Immobilisatie van DNA-plasmiden in het zijdenetwerk zorgde voor een effectieve besloten omgeving die de beweging van oligonucleotiden beperkte en de reacties van transcriptie- / translatiemechanismen versnelde, zelfs van verschillende DNA-kopieën21.
Hoewel de LbL-methode een zeer veelzijdige benadering biedt om multifunctionele assemblages op een controleerbare manier te construeren, is de fabricageprocedure relatief tijdrovend en vereist het meestal verwerkingsaanpassingen om de opbrengst van microcapsules op te schalen. Een andere overweging bij het maken van op biomoleculen gebaseerde microcapsules is de compatibiliteit van een bepaald systeem met de vereiste voor het oplossen van de kern nadat de LbL-afzetting is voltooid. Tot nu toe, om homogene en robuuste holle op zijde gebaseerde DNA-beladen microcapsules te produceren, werden de schelpen afgezet op opofferingssilica (SiO2) kernsjablonen, die vervolgens moesten worden verwijderd door fluorwaterstof (HF) zuuretsen. Noch HF-handling of etsen worden beschouwd als biocompatibele processen, waardoor hun wijdverbreide gebruik in praktische toepassingen wordt beperkt. Het alternatief voor SiO2 anorganische colloïdale sjablonen, carbonaatkernen zijn meestal inert in het vormen van complexen met polymeerlagen en kunnen onder milde omstandigheden worden opgelost met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Het aanpassen van opofferingskernen kan echter de depositie-eigenschappen van meerdere lagen en de integriteit van de schaalstructuur beïnvloeden, wat verdere optimalisatie van het protocol vereist.
Kortom, het huidige protocol maakt de bereiding mogelijk van op zijde gebaseerde DNA-beladen microcapsules met verschillende sensorontwerpen. De combinatie van een beperkte micro-omgeving door de LbL-methode en het gebruik van zijdefibroïne als biocompatibel materiaal verbeterde de detectie-eigenschappen van ingekapseld DNA. Met de snelle ontwikkeling van fluorogene RNA-aptamertechnologie kan het potentiële gebruik van met DNA beladen zijden microcapsules worden uitgebreid tot multiplexed in vitro diagnostiek. Onlangs zijn verschillende variaties van op RNA gebaseerde fluorescerende aptameren naar voren gekomen als krachtige achtergrondvrije technologie voor het afbeelden van RNA in levende cellen met een hoge signaal-ruisverhoudingsgevoeligheid30,31. Door synthetische RNA-nanotechnologie toe te passen om kunstmatige RNA-aptameren te ontwerpen, kunnen de fluorogene eigenschappen van aptameren worden benut om specifieke liganden van belang te detecteren. Deze technologie zal specifiek waardevol zijn om biomarkers van belang te monitoren in verschillende formaten, waaronder point-of-use op papier gebaseerde sensoren, op hydrogel gebaseerde patches voor zweet of interstitiële vloeistof en implanteerbare materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De standpunten en meningen die hierin worden gepresenteerd, zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van DoD of zijn componenten
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door LRIR 16RH3003J-subsidie van het Air Force Office of Scientific Research, evenals het Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programma van het Amerikaanse kantoor van de onderminister van Defensie voor Onderzoek en Engineering.
De plasmidevectorsequentie voor ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) werd genereus verstrekt door Dr. J. Gallivan. Zijderupsen cocons van Bombyx mori werden genereus gedoneerd door Dr. D.L. Kaplan van Tufts University, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N.
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
