Summary
Protokol, sağlam ve biyouyumlu DNA yüklü mikrokapsüllerin oluşumunu, birkaç ligandı izleyebilen çoklanmış in vitro biyosensörler olarak tanımlar.
Abstract
DNA yüklü ipek fibroin mikrokapsüllerinin, kurban küresel çekirdekler üzerinde Katman Katman (LbL) montaj yöntemiyle hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Bir asal tabakanın ve DNA plazmidlerinin adsorpsiyonunu takiben, tek bir ipek tabakasının akut dehidrasyonu sırasında ipek sekonder yapıda β-tabakaların indüklenmesiyle sağlam mikrokapsüllerin oluşumu kolaylaştırılmıştır. Bu nedenle, katmanlama çoklu hidrojen bağı ve hidrofobik etkileşimler yoluyla gerçekleşti. Çok katmanlı kabukların adsorpsiyonu üzerine, çekirdek-kabuk yapıları, uzaktan algılama ve / veya hedeflenen teslimat için kullanılacak altın nanopartiküller (AuNP'ler) ve / veya antikorlar (IgG) ile daha da işlevselleştirilebilir. Bir polimer astarının varlığı, DNA ve ipek proteininin konsantrasyonu ve bir dizi adsorbe edilmiş katmanın yanı sıra bir dizi adsorbe edilmiş katman gibi anahtar makromoleküllerin silika çekirdekleri üzerinde sıralı birikimi sırasında birkaç anahtar parametrenin ayarlanması, değişken geçirgenlik ve DNA yüklemelerine sahip biyouyumlu, DNA yüklü mikrokapsüllerle sonuçlandı. Silika çekirdeklerinin çözünmesi üzerine, protokol, kapsül zarının iç yüzeyine hareketsiz hale getirilmiş DNA plazmidleri ile içi boş ve sağlam mikrokapsüllerin oluşumunu gösterdi. DNA plazmidleri ve dış ortam arasında seçici olarak geçirgen biyouyumlu bir zar oluşturmak, uzun süreli depolama sırasında DNA'yı korudu ve mekansal olarak sınırlandırılmış plazmidlerden gelen gelişmiş çıktı tepkisinde önemli bir rol oynadı. DNA şablonlarının aktivitesi ve erişilebilirliği, in vitro transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları (hücresiz sistemler) sırasında test edildi. RNA ışıklandırma aptamerlerini ve riboswitchlerini kodlayan DNA plazmidleri, floresan olarak etiketlenmiş RNA transkriptlerinin veya GFPa1 proteininin kabuk zarlarında lokalizasyonu sırasında görselleştirildiği gibi, karşılık gelen analitlerle başarıyla aktive edildi.
Introduction
Sentetik biyoloji alanı, çevrelerini ve potansiyel tehditlerini izlemek için mikroorganizmalar tarafından geliştirilen doğal mekanizmalardan yararlanarak algılama yeteneklerini geliştirmek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Önemli olarak, bu algılama mekanizmaları tipik olarak bu mikroorganizmaları zararlı maruziyetten koruyan, olumsuz etkileri hafifletmek veya toksik maddelerin alımını önlemek için gen ekspresyonunu düzenleyen bir yanıtla bağlantılıdır. Bu mikroorganizmaları, bu doğal tepkilerden yararlanarak tüm hücre sensörleri oluşturmak üzere tasarlamak, ancak yeni hedefleri tanımak ve / veya nicelleştirme amacıyla (tipik olarak floresan) ölçülebilen ölçülebilir bir sinyal üretmek için yeniden yönlendirmek için önemli çabalar sarf edilmiştir1,2. Şu anda, genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların (GDO'lar) kullanımıyla ilgili endişeler, özellikle çevrede veya insan vücudunda salınırken, tüm hücrelerin veya genetik materyallerinin bir kısmının sızması nedeniyle, bir polimer matrisinde kapsüllenmiş olsa bile, bu algılama yaklaşımlarından yararlanmak için alternatif yollara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir3.
GDO'ların konuşlandırılması endişesi olmadan mikroorganizma bazlı algılamanın faydalarından yararlanmak için güçlü bir yaklaşım, in vitro transkripsiyon / translasyon (IVTT) sistemlerinin kullanılmasıdır. Pratik bir bakış açısıyla, IVTT sistemleri, hücre bileşenlerinin çoğunu, sonikasyon, boncuk dövme veya diğerleri de dahil olmak üzere hücrelerden farklı yollarla "ekstrakte edilmiş" aktif bir durumda içeren bir karışımdan oluşur4. Bu işlemin nihai ürünü, tüm hücrelerin kullanımıyla ilişkili kısıtlamalar (membran difüzyonu, transformasyon verimliliği, hücre toksisitesi, vb.) olmaksızın, farklı sensörleri "açık kap" formatında test etmek için kullanılabilecek transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için zaten optimize edilmiş bir biyokimyasal reaksiyon karışımıdır. Önemli olarak, farklı sensör bileşenleri nicel olarak eklenebilir ve etkileri, gösterdiğimiz gibi farklı optik ve spektrometrik tekniklerle incelenebilir5. IVTT sistemlerinin performansının tutarsız olabileceği fark edilmiştir; Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, sensör tasarımı6'daki performanslarını incelerken çok yardımcı olan hazırlık ve karakterizasyonlarını standartlaştırmak için yaklaşımlar göstermiştir. Son zamanlarda, kağıt matrislerindeki bileşenlerinin liyofilizasyonu yoluyla kağıt bazlı tahliller oluşturmak için kullanılan IVTT sistemlerinin birçok örneği, ağır metal iyonlarının, ilaçların, çekirdek algılama elemanlarının ve diğerlerinin tespiti de dahil olmak üzere gösterilmiştir 7,8,9. IVTT tabanlı sensörler için heyecan verici bir uygulama alanı, toprak, su ve insan vücudu dahil olmak üzere farklı ortam türlerinde algılama uygulamalarında kullanılmasıdır. Bu IVTT sistemlerini bu zorlu ortamlara dağıtmak için, IVTT bileşenlerini içermek ve bozulmaya karşı korumak için bir kapsülleme yaklaşımının uygulanması gerekir.
IVTT sistemleri için en yaygın kapsülleme yaklaşımları, lipit kapsüllerin, misellerin, polimerzomların ve diğer sıkıca kapatılmış mikro kapların kullanımını içerir10,11,12. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, dış çevre ile iletişime izin vermek ve algılama yetenekleri sağlamak için malzemeleri konteynerlerin içine ve dışına taşımak için pasif veya aktif mekanizmaların dahil edilmesi ihtiyacıdır. Bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için, buradaki çalışma, IVTT sistemlerinde ifade edilecek farklı sensör tasarımları için kodlama malzemelerini kapsüllemek için basit ama etkili bir yaklaşım sağlayan bir yöntem bildirmektedir. Bu yaklaşım, korunan genetik materyalin tercih edilen IVTT'nin farklı bileşenleri ile etkileşime girmesini sağlayan, yüksek gözenekliliğe sahip içi boş mikrokapsüller oluşturmak için ilgili plazmidlerin varlığında bir biyopolimerin Katman Katman (LbL) birikiminin kullanılmasına dayanmaktadır. Çalışma, kapsüllenmiş plazmidlerin, plazmid kodlu bir aptamer ve bir riboswitch'in karşılık gelen hedeflerine tepkisiyle gösterildiği gibi, bu polimerik matris içinde aktive edildiğinde transkripsiyon ve translasyonu yönlendirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, bu LbL kaplama, plazmidleri herhangi bir özel depolama koşulu olmadan aylarca korur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid vektörünün yapımı.
- pJ201:23976-RS-GFPa1 vektöründen GFPa1 ile birleştirilmiş bir teofilin riboanahtarının (ThyRS) kodlama dizisinin amplifikasyonu ve E. coli ekspresyon vektörü, pSAL13'e eklenmesi yoluyla bir plazmid vektörü (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) oluşturun. GFPa1 ile birleştirilmiş ThyRS'nin kodlama dizisini yükseltmek ve üreticinin protokolü14'e göre DNA polimeraz kullanarak 50 μL hacimde bir PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için ileri (5'-CGTGGTACCGGTTAAGCCAGCTCGTAG-3') ve geri (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') primerleri kullanın.
- 0.5 g agaroz, 50 mL TAE tamponu (40 mM Tris Asetat, 1 mM EDTA, pH 8.0) ve 3 μL DNA boyasından% 1'lik bir agaroz jeli hazırlayın.
- PCR ile güçlendirilmiş ürünün 5 μL aliquot'unu 5 μL RNaz / DNaz içermeyen su ve 2 μL 6x jel yükleme boyası ile karıştırın ve agaroz jel elektroforezi ile analiz edin. Referans olarak bir DNA merdiveni (0.1-10.0 kb) yükleyin. Boya hattı neredeyse jelin dibine ulaşana kadar jeli 120 V'ta çalıştırın.
- DNA15'in doğru boyutunu kontrol etmek için bir UV transilluminatör görüntüleme sistemi kullanarak DNA parçalarını görselleştirin.
- PCR ürününü, üreticinin protokolüne göre bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın16.
- PCR ürününü ve pSAL ekspresyon vektörünü KpnI ve BlpI kısıtlama enzimleri ile 10 μL PCR ürünü veya plazmid vektörü (konsantrasyon 20-50 ng / μL), 1.5 μL 10x enzim tamponu, her enzimin 1 μL'si ve 1.5 μL RNaz / DNaz içermeyen su içeren 15 μL reaksiyonda, 2 saat boyunca 37 ° C'de sindirin.
- Reaksiyon karışımına 3 μL 6x jel yükleme boyası ekleyin ve sindirilmiş parçaları 1.3-1.5 adımlarında açıklandığı gibi% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde ayırın.
- DNA parçalarını, üreticinin protokolü16'ya göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
- Sindirilmiş PCR ürününü, sindirilmiş vektörün 3-20 fmol'ü, sindirilmiş PCR ürününün 9-60 fmol'ü, 2 μL ligaz tamponu, 1 μL (1 ünite) T4 DNA Ligaz ve DNaz / RNaz içermeyen suyu içeren 10 μL'lik bir reaksiyonda T4 DNA ligaz ve takviye edilmiş ligaz tamponu kullanarak sindirilmiş doğrusallaştırılmış plazmid vektörü pSAL'a dökün. Ligasyon reaksiyonunu 25 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Reaksiyon karışımındaki toplam DNA içeriğinin 0,01-0,1 μg olduğundan emin olun. - E. coli DH5α yetkin hücreleri, üreticinin protokolü17'ye göre 10 ng ligasyon reaksiyonu karışımı ile dönüştürün.
- Dönüştürülmüş hücreleri, ampisilin (100 μg / mL) ile desteklenmiş LB-agar plakaları üzerinde bir gecede 37 ° C'de büyütün.
- Plakadan 3-4 bakteri kolonisi seçin ve her birini aseptik olarak ampisilin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 5 mL LB ortamına aktarın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 225 rpm'de çalkalayan bir inkübatörde büyütün.
- Gece kültürlerini oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 11 x g'de santrifüjleme ile pelet yapın.
- Plazmidleri üreticinin protokolü16'ya göre saflaştırmak için bir saflaştırma kiti kullanın.
- DNA dizilimi ile saflaştırılmış plazmidlerin dizilerini doğrulayın. Plazmid haritası ve elde edilen yapının sırası (pSALv-RS-GFPa1) Şekil 1'de gösterilmiştir.
2. Büyük ölçekli DNA saflaştırma.
- Plazmid vektörü pSALv-RS-GFPa1 (3.4 kb) (GFPa1 muhabir geni ile birleştirilmiş teofilin riboswitch'i kodlayan) veya pET28c-F30-2xBrokoli (5.4 kb) (Brokoli aptamerini kodlayan) üreticinin protokolü17'ye göre E. coli DH5α yetkili hücrelerine dönüştürün.
- Dönüştürülmüş hücreleri, pSALv-RS-GFPa1 ile dönüştürülmüş hücreler için ampisilin (100 μg / mL) veya pET28c-F30-2x Brokoli ile dönüştürülmüş hücreler için kanamisin (50 μg / mL) ile desteklenmiş LB-agar plakaları üzerinde bir gecede 37 ° C'de büyütün.
- Plakadan 3-4 bakteri kolonisi seçin ve her koloniyi aseptik olarak uygun antibiyotik (100 μg / mL ampisilin veya 50 μg / mL kanamisin) ile desteklenmiş 5 mL LB ortamına aktarın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 225 rpm'de çalkalayan bir inkübatörde büyütün.
- Uygun antibiyotik (100 μg / mL ampisilin veya 50 μg / mL kanamisin) ile desteklenmiş 150 mL LB'ye aşılamak için gecelik kültürün 3 mL'sini kullanın ve kültürleri 225 rpm'de çalkalayan bir inkübatörde 37 ° C'de bir gecede büyütün.
- Hücreleri ≥3400 x g'de santrifüjleme ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca pelet yapın.
- Plazmidleri üreticinin protokolü16'ya göre saflaştırmak için bir saflaştırma kiti kullanın.
- DNA'yı 0,5 mL saf DNaz/RNaz içermeyen su ile temizleyin. DNA konsantrasyonunu ölçün ve 1 mL DNA stok çözeltisi (100 ng / μL) hazırlayın. Tüpleri DNA'lı olarak 4 °C'de bir sonraki kullanıma kadar saklayın.
3. İpek fibroininin ekstraksiyonu ve başlangıç malzemelerinin hazırlanması.
- Silk-LiBr çözeltisi18'in% 10'unu oluşturmak için başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan prosedüre göre Bombyx mori ipekböceği kozalarından yeniden yapılandırılmış ipek fibroin (SF) proteininin sulu bir çözeltisini hazırlayın.
- Sulu SF çözeltisinin son konsantrasyonunu belirleyin. 60 mm'lik bir Petri kabına 0,5 mL ipek çözeltisi pipetleyin, 60 ° C'de kurumasını bekleyin ve kuru ipek filmin ağırlığını ölçün. Hacim yüzdesi başına ağırlığı hesaplamak için kuru ağırlığı 0,5 mL'ye bölün.
- 1 mg/mL nihai konsantrasyon elde etmek için serolojik pipet yoluyla yavaşça su ekleyerek konsantre ipek çözeltisini DNaz/RNase içermeyen damıtılmış su ile seyreltin. Çözeltiyi ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
- Bir antikor etiketleme kiti kullanarak floresan olarak etiketlenmiş ipek fibroini hazırlayın. Üreticinin protokolü19'a göre, proteinin N-terminal α-amino gruplarını NHS ester ile aktive edilmiş bir türev boya ile eşleştirmek için 1 mL 2 mg / mL ipek fibroin çözeltisi kullanın.
- 6 mg/mL konsantrasyonda 50 mL polietilenimin (PEI) sulu çözelti hazırlayın, HCl (1 M) ile pH'ı 4'e ayarlayın. Çözeltiyi steril bir 0,2 μm membrandan süzün. Ortam koşullarında aylarca depolama mümkündür.
- SiO2 çekirdeklerini hazırlayın. 300 μL SiO 2 partikülünü2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetin. Mikropartikülleri iki kez 1 mL DNaz/RNaz içermeyen su ile 0,2 x g'de santrifüjleme ile 1 dakika boyunca yıkayın.
4. Bir asal katmanın, DNA plazmidlerinin ve ipek katmanlarının Katman Katman biriktirilmesini gerçekleştirin.
- PEI asal tabakasını SiO2 mikropartikülleri üzerine biriktirmek için, adım 3.6'dan itibaren bükülmüş peletlere 1 mL PEI çözeltisi ekleyin ve karışımı ortam koşullarında 800 rpm'de bir termomikser üzerinde 15 dakika boyunca çalkalayın. Partikülleri dört kez 1 mL DNaz / RNaz içermeyen deiyonize su ile 1 dakika boyunca 0,2 x g'de santrifüjleme ile yıkayın.
- DNA tabakasının birikmesini gerçekleştirmek için, adım 2.7'den PEI astarlı mikropartiküllere 1 mL sulu DNA plazmid çözeltisi ekleyin ve karışımı 15 dakika boyunca 800 rpm'de bir termomikser üzerinde 4 ° C'de hafifçe çalkalayın. Farklı DNA yüklerine sahip mikrokapsüller hazırlamak için, DNaz / RNaz içermeyen damıtılmış su kullanarak DNA plazmidlerinin konsantrasyonunu 50-200 ng / μL'den ayarlayın ve DNA'yı biriktirmek için bu çözeltilerin 1 mL'sini kullanın. Mikropartikülleri 1 dakika boyunca 0.2 x g'de santrifüjleme ile toplayın.
- GFPa1 ile birleştirilmiş teofilin riboswitch'i kodlayan DNA plazmidleri için tüpleri ThyRS-GFPa1 olarak ve Brokoli aptamerini BrocApter olarak kodlayan DNA plazmidleri için tüpleri işaretleyin.
NOT: DNA'lı mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde tutun. - Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve mikropartikülleri 1 mL DNaz / RNaz içermeyen damıtılmış su ile dört kez yıkayın, her seferinde süpernatantı 1 dakika boyunca 0.2 x g'de santrifüjlemeden sonra atın. Aksi belirtilmedikçe tüm deneyleri oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirin.
- İpek fibroin tabakasının birikmesini gerçekleştirmek için, adım 3.3'ten DNA adsorbe edilmiş mikropartiküllere 1 mL yeniden yapılandırılmış sulu SF çözeltisi ekleyin, yavaşça vorteks edin ve karışımı termomikser üzerinde 10 ° C'de 750 rpm'de 15 dakika boyunca çalkalayın. Mikropartikülleri 4 °C'de 1 dakika boyunca 0.2 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın, süpernatanı çıkarın ve ardından 1 mL DNaz / RNaz içermeyen damıtılmış su ile bir kez yıkayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın.
NOT: Deney sırasında, sıcaklığa bağlı jelleşmeyi önlemek için ipek çözeltisini buz üzerinde tutun. - İpek protein yapısında β tabaka oluşumunu indüklemek için parçacıkları yavaş yavaş metanol ile muamele edin. İlk olarak, 0,5 mL DNaz / RNaz damıtılmış su ekleyin, mikrosantrifüj tüpünü vorteksleyin, ardından 0,5 mL% 100 metanol ekleyin. Termomikser üzerindeki partikülleri 10 °C'de 5 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. Partikülleri 1 dakika boyunca 0,2 x g'de santrifüjleme ile toplayın. Supernatan'ı çıkarın.
- β tabakaların oluşumunu teşvik etmek ve ipek tabakasının güçlü fiziksel adsorpsiyonunu sağlamak için parçacıkları metanol ile muamele edin. 1 mL% 100 metanol ekleyin. Termomikser üzerindeki partikülleri 750 rpm'de 10 dakika boyunca 10 °C'de yavaşça çalkalayın.
- Partikülleri 4 °C'de 1 dakika boyunca 0,2 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın ve her seferinde 1 mL DNaz / RNaz içermeyen damıtılmış su ile iki kez yıkayın, süpernatantı atın ve bir sonraki santrifüjlemeden önce hafifçe vorteks yapın.
- İpek çok katmanlı çekirdek-kabuk yapıları elde etmek için 4.5-4.8 arasındaki adımları 20 kez tekrarlayın. Son biriktirme adımı için, adım 3.4'ten (Silk-DyLight550, 1 mL) floresan olarak etiketlenmiş ipek kullanın.
- Son yıkama adımını gerçekleştirin ve mikropartikülleri ortam koşullarında 1 mL DNaz/RNaz içermeyen damıtılmış suda tutun.
NOT: İpek tabakaların birikmesi sırasında partiküllerin birikmesini önlemek için, partikül süspansiyonunun görsel bir incelemesini yapın ve homojen partikül dağılımını teşvik etmek için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyin. - Denklem 1'i kullanarak her bir mikrokapsül, N DNA'da kapsüllenmiş DNA plazmid kopyalarının sayısını hesaplayın:
(1)
Burada N = 6.769 × 1011 - kapsülleme için kullanılan SiO2 çekirdeğinin sayısı. Seri seyreltmeler ve λ = 320 nm'de absorpsiyon A320 kullanarak bilinen silika parçacıkları konsantrasyonları için standart bir eğriden hesaplayın;
C- Adsorpsiyon için kullanılan DNA'nın ilk konsantrasyonu
V- Adsorpsiyon için kullanılan DNA hacmi
0.8- Çekirdeklerde DNA adsorpsiyon etkinliği
Mw- DNA plazmidinin moleküler ağırlığı
NA- Avogadro'nun numarası (6.022 × 1023)
(1)5. İpek mikrokapsülleri elde etmek için çekirdeklerin çözülmesi.
- Stok çözeltisini (%48) damıtılmış su ile seyrelterek %8 hidroflorik asit (HF) çözeltisi, pH 5.5 hazırlayın. 50 mL'lik bir santrifüj tüpü edinin. 5 mL HF'yi dikkatlice pipetleyin ve% 8 HF çözeltisi elde etmek için 25 mL damıtılmış su ekleyin.
DİKKAT: HF oldukça aşındırıcı bir asittir ve dokularda ciddi yanıklara neden olabilir. Deneyler için HF'nin kullanımı ve kullanımı sırasında çok dikkatli olunmalıdır. İstenmeyen dökülme kazalarını önlemek için kuruluş tarafından geliştirilen HF'nin doğru kullanımı ve elleçlenmesi için Standart Çalışma Prosedürüne (SOP) uyun. HF asidini seyreltmek için cam kaplar kullanmayın. Protokolün bu adımını gerçekleştirmek için kimyasal başlığı kullanın. - Adım 4.10'dan itibaren peletlenmiş çekirdek-kabuk mikropartiküllerine 1,5 mL% 8 HF çözeltisi ekleyerek SiO2 çekirdeklerini çözün. Yavaşça vorteks yapın ve çekirdeklerin ortam koşullarında gece boyunca çözünmesine izin verin, 450 rpm'de hafifçe sallayın.
NOT: HF'nin dökülmesini önlemek için, mikrosantrifüj tüpünü kapatmak için aşılama bandı kullanın. Protokolün bu adımını gerçekleştirmek için kimyasal bir başlık kullanın. - 2 L deiyonize su ile doldurulmuş 2 L'lik bir cam beher hazırlayın. Mikrokapsül çözeltisini diyaliz cihazlarına (50 kDa MWCO) aktarın ve önümüzdeki 3 gün boyunca her 3 saatte bir suyun tekrar tekrar değiştirilmesiyle deiyonize suya karşı diyaliz edin.
NOT: İlk üç su değişimi sırasında süpernatantı toplayın ve çözeltiyi tehlikeli atık maddeler için belirlenen protokole göre atın. - Mikrokapsülleri toplamak üzere diyaliz cihazlarındaki süspansiyonu yeni 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın.
NOT: Mikrokapsüllerin sulu çözeltilerini birkaç yıl boyunca ortam koşullarında saklayın.
6. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak ipek fibroin mikrokapsüllerinin görüntülenmesi.
- DNA boyası kullanarak DNA boyama işlemi gerçekleştirin.
- 300 μL içi boş ipek fibroin mikrokapsüllerini taze bir 1 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 500 μL RNaz/DNaz içermeyen damıtılmış su ekleyin.
- DNA boyama boyasının 5 μL'sini, kısaca vorteksi ekleyin ve ışıktan korunan 2 saat boyunca RT'de inkübe edin.
- Her seferinde 4 °C'de 20 dakika boyunca 0,1 x g'de santrifüjleme yaparak dört yıkama adımı gerçekleştirin, süpernatantın 400 μL'sini dikkatlice çıkarın ve 400 μL RNaz / DNaz içermeyen damıtılmış su ile doldurun.
- 100x yağ daldırma hedefi (NA 1.49) kullanarak üç büyük lazerle (405 nm, 488 nm, 561 nm) donatılmış ters konfokal sistemlerde ipek kapsüllerin görüntülenmesini gerçekleştirin. Kapsül numunesinin 100 μL'sini 8 kuyucuklu cam slaytlardan oluşan tek bir kuyucuğa aktarın, kapsüllerin görüntülemeden önce 20-30 dakika boyunca çökelmesine izin verin.
NOT: Boyalar fotobeyazlatmaya karşı çok hassastır. Slaytları alüminyum folyo ile kaplayarak numuneleri koruyun.
7. Moleküler ağırlık kesme (MWCO) yöntemi kullanılarak içi boş mikrokapsüllerin geçirgenliğinin tahmini.
- Her biri 2 mL farklı M w (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa ve 2 MDa) farklı Mw (20 μM, diH 2 O) dekstran florofor çözeltilerinin (20 μM, diH2O) her birini hazırlayın.
- Pipet 100 μL kapsüllerin süspansiyonunu, odacıklı bir cam slaytın tek bir kuyucuğuna yerleştirin. Her mikrokapsül tasarımını (PEI konsantrasyonu, DNA plazmidlerinin yükleme sayısı, ipek fibroin konsantrasyonu ve katman sayısı) ayrı ayrı analiz edin.
- Her bir kuyucuğa, en düşük Mw'den en yükseğe kadar 300 μL spesifik florofor çözeltisi ekleyin, böylece her bir kuyucuk spesifik florofor çözeltisine karşılık gelecektir. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve florofor çözeltilerinin difüzyonu dengeye ulaşana kadar karışımın RT'de 1 saat inkübe etmesine izin verin.
- Slaytı bir konfokal lazer tarama mikroskobuna (CLSM) aktarın ve uyarma λ = 488 nm'de 100x yağ daldırma hedefi kullanarak her bir kuyucuğu görüntüleyin.
- Kapsüllerin en büyük çaplı daireler şeklinde göründüğünden emin olmak için odak düzlemini ayarlayarak ilgi alanını tanımlayın. Bu tipik olarak, kapsüller yerçekimi nedeniyle tortu oluşturduğunda numuneleri kuyunun dibine daha yakın görüntülerken olur.
- Slaytı XY yönünde hareket ettirerek mikrokapsül örneklerinin birkaç görüntüsünü toplayın. Her örnek için 100-150 kapsüle kadar hesap verecek şekilde görüntü yakalayın.
- Kapsüllerin içindeki ve dışındaki floresan yoğunluklarını karşılaştırarak her bir Mw florofor çözeltisindeki kapsül zarının geçirgenliğini analiz etmek için ImageJ yazılımını kullanın. Bunun için, kapsülün çevresini ana hatlarıyla belirtmek için bir daire şeklinde bir ilgi alanı (ROI) çizin ve içindeki floresan yoğunluğunu ölçmek için Analiz / Ölçüm'ü tıklayın. Verileri bir e-tabloya dönüştürün. Bu işlemi her mikrokapsül için toplam 200-300 kapsül için gerçekleştirin.
- ROI'yi ana hatlarıyla belirleyerek ve kapsüllerden uzaktaki yoğunluğu ölçerek dış floresan yoğunluğunu aynı şekilde değerlendirin. İstatistiksel analiz için 3-5 ölçüm yapın.
- İstatistiksel analiz yapmak için, kapsüllerin içindeki ve dışındaki floresan yoğunluklarını eşleştirilmiş t-testi kullanarak karşılaştırın (p < 0.05).
- Mw değişkenli FITC-Dextran için hidrodinamik yarıçapa dayanan mikrokapsüllerin geçirgenliğini tahmin etmek için Tablo 2 dönüşümünü kullanın.
8. İpek mikrokapsüllerinde sentetik teofilin riboswitch'in in vitro aktivasyonu
- 1 mL teofilin stok çözeltisi (100 mM, DMSO) hazırlayın. E. coli S30 ekstrakt sistemini, bileşenleri buz üzerinde 40 dakika boyunca çözerek dairesel DNA için hazırlayın.
- 0,5 mL DNaz/RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpü elde edin. İn vitro transkripsiyon/translasyon reaksiyonu gerçekleştirin, hücresiz bileşenleri aşağıdaki sırayla (50 μL toplam hacim) bir mikrokapsül örneği ile birleştirin: Amino asitler olmadan S30 ön karışımı (20 μL); S30 özü, dairesel (15 μL); tam amino asit karışımı (5 μL); adım 4.10'dan (9 μL) itibaren ThyRS-GFPa1 plazmidleri içeren içi boş mikrokapsüller; ve teofilin, 100 mM DMSO (1 μL).
NOT: Tüm bileşenleri ekledikten sonra, tüpü kısaca vorteksleyin ve numuneyi birkaç saniye boyunca 0,2 × g'da kısa santrifüjleme sırasında toplayın. - Tüpü 4 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin ve λ = 488 nm'de uyarma ve GFP / FITC filtresi için emisyon (510 nm ± 20 nm) kullanarak bir plaka okuyucu üzerindeki floresanı kontrol edin.
- Kapsülleri 488 nm ve 561 nm lazerler kullanarak herhangi bir LCSM sisteminde görüntüleyin. 100x yağ daldırma hedefi ve 8 kuyu odacıklı slaytları kullanarak en iyi kalitede görüntüler elde edin.
9. İpek mikrokapsüllerinde brokoli aptamerinin in vitro aktivasyonu
- DFHBI-1T boyasının 1 mL stok çözeltisini (30 μM, diH2O) hazırlayın. PURE (rekombinant elementler kullanılarak protein sentezi) hücresiz sistem reaksiyon kitini, bileşenleri buz üzerinde 40 dakika boyunca çözerek hazırlayın.
- 0,5 mL DNaz/RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpü elde edin. Hücresiz reaksiyon bileşenlerini aşağıdaki sırayla (50 μL toplam hacim) bir mikrokapsül örneği ile birleştirerek in vitro transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirin: çözelti A (20 μL); B çözeltisi (15 μL); adım 4.10'dan (14 μL) itibaren BrocApt plazmidleri içeren içi boş mikrokapsüller; ve DFHBI-1T boya (1 μL).
NOT: Tüm bileşenleri ekledikten sonra, tüpü kısaca vorteksleyin ve numuneyi birkaç saniye boyunca 0,2 × g'da kısa santrifüjleme sırasında toplayın. - Tüpü 37 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin ve λex = 470 nm'de uyarma ve λem = 510 nm ± 20 nm'de emisyon kullanarak bir plaka okuyucu üzerindeki floresanı kontrol edin.
- Kapsülleri 488 nm ve 561 nm lazerler kullanarak herhangi bir LCSM sisteminde görüntüleyin. 100x yağ daldırma hedefini ve 8 kuyucuklu kapak camı odacıklı slaytları kullanarak en iyi kalitede görüntüler elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, çalışma, ipek protein kapsüllerinde kapsüllemeden sonra farklı sensör tasarımlarını (iki tip RNA tarafından düzenlenmiş transkripsiyon / translasyon elemanı) kodlayan DNA şablonlarının işlevselliğini ele almaktadır. Mikrokapsüller, anahtar bileşenlerin şablonlu Katman Katman (LbL) montajı ile hazırlandı: Bir asal katman, sensör tasarımlarını kodlayan DNA plazmidleri ve ipek fibroin biyopolimeri (Şekil 2). Makromoleküllerin katmanlı bir şekilde birikmesi, emilen tabakalar ile kabuğun kalınlığı arasındaki moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlere dayanarak kapsül zarının geçirgenliğinin kontrol edilmesini sağlar. Sistemin ayarlanabilir geçirgenliği, büyük istenmeyen makromoleküllerin kapsül zarı20 boyunca difüzyonunu sınırlarken, esansiyel moleküllerin difüzyonunu kontrol etme potansiyeli sundu.
Homojen boyutta (4,5 μm) ve hidratlanmış halde ~500 nm (20 katman) kabuk kalınlığına sahip sağlam ipek fibroin mikrokapsüller, protokol düzgün bir şekilde takip edildiğinde üretilebilir (Şekil 3)21. LbL yaklaşımı, plazmidlerin başlangıç konsantrasyonuna dayanarak DNA şablonlarının yükleme kapasitesini ayarlamaya izin verdi. Optimal DNA yüklemesi, DNA şablonlarının başlangıç konsantrasyonunu 50-200 ng / μL'den değiştirerek elde edilebilir. Tablo 1, LbL kapsüllemesinin tamamlanmasından sonra tek bir mikrokapsülde tutulan DNA kopyalarının sayısını temsil eder ve Denklem 1'e göre ilk DNA konsantrasyonlarına ve DNA plazmidlerinin Mw'sine dayanarak her sensör tasarımı için hesaplanmıştır. ThyRS ve BrocApt sensör tasarımları için sırasıyla 32 ve 20 DNA kopyası ile optimum DNA yükleme kapasitesine ulaşıldı. Yükleme kapasitesinin değerlendirilmesi, kapsüllenmiş DNA konsantrasyonlarının doğru bir tahminine sahip olmak ve daha konsantre kapsül örnekleri ekleyerek sensörlerin IVTT aktivasyonu sırasında titre edebilmek için önemliydi.
Kapsül kabuklarının geçirgenliği, MWCO yöntemi izlenerek sistematik olarak analiz edilebilir. Yöntem, kapsül zarından nüfuz edemeyen çözünmüş moleküllerin moleküler ağırlığına dayanarak zarın gözenek boyutunu tahmin eder. Mikrokapsülleri değişken Mw florofor moleküllerine maruz bırakarak ve çoklu kapsüller arasında en büyük çapa karşılık gelen odak düzleminde konfokal görüntüleme yaparak, kabuk zarlarının geçirgenliği değerlendirilebilir. ImageJ analizi, kapsüllerin içindeki ve dışındaki floresan yoğunluklarını tahmin etmeye ve tam geçirgen (dış ve iç florofor yoğunlukları karşılaştırılabilir), kısmen geçirgen (kapsüllerin% 50-70'inin dışına kıyasla daha düşük floresansı vardı) ve geçirgen olmayan (iç florofor yoğunluğu dış yoğunluğa göre daha düşüktü) membranları tanımlamaya olanak tanır (Şekil 4). Her florofor için Mw'nin hidrodinamik yarıçapa dönüştürülmesi, kapsül membranının ağ boyutunun tahmin edilmesini sağlar (Tablo 2).
Protein kapsüllerinin seçici geçirgenliği, LbL biriktirme protokolünün sistematik optimizasyonu sırasında, bir asal tabakanın değişken konsantrasyonları (0-6 mg / mL'den), bir ipek fibroin konsantrasyonu (0.5-2 mg / mL'den) ve biriken tabakaların sayısı (10-25'ten) kullanılarak optimum geçirgenlik elde edilene kadar elde edilebilir. Bu protokolde, asal tabaka olarak 6 mg/mL PEI ve LbL montajı sırasında biriken 20 kat 1 mg/mL ipek fibroin ile 25-32 nm arasında optimum geçirgenlik elde edilmiştir (Şekil 4). Bu geçirgenlik aralığı, IVTT sisteminin bileşenlerinin kapsül kabuğundan sızması için idealdi. Tipik olarak, herhangi bir IVTT sisteminin en büyük moleküler kompleksleri, ribozomal bir komplekste mRNA ile bağlandığında, 22 boyutunda ~20 nm'ye kadar ulaşabilen prokaryotik ribozomal birimler, 30S ve 50S'dir. Geliştirilen mikrokapsül kabuklarının yapısı, LbL montajı sırasında üretilen β tabaka bloklarla fiziksel olarak çapraz bağlanan oldukça iç içe geçmiş bir ipek elyaf katmanları ağına benzer. Bu zar yapısı yarı geçirgendir: küçük moleküllere (örneğin, iyonlar, amino asitler, peptitler, şekerler, vb.) yüksek derecede geçirgendir ve yalnızca 25 nm'den daha az hidrodinamik yarıçapa sahip moleküllerin sızmasına izin veren büyük moleküllerle (örneğin, yüksek moleküler ağırlıklı proteinler, glikoproteinler, hücreler vb.) sınırlıdır. Bu nedenle, optimal DNA yüklemesi ve membran geçirgenliğine sahip ipek fibroin mikrokapsülleri, IVTT aktivasyonu için biyoreaktör taşıyıcıları olarak kullanılabilir.
ThyRS ve BrocApt tasarım sensörlerinin transkripsiyonel ve translasyonel aktivitesi, piyasada bulunan IVTT sistemleri kullanılarak test edilebilir. ThyRS, teofilin ligandının varlığında muhabir genin translasyonel aktivasyonunu gerektirir. Sentetik ThyRS'nin aktivasyonu, mRNA sentezi, analite bağlandıktan sonra mRNA dizisinin konformasyonel değişimi, ribozom bağlanma bölgesinin salınması ve raporlayıcı GFPa1 proteininin sentezi dahil olmak üzere gen ekspresyonunu başlatmak için birkaç adım içerir. Tüm bu adımlar, IVTT bileşenlerinin kapsül membranı boyunca serbest difüzyonunu gerektirir. DNA yüklü ipek fibroin mikrokapsüllerinin önerilen tasarımı, RNA tarafından düzenlenen sensör tasarımlarının aktivasyon parametrelerini geliştirdi: Hem ekspresyon kinetiği hem de floresan çıktısı, serbest immobilize edilmemiş DNA'ya kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 5A). CLSM görüntüleme ayrıca ThyRS sekanslarını kodlayan DNA plazmidleri ile yüklü kapsüller içinde başarılı GFPa1 gen aktivasyonunu doğruladı (Şekil 5B-D).
Alternatif olarak, BrocApt sensör tasarımının aktivasyonu, DHFBI-1T boyasının varlığında T7 E. coli promotör kuplajlı transkripsiyon / translasyonu destekleyen IVTT sisteminde gerçekleştirildi. Floresan çıkışı, florojenik boyanın mRNA dizisine bağlanmasıyla başlatıldı. Önemli olarak, ipek mikrokapsüllerinden gelen çıkış sinyali, eşdeğer konsantrasyonlardaki kapsüllenmemiş DNA örneklerine kıyasla birkaç kat daha yüksekti (Şekil 6). Bu nedenle, ipek fibroin mikrokapsülleri, DNA ile kodlanmış sensör elemanlarının temel işlevselliğini koruyabilir; bu, ilgilenilen analitlerin hızlı ve hassas bir şekilde tespiti için yeni tip in vitro biyosensör platformlarının tasarımı için önemli olabilir.
Resim 1: pSALv-RS-GFPa1'in plazmid haritası ve dizisi . (A) Plazmid, ampisilin direncinden sorumlu ptac promotörü, β-laktamaz (bla) kodlayan genin kontrolü altında GFPa1 kodlayan genin yukarı akımına yerleştirilmiş teofilin riboswitch (ThyRS) dizisini içerir. (B) ptac promotör dizisi kalın ve altı çizili olarak gösterilir; teofilin riboswitch dizisi kalın italik olarak gösterilmiştir; GFPa1 kodlama sırası kalın olarak gösterilir; kısıtlama siteleri dizilerinin altı çizilidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Katman Katman yaklaşımını kullanarak mikrokapsüllerin hazırlanmasına genel bakış. Bozulmamış SiO2 çekirdekleri ilk olarak PEI polimeri ile işlevselleştirildi, ardından istenen sayıda ipek protein katmanı adsorbe edilene kadar farklı sensör tasarımlarını ve ipek fibroin katmanlarını kodlayan DNA plazmidlerinin sıralı birikimi izledi. Çeşitli DNA sensör tasarımları içeren içi boş bozulmamış mikrokapsüller, kurban çekirdekleri çözülerek üretilebilir. Mikrokapsül içinde kapsüllenmiş her bir biyosensör tasarımının aktivasyonu, karşılık gelen ligandların varlığında IVTT reaksiyonları sırasında sağlanabilir. Bu rakam Drachuk, I. et al.21'den yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DNA yüklü mikrokapsüller için mikroskopi çalışmaları . (A) Kesitsel 2D ve (B) ThyRS'yi kodlayan DNA plazmidleri ile yüklenen içi boş (SF)20 mikrokapsülün 3D konfokal mikroskopi görüntüleri (32 DNA kopyaları/kapsülü) ve 6 mg/mL PEI astarlı SiO2 çekirdeklerinden üretilmiştir. DNA plazmidlerinin lokalizasyonunu tanımlamak ve kapsül membran kalınlığını tahmin etmek için ipek fibroin kapsüllerinden (DAPI kanalı, mavi) ve boyanmış DNA'dan (FITC kanalı, yeşil) otofloresan uygulandı. (A) içindeki girinti, kapsül boyunca DNA ve ipek fibroin kabukları için yoğunluk profillerini temsil eder. Ölçek çubuğu: 2 μm. (B) içindeki girinti, kapsül kabuğu boyunca ipek proteininin yoğunluk profilini temsil eder. Membran kalınlığı yarım yoğunluklu pikteki uzunluk olarak ölçüldü. Kesitsel görüntülerin işlenmesi ve 3D render, Nikon C2+ sistemindeki NIS görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakam Drachuk, I. et al.21'den yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MWCO yöntemi kullanılarak ipek mikrokapsülleri için membran geçirgenliğinin tahmini. Çeşitli Mw (20 μM, diH2O) FITC-Dextran çözeltilerine tabi tutulan içi boş ipek fibroin mikrokapsüllerinin seçici CLSM temsili floresan görüntüleri. Kapsüller farklı sayıda katman ve PEI konsantrasyonları ile hazırlandı. Bir asal tabakanın konsantrasyonundaki bir artış, daha geçirgen kabuklara sahip mikrokapsüllerin kolloidal stabilitesinin artmasına neden olurken, asal tabakanın ortadan kaldırılması, daha az geçirgen kabuk zarlarına sahip kapsüllerin toplanmasına neden olur. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu rakam Drachuk, I. et al.21'den yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İpek fibroin mikrokapsüllerinde ThyRS sensör tasarımının aktivasyonu. (A) 20 katmanlı SF mikrokapsüllerine (kırmızı renkli çizgiler) yüklenen DNA plazmidlerinden ThyRS aktivasyonu sırasında GFPa1 ekspresyonu için kinetik ve kapsüllenmemiş DNA'yı (mavi renkli çizgiler) kontrol eder. Yukarıdan aşağıya, bir numune hacmindeki (50 μL) DNA konsantrasyonları 6.5 ng / μL, 4.5 ng / μL, 2.5 ng / μL ve 0 ng / μL idi ve renk yoğunluklarındaki değişikliklere karşılık geliyordu. (B) Kapsül başına 32 DNA kopyası ile yüklenen ipek fibroin kapsüllerin CLSM görüntüleri. Ölçek çubuğu: 5 μm. (C) Görüntü, iki kapsül boyunca (B) görüntüye karşılık gelen kesitsel yoğunluk profillerine karşılık gelir (B'de beyaz çizgi). Kırmızı çizgi ipek kapsülleri temsil eder ve yeşil çizgi kapsüllerle ifade edilen GFPa1'i temsil eder. (D) Görüntü, IVTT sisteminde inkübasyondan sonra 32 kopya DNA ile yüklenen işlenmiş 3D ipek kapsülleri temsil eder. Yeşil floresan GFPa1 sinyaline karşılık gelir ve kırmızı floresan floresan floresan etiketli ipek tabakalarına karşılık gelir. Ölçek çubuğu: 2 μm. ThyRS aktivasyonu, IVTT sistemindeki (S30 ekstrakt) mikrokapsüllerin inkübasyonu sırasında teofilin (2 mM, DMSO) ile gerçekleştirildi. Bu rakam Drachuk, I. et al.21'den yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İpek fibroin mikrokapsüllerinde BroccApt'ın aktivasyonu. Transkripsiyon kinetiğinin karşılaştırılması, kapsül başına 30 DNA kopyası (kırmızı renkli çizgiler) ve kapsüllenmemiş DNA'yı (mavi renkli çizgiler) kontrol eden 20 katmanlı ipek mikrokapsüller için yapıldı. Yukarıdan aşağıya, bir numunedeki kapsüllenmiş DNA konsantrasyonları şunlardı: 3.6 ng / μL, 2 ng / μL, 1 ng / μL ve 0 ng / μL ve renk yoğunluklarındaki değişikliklere karşılık gelir. Kapsüllenmemiş DNA konsantrasyonları: 20 ng / μL, 10 ng / μL, 5 ng / μL ve 0 ng / μL idi ve renk yoğunluklarındaki değişikliklere karşılık geliyordu. Aktivasyon, PURE hücresiz sistemde inkübasyon sırasında DHBFI-1T (100 μM, diH2O) ile gerçekleştirildi. Bu rakam Drachuk, I. et al.21'den yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| DNA Sensör Tasarımı | Başlangıç DNA Konsantrasyonu (ng/μL) | Kapsül başına DNA kopya sayısı (DNA / kapsül) |
| 50 | 16 | |
| ThyRS | 100 | 32 |
| 150 | 48 | |
| 200 | 64 | |
| 50 | 10 | |
| BrocApt | 100 | 20 |
| 150 | 30 | |
| 200 | 40 |
Tablo 1: Her DNA tasarımı için kapsül başına DNA kopya numarası. Kopya sayısı Denklem 1'e göre hesaplandı ve DNA plazmidlerinin başlangıç konsantrasyonu, LbL biriktirme işlemi sırasında DNA dizilerinin retansiyon afinitesi ve DNA plazmidlerinin uzunluğu ile ilişkilendirildi.
| FITC-Dextran Mw (kDa) | Hidrodinamik Yarıçap (nm) |
| 4 | 1.4 |
| 20 | 3.3 |
| 40 | 4.5 |
| 70 | 6 |
| 150 | 8.5 |
| 250 | 10 |
| 500 | 14 |
| 2,000 | 18 |
Tablo 2: FITC-dextrans'ın fiziksel özellikleri. İçi boş ipek fibroin mikrokapsüllerinin geçirgenliğini tahmin etmek için her florofor için hidrodinamik yarıçap kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolü takiben çeşitli DNA kodlu sensör tasarımları ile yüklenen seçici geçirgen hidrojel mikrokapsüller hazırlanabilir. LbL yaklaşımının ayırt edici özelliklerinden biri, genellikle moleküler türlerin kurban şablonları üzerinde adsorpsiyonuyla başlayan aşağıdan yukarıya montaj sırasında mikrokapsüllerin karmaşıklığını uyarlama yeteneğidir. İlk bileşenlerin konsantrasyonlarını, pH koşullarını ve katman sayısını dikkatlice ayarlayarak, farklı DNA yükleme parametrelerine, işlevselliğine ve ayarlanabilir geçirgenliğine sahip mikrokapsüller hazırlanabilir23. Kapsüllerin çok yönlülüğünü arttırmak için, in vivo teşhis için biyouyumlu sensör taşıyıcılarının uygulanması için kabuk yüzeyinin AuNP'ler ve IgG ile daha fazla işlevselleştirilmesi sağlanabilir. Bu alternatif yolların her ikisi de ipek fibroininin benzersiz moleküler yapısına dayanır. Au3+ iyonlarının yerinde indirgenmesi, optimal bir indirgeme tamponu varlığında metal iyonlarını indirgeyebilen tirozin kalıntılarının (% 5.3 mol.) varlığı nedeniyle gerçekleştirilebilir. AuNP'ler tarafından işlevselleştirilmiş protein mikrokapsüllerinin yüzeyine spesifik antikorların konjugasyonu, karbodiimid aktivasyon kimyasının uygulanmasıyla yapılabilir . Bu adımların her ikisi de, gelecekteki uygulamalar için biyosensör kapsüllerinin uygun işlevselliğini elde etmek için protokolün dikkatli bir şekilde geliştirilmesini ve optimizasyonunu gerektirir. Örneğin, bu mikrokapsülleri, moleküler bir kargonun belirli uyaranlar (pH veya kimyasal ipuçları gibi) üzerine teslim edildiği "akıllı" dağıtım sistemleri olarak kullanmak için, bu kapsüllerin spesifik özellikleri, teslimat verimliliği, tutma süresi, uygulama yolu ve hastalık modeli tedavileri dahil olmak üzere karakterize edilmeli ve ayarlanmalıdır.
DNA yüklü mikrokapsüller CLSM tekniği ve floresan ölçümleri ile karakterize edildi. Bununla birlikte, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), kriyojenik elektron tomografisi (CEM) ve doğrudan stokastik rekonstrüksiyon süper çözünürlüklü mikroskopi (dSTORM) gibi diğer karakterizasyon yöntemleri, bireysel lifler, nanodomainler ve DNA plazmidlerinin lokalizasyonu dahil olmak üzere mikrokapsüllerin spesifik yapılarını ayırt etmek için uygulanabilir24,25,26.
Geliştirilen protokol, ipek fibroin biyopolimerinin, yüklü DNA plazmidlerinin üçüncül yapısını koruyan biyouyumlu bir ağ malzemesi olarak kullanımını vurgulamaktadır. İpek fibroin ağı içindeki hareketsiz DNA dizilerinin stabilitesi, pH inaktivasyonuna, oksidasyona veya hidrolize karşı koruyucu bir mikro ortam sağlayan hidrofobik etkileşimler ve / veya hidrojen bağı yoluyla gerçekleşir27. Ek olarak, ipek fibroininin β-kristalin alanları, sıkışmış makromoleküllerin hareketini kısıtlayan ve DNA plazmidlerinin sulu çözeltilerde depolanması sırasında bozulmasını önleyen benzersiz bir mekanik bariyer sağlar.
DNA şablonlarıyla yüklü ipek fibroin mikrokapsüllerinin yarı geçirgen doğası, IVTT reaksiyonları için benzersiz mekansal ve fizikokimyasal koşullar yarattı. İpek fibroin mikrokapsüllerinde hareketsiz hale getirilmiş transkripsiyonel ve translasyonel olarak aktive edilmiş RNA aptamer ve riboswitch, serbest immobilize edilmemiş sensörlere kıyasla en az üç kat daha yüksek bir çıkış sinyali üretebildi. Ek olarak, DNA şablonlarının mikrokapsüllerdeki immobilizasyonu, kapsüllenmiş sensörlerin aktivitesini, kapsüllenmemiş olanların algılama sınırının ötesinde önemli ölçüde artırabilir. Kapsüllenmemiş sensörler düşük DNA konsantrasyonlarında minimum tepkiye sahipken, kapsüllenmiş sensörler DNA konsantrasyonlarındaki ince değişiklikleri yansıtmak için kolayca titre edilebilen çok farklı bir çıkış tepkisine sahipti. Kapsüllenmiş muhabirlerin geliştirilmiş tepki sinyali, IVTT makinesinin bileşenlerinin sınırsız difüzyonu ve DNA plazmidlerinin hareketliliğinin azalmasından kaynaklanıyordu. Birçok çalışma, hücresiz reaksiyonlarda protein sentezinin veriminin makromoleküler ortama bağlı olduğunu kabul etmiştir28,29. DNA plazmidlerinin ipek ağına immobilizasyonu, oligonükleotidlerin hareketini kısıtlayan ve birkaç DNA kopyasından bile transkripsiyon / translasyon mekanizması reaksiyonlarını hızlandıran etkili bir sınırlı ortam sağlamıştır21.
LbL yöntemi, çok işlevli montajları kontrol edilebilir bir şekilde oluşturmak için çok yönlü bir yaklaşım sağlarken, imalat prosedürü nispeten zaman alıcıdır ve tipik olarak mikrokapsül verimini artırmak için işleme ayarlamaları gerektirir. Biyomolekül bazlı mikrokapsüllerin yapımında göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus, herhangi bir sistemin LbL birikimi tamamlandıktan sonra çekirdek çözünmesi gereksinimi ile uyumluluğudur. Şimdiye kadar, homojen boyutta ve sağlam içi boş ipek bazlı DNA yüklü mikrokapsüller üretmek için, kabuklar kurban silika (SiO2) çekirdek şablonları üzerinde biriktirildi ve bu da daha sonra hidroflorik (HF) asit aşındırma ile çıkarılmasını gerektirdi. HF elleçleme veya gravür, pratik uygulamalarda yaygın kullanımlarını sınırlayan biyouyumlu süreçler olarak kabul edilmez. SiO2 inorganik kolloidal şablonlarına alternatif olarak, karbonat çekirdekleri tipik olarak polimer tabakaları ile kompleksler oluşturmada inerttir ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak hafif koşullar altında çözülebilir. Bununla birlikte, kurban çekirdeklerinin ayarlanması, çok katmanların biriktirme özelliklerini ve protokolün daha fazla optimizasyonunu gerektiren kabuk yapısının bütünlüğünü etkileyebilir.
Özetle, mevcut protokol, farklı sensör tasarımlarına sahip ipek bazlı DNA yüklü mikrokapsüllerin hazırlanmasına izin vermektedir. LbL yöntemiyle sağlanan sınırlı bir mikro ortamın kombinasyonu ve ipek fibroinin biyouyumlu bir malzeme olarak kullanılması, kapsüllenmiş DNA'nın algılama özelliklerini geliştirmiştir. Florojenik RNA aptamer teknolojisinin hızla gelişmesiyle, DNA yüklü ipek mikrokapsüllerin potansiyel kullanımı, çoklanmış in vitro teşhise genişletilebilir. Son zamanlarda, RNA bazlı floresan aptamerlerin çeşitli varyasyonları, yüksek sinyal-gürültü oranı duyarlılığı30,31 olan canlı hücrelerde RNA'yı görüntülemek için güçlü arka plansız teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Yapay RNA aptamerleri tasarlamak için sentetik RNA nanoteknolojisi uygulanarak, aptamerlerin florojenik özellikleri, ilgilenilen spesifik ligandları tespit etmek için kullanılabilir. Bu teknoloji, kullanım noktası kağıt bazlı sensörler, ter veya interstisyel sıvı için hidrojel bazlı yamalar ve implante edilebilir malzemeler dahil olmak üzere farklı formatlardaki biyobelirteçleri izlemek için özellikle değerli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Burada sunulan görüş ve düşünceler yazarların görüşleridir ve mutlaka DoD'nin veya Bileşenlerinin görüşlerini temsil etmez
Acknowledgments
Bu çalışma, Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi'nden LRIR 16RH3003J hibesi ve ABD Savunma Bakanlığı Araştırma ve Mühendislik Müsteşarlığı Ofisi'nin S&T Önceliklerinin Geliştirilmesi için Askeri Ortamlar için Sentetik Biyoloji Uygulamalı Araştırma (ARAP) programı ile desteklenmiştir.
ThyRS için plazmid vektör dizisi (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) Dr. J. Gallivan tarafından cömertçe sağlanmıştır. Bombyx mori'den ipekböceği kozaları, Tufts Üniversitesi, MA'dan Dr. D.L. Kaplan tarafından cömertçe bağışlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N.
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
