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Biology

डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग आरएनए एपटामर और राइबोस्विच से भरे बहुक्रियाशील रेशम-आधारित माइक्रोकैप्सूल की तैयारी

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/62854
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2
1UES Inc., 2711th Human Performance Wing, Airman Systems Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson AFB, 3Materials and Manufacturing Directorate, Wright-Patterson AFB

Summary

प्रोटोकॉल में मजबूत और बायोकंपैटिबल डीएनए से भरे माइक्रोकैप्सूल के गठन का वर्णन किया गया है, जो कई लिगेंड को ट्रैक करने में सक्षम मल्टीप्लेक्स इन विट्रो बायोसेंसर के रूप में है।

Abstract

हम बलिदान गोलाकार कोर पर परत-दर-परत (एलबीएल) असेंबली विधि के माध्यम से डीएनए से भरे रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। एक प्रमुख परत और डीएनए प्लास्मिड के सोखने के बाद, एक एकल रेशम परत के तीव्र निर्जलीकरण के दौरान रेशम द्वितीयक संरचना में β-शीट को प्रेरित करके मजबूत माइक्रोकैप्सूल के गठन की सुविधा प्रदान की गई थी। इसलिए, लेयरिंग कई हाइड्रोजन बॉन्डिंग और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से हुई। बहुस्तरीय गोले के सोखने पर, कोर-शेल संरचनाओं को रिमोट सेंसिंग और / या लक्षित वितरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) और / या एंटीबॉडी (आईजीजी) के साथ आगे कार्यात्मक बनाया जा सकता है। सिलिका कोर पर प्रमुख मैक्रोमोलेक्यूल्स के अनुक्रमिक जमाव के दौरान कई प्रमुख मापदंडों को समायोजित करना जैसे कि बहुलक प्राइमर की उपस्थिति, डीएनए और रेशम प्रोटीन की एकाग्रता, साथ ही साथ कई अधिशोषित परतों के परिणामस्वरूप परिवर्तनीय पारगम्यता और डीएनए लोडिंग के साथ जैव-संगत, डीएनए से भरे माइक्रोकैप्सूल होते हैं। सिलिका कोर के विघटन पर, प्रोटोकॉल ने कैप्सूल झिल्ली की आंतरिक सतह पर डीएनए प्लास्मिड के साथ खोखले और मजबूत माइक्रोकैप्सूल के गठन का प्रदर्शन किया। डीएनए प्लास्मिड और बाहरी वातावरण के बीच एक चुनिंदा पारगम्य जैव-संगत झिल्ली बनाने से डीएनए को दीर्घकालिक भंडारण के दौरान संरक्षित किया गया और स्थानिक रूप से सीमित प्लास्मिड से बेहतर आउटपुट प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं (सेल-फ्री सिस्टम) के दौरान डीएनए टेम्प्लेट की गतिविधि और उनकी पहुंच का परीक्षण किया गया था। आरएनए लाइट-अप एपटामर और राइबोस्विच को एन्कोडिंग करने वाले डीएनए प्लास्मिड को संबंधित विश्लेषणों के साथ सफलतापूर्वक सक्रिय किया गया था, जैसा कि शेल झिल्ली में फ्लोरोसेंटली लेबल आरएनए ट्रांस्क्रिप्ट या जीएफपीए 1 प्रोटीन के स्थानीयकरण के दौरान कल्पना की गई थी।

Introduction

सिंथेटिक जीव विज्ञान का क्षेत्र सूक्ष्मजीवों द्वारा विकसित प्राकृतिक तंत्र का दोहन करके संवेदन क्षमताओं को विकसित करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है ताकि उनके पर्यावरण और संभावित खतरों की निगरानी की जा सके। महत्वपूर्ण रूप से, ये संवेदन तंत्र आम तौर पर एक प्रतिक्रिया से जुड़े होते हैं जो इन सूक्ष्मजीवों को हानिकारक जोखिम से बचाता है, नकारात्मक प्रभावों को कम करने या विषाक्त पदार्थों के सेवन को रोकने के लिए जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करता है। इन प्राकृतिक प्रतिक्रियाओं का लाभ उठाते हुए पूरे सेल सेंसर बनाने के लिए इन सूक्ष्मजीवों को इंजीनियर करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए हैं, लेकिन उन्हें नए लक्ष्यों को पहचानने और / या एक औसत दर्जे का संकेत उत्पन्न करने के लिए फिर से निर्देशित किया गया है जिसे परिमाणीकरण उद्देश्यों (आमतौर पर प्रतिदीप्ति) 1,2 के लिए मापा जा सकता है। वर्तमान में, आनुवंशिक रूप से संशोधित सूक्ष्मजीवों (जीएमओ) के उपयोग के साथ चिंताएं, विशेष रूप से जब पर्यावरण या मानव शरीर में जारी होती हैं, पूरी कोशिकाओं या उनकी कुछ आनुवंशिक सामग्री के रिसाव के कारण, भले ही बहुलक मैट्रिक्स में समझाया गया हो, सुझाव देते हैं कि इन संवेदन दृष्टिकोणों का फायदा उठाने के वैकल्पिक तरीकोंकी आवश्यकता है।

जीएमओ की तैनाती की चिंता के बिना सूक्ष्मजीव-आधारित संवेदन के लाभों का फायदा उठाने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन / अनुवाद (आईवीटीटी) सिस्टम का उपयोग है। एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से, आईवीटीटी सिस्टम में एक मिश्रण होता है जिसमें एक सक्रिय अवस्था में अधिकांश सेल घटक होते हैं जिन्हें विभिन्न माध्यमों से कोशिकाओं से "निकाला" जाता है, जिसमें सोनिकेशन, बीड-बीटिंग या अन्य4 शामिल हैं। इस प्रक्रिया का अंतिम उत्पाद एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया मिश्रण है जो पहले से ही प्रतिलेखन और अनुवाद करने के लिए अनुकूलित है जिसका उपयोग पूरे कोशिकाओं (झिल्ली प्रसार, परिवर्तन दक्षता, सेल विषाक्तता, आदि) के उपयोग से जुड़ी बाधाओं के बिना "खुले पोत" प्रारूप में विभिन्न सेंसर का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न सेंसर घटकों को मात्रात्मक रूप से जोड़ा जा सकता है, और उनके प्रभाव का अध्ययन विभिन्न ऑप्टिकल और स्पेक्ट्रोमेट्रिक तकनीकों द्वारा किया जाता है, जैसा किहमने 5 का प्रदर्शन किया है। यह देखा गया है कि आईवीटीटी सिस्टम का प्रदर्शन असंगत हो सकता है; हालांकि, हाल के अध्ययनों ने उनकी तैयारी और लक्षण वर्णन को मानकीकृत करने के लिए दृष्टिकोण दिखाए हैं, जो सेंसर डिजाइन6 में उनके प्रदर्शन का अध्ययन करते समय बहुत मदद करता है। हाल ही में, पेपर मैट्रिसेस में अपने घटकों के लियोफिलाइजेशन के माध्यम से पेपर-आधारित परख बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले आईवीटीटी सिस्टम के कई उदाहरणों का प्रदर्शन किया गया है, जिसमें भारी धातु आयनों, दवाओं, कोरम सेंसिंग तत्वों और अन्य 7,8,9 का पता लगाना शामिल है। आईवीटीटी-आधारित सेंसर के लिए एक रोमांचक अनुप्रयोग स्थान मिट्टी, पानी और मानव शरीर सहित विभिन्न प्रकार के वातावरण में संवेदन अनुप्रयोगों में उनका उपयोग है। इन चुनौतीपूर्ण वातावरणों में इन आईवीटीटी प्रणालियों को तैनात करने के लिए, आईवीटीटी घटकों को शामिल करने और उन्हें क्षरण से बचाने के लिए एक एनकैप्सुलेशन दृष्टिकोण को लागू करने की आवश्यकता है।

आईवीटीटी सिस्टम के लिए सबसे आम एनकैप्सुलेशन दृष्टिकोण में लिपिड कैप्सूल, मिसेल, पॉलिमरसोम और अन्य कसकर संलग्न माइक्रोकंटेनर10,11,12 का उपयोग शामिल है। इस दृष्टिकोण का एक नुकसान बाहरी वातावरण के साथ संचार की अनुमति देने और संवेदन क्षमताओं को प्रदान करने के लिए कंटेनरों के अंदर और बाहर सामग्री परिवहन के लिए निष्क्रिय या सक्रिय तंत्र को शामिल करने की आवश्यकता है। इनमें से कुछ मुद्दों को दूर करने के लिए, अध्ययन यहां एक विधि की रिपोर्ट करता है जो आईवीटीटी सिस्टम में व्यक्त किए जाने वाले विभिन्न सेंसर डिजाइनों के लिए एन्कोडिंग सामग्री को समाहित करने के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण उच्च छिद्र के साथ खोखले माइक्रोकैप्सूल बनाने के लिए रुचि के प्लास्मिड की उपस्थिति में एक बायोपॉलिमर के परत-दर-परत (एलबीएल) जमाव के उपयोग पर आधारित है, जो संरक्षित आनुवंशिक सामग्री को पसंद के आईवीटीटी के विभिन्न घटकों के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है। अध्ययन से पता चला है कि इस बहुलक मैट्रिक्स के भीतर सक्रिय होने पर एनकैप्सुलेटेड प्लास्मिड प्रतिलेखन और अनुवाद को निर्देशित कर सकते हैं, जैसा कि प्लास्मिड-एन्कोडेड एपटामर और उनके संबंधित लक्ष्यों के लिए राइबोस्विच की प्रतिक्रिया के साथ दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, यह एलबीएल कोटिंग किसी भी विशेष भंडारण स्थितियों के बिना महीनों तक प्लास्मिड की रक्षा करती है।

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Protocol

1. प्लास्मिड वेक्टर का निर्माण।

  1. एक प्लास्मिड वेक्टर (पीएसएएलवी-आरएस-जीएफपीए 1, 3.4 केबी) का निर्माण एक थियोफिलाइन राइबोस्विच (थाइआरएस) के कोडिंग अनुक्रम के प्रवर्धन द्वारा पीजे 201: 23976-आरएस-जीएफपीए 1 वेक्टर (डीएनए 2.0 द्वारा डिजाइन और बनाया गया) से जीएफपीए 1 के साथ मिलकर और ई कोलाई अभिव्यक्ति वेक्टर, पीएसएएल13 में सम्मिलन द्वारा। जीएफपीए 1 के साथ युग्मित थाइआरएस के कोडिंग अनुक्रम को बढ़ाने के लिए फॉरवर्ड (5'-सीजीटीजीटीएसीजीजीटीएसीएजीटीसीजीटीजीटीजी-3') और रिवर्स (5'-सीजीटीजीसीटीसीएजीसीटीएएजीसीसीसीजीटीसीजीटीएजीटीजी-3') प्राइमरों का उपयोग करें और निर्माता के प्रोटोकॉल14 के अनुसार डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके 50 μएल वॉल्यूम में पीसीआर प्रतिक्रिया करें।
  2. 0.5 ग्राम अगारोस, 50 एमएल टीएई बफर (40 एमएम ट्रिस एसीटेट, 1 एमएम ईडीटीए, पीएच 8.0), और 3 μL डीएनए दाग से 1% एगारोस जेल तैयार करें।
  3. पीसीआर-प्रवर्धित उत्पाद के 5 μL एलिकोट को 5 μL RNase / DNase-मुक्त पानी और 2 μL 6x जेल लोडिंग डाई के साथ मिलाएं और Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण करें। संदर्भ के रूप में एक डीएनए सीढ़ी (0.1-10.0 केबी) लोड करें। जेल को 120 वी पर चलाएं जब तक कि डाई लाइन जेल के नीचे लगभग न पहुंच जाए।
  4. डीएनए15 के सही आकार की जांच करने के लिए यूवी ट्रांसलुमिनेटर इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके डीएनए टुकड़ों की कल्पना करें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल16 के अनुसार पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें।
  6. पीसीआर उत्पाद और पीएसएएल अभिव्यक्ति वेक्टर को 15 μL प्रतिक्रिया में KpnI और BLPI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचाएं, जिसमें पीसीआर उत्पाद या प्लास्मिड वेक्टर (एकाग्रता 20-50 ng / μL), 10x एंजाइम बफर का 1.5 μL, प्रत्येक एंजाइम का 1 μL, और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 μL RNase / DNase-मुक्त पानी होता है।
  7. प्रतिक्रिया मिश्रण में 6x जेल लोडिंग डाई के 3 μL जोड़ें और चरण 1.3-1.5 में वर्णित 1% Agarose जेल पर पचे हुए टुकड़ों को अलग करें।
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल16 के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए टुकड़ों को शुद्ध करें।
  9. पचे हुए पीसीआर उत्पाद को एक पचे हुए रैखिक प्लास्मिड वेक्टर, पीएसएएल में मिलाएं, जिसमें टी 4 डीएनए लिगेज का उपयोग किया जाता है और 10 μएल प्रतिक्रिया में पूरक लिगेज बफर होता है जिसमें 3-20 एफएमओएल पचा हुआ वेक्टर, 9-60 एफएमओएल पचा हुआ पीसीआर उत्पाद, 2 μL लिगेज बफर, 1 μL (1 यूनिट) T4 डीएनए लिगेज, और DNase / RNase-मुक्त पानी होता है। 3 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर बंधाव प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया मिश्रण में कुल डीएनए सामग्री 0.01-0.1 μg है।
  10. निर्माता के प्रोटोकॉल17 के अनुसार 10 एनजी बंधाव प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ ई कोलाई डीएच 5 सक्षम कोशिकाओं को बदलें।
  11. एम्पीसिलिन (100 μg / mL) के साथ पूरक एलबी-एगर प्लेटों पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तित कोशिकाओं को विकसित करें।
  12. प्लेट से 3-4 जीवाणु कालोनियों को चुनें और उनमें से प्रत्येक को एम्पीसिलीन (100 μg / mL) के साथ पूरक 5 मिलीलीटर एलबी मीडिया में स्थानांतरित करें। 225 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों को विकसित करें।
  13. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 11 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा रात भर की संस्कृतियों को पेलेट करें।
  14. निर्माता के प्रोटोकॉल16 के अनुसार प्लास्मिड को शुद्ध करने के लिए एक शुद्धिकरण किट का उपयोग करें।
  15. डीएनए अनुक्रमण द्वारा शुद्ध प्लास्मिड के अनुक्रमों को सत्यापित करें। प्लास्मिड मानचित्र और परिणामी निर्माण का अनुक्रम (पीएसएएलवी-आरएस-जीएफपीए 1) चित्र 1 में दिखाया गया है।

2. बड़े पैमाने पर डीएनए शुद्धिकरण।

  1. प्लास्मिड वेक्टर पीएसएएलवी-आरएस-जीएफपीए 1 (3.4 केबी) (जीएफपीए 1 रिपोर्टर जीन के साथ युग्मित थियोफिलाइन राइबोस्विच एन्कोडिंग) या पीईटी 28 सी-एफ 30-2एक्सब्रोकोली (5.4 केबी) (एन्कोडिंग ब्रोकोली एपटामर) को निर्माता के प्रोटोकॉल17 के अनुसार ई कोलाई डीएच 5 सक्षम कोशिकाओं में बदलें।
  2. परिवर्तित कोशिकाओं को एलबी-एगर प्लेटों पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करें, जो कि पीएसएएलवी-आरएस-जीएफपीए 1 या कनामाइसिन (50 μg / एमएल) के साथ परिवर्तित कोशिकाओं के लिए एम्पीसिलीन (100 μg / mL) के साथ पूरक हैं।
  3. प्लेट से 3-4 जीवाणु कालोनियों को चुनें और प्रत्येक कॉलोनी को उचित एंटीबायोटिक (100 μg / mL एम्पीसिलिन या 50 μg / mL kanamycin) के साथ पूरक एलबी मीडिया के 5 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें। 225 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों को विकसित करें।
  4. उचित एंटीबायोटिक (100 μg / mL एम्पीसिलिन या 50 μg / mL kanamycin) के साथ पूरक 150 मिलीलीटर एलबी में टीका लगाने के लिए रात भर की संस्कृति के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें और 225 आरपीएम पर हिलाने वाले इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों को विकसित करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ≥3400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल16 के अनुसार प्लास्मिड को शुद्ध करने के लिए एक शुद्धिकरण किट का उपयोग करें।
  7. डीएनए को 0.5 मिलीलीटर शुद्ध DNase / RNase-मुक्त पानी के साथ मिलाएं। डीएनए एकाग्रता को मापें और डीएनए स्टॉक समाधान (100 एनजी / μL) के 1 एमएल तैयार करें। आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए के साथ ट्यूबों को स्टोर करें।

3. रेशम फाइब्रोइन का निष्कर्षण और प्रारंभिक सामग्री की तैयारी।

  1. रेशम-एलआईबीआर समाधान18 के 10% के लिए कहीं और विस्तार से वर्णित प्रक्रिया के अनुसार बोम्बिक्स मोरी रेशम कीट कोकून से पुनर्गठित रेशम फाइब्रोइन (एसएफ) प्रोटीन का एक जलीय घोल तैयार करें।
  2. जलीय एसएफ घोल की अंतिम एकाग्रता निर्धारित करें। 60 मिमी पेट्री डिश के लिए 0.5 मिलीलीटर रेशम समाधान का पिपेट, इसे 60 डिग्री सेल्सियस पर सूखने दें, और सूखी रेशम फिल्म के वजन को मापें। प्रति आयतन प्रतिशत वजन की गणना करने के लिए सूखे वजन को 0.5 एमएल से विभाजित करें।
  3. 1 मिलीग्राम/एमएल अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट के माध्यम से धीरे-धीरे पानी जोड़कर डीनेस /आरएनएस-मुक्त आसुत जल के साथ केंद्रित रेशम समाधान को पतला करें। भविष्य के उपयोग के लिए समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एंटीबॉडी लेबलिंग किट का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल रेशम फाइब्रोइन तैयार करें। निर्माता के प्रोटोकॉल19 के अनुसार एनएचएस एस्टर-सक्रिय व्युत्पन्न डाई के साथ प्रोटीन के एन-टर्मिनल α-अमीनो समूहों को जोड़ने के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल रेशम फाइब्रोइन समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें।
  5. 6 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ 50 एमएल पॉलीथिलीनमाइन (पीईआई) जलीय घोल तैयार करें, एचसीएल (1 एम) के साथ पीएच को 4 में समायोजित करें। एक बाँझ 0.2 μm झिल्ली के माध्यम से घोल को फ़िल्टर करें। महीनों तक परिवेश की स्थिति में भंडारण संभव है।
  6. SiO2 कोर तैयार करें। SiO 2 कणों के Pipete 300 μL को2 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में परिवर्तित करें। माइक्रोपार्टिकल्स को 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा DNase/RNase-मुक्त पानी के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।

4. एक प्रमुख परत, डीएनए प्लास्मिड और रेशम परतों की परत-दर-परत जमाव करें।

  1. पीआई प्राइम परत को एसआईओ2 माइक्रोपार्टिकल्स पर जमा करने के लिए, चरण 3.6 से काते हुए गोली में 1 मिलीलीटर पीईआई घोल जोड़ें और मिश्रण को 15 मिनट के लिए 800 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर पर परिवेश की स्थिति में हिलाएं। कणों को 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा DNase/RNase-मुक्त विआयनीकृत पानी के 1 मिलीलीटर के साथ चार बार धोएं।
  2. डीएनए परत का जमाव करने के लिए, चरण 2.7 से डीएनए प्लास्मिड के जलीय घोल के 1 एमएल को पीईआई-प्राइमेड माइक्रोपार्टिकल्स में जोड़ें और 15 मिनट के लिए 800 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को धीरे से हिलाएं। विभिन्न डीएनए भार के साथ माइक्रोकैप्सूल तैयार करने के लिए, DNase / RNase-मुक्त आसुत जल का उपयोग करके 50-200 ng / μL से डीएनए प्लास्मिड की एकाग्रता को समायोजित करें और डीएनए जमा करने के लिए इन समाधानों के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा माइक्रोपार्टिकल्स एकत्र करें।
  3. डीएनए प्लास्मिड के लिए ट्यूबों को एन्कोडिंग थियोफिलाइन राइबोस्विच को जीएफपीए 1 के साथ जीएफपीए 1 के रूप में मिलाया जाता है, और ब्रोकोली एपटामर को ब्रोकाप्ट के रूप में एन्कोडिंग करने वाले डीएनए प्लास्मिड को चिह्नित करें।
    नोट: बर्फ पर डीएनए के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
  4. सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें और माइक्रोपार्टिकल्स को 1 एमएल DNase / RNase-मुक्त आसुत पानी के साथ चार बार धोएं, हर बार 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सुपरनैटेंट को छोड़ दें। कमरे के तापमान (आरटी) पर सभी प्रयोग ों को निष्पादित करें जब तक कि यह अन्यथा निर्दिष्ट न हो।
  5. रेशम फाइब्रोइन परत का जमाव करने के लिए चरण 3.3 से पुनर्गठित जलीय एसएफ घोल के 1 मिलीलीटर को डीएनए-अधिशोषित माइक्रोपार्टिकल्स में जोड़ें, धीरे से भंवर करें और मिश्रण को 15 मिनट के लिए 750 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर पर 10 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा माइक्रोपार्टिकल्स को इकट्ठा करें, सुपरनैटेंट को हटा दें, और फिर उन्हें 1 मिलीलीटर DNase / RNase-मुक्त आसुत पानी से एक बार धो लें। सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
    नोट: प्रयोग के दौरान, तापमान-प्रेरित गेलेशन से बचने के लिए बर्फ पर रेशम का घोल रखें।
  6. रेशम प्रोटीन संरचना में β-शीट गठन को प्रेरित करने के लिए धीरे-धीरे मेथनॉल के साथ कणों का इलाज करें। सबसे पहले, 0.5 मिलीलीटर DNase / RNase आसुत जल जोड़ें, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को भंवर करें, फिर 100% मेथनॉल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कणों को 5 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर धीरे से हिलाएं। 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कणों को इकट्ठा करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  7. β-शीट के गठन को बढ़ावा देने और रेशम परत के मजबूत भौतिक शोषण को सुनिश्चित करने के लिए मेथनॉल के साथ कणों का इलाज करें। 100% मेथनॉल का 1 एमएल जोड़ें। थर्मोमिक्सर पर कणों को 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 750 आरपीएम पर धीरे से हिलाएं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 0.2 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कणों को इकट्ठा करें और उन्हें हर बार 1 मिलीलीटर DNase / RNase-मुक्त आसुत पानी के साथ दो बार धोएं, अगले सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले सुपरनैटेंट और धीरे से भंवर को छोड़ दें।
  9. रेशम बहुस्तरीय कोर-शेल संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए चरण 4.5-4.8 को 20 बार दोहराएं। अंतिम निक्षेपण चरण के लिए, चरण 3.4 (सिल्क-डाइलाइट 550, 1 एमएल) से फ्लोरोसेंटली लेबल वाले रेशम का उपयोग करें।
  10. अंतिम धोने का चरण करें और परिवेश की स्थिति में माइक्रोपार्टिकल्स को 1 मिलीलीटर DNase / RNase-मुक्त आसुत जल में रखें।
    नोट: रेशम परतों के जमाव के दौरान कणों के एकत्रीकरण से बचने के लिए, कण निलंबन का एक दृश्य निरीक्षण करें और सजातीय कण वितरण को बढ़ावा देने के लिए 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके इसे ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  11. समीकरण 1 का उपयोग करके प्रत्येक माइक्रोकैप्सूल, एन डीएनए में समझाया गया डीएनए प्लास्मिड प्रतियों की संख्या की गणना करें:
    Equation 1 (1)
    जहां एन = 6.769 × 1011 - एनकैप्सुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले एसआईओ2 कोर की संख्या। सीरियल कमजोर पड़ने और अवशोषण ए320 एट = 320 एनएम का उपयोग करके सिलिका कणों की ज्ञात सांद्रता के लिए एक मानक वक्र से इसकी गणना करें;
    सी- सोखने के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए की प्रारंभिक एकाग्रता
    V- सोखने के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए की मात्रा।
    0.8- कोर पर डीएनए सोखना दक्षता।
    एमडब्ल्यू- डीएनए प्लास्मिड का आणविक भार।
    एनए- एवोगाड्रो का नंबर (6.022 × 1023)

5. रेशम माइक्रोकैप्सूल प्राप्त करने के लिए कोर का विघटन।

  1. आसुत जल के साथ स्टॉक समाधान (48%) को पतला करके 8% हाइड्रोफ्लोरिक एसिड (एचएफ) समाधान, पीएच 5.5 तैयार करें। एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब प्राप्त करें। एचएफ के 5 एमएल को सावधानीपूर्वक पिपेट करें और 8% एचएफ समाधान प्राप्त करने के लिए 25 एमएल आसुत जल जोड़ें।
    सावधानी: एचएफ एक अत्यधिक संक्षारक एसिड है और ऊतकों को गंभीर जलन का कारण बन सकता है। प्रयोगों के लिए एचएफ की हैंडलिंग और उपयोग के दौरान अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए। अवांछनीय रिसाव दुर्घटनाओं से बचने के लिए संगठन द्वारा विकसित एचएफ के उचित उपयोग और हैंडलिंग के लिए मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) का पालन करें। एचएफ एसिड को पतला करने के लिए ग्लास कंटेनर का उपयोग न करें। प्रोटोकॉल के इस चरण को करने के लिए रासायनिक हुड का उपयोग करें।
  2. चरण 4.10 से पेलेट कोर-शेल माइक्रोपार्टिकल्स में 8% एचएफ समाधान के 1.5 एमएल जोड़कर एसआईओ2 कोर को भंग करें। धीरे से भंवर करें और कोर को 450 आरपीएम पर कोमल झटकों के साथ परिवेश की स्थिति में रात भर घुलने दें।
    नोट: एचएफ के फैलाव से बचने के लिए, माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सील करने के लिए ग्राफ्टिंग टेप का उपयोग करें। प्रोटोकॉल के इस चरण को करने के लिए एक रासायनिक हुड का उपयोग करें।
  3. 2 लीटर विआयनीकृत पानी से भरा 2 एल ग्लास बीकर तैयार करें। माइक्रोकैप्लस समाधान को डायलिसिस उपकरणों (50 केडीए एमडब्ल्यूसीओ) में स्थानांतरित करें और अगले 3 दिनों के लिए हर 3 घंटे में पानी के बार-बार परिवर्तन के साथ उन्हें विआयनीकृत पानी के खिलाफ डायलेज़ करें।
    नोट: पानी के पहले तीन आदान-प्रदान के दौरान सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और खतरनाक अपशिष्ट पदार्थों के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार समाधान को छोड़ दें।
  4. माइक्रोकैप्सूल इकट्ठा करने के लिए डायलिसिस उपकरणों से निलंबन को नए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: कई वर्षों के लिए परिवेश की स्थिति में माइक्रोकैप्सूल के जलीय घोल को स्टोर करें।

6. कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम) का उपयोग करके रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल की इमेजिंग।

  1. डीएनए डाई का उपयोग करके डीएनए धुंधला करें।
    1. खोखले रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल के 300 μL को एक ताजा 1 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। DNase-मुक्त आसुत जल के 500 μL जोड़ें।
    2. डीएनए स्टेनिंग डाई के 5 μL जोड़ें, संक्षेप में भंवर, और प्रकाश से सुरक्षित 2 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    3. हर बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 0.1 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा चार धोने के चरण ों का पालन करें, सावधानीपूर्वक 400 μL सुपरनैटेंट को हटा दें और इसे 400 μL RNase / DNase-मुक्त आसुत जल के साथ फिर से भर दें।
  2. 100x तेल-विसर्जन उद्देश्य (NA 1.49) का उपयोग करके तीन प्रमुख लेजर (405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम) से लैस उल्टे कॉन्फोकल सिस्टम पर रेशम कैप्सूल की इमेजिंग करें। कैप्सूल के नमूने के 100 μL को 8-अच्छी तरह से चैंबर ग्लास स्लाइड के एक कुएं में स्थानांतरित करें, कैप्सूल को इमेजिंग से पहले 20-30 मिनट के लिए तलछट की अनुमति दें।
    नोट: रंजक फोटोब्लीचिंग के प्रति बहुत संवेदनशील हैं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ स्लाइड को कवर करके नमूने की रक्षा करें।

7. आणविक भार कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) विधि का उपयोग करके खोखले माइक्रोकैप्सूल की पारगम्यता का अनुमान।

  1. विभिन्न एमडब्ल्यू (4 केडीए, 20 केडीए, 40 केडीए, 70 केडीए, 150 केडीए, 250 केडीए, 500 केडीए और 2 एमडीए) के एफआईटीसी-लेबल डेक्सट्रान फ्लोरोफोरे समाधान (20 μM, diH2O) के प्रत्येक 2 एमएल तैयार करें।
  2. पिपेट 100 μL कैप्सूल के निलंबन को एक चैंबर ग्लास स्लाइड के एकल कुएं में डालें। प्रत्येक माइक्रोकैप्सूल डिजाइन (पीईआई की एकाग्रता, डीएनए प्लास्मिड की लोडिंग संख्या, रेशम फाइब्रोइन की एकाग्रता और परतों की संख्या) का अलग से विश्लेषण करें।
  3. प्रत्येक कुएं में, विशिष्ट फ्लोरोफोरे समाधान के 300 μL जोड़ें जो सबसे कम एमडब्ल्यू से उच्चतम तक शुरू होता है, इसलिए प्रत्येक कुआं विशिष्ट फ्लोरोफोरे समाधान के अनुरूप होगा। ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं और मिश्रण को आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट होने दें जब तक कि फ्लोरोफोरे समाधान का प्रसार संतुलन तक न पहुंच जाए।
  4. स्लाइड को एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम) में स्थानांतरित करें और उत्तेजना = 488 एनएम पर 100x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके प्रत्येक को अच्छी तरह से चित्रित करें।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए फोकल प्लेन को समायोजित करके रुचि के क्षेत्र की पहचान करें कि कैप्सूल सबसे बड़े व्यास के सर्कल के रूप में दिखाई देते हैं। यह आमतौर पर तब होता है जब नमूने को कुएं के तल के करीब देखा जाता है जब कैप्सूल गुरुत्वाकर्षण के कारण तलछट होता है।
    2. स्लाइड को एक्सवाई दिशा में ले जाकर माइक्रोकैप्लस नमूनों की कई छवियां एकत्र करें। प्रत्येक नमूने के लिए 100-150 कैप्सूल तक के लिए छवियों को कैप्चर करें।
    3. कैप्सूल के अंदर और बाहर प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करके प्रत्येक एमडब्ल्यू फ्लोरोफोरे समाधान में कैप्सूल की झिल्ली की पारगम्यता का विश्लेषण करने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। इसके लिए, कैप्सूल की परिधि को रेखांकित करने के लिए एक सर्कल के रूप में रुचि का एक क्षेत्र (आरओआई) खींचें और अंदर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए विश्लेषण / माप पर क्लिक करें। डेटा को स्प्रेडशीट में सारणीबद्ध करें। कुल 200-300 कैप्सूल के लिए प्रत्येक माइक्रोकैप्सूल के लिए यह ऑपरेशन करें।
    4. आरओआई को रेखांकित करके और कैप्सूल से दूर तीव्रता को मापकर उसी तरह से बाहरी प्रतिदीप्ति तीव्रता का आकलन करें। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए 3-5 माप करें।
    5. सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए, युग्मित टी-टेस्ट (पी < 0.05) का उपयोग करके कैप्सूल के अंदर और बाहर प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करें।
    6. परिवर्तनीय एम डब्ल्यू के साथ एफआईटीसी-डेक्सट्रान के लिए हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या के आधार पर माइक्रोकैप्सूल की पारगम्यता का अनुमान लगाने के लिए रूपांतरण तालिका 2 का उपयोग करें।

8. रेशम माइक्रोकैप्सूल में सिंथेटिक थियोफिलाइन राइबोस्विच का इन विट्रो सक्रियण

  1. थियोफिलाइन स्टॉक समाधान (100 एमएम, डीएमएसओ) के 1 एमएल तैयार करें। 40 मिनट के लिए बर्फ पर घटकों को पिघलाकर परिपत्र डीएनए के लिए ई कोलाई एस 30 अर्क प्रणाली तैयार करें।
  2. एक 0.5 mL DNase / RNase-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब प्राप्त करें। अनुवाद प्रतिक्रिया करें, सेल-मुक्त घटकों को निम्नलिखित क्रम में माइक्रोकैप्सूल के नमूने के साथ मिलाएं (50 μL कुल मात्रा): अमीनो एसिड के बिना S30 प्रीमिक्स (20 μL); एस 30 अर्क, परिपत्र (15 μL); पूर्ण अमीनो एसिड मिश्रण (5 μL); चरण 4.10 (9 μL) से ThyRS-GFPa1 प्लास्मिड युक्त खोखले माइक्रोकैप्सूल; और थियोफिलाइन, 100 एमएम डीएमएसओ (1 μL)।
    नोट: सभी घटकों को जोड़ने के बाद, ट्यूब को संक्षेप में भंवर करें और कुछ सेकंड के लिए 0.2 × ग्राम पर संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान नमूना एकत्र करें।
  3. 4 घंटे के लिए ट्यूब को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और एक प्लेट रीडर पर प्रतिदीप्ति की जांच करें, जिसमें उत्तेजना = 488 एनएम और जीएफपी / एफआईटीसी फिल्टर (510 एनएम ± 20 एनएम) के लिए उत्सर्जन का उपयोग किया जाता है।
  4. 488 एनएम और 561 एनएम लेजर का उपयोग करके किसी भी एलसीएसएम सिस्टम पर कैप्सूल की छवि बनाएं। 100x तेल विसर्जन उद्देश्य और 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड का उपयोग करके सर्वोत्तम गुणवत्ता वाली छवियां प्राप्त करें।

9. रेशम माइक्रोकैप्सूल में ब्रोकोली एपटामर का इन विट्रो सक्रियण

  1. DFHBI-1T डाई (30 μM, diH2O) का 1 एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें। 40 मिनट के लिए बर्फ पर घटकों को पिघलाकर शुद्ध (पुनः संयोजक तत्वों का उपयोग करके प्रोटीन संश्लेषण) सेल-मुक्त सिस्टम प्रतिक्रिया किट तैयार करें।
  2. एक 0.5 mL DNase / RNase-मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब प्राप्त करें। निम्नलिखित क्रम में माइक्रोकैप्सूल के नमूने के साथ सेल-मुक्त प्रतिक्रिया घटकों के संयोजन से इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करें (50 μL कुल मात्रा): समाधान A (20 μL); समाधान बी (15 μL); चरण 4.10 (14 μL) से ब्रोकेप्ट प्लास्मिड युक्त खोखले माइक्रोकैप्सूल; और DFHBI-1T डाई (1 μL)।
    नोट: सभी घटकों को जोड़ने के बाद, ट्यूब को संक्षेप में भंवर करें और कुछ सेकंड के लिए 0.2 × ग्राम पर संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान नमूना एकत्र करें।
  3. 6 घंटे के लिए ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और एक प्लेट रीडर पर प्रतिदीप्ति की जांच करें, जिसमें उत्तेजना का उपयोग करके3 एक्स = 470 एनएम और उत्सर्जन = 510 एनएम ± 20 एनएम पर उत्सर्जन की जांच करें।
  4. 488 एनएम और 561 एनएम लेजर का उपयोग करके किसी भी एलसीएसएम सिस्टम पर कैप्सूल की छवि बनाएं। 100x तेल-विसर्जन उद्देश्य, और 8-अच्छी तरह से कवरग्लास चैंबर स्लाइड का उपयोग करके सर्वोत्तम गुणवत्ता वाली छवियां प्राप्त करें।

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Representative Results

यहां, अध्ययन रेशम प्रोटीन कैप्सूल में एनकैप्सुलेशन के बाद विभिन्न सेंसर डिजाइनों (दो प्रकार के आरएनए-विनियमित प्रतिलेखन / अनुवाद तत्वों) को एन्कोडिंग करने वाले डीएनए टेम्प्लेट की कार्यक्षमता को संबोधित करता है। माइक्रोकैप्सूल को प्रमुख घटकों की टेम्प्लेटेड परत-दर-परत (एलबीएल) असेंबली के माध्यम से तैयार किया गया था: एक प्रमुख परत, डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग सेंसर डिजाइन, और रेशम फाइब्रोइन बायोपॉलिमर (चित्रा 2)। एक स्तरित फैशन में मैक्रोमोलेक्यूल का जमाव अवशोषित परतों और खोल की मोटाई के बीच अंतर-और इंट्रामोलेक्यूलर इंटरैक्शन के आधार पर कैप्सूल झिल्ली की पारगम्यता को नियंत्रित करने की अनुमति देता है। सिस्टम की अक्षम पारगम्यता ने कैप्सूल झिल्ली20 के माध्यम से बड़े अवांछनीय मैक्रोमोलेक्यूल्स के प्रसार को सीमित करते हुए आवश्यक अणुओं के प्रसार को नियंत्रित करने की क्षमता प्रदान की।

आकार में सजातीय (4.5 μm) और हाइड्रेटेड अवस्था में ~ 500 nm (20 परतों) की खोल मोटाई के साथ मजबूत रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल प्रोटोकॉल (चित्रा 3)21 का ठीक से पालन करने पर उत्पादित किया जा सकता है। एलबीएल दृष्टिकोण ने प्लास्मिड की प्रारंभिक एकाग्रता के आधार पर डीएनए टेम्प्लेट की लोडिंग क्षमता को ट्यून करने की अनुमति दी। इष्टतम डीएनए लोडिंग को डीएनए टेम्प्लेट की प्रारंभिक एकाग्रता को 50-200 ng / μL से बदलकर प्राप्त किया जा सकता है। तालिका 1 एलबीएल एनकैप्सुलेशन के पूरा होने पर एकल माइक्रोकैप्सूल में बनाए गए डीएनए प्रतियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है और समीकरण 1 के अनुसार प्रारंभिक डीएनए सांद्रता और डीएनए प्लास्मिड के एमडब्ल्यू के आधार पर प्रत्येक सेंसर डिजाइन के लिए गणना की गई थी। इष्टतम डीएनए लोडिंग क्षमता क्रमशः THYRS और BrocApt सेंसर डिजाइनों के लिए 32 और 20 डीएनए प्रतियों के साथ हासिल की गई थी। लोडिंग क्षमता का आकलन एनकैप्सुलेटेड डीएनए सांद्रता का सटीक अनुमान लगाने के लिए महत्वपूर्ण था ताकि अधिक केंद्रित कैप्सूल नमूने जोड़कर सेंसर के आईवीटीटी सक्रियण के दौरान इसे टाइट किया जा सके।

कैप्सूल के गोले की पारगम्यता का एमडब्ल्यूसीओ विधि का पालन करके व्यवस्थित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। विधि विलेय अणुओं के आणविक भार के आधार पर झिल्ली के छिद्र आकार का अनुमान लगाती है जो कैप्सूल झिल्ली के माध्यम से प्रवेश नहीं कर सकती है। माइक्रोकैप्सूल को चर एमडब्ल्यू फ्लोरोफोरे अणुओं के अधीन करके और फोकल प्लेन में कॉन्फोकल इमेजिंग करके जो कई कैप्सूल में सबसे बड़े व्यास से मेल खाती है, शेल झिल्ली की पारगम्यता का आकलन किया जा सकता है। इमेजजे विश्लेषण कैप्सूल के अंदर और बाहर प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुमान लगाने और पूरी तरह से पारगम्य (फ्लोरोफोरे तीव्रता के बाहर और अंदर तुलनीय थे), आंशिक रूप से पारगम्य (50% -70% कैप्सूल में बाहर की तुलना में कम प्रतिदीप्ति थी), और पारगम्य नहीं (बाहरी तीव्रता की तुलना में फ्लोरोफोरे की तीव्रता कम थी) झिल्ली की पहचान करने की अनुमति देता है (चित्रा 4)। प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए एमडब्ल्यू को हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या में परिवर्तित करने से कैप्सूल झिल्ली के जाल आकार का अनुमान लगाया जा सकता है (तालिका 2)।

प्रोटीन कैप्सूल की चयनात्मक पारगम्यता एक प्रमुख परत (0-6 मिलीग्राम / एमएल से) की परिवर्तनीय सांद्रता, रेशम फाइब्रोइन की एकाग्रता (0.5-2 मिलीग्राम / एमएल से) और जमा परतों की संख्या (10-25 से) का उपयोग करके एलबीएल जमाव प्रोटोकॉल के व्यवस्थित अनुकूलन के दौरान प्राप्त की जा सकती है जब तक कि इष्टतम पारगम्यता प्राप्त नहीं हो जाती है। इस प्रोटोकॉल में, 25-32 एनएम के बीच इष्टतम पारगम्यता एक प्रमुख परत के रूप में पीईआई के 6 मिलीग्राम / एमएल और एलबीएल असेंबली के दौरान जमा रेशम फाइब्रोइन की 1 मिलीग्राम / एमएल की 20 परतों के साथ हासिल की गई थी (चित्रा 4)। यह पारगम्यता सीमा आईवीटीटी प्रणाली के घटकों के लिए कैप्सूल शेल के माध्यम से घूमने के लिए आदर्श थी। आमतौर पर, किसी भी आईवीटीटी प्रणाली के सबसे बड़े आणविक परिसर प्रोकैरियोटिक राइबोसोमल इकाइयां, 30 एस और 50 एस हैं, जो एक राइबोसोमल कॉम्प्लेक्स में एमआरएनए से बंधे होने पर, आकार 22 में ~20 एनएम तक पहुंच सकते हैं। विकसित माइक्रोकैप्सूल गोले की संरचना रेशम फाइबर परतों के एक अत्यधिक अंतर्निहित नेटवर्क से मिलती-जुलती है जो एलबीएल असेंबली के दौरान उत्पादित β-शीट ब्लॉक द्वारा शारीरिक रूप से क्रॉसलिंक होती हैं। यह झिल्ली संरचना अर्ध-पारगम्य है: छोटे अणुओं (जैसे, आयन, अमीनो एसिड, पेप्टाइड्स, शर्करा, आदि) के लिए अत्यधिक पारगम्य और बड़े अणुओं (जैसे, उच्च आणविक भार प्रोटीन, ग्लाइकोप्रोटीन, कोशिकाओं, आदि) तक सीमित है जो केवल 25 एनएम से कम हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या वाले अणुओं के अंतःस्त्रवण की अनुमति देता है। इसलिए, इष्टतम डीएनए लोडिंग और झिल्ली पारगम्यता के साथ रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल का उपयोग आईवीटीटी सक्रियण के लिए बायोरिएक्टर वाहक के रूप में किया जा सकता है।

थाइआरएस और ब्रोकेप्ट डिजाइन सेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल गतिविधि का परीक्षण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईवीटीटी सिस्टम का उपयोग करके किया जा सकता है। थाइआरएस को थियोफिलाइन लिगैंड की उपस्थिति में रिपोर्टर जीन के ट्रांसलेशनल सक्रियण की आवश्यकता होती है। सिंथेटिक थाइआरएस के सक्रियण में जीन अभिव्यक्ति शुरू करने के लिए कई कदम शामिल हैं, जिसमें एमआरएनए संश्लेषण, विश्लेषण से जुड़ने पर एमआरएनए अनुक्रम का विरूपण परिवर्तन, राइबोसोम बाइंडिंग साइट की रिहाई और रिपोर्टर जीएफपीए 1 प्रोटीन का संश्लेषण शामिल है। इन सभी चरणों में कैप्सूल झिल्ली के माध्यम से आईवीटीटी घटकों के मुक्त प्रसार की आवश्यकता होती है। डीएनए से भरे रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल के प्रस्तावित डिजाइन ने आरएनए-विनियमित सेंसर डिजाइनों के सक्रियण मापदंडों में सुधार किया: अभिव्यक्ति कैनेटीक्स और प्रतिदीप्ति आउटपुट दोनों मुक्त गैर-स्थिर डीएनए (चित्रा 5 ए) की तुलना में काफी अधिक थे। सीएलएसएम इमेजिंग ने थाइआरएस अनुक्रमों (चित्रा 5 बी-डी) को एन्कोडिंग करने वाले डीएनए प्लास्मिड से भरे कैप्सूल के भीतर सफल जीएफपीए 1 जीन सक्रियण की भी पुष्टि की।

वैकल्पिक रूप से, ब्रोकेप्ट सेंसर डिजाइन का सक्रियण आईवीटीटी प्रणाली में किया गया था जो डीएचएफबीआई -1 टी डाई की उपस्थिति में टी 7 ई कोलाई प्रमोटर युग्मित प्रतिलेखन / अनुवाद का समर्थन करता है। फ्लोरोजेनिक डाई को एमआरएनए अनुक्रम में बांधने पर प्रतिदीप्ति उत्पादन शुरू किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, रेशम माइक्रोकैप्सूल से आउटपुट सिग्नल समकक्ष सांद्रता के गैर-एनकैप्सुलेटेड डीएनए नमूनों की तुलना में कई गुना अधिक था (चित्रा 6)। इसलिए, रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल डीएनए-एन्कोडेड सेंसर तत्वों की आवश्यक कार्यक्षमता को बनाए रख सकते हैं, जो रुचि के विश्लेषणों का तेजी से और संवेदनशील पता लगाने के लिए नए प्रकार के इन विट्रो बायोसेंसर प्लेटफार्मों के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।

Figure 1
(ए) प्लास्मिड में पीटीएसी प्रमोटर के नियंत्रण में जीएफपीए 1 एन्कोडिंग जीन के ऊपर रखा गया थियोफिलाइन राइबोस्विच (थाइरस) अनुक्रम होता है, β-लैक्टामेज (बीएलए) एन्कोडिंग जीन एम्पीसिलीन के प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार होता है। (बी) पीटीएसी प्रमोटर अनुक्रम को बोल्ड और रेखांकित में दिखाया गया है; थियोफिलाइन राइबोस्विच अनुक्रम बोल्ड इटैलिक में दिखाया गया है; जीएफपीए 1 एन्कोडिंग अनुक्रम बोल्ड में दिखाया गया है; प्रतिबंध साइट अनुक्रम रेखांकित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: परत-दर-परत दृष्टिकोण का उपयोग करके माइक्रोकैप्सूल की तैयारी का अवलोकन। प्राचीन एसआईओ2 कोर को पहले पीईआई बहुलक के साथ कार्यात्मक बनाया गया था, इसके बाद विभिन्न सेंसर डिजाइनों और रेशम फाइब्रोइन परतों को एन्कोडिंग करने वाले डीएनए प्लास्मिड का अनुक्रमिक जमाव होता है जब तक कि रेशम प्रोटीन परतों की वांछित संख्या अधिशोषित नहीं हो जाती है। विभिन्न डीएनए सेंसर डिजाइनों वाले खोखले प्राचीन माइक्रोकैप्सूल का उत्पादन बलिदान कोर को भंग करके किया जा सकता है। माइक्रोकैप्सूल में समझाया गया प्रत्येक बायोसेंसर डिजाइन का सक्रियण संबंधित लिगेंड की उपस्थिति में आईवीटीटी प्रतिक्रियाओं के दौरान प्राप्त किया जा सकता है। यह आंकड़ा ड्रैचुक, I. et al.21 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए-लोडेड माइक्रोकैप्सूल के लिए माइक्रोस्कोपी अध्ययन। (ए) क्रॉस-सेक्शनल 2 डी और (बी) खोखले (एसएफ) 20 माइक्रोकैप्सूल की 3 डी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को प्रस्तुत किया गया जो डीएनए प्लास्मिड से भरे हुए थेइआरएस (32 डीएनए प्रतियां / कैप्सूल) एन्कोडिंग करते हैं और 6 मिलीग्राम / एमएल पीईआई-प्राइमेड एसआईओ2 कोर से निर्मित होते हैं। रेशम फाइब्रोइन कैप्सूल (डीएपीआई चैनल, नीला) और सना हुआ डीएनए (एफआईटीसी चैनल, हरा) से ऑटो-फ्लोरेसेंस डीएनए प्लास्मिड के स्थानीयकरण की पहचान करने और कैप्सूल झिल्ली मोटाई का अनुमान लगाने के लिए लागू किया गया था। इनसेट इन (ए) कैप्सूल में डीएनए और रेशम फाइब्रोइन गोले के लिए तीव्रता प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार: 2 μm. इनसेट इन (बी) कैप्सूल शेल में रेशम प्रोटीन के लिए तीव्रता प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व करता है। झिल्ली की मोटाई को आधी तीव्रता के शिखर पर लंबाई के रूप में मापा गया था। क्रॉस-अनुभागीय छवियों और 3 डी रेंडरिंग का प्रसंस्करण Nikon C2+ सिस्टम पर एनआईएस इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। यह आंकड़ा ड्रैचुक, I. et al.21 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एमडब्ल्यूसीओ विधि का उपयोग करके रेशम माइक्रोकैप्सूल के लिए झिल्ली पारगम्यता का अनुमान। खोखले रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल की चयनात्मक सीएलएसएम प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां विभिन्न एमडब्ल्यू (20 μM, diH2O) के FITC-Dextran समाधानों के अधीन हैं। कैप्सूल को परतों और पीईआई सांद्रता की एक अलग संख्या के साथ तैयार किया गया था। एक प्रमुख परत की एकाग्रता में वृद्धि से अधिक पारगम्य गोले के साथ माइक्रोकैप्सूल की कोलाइडल स्थिरता में वृद्धि होती है, जबकि प्रमुख परत के उन्मूलन से कम पारगम्य शेल झिल्ली वाले कैप्सूल का एकत्रीकरण होता है। स्केल बार: 5 μm. यह आंकड़ा ड्रैचुक, I. et al.21 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल में थाइआरएस सेंसर डिजाइन का सक्रियण। (ए) डीएनए प्लास्मिड से थाइआरएस सक्रियण के दौरान जीएफपीए 1 अभिव्यक्ति के लिए कैनेटीक्स 20-स्तरित एसएफ माइक्रोकैप्सूल (लाल रंग की लाइनों) में लोड होते हैं और गैर-एनकैप्सुलेटेड डीएनए (नीले रंग की लाइनों) को नियंत्रित करते हैं। ऊपर से नीचे तक, एक नमूना मात्रा (50 μL) में डीएनए की सांद्रता 6.5 ng / μL, 4.5 ng / μL, 2.5 ng / μL, और 0 ng / μL थी और रंग तीव्रता में परिवर्तन के अनुरूप थी। (बी) रेशम फाइब्रोइन कैप्सूल की सीएलएसएम छवियां प्रति कैप्सूल 32 डीएनए प्रतियों से भरी हुई हैं। स्केल बार: 5 μm. (C) छवि दो कैप्सूल (B में सफेद रेखा) में छवि (B) के अनुरूप पार-अनुभागीय तीव्रता प्रोफाइल से मेल खाती है। लाल रेखा रेशम कैप्सूल का प्रतिनिधित्व करती है, और हरी रेखा कैप्सूल में व्यक्त जीएफपीए 1 का प्रतिनिधित्व करती है। (डी) छवि आईवीटीटी प्रणाली में इनक्यूबेशन के बाद डीएनए की 32 प्रतियों से भरे 3 डी रेशम कैप्सूल का प्रतिनिधित्व करती है। हरी प्रतिदीप्ति जीएफपीए 1 सिग्नल से मेल खाती है, और लाल प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंटली लेबल रेशम परतों से मेल खाती है। स्केल बार: 2 μm. आईवीटीटी प्रणाली (एस 30 अर्क) में माइक्रोकैप्सूल के इनक्यूबेशन के दौरान थियोफिलाइन (2 एमएम, डीएमएसओ) के साथ थाइआरएस सक्रियण किया गया था। यह आंकड़ा ड्रैचुक, I. et al.21 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल में ब्रोकपैट का सक्रियण। प्रतिलेखन कैनेटीक्स की तुलना प्रति कैप्सूल (लाल रंग की लाइनों) 30 डीएनए प्रतियों से भरे 20-स्तरित रेशम माइक्रोकैप्सूल के लिए की गई थी और गैर-एनकैप्सुलेटेड डीएनए (नीले रंग की लाइनें) को नियंत्रित किया गया था। ऊपर से नीचे तक, एक नमूने में एनकैप्सुलेटेड डीएनए की सांद्रता थी: 3.6 ng / μL, 2 ng / μL, 1 ng / μL और 0 ng / μL और रंग तीव्रता में परिवर्तन के अनुरूप। गैर-एनकैप्सुलेटेड डीएनए की सांद्रता थी: 20 ng / μL, 10 ng / μL, 5 ng / μL और 0 ng / μL और रंग तीव्रता में परिवर्तन के अनुरूप। प्योर सेल-फ्री सिस्टम में इनक्यूबेशन के दौरान डीएचबीएफआई -1 टी (100 μM, diH2O) के साथ सक्रियण किया गया था। यह आंकड़ा ड्रैचुक, I. et al.21 से पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डीएनए सेंसर डिजाइन प्रारंभिक डीएनए एकाग्रता (ng / μL) प्रति कैप्सूल डीएनए प्रतियों की संख्या (डीएनए / कैप्सूल)
50 16
थाइआरएस 100 32
150 48
200 64
50 10
BrocApt 100 20
150 30
200 40

तालिका 1: प्रत्येक डीएनए डिजाइन के लिए प्रति कैप्सूल डीएनए कॉपी संख्या। कॉपी संख्या की गणना समीकरण 1 के अनुसार की गई थी और डीएनए प्लास्मिड की प्रारंभिक एकाग्रता, एलबीएल जमाव प्रक्रिया के दौरान डीएनए अनुक्रमों के प्रतिधारण संबंध और डीएनए प्लास्मिड की लंबाई से संबंधित थी।

एफआईटीसी-डेक्सट्रान (केडीए) का मेगावाट हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या (एनएम)
4 1.4
20 3.3
40 4.5
70 6
150 8.5
250 10
500 14
2,000 18

तालिका 2: एफआईटीसी-डेक्सट्रांस के भौतिक गुण। प्रत्येक फ्लोरोफोरे के लिए हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या का उपयोग खोखले रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल की पारगम्यता का अनुमान लगाने के लिए किया गया था।

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Discussion

विभिन्न प्रकार के डीएनए-एन्कोडेड सेंसर डिजाइनों से भरे चुनिंदा पारगम्य हाइड्रोगेल माइक्रोकैप्सूल इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए तैयार किए जा सकते हैं। एलबीएल दृष्टिकोण की विशिष्ट विशेषताओं में से एक बॉटम-अप असेंबली के दौरान माइक्रोकैप्सूल की जटिलता को तैयार करने की क्षमता है, जो आमतौर पर बलिदान टेम्पलेट्स पर आणविक प्रजातियों के सोखने से शुरू होता है। प्रारंभिक घटकों, पीएच स्थितियों और परतों की संख्या की सांद्रता को सावधानीपूर्वक समायोजित करके, विभिन्न डीएनए लोडिंग पैरामीटर, कार्यक्षमता और असमर्थ पारगम्यता के साथ माइक्रोकैप्सूलतैयार किए जा सकते हैं। कैप्सूल की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाने के लिए, विवो निदान में बायोकंपैटिबल सेंसर वाहक को लागू करने के लिए एयूएनपी और आईजीजी के साथ शेल सतह के आगे कार्यात्मककरण को प्राप्त किया जा सकता है। ये दोनों वैकल्पिक मार्ग रेशम फाइब्रोइन की अनूठी आणविक संरचना पर निर्भर करते हैं। एयू 3 + आयनों की सीटू कमी एक इष्टतम कमी बफर की उपस्थिति में धातु आयनों को कम करने में सक्षम टायरोसिन अवशेषों (5.3 % मोल) की उपस्थिति के कारण पूरी की जा सकती है। एयूएनपी-कार्यात्मक प्रोटीन माइक्रोकैप्सूल की सतह पर विशिष्ट एंटीबॉडी का संयुग्मन कार्बोडिमाइड सक्रियण रसायन विज्ञान के कार्यान्वयन के माध्यम से किया जा सकता है। इन दोनों चरणों में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए बायोसेंसर कैप्सूल की उचित कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल के सावधानीपूर्वक विकास और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, इन माइक्रोकैप्सूल को "स्मार्ट" डिलीवरी सिस्टम के रूप में उपयोग करने के लिए, जिसमें एक आणविक कार्गो विशिष्ट उत्तेजनाओं (जैसे पीएच या रासायनिक संकेतों) पर वितरित किया जाता है, इन कैप्सूल के विशिष्ट गुणों को विशेषता और ट्यून किया जाना चाहिए, जिसमें वितरण दक्षता, प्रतिधारण समय, प्रशासन का मार्ग और रोग मॉडल उपचार शामिल हैं।

डीएनए-लोडेड माइक्रोकैप्सूल को सीएलएसएम तकनीक और प्रतिदीप्ति माप की विशेषता थी। हालांकि, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (सीईएम), और प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक पुनर्निर्माण सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (डीस्टॉर्म) जैसे अन्य लक्षण वर्णन विधियों को माइक्रोकैप्सूल की विशिष्ट संरचनाओं को अलग करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें व्यक्तिगत फाइबर, नैनोडोमेन और डीएनए प्लास्मिड24,25,26 का स्थानीयकरण शामिल है।

विकसित प्रोटोकॉल एक जैव-संगत नेटवर्क सामग्री के रूप में रेशम फाइब्रोइन बायोपॉलिमर के उपयोग पर प्रकाश डालता है जो लोड किए गए डीएनए प्लास्मिड की तृतीयक संरचना को संरक्षित करता है। रेशम फाइब्रोइन नेटवर्क के भीतर स्थिर डीएनए अनुक्रमों की स्थिरता हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन और / या हाइड्रोजन बॉन्डिंग के माध्यम से होती है, जो पीएच निष्क्रियता, ऑक्सीकरण या हाइड्रोलिसिस27 के खिलाफ एक सुरक्षात्मक माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करती है। इसके अलावा, रेशम फाइब्रोइन के β-क्रिस्टलीय डोमेन एक अद्वितीय यांत्रिक बाधा प्रदान करते हैं, संलग्न मैक्रोमोलेक्यूल्स की गति को प्रतिबंधित करते हैं, और जलीय समाधानों में भंडारण के दौरान डीएनए प्लास्मिड को क्षरण से रोकते हैं।

डीएनए टेम्प्लेट से भरे रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल की अर्ध-पारगम्य प्रकृति ने आईवीटीटी प्रतिक्रियाओं के लिए अद्वितीय स्थानिक और भौतिक रासायनिक स्थितियां बनाईं। रेशम फाइब्रोइन माइक्रोकैप्सूल में ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल रूप से सक्रिय आरएनए एपटामर और राइबोस्विच एक आउटपुट सिग्नल का उत्पादन करने में सक्षम थे जो मुक्त गैर-स्थिर सेंसर की तुलना में कम से कम तीन गुना अधिक था। इसके अलावा, माइक्रोकैप्सूल में डीएनए टेम्प्लेट का स्थिरीकरण गैर-एनकैप्सुलेटेड सेंसर की पहचान सीमा से परे एन्कैप्सुलेटेड सेंसर की गतिविधि को काफी बढ़ा सकता है। जबकि गैर-एनकैप्सुलेटेड सेंसर में कम डीएनए सांद्रता पर न्यूनतम प्रतिक्रिया थी, एनकैप्सुलेटेड सेंसर में एक बहुत ही अलग आउटपुट प्रतिक्रिया थी, जिसे डीएनए सांद्रता में सूक्ष्म परिवर्तनों को प्रतिबिंबित करने के लिए आसानी से टाइट किया जा सकता है। एनकैप्सुलेटेड संवाददाताओं के बेहतर प्रतिक्रिया संकेत आईवीटीटी मशीनरी के घटकों के अप्रतिबंधित प्रसार और डीएनए प्लास्मिड की कम गतिशीलता के कारण होने की संभावना थी। कई अध्ययनों ने मान्यता दी है कि सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन संश्लेषण की उपज मैक्रोमोलेक्यूलर वातावरण28,29 पर निर्भर है। रेशम नेटवर्क में डीएनए प्लास्मिड के स्थिरीकरण ने ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स आंदोलन को प्रतिबंधित करने और कईडीएनए प्रतियों से भी प्रतिलेखन / अनुवाद तंत्र प्रतिक्रियाओं को तेज करने के लिए एक प्रभावी सीमित वातावरण प्रदान किया।

जबकि एलबीएल विधि एक नियंत्रणीय तरीके से बहुक्रियाशील विधानसभाओं के निर्माण के लिए एक बहुत ही बहुमुखी दृष्टिकोण प्रदान करती है, निर्माण प्रक्रिया अपेक्षाकृत समय लेने वाली होती है और आमतौर पर माइक्रोकैप्सूल उपज को बढ़ाने के लिए प्रसंस्करण समायोजन की आवश्यकता होती है। बायोमोलेक्यूल-आधारित माइक्रोकैप्सूल बनाने में एक और विचार एलबीएल जमाव पूरा होने के बाद कोर विघटन की आवश्यकता के साथ किसी भी प्रणाली की संगतता है। अब तक, आकार में सजातीय और मजबूत खोखले रेशम आधारित डीएनए-लदे माइक्रोकैप्सूल का उत्पादन करने के लिए, गोले को बलिदान सिलिका (एसआईओ2) कोर टेम्प्लेट पर जमा किया गया था, जिसे बाद में हाइड्रोफ्लोरिक (एचएफ) एसिड नक़्क़ाशी द्वारा हटाने की आवश्यकता थी। न ही एचएफ हैंडलिंग या एचिंग को जैव-संगत प्रक्रियाएं माना जाता है, जो व्यावहारिक अनुप्रयोगों में उनके व्यापक उपयोग को सीमित करता है। एसआईओ2 अकार्बनिक कोलाइडल टेम्प्लेट के विकल्प, कार्बोनेट कोर आमतौर पर बहुलक परतों के साथ कॉम्प्लेक्स बनाने में निष्क्रिय होते हैं और एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग करके हल्के परिस्थितियों में भंग किए जा सकते हैं। हालांकि, बलिदान कोर को समायोजित करने से मल्टीलेयर के जमाव गुण और शेल संरचना की अखंडता प्रभावित हो सकती है, जिसके लिए प्रोटोकॉल के और अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

सारांश में, वर्तमान प्रोटोकॉल विभिन्न सेंसर डिजाइनों के साथ रेशम आधारित डीएनए से लदे माइक्रोकैप्सूल की तैयारी की अनुमति देता है। एलबीएल विधि द्वारा प्रदान किए गए एक सीमित माइक्रोएन्वायरमेंट के संयोजन और एक जैव-संगत सामग्री के रूप में रेशम फाइब्रोइन के उपयोग ने एनकैप्सुलेटेड डीएनए के संवेदन गुणों में सुधार किया। फ्लोरोजेनिक आरएनए एपटामर तकनीक के तेजी से विकास के साथ, डीएनए से भरे रेशम माइक्रोकैप्सूल के संभावित उपयोग को मल्टीप्लेक्स इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स तक बढ़ाया जा सकता है। हाल ही में, आरएनए-आधारित फ्लोरोसेंट एपटामर के कई रूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात संवेदनशीलता30,31 के साथ जीवित कोशिकाओं में इमेजिंग आरएनए के लिए शक्तिशाली पृष्ठभूमि-मुक्त तकनीक के रूप में उभरे हैं। कृत्रिम आरएनए एपटामर को डिजाइन करने के लिए सिंथेटिक आरएनए नैनो टेक्नोलॉजी को लागू करके, एपटामर के फ्लोरोजेनिक गुणों का उपयोग विशिष्ट लिगेंड का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक विशेष रूप से विभिन्न प्रारूपों में रुचि के बायोमार्कर की निगरानी के लिए मूल्यवान होगी, जिसमें पॉइंट-ऑफ-यूज पेपर-आधारित सेंसर, पसीने या अंतरालीय तरल पदार्थ के लिए हाइड्रोगेल-आधारित पैच और प्रत्यारोपण योग्य सामग्री शामिल हैं।

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Disclosures

यहां प्रस्तुत विचार और राय लेखकों के हैं और जरूरी नहीं कि डीओडी या उसके घटकों के विचारों का प्रतिनिधित्व करें।

Acknowledgments

इस काम को वायु सेना के वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यालय से एलआरआईआर 16 आरएच 3003 जे अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, साथ ही अनुसंधान और इंजीनियरिंग के लिए रक्षा के अवर सचिव के अमेरिकी कार्यालय के एस एंड टी प्राथमिकताओं की उन्नति (एआरएपी) कार्यक्रम के लिए सैन्य वातावरण एप्लाइड रिसर्च के लिए सिंथेटिक जीवविज्ञान द्वारा समर्थित किया गया था।

थाइआरएस (पीएसएएलवी-आरएस-जीएफपीए 1, 3.4 केबी) के लिए प्लास्मिड वेक्टर अनुक्रम डॉ जे गैलिवन द्वारा उदारतापूर्वक प्रदान किया गया था। बोम्बिक्स मोरी के रेशम कीट कोकून को टफ्ट्स विश्वविद्यालय, एमए के डॉ डीएल कपलान द्वारा उदारतापूर्वक दान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) Lucerna DFHBI-1T
5x T4 DNA Ligase Buffer ThermoFisher Scientific 46300-018
6x Blue Gel Loading Dye New England BioLabs B7021S
96-well plates, black circular Corning 3601
Agarose Sigma-Aldrich A9539 BioReagent, for molecular biology, low EEO
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture
BlpI restriction enzymes New England BioLabs R0585S
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems FisherScientific 09-761-1
Dimethyl sulfoxide, DMSO Sigma-Aldrich 472301 ACS reagent, ≥99.9%
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. Addgene Plasmid #66788
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) ThermoFisher Scientific 84530
E. coli S30 extract system for circular DNA Promega L1020
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL FisherScientific 14-959-53A
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL 14-432-22
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL FisherScientific 05-408-129
Hydrofluoric acid, HF Sigma-Aldrich 695068 ACS reagent, 48%
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C
KpnI restriction enzymes New England BioLabs R0142S
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin Sigma-Aldrich L5667 pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin Sigma-Aldrich L0543 pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin
LB broth (Lennox grade) Sigma-Aldrich L3022
Lithium bromide, LiBr Sigma-Aldrich 213225 ReagentPlus, ≥99%
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain ThermoFisher Scientific 18258012
Methanol MilliporeSigma 322415 anhydrous, 99.8%
MilliQ-water EMD MilliPore Milli-Q Reference Water Purification System
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC Sigma-Aldrich E1769
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific 10010023 1x PBS, pH 7.4
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Polyethylenimine, branched Sigma-Aldrich 408727 average Mw ~25,000
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit New England BioLabs E6800S
QIAEX II Gel Extraction Kit Qiagen 20021
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen  27104
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) New England BioLabs N0469S
SiO? silica microspheres, 4.0 µm Polysciences, Inc. 24331-15 10% aqueous solution
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL ThermoFisher Scientific 87724
Sodium carbonate, Na?CO? Sigma-Aldrich 222321 ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices FisherScientific 08-607-008 Spectrum G235058
SYBR Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
T4 DNA Ligase (5 U/µL) ThermoFisher Scientific EL0011
Theophylline Sigma-Aldrich T1633 anhydrous, ≥99%, powder
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) Sigma-Aldrich T6025 Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water FisherScientific 10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit ZymoResearch D4202

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References

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डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग आरएनए एपटामर और राइबोस्विच से भरे बहुक्रियाशील रेशम-आधारित माइक्रोकैप्सूल की तैयारी
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