Summary
El protocolo describe la formación de microcápsulas robustas y biocompatibles cargadas de ADN como biosensores in vitro multiplexados capaces de rastrear varios ligandos.
Abstract
Introducimos un protocolo para la preparación de microcápsulas de fibroína de seda cargadas de ADN a través del método de ensamblaje capa por capa (LbL) en núcleos esféricos de sacrificio. Después de la adsorción de una capa primaria y plásmidos de ADN, la formación de microcápsulas robustas se facilitó mediante la inducción de hojas de β en la estructura secundaria de seda durante la deshidratación aguda de una sola capa de seda. Por lo tanto, la estratificación se produjo a través de múltiples enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Tras la adsorción de conchas multicapa, las estructuras núcleo-cáscara se pueden funcionalizar aún más con nanopartículas de oro (AuNP) y / o anticuerpos (IgG) para ser utilizados para la teledetección y / o la entrega dirigida. El ajuste de varios parámetros clave durante la deposición secuencial de macromoléculas clave en núcleos de sílice, como la presencia de un cebador de polímero, la concentración de ADN y proteína de seda, así como una serie de capas adsorbidas, dio como resultado microcápsulas biocompatibles y cargadas de ADN con permeabilidad variable y cargas de ADN. Tras la disolución de los núcleos de sílice, el protocolo demostró la formación de microcápsulas huecas y robustas con plásmidos de ADN inmovilizados a la superficie interna de la membrana de la cápsula. La creación de una membrana biocompatible selectivamente permeable entre los plásmidos de ADN y el entorno externo preservó el ADN durante el almacenamiento a largo plazo y desempeñó un papel importante en la respuesta de salida mejorada de plásmidos confinados espacialmente. La actividad de las plantillas de ADN y su accesibilidad se probaron durante la transcripción in vitro y las reacciones de traducción (sistemas libres de células). Los plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de iluminación de ARN se activaron con éxito con los analitos correspondientes, como se visualizó durante la localización de transcripciones de ARN marcadas con fluorescencia o proteína GFPa1 en las membranas de la cáscara.
Introduction
El campo de la biología sintética ofrece oportunidades únicas para desarrollar capacidades de detección mediante la explotación de mecanismos naturales evolucionados por microorganismos para monitorear su entorno y amenazas potenciales. Es importante destacar que estos mecanismos de detección suelen estar vinculados a una respuesta que protege a estos microorganismos de la exposición dañina, regulando la expresión génica para mitigar los efectos negativos o prevenir la ingesta de materiales tóxicos. Ha habido esfuerzos significativos para diseñar estos microorganismos para crear sensores de células completas aprovechando estas respuestas naturales, pero redirigiéndolas para reconocer nuevos objetivos y / o producir una señal medible que pueda medirse con fines de cuantificación (típicamente fluorescencia)1,2. Actualmente, las preocupaciones con el uso de microorganismos genéticamente modificados (OGM), especialmente cuando se liberan en el medio ambiente o en el cuerpo humano, debido a la fuga de células enteras o parte de su material genético, incluso si están encapsulados en una matriz polimérica, sugieren que se necesitan formas alternativas de explotar estos enfoques de detección3.
Un enfoque poderoso para explotar los beneficios de la detección basada en microorganismos sin la preocupación por el despliegue de OMG es el uso de sistemas de transcripción/traducción in vitro (IVTT). Desde una perspectiva práctica, los sistemas IVTT consisten en una mezcla que contiene la mayoría de los componentes celulares en un estado activo que ha sido "extraído" de las células por diferentes medios, incluyendo sonicación, bala u otros4. El producto final de este proceso es una mezcla de reacción bioquímica ya optimizada para realizar la transcripción y traducción que se puede utilizar para probar diferentes sensores en un formato de "recipiente abierto", sin las restricciones asociadas con el uso de células enteras (difusión de membrana, eficiencia de transformación, toxicidad celular, etc.). Es importante destacar que se pueden agregar cuantitativamente diferentes componentes del sensor y estudiar su efecto mediante diferentes técnicas ópticas y espectrométricas, como hemos demostrado5. Se ha observado que el rendimiento de los sistemas IVTT puede ser inconsistente; Sin embargo, estudios recientes han mostrado enfoques para estandarizar su preparación y caracterización, lo cual es de gran ayuda al estudiar su desempeño en el diseño de sensores6. Recientemente, se han demostrado muchos ejemplos de sistemas IVTT utilizados para crear ensayos basados en papel a través de la liofilización de sus componentes en matrices de papel, incluida la detección de iones de metales pesados, medicamentos, elementos de detección de quórum y otros 7,8,9. Un espacio de aplicación emocionante para los sensores basados en IVTT es su uso en aplicaciones de detección en diferentes tipos de entornos, incluidos el suelo, el agua y el cuerpo humano. Para implementar estos sistemas IVTT en estos entornos desafiantes, se debe implementar un enfoque de encapsulación para contener los componentes IVTT y protegerlos de la degradación.
Los enfoques de encapsulación más comunes para los sistemas IVTT incluyen el uso de cápsulas lipídicas, micelas, polimerosomas y otros microcontenedores estrechamente cerrados10,11,12. Una desventaja de este enfoque es la necesidad de incorporar mecanismos pasivos o activos para transportar materiales dentro y fuera de los contenedores para permitir la comunicación con el entorno externo y proporcionar capacidades de detección. Para superar algunos de estos problemas, el estudio aquí informa un método que proporciona un enfoque simple pero efectivo para encapsular los materiales de codificación para diferentes diseños de sensores que se expresarán en sistemas IVTT. Este enfoque se basa en el uso de la deposición capa por capa (LbL) de un biopolímero en presencia de los plásmidos de interés para crear microcápsulas huecas con alta porosidad, lo que permite que el material genético protegido interactúe con los diferentes componentes del IVTT de elección. El estudio demostró que los plásmidos encapsulados podían dirigir la transcripción y la traducción cuando se activan dentro de esta matriz polimérica, como se muestra con la respuesta de un aptámero codificado por plásmidos y un riboswitch a sus objetivos correspondientes. Además, este recubrimiento LbL protege los plásmidos durante meses sin condiciones especiales de almacenamiento.
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Protocol
1. Construcción del vector plásmido.
- Construir un vector plásmido (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) mediante la amplificación de la secuencia codificante de un riboswitch de teofilina (ThyRS) acoplado con GFPa1 a partir del vector pJ201:23976-RS-GFPa1 (diseñado y creado por DNA2.0) y la inserción en el vector de expresión de E. coli , pSAL13. Utilice cebadores hacia adelante (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e inverso (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') para amplificar la secuencia codificante de ThyRS acoplado con GFPa1 y realizar una reacción de PCR en volumen de 50 μL utilizando ADN polimerasa de acuerdo con el protocolo del fabricante14.
- Prepare un gel de agarosa al 1% a partir de 0,5 g de agarosa, 50 ml de tampón TAE (40 mM de acetato de Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) y 3 μL de tinción de ADN.
- Mezclar 5 μL de alícuota del producto amplificado por PCR con 5 μL de agua libre de RNasa/DNasa y 2 μL de 6x colorante de carga de gel y analizar mediante electroforesis en gel de agarosa. Cargue una escalera de ADN (0.1-10.0 kb) como referencia. Pase el gel a 120 V hasta que la línea de tinte casi haya llegado al fondo del gel.
- Visualice los fragmentos de ADN utilizando un sistema de imágenes de transiluminador UV para verificar el tamaño correcto del ADN15.
- Purificar el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante16.
- Digerir el producto de PCR y el vector de expresión de pSAL con enzimas de restricción KpnI y BlpI en una reacción de 15 μL, que contenga 10 μL de producto de PCR o vector plásmido (concentración 20-50 ng/μL), 1,5 μL de tampón enzimático 10x, 1 μL de cada enzima y 1,5 μL de agua libre de RNasa/DNasa, a 37 °C durante 2 h.
- Agregue 3 μL de colorante de carga de gel 6x a la mezcla de reacción y separe los fragmentos digeridos en un gel de agarosa al 1% como se describe en los pasos 1.3-1.5.
- Purificar los fragmentos de ADN utilizando un kit de extracción en gel según el protocolo del fabricante16.
- Ligue el producto de PCR digerido en un vector plásmido linealizado digerido, pSAL, utilizando ADN ligasa T4 y tampón ligasa suplementado en una reacción de 10 μL que contiene 3-20 fmol del vector digerido, 9-60 fmol del producto de PCR digerido, 2 μL de tampón ligasa, 1 μL (1 unidad) de ADN ligasa T4 y agua libre de DNasa/RNasa. Incubar la reacción de ligadura a 25 °C durante 3 h.
NOTA: Asegúrese de que el contenido total de ADN en la mezcla de reacción sea de 0,01-0,1 μg. - Transformar E. coli DH5α células competentes con 10 ng de la mezcla de reacción de ligadura de acuerdo con el protocolo del fabricante17.
- Cultivar las células transformadas a 37 °C durante la noche en placas de LB-agar suplementadas con ampicilina (100 μg/ml).
- Recoger 3-4 colonias bacterianas de la placa y transferir asépticamente cada una de ellas a 5 ml de medios LB suplementados con ampicilina (100 μg/mL). Cultivar los cultivos durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 225 rpm.
- Granular los cultivos nocturnos por centrifugación a 11 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Utilice un kit de purificación para purificar los plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante16.
- Verificar las secuencias de los plásmidos purificados mediante secuenciación de ADN. El mapa plásmido y la secuencia del constructo resultante (pSALv-RS-GFPa1) se muestran en la Figura 1.
2. Purificación de ADN a gran escala.
- Transformar el vector plásmido pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (codificando el riboswitch teofilina acoplado con el gen informador GFPa1) o pET28c-F30-2xBrócoli (5,4 kb) (codificando el aptámero de brócoli) en células competentes de E. coli DH5α según el protocolo del fabricante17.
- Cultivar las células transformadas a 37 °C durante la noche en placas de LB-agar suplementadas con ampicilina (100 μg/ml) para células transformadas con pSALv-RS-GFPa1 o kanamicina (50 μg/ml) para células transformadas con brócoli pET28c-F30-2x.
- Recoger 3-4 colonias bacterianas de la placa y transferir asépticamente cada colonia a 5 ml de medios LB suplementados con antibiótico apropiado (100 μg/ml de ampicilina o 50 μg/ml de kanamicina). Cultivar los cultivos durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 225 rpm.
- Use 3 ml del cultivo nocturno para inocular en 150 ml de LB suplementado con antibiótico apropiado (100 μg/ml de ampicilina o 50 μg/ml de kanamicina) y cultive los cultivos durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 225 rpm.
- Granular las células por centrifugación a ≥3400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Utilice un kit de purificación para purificar los plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante16.
- Eluya el ADN con 0,5 ml de agua pura libre de DNasa/RNasa. Mida la concentración de ADN y prepare 1 ml de soluciones madre de ADN (100 ng/μL). Conservar los tubos con ADN a 4 °C hasta su uso posterior.
3. Extracción de fibroína de seda y preparación de materiales iniciales.
- Preparar una solución acuosa de proteína de fibroína de seda (SF) reconstituida de capullos de gusanos de seda Bombyx mori de acuerdo con el procedimiento descrito en detalle en otra parte para representar el 10% de la solución de Silk-LiBr18.
- Determinar la concentración final de la solución acuosa de SF. Pipetear 0,5 ml de solución de seda a una placa de Petri de 60 mm, dejar secar a 60 °C y medir el peso de la película de seda seca. Divida el peso seco entre 0,5 ml para calcular el porcentaje de peso por volumen.
- Diluir la solución de seda concentrada con agua destilada libre de DNasa/RNasa añadiendo lentamente agua mediante pipeta serológica para obtener una concentración final de 1 mg/ml. Conservar la solución a 4 °C para utilizarla en el futuro.
- Prepare fibroína de seda marcada con fluorescencia usando un kit de etiquetado de anticuerpos. Use 1 ml de solución de fibroína de seda de 2 mg / ml para acoplar los grupos N-terminal α-amino de la proteína con un colorante derivado activado por éster NHS de acuerdo con el protocolo del fabricante19.
- Preparar 50 ml de solución acuosa de polietileneimina (PEI) con una concentración de 6 mg/ml, ajustar el pH a 4 con HCl (1 M). Filtrar la solución a través de una membrana estéril de 0,2 μm. El almacenamiento es posible en condiciones ambientales durante meses.
- Preparar núcleos de SiO2 . Pipetear 300 μL de partículas deSiO2 en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Lave las micropartículas dos veces con 1 ml de agua libre de DNasa/RNasa por centrifugación a 0,2 x g durante 1 minuto.
4. Realice la deposición capa por capa de una capa prima, plásmidos de ADN y capas de seda.
- Para depositar la capa principal de PEI en las micropartículas de SiO2 , agregue 1 ml de solución de PEI al pellet hilado del paso 3.6 y agite la mezcla en condiciones ambientales en un termomezclador a 800 rpm durante 15 min. Lave las partículas cuatro veces con 1 ml de agua desionizada libre de DNasa/RNasa por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min.
- Para realizar la deposición de la capa de ADN, añadir 1 ml de la solución acuosa de plásmidos de ADN del paso 2.7 a las micropartículas cebadas con PEI y agitar suavemente la mezcla a 4 °C en un termomezclador a 800 rpm durante 15 min. Para preparar microcápsulas con diferentes cargas de ADN, ajustar la concentración de plásmidos de ADN de 50-200 ng/μL usando agua destilada libre de DNasa/RNasa y usar 1 ml de estas soluciones para depositar el ADN. Recoger las micropartículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min.
- Marque los tubos para los plásmidos de ADN que codifican el ribointerruptor teofilina junto con GFPa1 como ThyRS-GFPa1, y los plásmidos de ADN que codifican el aptámero de brócoli como BrocApt.
NOTA: Mantenga los tubos de microcentrífuga con ADN en hielo. - Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave las micropartículas cuatro veces con 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa, desechando cada vez el sobrenadante después de la centrifugación a 0,2 x g durante 1 minuto. Realice todos los experimentos a temperatura ambiente (RT) a menos que se especifique lo contrario.
- Para realizar la deposición de la capa de fibroína de seda, agregue 1 ml de la solución acuosa de SF reconstituida del paso 3.3 a las micropartículas adsorbidas por ADN, voltee suavemente y agite la mezcla a 10 °C en el termomezclador a 750 rpm durante 15 min. Recoger las micropartículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 minuto a 4 °C, retirar el sobrenadante y, a continuación, lavarlas una vez con 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.
NOTA: Durante el experimento, mantenga la solución de seda en hielo para evitar la gelificación inducida por la temperatura. - Trate gradualmente las partículas con metanol para inducir la formación de β láminas en la estructura de la proteína de seda. Primero, agregue 0.5 ml de agua destilada DNasa / RNasa, haga un vórtice en el tubo de microcentrífuga y luego agregue 0.5 ml de metanol al 100%. Agitar suavemente las partículas del termomezclador a 10 °C durante 5 min. Recoger las partículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante.
- Trate las partículas con metanol para promover la formación de hojas de β y asegurar una fuerte adsorción física de la capa de seda. Agregue 1 ml de metanol al 100%. Agitar suavemente las partículas del termomezclador a 750 rpm durante 10 min a 10 °C.
- Recoger las partículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min a 4 °C y lavarlas dos veces con 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa cada vez, desechando el sobrenadante y vórtice suavemente antes de la siguiente centrifugación.
- Repita los pasos 4.5-4.8 20 veces para obtener estructuras de concha de núcleo multicapa de seda. Para el último paso de deposición, utilice seda etiquetada con fluorescencia del paso 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
- Realice el último paso de lavado y mantenga las micropartículas en 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa en condiciones ambientales.
NOTA: Para evitar la agregación de partículas durante la deposición de capas de seda, realice una inspección visual de la suspensión de partículas y pipetearla hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta de pipeta de 1 ml para promover una distribución homogénea de partículas. - Calcule el número de copias de plásmidos de ADN encapsuladas en cada microcápsula, NADN usando la Ecuación 1:
(1)
Donde N = 6.769 × 1011 - el número de núcleos de SiO2 utilizados para la encapsulación. Calcularlo a partir de una curva estándar para concentraciones conocidas de partículas de sílice utilizando diluciones seriadas y absorción A 320 a λ =320 nm;
C- concentración inicial de ADN utilizado para la adsorción
V- el volumen de ADN utilizado para la adsorción
0.8- Eficiencia de adsorción de ADN en los núcleos
Mw- Peso molecular del plásmido de ADN
NA- Número de Avogadro (6.022 × 1023)
(1)5. Disolución de núcleos para obtener microcápsulas de seda.
- Preparar una solución de ácido fluorhídrico (HF) al 8%, pH 5,5, diluyendo la solución madre (48%) con agua destilada. Adquiera un tubo de centrífuga de 50 ml. Pipetear cuidadosamente 5 ml de HF y añadir 25 ml de agua destilada para obtener una solución de HF al 8%.
PRECAUCIÓN: HF es un ácido altamente corrosivo y puede causar quemaduras graves en los tejidos. Se debe tener extrema precaución durante la manipulación y el uso de HF para los experimentos. Adherirse al Procedimiento Operativo Estándar (SOP) para el uso y manejo adecuado de HF desarrollado por la organización para evitar accidentes de derrame indeseables. No utilice recipientes de vidrio para diluir el ácido HF. Utilice la campana química para realizar este paso del protocolo. - Disuelva los núcleos de SiO2 añadiendo 1,5 ml de solución de HF al 8% a las micropartículas granuladas de núcleo a partir del paso 4.10. Realice un vórtice suave y deje que los núcleos se disuelvan durante la noche en condiciones ambientales con una agitación suave a 450 rpm.
NOTA: Para evitar derrames de HF, use cinta de injerto para sellar el tubo de microcentrífuga. Utilice una campana química para realizar este paso del protocolo. - Prepare un vaso de precipitados de vidrio de 2 L lleno de 2 L de agua desionizada. Transfiera la solución de microcápsulas a dispositivos de diálisis (MWCO de 50 kDa) y dialícelos contra agua desionizada con un cambio repetido del agua cada 3 h durante los próximos 3 días.
NOTA: Recoja el sobrenadante durante los tres primeros intercambios de agua y deseche la solución de acuerdo con el protocolo establecido para materiales de desecho peligrosos. - Use una pipeta de 1 ml para transferir la suspensión de los dispositivos de diálisis a nuevos tubos de microcentrífuga de 2 ml para recoger las microcápsulas.
NOTA: Almacenar las soluciones acuosas de microcápsulas en condiciones ambientales durante varios años.
6. Obtención de imágenes de microcápsulas de fibroína de seda utilizando microscopio de barrido láser confocal (CLSM).
- Realice la tinción de ADN con un tinte de ADN.
- Transfiera 300 μL de microcápsulas huecas de fibroína de seda a un tubo de microcentrífuga fresco de 1 ml. Añadir 500 μL de agua destilada libre de RNasa/DNasa.
- Añadir 5 μL del colorante de tinción de ADN, vórtice brevemente e incubar a RT durante 2 h protegido de la luz.
- Realizar cuatro pasos de lavado por centrifugación a 0,1 x g durante 20 min a 4 °C cada vez, retirando cuidadosamente 400 μL del sobrenadante y reponiéndolo con 400 μL de agua destilada libre de RNasa/DNasa.
- Realice la obtención de imágenes de cápsulas de seda en sistemas confocales invertidos equipados con tres láseres principales (405 nm, 488 nm, 561 nm) utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x (NA 1.49). Transfiera 100 μL de la muestra de la cápsula a un solo pocillo de portaobjetos de vidrio con cámara de 8 pocillos, permita que las cápsulas sedimenten durante 20-30 minutos antes de la obtención de imágenes.
NOTA: Los tintes son muy sensibles al fotoblanqueo. Proteja las muestras cubriendo los portaobjetos con papel de aluminio.
7. Estimación de la permeabilidad de microcápsulas huecas mediante el método de corte de peso molecular (MWCO).
- Prepare 2 ml de cada una de las soluciones fluoróforas de dextrano marcadas con FITC (20 μM,diH2O) de diferentes Mw (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa y 2 MDa).
- Pipetear 100 μL de la suspensión de cápsulas en un solo pocillo de un portaobjetos de vidrio con cámara. Analice cada diseño de microcápsula (concentración de PEI, número de carga de plásmidos de ADN, concentración de fibroína de seda y número de capas) por separado.
- A cada pocillo, agregue 300 μL de la solución fluorófora específica desde el Mw más bajo hasta el más alto, de modo que cada pocillo corresponda a la solución fluorófora específica. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo y dejar que la mezcla se incube durante 1 h a RT hasta que la difusión de las soluciones fluoróforas alcance el equilibrio.
- Transfiera el portaobjetos a un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) e imagine la imagen de cada pocillo utilizando un objetivo de inmersión en aceite 100x en excitación λ = 488 nm.
- Identifique el área de interés ajustando el plano focal para asegurarse de que las cápsulas aparezcan en forma de círculos del mayor diámetro. Esto suele suceder cuando se ven las muestras más cerca del fondo del pozo cuando las cápsulas sedimentan debido a la gravedad.
- Recoja varias imágenes de muestras de microcápsulas moviendo el portaobjetos en dirección XY. Capture imágenes para dar cuenta de hasta 100-150 cápsulas para cada muestra.
- Utilice el software ImageJ para analizar la permeabilidad de la membrana de la cápsula en cada solución de fluoróforo Mw comparando las intensidades de fluorescencia dentro y fuera de las cápsulas. Para eso, dibuje una región de interés (ROI) en forma de círculo para delinear la circunferencia de la cápsula y haga clic en Analizar / Medir para medir la intensidad de fluorescencia en el interior. Tabula los datos en una hoja de cálculo. Realice esta operación para cada microcápsula para un total de 200-300 cápsulas.
- Evalúe la intensidad de fluorescencia exterior de la misma manera delineando el ROI y midiendo la intensidad lejos de las cápsulas. Realizar 3-5 mediciones para análisis estadístico.
- Para realizar el análisis estadístico, comparar las intensidades de fluorescencia dentro y fuera de las cápsulas utilizando la prueba t pareada (p < 0,05).
- Utilice la tabla de conversión 2 para estimar la permeabilidad de las microcápsulas en función de los radios hidrodinámicos para FITC-Dextrano con la variable Mw.
8. Activación in vitro del riboswitch de teofilina sintética en microcápsulas de seda
- Preparar 1 ml de solución madre de teofilina (100 mM, DMSO). Prepare el sistema de extracto de E. coli S30 para el ADN circular descongelando los componentes en hielo durante 40 minutos.
- Obtenga un tubo de microcentrífuga libre de DNasa/RNasa de 0,5 ml. Realizar reacción de transcripción/traducción in vitro , combinar los componentes libres de células con una muestra de microcápsulas en el siguiente orden (volumen total de 50 μL): Premezcla S30 sin aminoácidos (20 μL); Extracto de S30, circular (15 μL); mezcla completa de aminoácidos (5 μL); microcápsulas huecas que contengan plásmidos ThyRS-GFPa1 del paso 4.10 (9 μL); y teofilina, 100 mM DMSO (1 μL).
NOTA: Después de agregar todos los componentes, haga un breve vórtice del tubo y recoja la muestra durante una breve centrifugación a 0,2 × g durante un par de segundos. - Incubar el tubo a 30 °C durante 4 h y comprobar la fluorescencia en un lector de placas utilizando excitación a λ = 488 nm y emisión para filtro GFP/FITC (510 nm ± 20 nm).
- Imagen de las cápsulas en cualquier sistema LCSM utilizando láseres de 488 nm y 561 nm. Obtenga imágenes de la mejor calidad utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x y diapositivas con cámara de 8 pocillos.
9. Activación in vitro del aptámero de brócoli en microcápsulas de seda
- Preparar 1 ml de solución madre de colorante DFHBI-1T (30 μM,diH2O). Prepare el kit de reacción del sistema libre de células PURE (síntesis de proteínas utilizando elementos recombinantes) descongelando los componentes en hielo durante 40 minutos.
- Obtenga un tubo de microcentrífuga libre de DNasa/RNasa de 0,5 ml. Realizar una reacción de transcripción in vitro combinando componentes de reacción libres de células con una muestra de microcápsulas en el siguiente orden (volumen total de 50 μL): solución A (20 μL); solución B (15 μL); microcápsulas huecas que contengan plásmidos BrocApt del paso 4.10 (14 μL); y colorante DFHBI-1T (1 μL).
NOTA: Después de agregar todos los componentes, haga un breve vórtice del tubo y recoja la muestra durante una breve centrifugación a 0,2 × g durante un par de segundos. - Incubar el tubo a 37 °C durante 6 h y comprobar la fluorescencia en un lector de placas utilizando excitación a λex = 470 nm y emisión a λem = 510 nm ± 20 nm.
- Imagen de las cápsulas en cualquier sistema LCSM utilizando láseres de 488 nm y 561 nm. Obtenga imágenes de la mejor calidad utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x y diapositivas con cámara de vidrio de cubierta de 8 pocillos.
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Representative Results
Aquí, el estudio aborda la funcionalidad de las plantillas de ADN que codifican diferentes diseños de sensores (dos tipos de elementos de transcripción / traducción regulados por ARN) después de la encapsulación en cápsulas de proteína de seda. Las microcápsulas se prepararon mediante el ensamblaje capa por capa (LbL) de los componentes clave: una capa principal, plásmidos de ADN que codifican diseños de sensores y biopolímero de fibroína de seda (Figura 2). La deposición de macromoléculas en forma estratificada permite controlar la permeabilidad de la membrana de la cápsula en función de las interacciones inter e intramoleculares entre las capas absorbidas y el grosor de la cáscara. La permeabilidad sintonizable del sistema ofrecía el potencial de controlar la difusión de moléculas esenciales al tiempo que limitaba la difusión de macromoléculas grandes e indeseables a través de la membrana de la cápsula20.
Se pueden producir microcápsulas de fibroína de seda homogéneas (4,5 μm) y robustas con un espesor de cáscara de ~500 nm (20 capas) en estado hidratado cuando se sigue correctamente el protocolo (Figura 3)21. El enfoque LbL permitió ajustar la capacidad de carga de las plantillas de ADN en función de la concentración inicial de los plásmidos. La carga óptima de ADN se puede lograr variando la concentración inicial de plantillas de ADN de 50-200 ng / μL. La Tabla 1 representa el número de copias de ADN retenidas en una sola microcápsula al finalizar la encapsulación de LbL y se calculó para cada diseño de sensor en función de las concentraciones iniciales de ADN y Mw de plásmidos de ADN de acuerdo con la Ecuación 1. La capacidad óptima de carga de ADN se logró con 32 y 20 copias de ADN para los diseños de sensores ThyRS y BrocApt, respectivamente. La evaluación de la capacidad de carga fue importante para tener una estimación precisa de las concentraciones de ADN encapsulado para poder titularla durante la activación de IVTT de los sensores mediante la adición de muestras de cápsulas más concentradas.
La permeabilidad de las cubiertas de la cápsula se puede analizar sistemáticamente siguiendo el método MWCO. El método estima el tamaño de poro de la membrana basándose en el peso molecular de las moléculas de soluto que no pudieron penetrar a través de la membrana de la cápsula. Al someter microcápsulas a moléculas de fluoróforos variables de Mw y realizar imágenes confocales en el plano focal que corresponde al diámetro más grande en múltiples cápsulas, se puede evaluar la permeabilidad de las membranas de la cáscara. El análisis ImageJ permite estimar las intensidades de fluorescencia dentro y fuera de las cápsulas e identificar membranas totalmente permeables (las intensidades de fluoróforos fuera e interior eran comparables), parcialmente permeables (50%-70% de las cápsulas tenían menor fluorescencia en el interior en comparación con el exterior) y no permeables (la intensidad del fluoróforo interior fue menor en comparación con la intensidad exterior) (Figura 4). La conversión de Mw a radio hidrodinámico para cada fluoróforo permite estimar el tamaño de malla de la membrana de la cápsula (Tabla 2).
La permeabilidad selectiva de las cápsulas de proteína se puede lograr durante la optimización sistemática del protocolo de deposición de LbL mediante el uso de concentraciones variables de una capa principal (de 0-6 mg / ml), la concentración de una fibroína de seda (de 0.5-2 mg / ml) y el número de capas depositadas (de 10-25) hasta que se alcanza la permeabilidad óptima. En este protocolo, se logró una permeabilidad óptima entre 25-32 nm con 6 mg/mL de PEI como capa principal y 20 capas de 1 mg/mL de fibroína de seda depositadas durante el ensamblaje de LbL (Figura 4). Este rango de permeabilidad fue ideal para que los componentes del sistema IVTT se filtraran a través de la cubierta de la cápsula. Típicamente, los complejos moleculares más grandes de cualquier sistema IVTT son unidades ribosómicas procariotas, 30S y 50S, que, cuando se unen por ARNm en un complejo ribosómico, pueden alcanzar hasta ~ 20 nm en tamaño22. La estructura de las cubiertas de microcápsulas desarrolladas se asemeja a una red altamente entrelazada de capas de fibra de seda que están físicamente reticuladas por bloques de β hojas producidas durante el ensamblaje de LbL. Esta estructura de membrana es semipermeable: altamente permeable a moléculas pequeñas (por ejemplo, iones, aminoácidos, péptidos, azúcares, etc.) y restringida a moléculas grandes (por ejemplo, proteínas de alto peso molecular, glicoproteínas, células, etc.) que solo permite la percolación de moléculas con un radio hidrodinámico inferior a 25 nm. Por lo tanto, las microcápsulas de fibroína de seda con carga óptima de ADN y permeabilidad a la membrana se pueden utilizar como portadores de biorreactores para la activación de IVTT.
La actividad transcripcional y traslacional de los sensores de diseño ThyRS y BrocApt se puede probar utilizando sistemas IVTT disponibles comercialmente. ThyRS requiere la activación traslacional del gen reportero en presencia del ligando teofilina. La activación de ThyRS sintético implica varios pasos para iniciar la expresión génica, incluida la síntesis de ARNm, el cambio conformacional de la secuencia de ARNm al unirse al analito, la liberación del sitio de unión al ribosoma y la síntesis de la proteína GFPa1 reportera. Todos estos pasos requieren la difusión libre de los componentes de IVTT a través de la membrana de la cápsula. El diseño propuesto de microcápsulas de fibroína de seda cargadas de ADN mejoró los parámetros de activación de los diseños de sensores regulados por ARN: tanto la cinética de expresión como la salida de fluorescencia fueron significativamente mayores en comparación con el ADN libre no inmovilizado (Figura 5A). Las imágenes CLSM también confirmaron la activación exitosa del gen GFPa1 dentro de cápsulas cargadas con plásmidos de ADN que codifican secuencias ThyRS (Figura 5B-D).
Alternativamente, la activación del diseño del sensor BrocApt se llevó a cabo en el sistema IVTT que admite la transcripción/traducción acoplada al promotor de E. coli T7 en presencia de colorante DHFBI-1T. La salida de fluorescencia se inició al unir el colorante fluorogénico a la secuencia de ARNm. Es importante destacar que la señal de salida de las microcápsulas de seda fue varios pliegues más alta en comparación con las muestras de ADN no encapsuladas de concentraciones equivalentes (Figura 6). Por lo tanto, las microcápsulas de fibroína de seda pueden conservar la funcionalidad esencial de los elementos sensores codificados por ADN, lo que puede ser importante para el diseño de nuevos tipos de plataformas de biosensores in vitro para la detección rápida y sensible de analitos de interés.
Figura 1: Mapa plásmido y secuencia de pSALv-RS-GFPa1. (A) El plásmido contiene teofilina riboswitch (ThyRS) secuencia colocada aguas arriba del gen que codifica GFPa1 bajo el control del promotor ptac, β-lactamasa (bla) que codifica el gen responsable de la resistencia a la ampicilina. (B) La secuencia del promotor ptac se muestra en negrita y subrayado; La secuencia del riboswitch de teofilina se muestra en negrita cursiva; La secuencia de codificación GFPa1 se muestra en negrita; Las secuencias de sitios de restricción están subrayadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general de la preparación de microcápsulas utilizando el enfoque capa por capa. Los núcleos de SiO2 prístinos se funcionalizaron primero con polímero PEI, seguido de la deposición secuencial de plásmidos de ADN que codifican diferentes diseños de sensores y capas de fibroína de seda hasta que se haya adsorbido el número deseado de capas de proteína de seda. Las microcápsulas huecas prístinas que contienen varios diseños de sensores de ADN se pueden producir disolviendo núcleos de sacrificio. La activación de cada diseño de biosensor encapsulado en la microcápsula se puede lograr durante las reacciones IVTT en presencia de los ligandos correspondientes. Esta figura ha sido reimpresa de Drachuk, I. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estudios microscópicos para microcápsulas cargadas de ADN. (A) Imágenes transversales de microscopía confocal 3D 2D y (B) renderizadas de microcápsulas huecas (SF)20 cargadas con plásmidos de ADN que codifican ThyRS (32 copias de ADN/cápsula) y producidas a partir de núcleos deSiO2 cebados con PEI de 6 mg/ml. Se aplicó autofluorescencia de cápsulas de fibroína de seda (canal DAPI, azul) y ADN teñido (canal FIFC, verde) para identificar la localización de plásmidos de ADN y estimar el grosor de la membrana de la cápsula. El recuadro en (A) representa perfiles de intensidad para el ADN y las conchas de fibroína de seda a través de la cápsula. Barra de escala: 2 μm. El recuadro en (B) representa el perfil de intensidad de la proteína de seda a través de la cubierta de la cápsula. El espesor de la membrana se midió como la longitud a la mitad del pico de intensidad. El procesamiento de las imágenes transversales y la representación 3D se realizaron utilizando el software de imágenes NIS en el sistema Nikon C2+ . Esta figura ha sido reimpresa de Drachuk, I. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estimación de la permeabilidad de la membrana para microcápsulas de seda utilizando el método MWCO. Imágenes fluorescentes representativas selectivas de CLSM de microcápsulas huecas de fibroína de seda sometidas a soluciones FITC-Dextrano de varios Mw (20 μM,diH2O). Las cápsulas se prepararon con un número diferente de capas y concentraciones de PEI. Un aumento en la concentración de una capa principal conduce a una mayor estabilidad coloidal de las microcápsulas con capas más permeables, mientras que la eliminación de la capa principal causa la agregación de cápsulas con membranas de cubierta menos permeables. Barra de escala: 5 μm. Esta figura ha sido reimpresa de Drachuk, I. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Activación del diseño del sensor ThyRS en microcápsulas de fibroína de seda. (A) Cinética para la expresión de GFPa1 durante la activación de ThyRS a partir de plásmidos de ADN cargados en microcápsulas SF de 20 capas (líneas de color rojo) y control de ADN no encapsulado (líneas de color azul). De arriba a abajo, las concentraciones de ADN en un volumen de muestra (50 μL) fueron 6.5 ng / μL, 4.5 ng / μL, 2.5 ng / μL y 0 ng / μL y corresponden a los cambios en las intensidades de color. (B) Imágenes CLSM de cápsulas de fibroína de seda cargadas con 32 copias de ADN por cápsula. Barra de escala: 5 μm. (C) La imagen corresponde a perfiles de intensidad de sección transversal correspondientes a la imagen (B) a través de dos cápsulas (línea blanca en B). La línea roja representa cápsulas de seda, y la línea verde representa GFPa1 expresado en cápsulas. (D) La imagen representa cápsulas de seda 3D renderizadas cargadas con 32 copias de ADN después de la incubación en el sistema IVTT. La fluorescencia verde corresponde a la señal GFPa1, y la fluorescencia roja corresponde a capas de seda marcadas con fluorescencia. Barra de escala: 2 μm. La activación de ThyRS se realizó con teofilina (2 mM, DMSO) durante la incubación de microcápsulas en el sistema IVTT (extracto S30). Esta figura ha sido reimpresa de Drachuk, I. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Activación de BroccApt en microcápsulas de fibroína de seda. La comparación de la cinética de transcripción se realizó para microcápsulas de seda de 20 capas cargadas con 30 copias de ADN por cápsula (líneas de color rojo) y ADN control no encapsulado (líneas de color azul). De arriba a abajo, las concentraciones de ADN encapsulado en una muestra fueron: 3,6 ng/μL, 2 ng/μL, 1 ng/μL y 0 ng/μL y corresponden a los cambios en las intensidades de color. Las concentraciones de ADN no encapsulado fueron: 20 ng/μL, 10 ng/μL, 5 ng/μL y 0 ng/μL y corresponden a los cambios en las intensidades de color. La activación se realizó con DHBFI-1T (100 μM,diH2O) durante la incubación en el sistema libre de células PURE. Esta figura ha sido reimpresa de Drachuk, I. et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Diseño del sensor de ADN | Concentración inicial de ADN (ng/μL) | Número de copias de ADN por cápsula (ADN/cápsula) |
| 50 | 16 | |
| ThyRS | 100 | 32 |
| 150 | 48 | |
| 200 | 64 | |
| 50 | 10 | |
| BrocApt | 100 | 20 |
| 150 | 30 | |
| 200 | 40 |
Tabla 1: Número de copias de ADN por cápsula para cada diseño de ADN. El número de copias se calculó de acuerdo con la Ecuación 1 y se correlacionó con la concentración inicial de plásmidos de ADN, la afinidad de retención de las secuencias de ADN durante el proceso de deposición de LbL y la longitud de los plásmidos de ADN.
| Mw de FITC-Dextrano (kDa) | Radio hidrodinámico (nm) |
| 4 | 1.4 |
| 20 | 3.3 |
| 40 | 4.5 |
| 70 | 6 |
| 150 | 8.5 |
| 250 | 10 |
| 500 | 14 |
| 2,000 | 18 |
Tabla 2: Propiedades físicas de FITC-dextranos. Se utilizó un radio hidrodinámico para cada fluoróforo para estimar la permeabilidad de las microcápsulas huecas de fibroína de seda.
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Discussion
Las microcápsulas de hidrogel selectivamente permeables cargadas con varios tipos de diseños de sensores codificados por ADN se pueden preparar siguiendo este protocolo. Una de las características distintivas del enfoque LbL es la capacidad de adaptar la complejidad de las microcápsulas durante el ensamblaje ascendente, que generalmente comienza con la adsorción de especies moleculares en plantillas de sacrificio. Ajustando cuidadosamente las concentraciones de los componentes iniciales, las condiciones de pH y el número de capas, se pueden preparar microcápsulas con diferentes parámetros de carga de ADN, funcionalidad y permeabilidad sintonizable23. Para amplificar la versatilidad de las cápsulas, se puede lograr una mayor funcionalización de la superficie de la carcasa con AuNP e IgG para implementar portadores de sensores biocompatibles para diagnósticos in vivo . Ambas rutas alternativas se basan en la estructura molecular única de la fibroína de seda. La reducción in situ de iones Au3+ se puede lograr debido a la presencia de residuos de tirosina (5.3% mol.) capaces de reducir los iones metálicos en presencia de un tampón de reducción óptimo. La conjugación de anticuerpos específicos a la superficie de las microcápsulas de proteínas funcionalizadas con AuNPs se puede realizar mediante la implementación de la química de activación de carbodiimida. Ambos pasos requieren un desarrollo cuidadoso y la optimización del protocolo para lograr la funcionalidad adecuada de las cápsulas biosensoras para futuras aplicaciones. Por ejemplo, para usar estas microcápsulas como sistemas de administración "inteligentes", en los que se administra una carga molecular sobre estímulos específicos (como pH o señales químicas), se deben caracterizar y ajustar las propiedades específicas de estas cápsulas, incluida la eficiencia de entrega, el tiempo de retención, la vía de administración y los tratamientos modelo de enfermedad.
Las microcápsulas cargadas de ADN se caracterizaron mediante la técnica CLSM y mediciones de fluorescencia. Sin embargo, otros métodos de caracterización como la microscopía de fuerza atómica (AFM), la tomografía electrónica criogénica (CEM) y la microscopía de superresolución de reconstrucción estocástica directa (dSTORM) pueden aplicarse para diferenciar estructuras específicas de las microcápsulas, incluyendo fibras individuales, nanodominios y localización de plásmidos de ADN24,25,26.
El protocolo desarrollado destaca el uso del biopolímero de fibroína de seda como material de red biocompatible que preserva la estructura terciaria de los plásmidos de ADN cargados. La estabilidad de las secuencias de ADN inmovilizadas dentro de la red de fibroínas de seda ocurre a través de interacciones hidrofóbicas y/o enlaces de hidrógeno, que proporcionan un microambiente protector contra la inactivación del pH, la oxidación o la hidrólisis27. Además, los dominios β cristalinos de la fibroína de seda proporcionan una barrera mecánica única, restringiendo el movimiento de las macromoléculas atrapadas y evitando que los plásmidos de ADN se degraden durante el almacenamiento en soluciones acuosas.
La naturaleza semipermeable de las microcápsulas de fibroína de seda cargadas con plantillas de ADN creó condiciones espaciales y fisicoquímicas únicas para las reacciones IVTT. El aptámero de ARN activado transcripcional y traduccionalmente y el riboswitch inmovilizados en microcápsulas de fibroína de seda pudieron producir una señal de salida que fue al menos tres veces mayor en comparación con los sensores libres no inmovilizados. Además, la inmovilización de plantillas de ADN en microcápsulas puede mejorar significativamente la actividad de los sensores encapsulados más allá del límite de detección de los no encapsulados. Mientras que los sensores no encapsulados tenían una respuesta mínima a bajas concentraciones de ADN, los sensores encapsulados tenían una respuesta de salida muy distinta, que se puede ajustar fácilmente para reflejar los cambios sutiles en las concentraciones de ADN. La señal de respuesta mejorada de los reporteros encapsulados probablemente se debió a la difusión sin restricciones de los componentes de la maquinaria IVTT y la movilidad reducida de los plásmidos de ADN. Varios estudios han reconocido que el rendimiento de la síntesis de proteínas en las reacciones libres de células depende del ambiente macromolecular28,29. La inmovilización de plásmidos de ADN en la red de seda proporcionó un ambiente confinado eficaz que restringió el movimiento de oligonucleótidos y aceleró las reacciones del mecanismo de transcripción/traducción incluso de varias copias de ADN21.
Si bien el método LbL proporciona un enfoque muy versátil para construir ensamblajes multifuncionales de una manera controlable, el procedimiento de fabricación requiere relativamente tiempo y generalmente requiere ajustes de procesamiento para aumentar el rendimiento de las microcápsulas. Otra consideración en la fabricación de microcápsulas basadas en biomoléculas es la compatibilidad de cualquier sistema dado con el requisito de la disolución del núcleo después de que se complete la deposición de LbL. Hasta ahora, para producir microcápsulas huecas cargadas de ADN a base de seda homogéneas y robustas, las conchas se depositaron en plantillas de núcleo de sílice de sacrificio (SiO2), que requirieron su posterior eliminación mediante grabado ácido fluorhídrico (HF). Ni la manipulación o el grabado en ondas decamétricas se consideran procesos biocompatibles, lo que limita su uso generalizado en aplicaciones prácticas. La alternativa a las plantillas coloidales inorgánicas deSiO2 , los núcleos de carbonato son típicamente inertes en la formación de complejos con capas de polímero y pueden disolverse en condiciones suaves utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Sin embargo, el ajuste de los núcleos de sacrificio puede afectar las propiedades de deposición de las multicapas y la integridad de la estructura de la cáscara, lo que requiere una mayor optimización del protocolo.
En resumen, el protocolo actual permite la preparación de microcápsulas cargadas de ADN a base de seda con diferentes diseños de sensores. La combinación de un microambiente confinado proporcionado por el método LbL y el uso de fibroína de seda como material biocompatible mejoró las propiedades de detección del ADN encapsulado. Con el rápido desarrollo de la tecnología de aptámero de ARN fluorogénico, el uso potencial de microcápsulas de seda cargadas de ADN puede extenderse al diagnóstico in vitro multiplexado. Recientemente, varias variaciones de aptámeros fluorescentes basados en ARN han surgido como una poderosa tecnología libre de fondo para obtener imágenes de ARN en células vivas con alta sensibilidad de relación señal-ruido30,31. Mediante la aplicación de nanotecnología de ARN sintético para diseñar aptámeros de ARN artificiales, las propiedades fluorogénicas de los aptámeros se pueden aprovechar para detectar ligandos específicos de interés. Esta tecnología será específicamente valiosa para monitorear biomarcadores de interés en diferentes formatos, incluidos sensores basados en papel en el punto de uso, parches a base de hidrogel para sudor o líquido intersticial y materiales implantables.
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Disclosures
Los puntos de vista y opiniones presentados en este documento son los de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del Departamento de Defensa o sus componentes.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención LRIR 16RH3003J de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea, así como el programa de Investigación Aplicada de Biología Sintética para Entornos Militares para el Avance de las Prioridades de Ciencia y Tecnología (ARAP) de la Oficina del Subsecretario de Defensa de los Estados Unidos para Investigación e Ingeniería.
La secuencia vectorial plásmida para ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) fue generosamente proporcionada por el Dr. J. Gallivan. Los capullos de gusanos de seda de Bombyx mori fueron generosamente donados por el Dr. DL Kaplan de la Universidad de Tufts, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
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