Summary
Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.
Abstract
Los hongos entomopatógenos (EPF) son uno de los agentes de control microbiano para el manejo integrado de plagas. Para controlar las plagas locales o invasoras, es importante aislar y seleccionar el EPF autóctono. Por lo tanto, el método de cebo del suelo combinado con el sistema de cebo de insectos (gusano de la harina, Tenebrio molitor) se utilizó en este estudio con algunas modificaciones. Los EPF aislados fueron sometidos a la prueba de virulencia contra la plaga agrícola Spodoptera litura. Además, las cepas potenciales de EPF fueron sometidas a identificaciones morfológicas y moleculares. Además, se realizó el ensayo de producción de conidios y termotolerancia para las cepas EPF prometedoras y se comparó; estos datos se sustituyeron además por la fórmula del número de conidios efectivos (ECN) para la clasificación de laboratorio. El sistema de gusanos de la harina de cebo del suelo y la fórmula ECN se pueden mejorar reemplazando las especies de insectos e integrando más factores de estrés para la evaluación de la comercialización y la aplicación en el campo. Este protocolo proporciona un enfoque rápido y eficiente para la selección de EPF y mejorará la investigación sobre agentes de control biológico.
Introduction
Actualmente, los hongos entomopatógenos (EPF) son ampliamente utilizados en el control microbiano de plagas agrícolas, forestales y hortícolas. Las ventajas de EPF son sus amplias gamas de huéspedes, buena adaptabilidad ambiental, naturaleza ecológica y que se puede utilizar con otros productos químicos para mostrar el efecto sinérgico para el manejo integrado de plagas1,2. Para la aplicación como agente de control de plagas, es necesario aislar una gran cantidad de EPF de insectos enfermos o del entorno natural.
El muestreo de estos organismos de sus huéspedes ayuda a comprender la distribución geográfica y la tasa de prevalencia de EPF en huéspedes naturales3,4,5. Sin embargo, la colección de insectos infectados por hongos suele estar limitada por factores ambientales y poblaciones de insectos en el campo4. Teniendo en cuenta que los insectos huéspedes morirán después de la infección por EPF y luego caerán en el suelo, el aislamiento de EPF a partir de muestras de suelo podría ser un recurso estable3,6. Por ejemplo, se sabe que los saprófitos usan el huésped muerto como su recurso para el crecimiento. Los sistemas de cebo de suelo y medio selectivo se han utilizado ampliamente para detectar y aislar EPF del suelo3,4,7,8,9,10.
En el método del medio selectivo, la solución de suelo diluida se coloca en un medio que contiene antibióticos de amplio espectro (por ejemplo, cloranfenicol, tetraciclina o estreptomicina) para inhibir el crecimiento de bacterias2,3,9,11. Sin embargo, se ha informado que este método puede distorsionar la diversidad y densidad de la cepa y puede causar una sobreestimación o subestimación de muchas comunidades microbianas6. Además, las cepas aisladas son menos patógenas y compiten con los saprófitos durante el aislamiento. Es difícil aislar el EPF de la solución de suelo diluido3. En lugar de utilizar un medio selectivo, el método de cebo en el suelo aísla el EPF de los insectos muertos infectados, que puede almacenarse durante 2-3 semanas, proporcionando así un método de separación EPF más eficiente y estándar3,4,7,6. Debido a que el método es fácil de operar, se puede aislar una variedad de cepas patógenas a un bajo costo4. Por lo tanto, es ampliamente utilizado por muchos investigadores.
Al comparar los diferentes tipos de sistemas de cebo de insectos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae son las especies de EPF más comunes que se encuentran en insectos pertenecientes a Hemiptera, Lepidoptera, Blattella y Coleoptera6,12,13,14. Entre estos cebos de insectos, Galleria mellonella (orden Lepidoptera) y Tenebrio molitor (orden Coleoptera) muestran mayores tasas de recuperación de Beauveria y Metarhizium spp., en comparación con otros insectos. Por lo tanto, G. mellonella y T. molitor se utilizan comúnmente para el cebo de insectos. A lo largo de los años, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) ha establecido una Biblioteca EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) que contiene una amplia variedad de especies, incluidas 4081 especies de Beauveria spp., 18 especies de Clonostachys spp., 878 especies de Cordyceps spp., 2473 especies de Metarhizium spp., 226 especies de Purpureocillium spp., y 13 especies de Pochonia spp. entre otras15. Otra Biblioteca EPF fue construida por el Laboratorio de Investigación de Entomología (ERL) de la Universidad de Vermont en los Estados Unidos durante aproximadamente 30 años. Incluye 1345 cepas de EPF de estados Unidos, Europa, Asia, África y Oriente Medio16.
Para controlar las plagas locales o de invasión en Taiwán, se requiere el aislamiento y la selección de EPF autóctonos. Por lo tanto, en este protocolo, hemos modificado y descrito el procedimiento del método de cebo del suelo y lo hemos combinado con el sistema de cebo de insectos (gusano de la harina, Tenebrio molitor)17. Sobre la base de este protocolo, se estableció una biblioteca EPF. Se realizaron dos rondas de cribado (cuantificación de la inoculación) para los aislados preliminares de EPF. Los aislados de EPF mostraron patogenicidad a los insectos. Las cepas potenciales fueron sometidas a identificaciones morfológicas y moleculares y analizadas posteriormente por el ensayo de termotolerancia y producción conidial. Además, también se propuso un concepto de número de conidios efectivo (ECN). Utilizando la fórmula ECN y el análisis de componentes principales (PCA), las cepas potenciales se analizaron bajo presión ambiental simulada para completar el proceso de establecimiento y detección de la biblioteca EPF. Posteriormente, se probó la patogenicidad de cepas prometedoras de EPF para la plaga objetivo (por ejemplo, Spodoptera litura). El protocolo actual integra datos de termotolerancia y producción conidial en la fórmula ECN y el análisis PCA, que se puede utilizar como un sistema de clasificación estándar para la investigación relacionada con EPF.
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Protocol
NOTA: Todo el diagrama de flujo se muestra en la Figura 1.
1. Aislamiento y selección de posibles hongos entomopatógenos (EPF)
- Recoger la muestra de suelo
- Retire 1 cm del suelo de la superficie y luego recoja el suelo dentro de la profundidad de 5-10 cm usando una pala de cada sitio de muestreo.
NOTA: Los sitios de muestreo serían una montaña, un bosque o áreas escasamente pobladas para evitar la contaminación de cepas de EPF rociadas artificialmente. Asegúrese de que las áreas para la recolección de muestras de suelo estén cubiertas con maleza en la superficie. El suelo seco o húmedo no es adecuado para este experimento. - Registre los detalles de cada sitio de muestreo, incluido el GPS, la elevación, el tipo de campo, la temperatura anual, la precipitación anual, el tiempo de recolección (temporada), el tipo de suelo y el valor del pH.
- Recoger 100 g de la muestra de suelo en una bolsa de plástico y mantenerla a temperatura ambiente si se somete al protocolo de aislamiento de hongos en el laboratorio en un plazo de 3 h.
NOTA: Si la muestra no se puede utilizar en un plazo de 3 h, almacene el suelo a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. Si el experimento no se realiza inmediatamente, la muestra de suelo puede almacenarse a 4 °C durante 1 semana hasta el inicio del protocolo18,19.
- Retire 1 cm del suelo de la superficie y luego recoja el suelo dentro de la profundidad de 5-10 cm usando una pala de cada sitio de muestreo.
- Cebar y aislar el EPF con gusano de la harina (Tenebrio molitor)
- Coloque 100 g de la muestra de suelo en un vaso de plástico (diámetro de la tapa = 8,5 cm, altura = 12,5 cm) y luego coloque 5 gusanos de la harina en la superficie del suelo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 semanas.
NOTA: También se pueden utilizar otros tipos de recipientes de plástico. Si los suelos están demasiado secos (agrietados o arenosos), rocíe ddH2O esterilizado por pulverización (aproximadamente 5-10 ml) en los suelos. La longitud corporal c.a. 2,5 cm (14º instar) de larvas de T. molitor ayuda en las pantallas aisladas de hongos20. - Observar y registrar las larvas diariamente para la mortalidad y la micosis; mantenga las larvas muertas en la taza hasta 2 semanas para el aislamiento de hongos.
NOTA: La espora de conidios fúngicos en las muestras de suelo se unirá a las larvas del gusano de la harina durante el proceso anterior. La micosis fúngica se observará a medida que las hifas crecen desde la membrana intersegmental, y luego todo el cuerpo se cubrirá con el micelio. La esporulación comenzará después de 7 días y el color de la infección por hongos cambiará al color de la masa de conidios. - Transfiera los insectos muertos a un banco limpio y use un palillo estéril para recolectar los conidios. Rayarlos en una placa de medio de agar dextrosa Sabouraud de un cuarto de fuerza (1/4 SDA) (55 mm) en el laboratorio21. Incubar la placa de cultivo a 25 °C durante 7 días para obtener el cultivo primario de hongos.
NOTA: La placa de 1/4 SDA se prepara de la siguiente manera: Mezcle 1.5 g de caldo de dextrosa Sabouraud y 3 g de agar en 200 ml de H2O, y luego esterilice durante 20 min. Alícuota 1/4 SDA en cada placa de Petri de 55 mm antes de la solidificación. Las placas SDA 1/4 solidificadas se almacenan a 4 °C hasta su uso. - Vuelva a rayar cada hongo de cultivo primario en una placa SDA de 55 mm 1/4 en un flujo laminar e incube la placa de cultivo a 25 °C durante 7 días para obtener colonias individuales de hongos.
- Repita este reaislamiento ~ 2-3 veces y observe bajo microscopía de luz para obtener colonias de hongos morfológicos únicos y puros.
NOTA: Aísle todo el EPF usando T. molitor-bait y guárdelo como se describe en la siguiente sección. La separación, preservación, cultivo puro y rayado deben realizarse en un flujo laminar en las secciones posteriores.
- Coloque 100 g de la muestra de suelo en un vaso de plástico (diámetro de la tapa = 8,5 cm, altura = 12,5 cm) y luego coloque 5 gusanos de la harina en la superficie del suelo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 semanas.
- Almacenar los aislados de EPF
- Corte 3 de los bloques de agar de 5 mm en el borde de cada placa aislada de cultivo de hongos puros con un barrenador de corcho y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como una réplica.
NOTA: Se recomiendan tres réplicas para cada aislado de hongos para el almacenamiento de las cepas EPF después de la 2ª prueba de virulencia. También se recomienda la identificación molecular si el espacio de almacenamiento es limitado. - Añadir 250 μL de solución de surfactante al 0,03% (Tabla de Materiales) y 250 μL de glicerol al 60% en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una micropipeta; luego, vórtice durante 10 s.
- Selle el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con película de parafina y enfríelo previamente en un refrigerador de -20 °C durante 24 h. Luego, transfiera las existencias de hongos preenfriadas a un refrigerador de -80 ° C para la criopreservación.
NOTA: En la sección 1.4 se utilizaron placas de cultivo de hongos extra puros (aparte de las muestras crioconservadas).
- Corte 3 de los bloques de agar de 5 mm en el borde de cada placa aislada de cultivo de hongos puros con un barrenador de corcho y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como una réplica.
- 1ª prueba de patogenicidad para aislados de hongos
- Coloque cinco larvas de T. molitor directamente sobre la superficie de cada placa de cultivo de hongos puros a 25 °C.
- Observe y registre la micosis y la mortalidad durante 10 días. Seleccione el aislado de hongos para un análisis posterior.
NOTA: Los aislados de hongos que causan una mortalidad del 100% se seleccionan para la 2ª prueba de virulencia para confirmar su virulencia a las larvas de T. molitor . Alternativamente, el investigador puede ajustar los criterios según su propio estudio.
- 2ª prueba de virulencia de aislados fúngicos
NOTA: Sobre la base de la 1ª prueba de patogenicidad, recupere los aislados de hongos seleccionados de -80 °C para la 2ª prueba de virulencia. El propósito de la 2ª prueba de virulencia es cuantificar la patogenicidad de los aislados de hongos seleccionados después de la 1ª ronda de cribado.- Cosechar conidios de cada aislado de hongos por vórtice durante 1 min y contar el número de conidios usando un hemocitómetro.
- Ajuste la suspensión de conidios a una concentración de 1 x 107 conidios/ml en una solución de surfactante al 0,03% (Tabla de materiales).
- Extienda 10 μL de la suspensión fúngica sobre placas SDA de 55 mm 1/4 y crezca durante 7 días a 25 °C en la oscuridad.
- Coloque cinco larvas de T. molitor directamente en la superficie de cada placa de cultivo de hongos puros (c.a. 6 x 107 conidios). Selle las placas con película de parafina e incube a 25 °C en la oscuridad.
- Observe y registre la micosis y la mortalidad durante 10 días.
- Repita la prueba (del paso 1.51 al 1.5.5) por triplicado para cada aislado de hongo.
NOTA: Los aislados de hongos que causan una mortalidad del 100% se seleccionan para la 3ª prueba de virulencia para confirmar su virulencia para atacar la plaga.
- 3ª prueba de virulencia de aislados fúngicos para plaga objetivo (Spodoptera litura como ejemplo)
- Repita los pasos 1.5.2 a 1.5.6 con aislados seleccionados de la 2ª virulencia para probar la virulencia contra la plaga objetivo.
- Calcule el LT50 de cada aislado fúngico22.
NOTA: El LT50 de cada aislado fúngico se calculó a través de modelos lineales generalizados (GLM) utilizando R studio (versión 3.4.1); la distribución de errores cuasibinomiales y una función de enlace de registro se pueden utilizar para tener en cuenta la sobredispersión.
2. Identificación molecular de EPF
- Extracción de ADN genómico fúngico
- Recoja c.a. 1 cm2 EPF de la placa SDA de 7 días y 1/4.
- Extraiga el ADN genómico fúngico utilizando un kit de extracción de ADN genómico fúngico de acuerdo con las instrucciones del fabricante23 (Tabla de Materiales).
- Amplificación por PCR y secuenciación de ADN
- Amplificar la región ITS fúngica mediante PCR de la muestra de ADN21 utilizando la mezcla maestra de PCR (2x), el conjunto de cebadores ITS1F/ITS4R24 (Tabla 1) con el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 1 min, y luego 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min, seguido de una extensión final de 7 min a 72 °C.
NOTA: El conjunto de cebadores ITS1F/ITS4R es para la identificación a nivel de género. - Secuenciar la PCR mediante servicio de secuenciación comercial.
- Utilice la búsqueda NCBI BLAST de hongos similares en la base de datos NCBI y seleccione las especies de tipo fúngico relativas para el análisis filogenético.
NOTA: Las especies de hongos pertenecientes al género metarhizium o Beauveria deben identificarse aún más a nivel de especie con el conjunto de cebadores tef-983F/tef-2218R25 (repita los pasos 2.1.1 a 2.2.3). Para los hongos que no pertenecen a los géneros Metarhizium o Beauveria, se pueden utilizar otros marcadores moleculares para identificar las especies, incluyendo la ADN liasa (APN2), la beta tubulina (BTUB), la subunidad más grande de la ARN polimerasa II (RPB1), la segunda subunidad más grande de la ARN polimerasa II (RPB2) y la porción 3' del factor de elongación de la traducción 1 alfa (TEF)25,26 .
- Amplificar la región ITS fúngica mediante PCR de la muestra de ADN21 utilizando la mezcla maestra de PCR (2x), el conjunto de cebadores ITS1F/ITS4R24 (Tabla 1) con el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 1 min, y luego 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min, seguido de una extensión final de 7 min a 72 °C.
- Análisis filogenético
- Utilice el software ClustalX 2.127 para alinear las múltiples secuencias de los pasos 2.2.2 y 2.2.3. Recorte la región de secuencias conservadas manualmente con GeneDoc28.
- Realizar el análisis filogenético mediante el software MEGA729 basado en los métodos de evolución mínima (ME), Neighbor-Joining (NJ) y máxima verosimilitud (ML).
NOTA: Realizar los tres métodos puede ayudar a confirmar y concluir con precisión el estado de clasificación. Los aislados de hongos examinados por el 1er cribado de patogenicidad se utilizan para la identificación molecular a nivel de género. Los aislados fúngicos cribados por la 2ª prueba de virulencia se utilizan para la identificación molecular y morfológica a nivel de especie.
3. Identificación morfológica de la EPF
- Observación de la morfología de la colonia fúngica
- Use una cámara para capturar el crecimiento de la colonia de cultivo de hongos durante 7 días y registre el crecimiento, la forma (esponjosa, firme) y el color de las colonias.
- Observación de conidios y conidióforos
- Raspe los conidios de la colonia de hongos de cultivo puro con un bucle de inoculación y transfiera las esporas a un portaobjetos de vidrio con una solución de Tween 80 al 0,1%. Luego, cubra con un cobertor para la observación microscópica ligera de los conidios.
- Use un bisturí para cortar un bloque de agar de 5 mm2 de la hebra hifal en el borde de la colonia de hongos, y luego transfiera el bloque de agar a un portaobjetos de vidrio.
- Realice la limpieza de la siguiente manera: Agregue la solución Tween 80 al 0.1% en el bloque de agar con un gotero de plástico y lave la mayor parte del exceso de conidios con pinzas. Luego, cúbralo con un cobertor para la observación microscópica ligera.
NOTA: El 0,1% de Tween 80 puede ser sustituido por otro surfactante más potente (Tabla de Materiales) dependiendo de las especies de hongos y la hidrofobicidad. - Mida y registre el ancho y la longitud de los conidios y conidióforos para comparar las diferencias entre los diferentes aislados de hongos.
- Utilice la prueba ANOVA de Welch y la prueba Games-Howell (prueba post-hoc) para analizar el ancho y la longitud conidiales de cada cepa utilizando R studio (versión 3.4.1).
NOTA: El análisis de datos de los caracteres morfológicos se puede ajustar por casos. Los aislados fúngicos cribados con la 3ª prueba de virulencia se utilizan para la caracterización fisiológica y clasificación ECN en las secciones 4 y 5.
4. Investigación de la productividad conidial y termotolerancia
- Ensayo de producción conidial
- Cultive el aislado fúngico seleccionado en medio SDA 1/4 a 25 ± 1 °C en la oscuridad durante 10 días.
- Preparar 1 ml de la suspensión conidial del aislado fúngico en solución de surfactante al 0,03% y ajustar a 1 x 107 conidios/ml como se describió anteriormente.
- Deje caer tres gotas de 10 μL de suspensión conidial en 1/4 SDA e incube a 25 ° C en la oscuridad durante 7, 10 y 14 días para contar la esporulación de hongos.
NOTA: 10 μL es el mejor volumen para recoger el bloque de 5 mm con esporulación fúngica uniforme después del crecimiento de hongos durante 7-14 días. - Use el barrenador del corcho para separar el bloque de agar de 5 mm del centro de la colonia y transferirlo a 1 ml de solución de surfactante al 0,03% (Tabla de materiales) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en cada punto de tiempo.
- Vórtice el tubo a 3.000 rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos y use un hemocitómetro para contar el número de conidios.
NOTA: La fórmula utilizada para contar es el número de conidios por cada 25 cuadrados de la celda más pequeña (tamaño = 0,025 mm2; profundidad de la cámara = 0,1 mm):
Número total de conidios en 5 plazas ÷ 80 × (4 × 106) - Repita tres veces para cada aislado.
- Ensayo de termotolerancia
- Cultive el aislado fúngico seleccionado en medio SDA 1/4 a 25 ± 1 °C en la oscuridad durante 10 días.
- Preparar 1 ml de la suspensión conidial de aislado fúngico en solución de surfactante al 0,03% y ajustar a 1 x 107 conidios/ml como se describió anteriormente.
- Vórtice la suspensión conidial y caliéntela en un baño seco de 45 °C durante 0, 30, 60, 90 y 120 min. Deje caer tres gotas de 5 μL de la suspensión conidial en un medio SDA de 55 mm 1/4 en cada punto de tiempo posterior a la exposición al calor e incube a 25 ± 1 °C durante 18 h.
NOTA: Evite esparcir las gotitas de hongos para poder concentrarse mejor en el área. - Cuente el número de esporas de conidios germinados con cinco campos seleccionados al azar bajo microscopía de luz 200x para determinar la tasa de germinación.
- Realice tres réplicas para cada aislado.
5. Clasificación efectiva del número de conidios (ECN)
- Cálculo de ECN
NOTA: Obtenga los datos de producción conidial y termotolerancia de cada cepa fúngica potencial antes de calcular el ECN21 total.- Calcule el cambio de pliegue (FC) de la producción conidial en cada punto de tiempo:
donde, x = punto de tiempo para la recopilación de datos; ncp = número de conidios después de cada día de crecimiento; e I = número inicial de conidios sembrados. - Calcule el número de conidios bajo el tratamiento de estrés en cada punto de tiempo utilizando la siguiente fórmula:
Donde, y = la ECN del punto temporal objeto de tratamiento; TT0 = la tasa de germinación de los conidios que no sufren estrés térmico (= tasa de germinación de 0 min de tratamiento térmico); TTz = coeficiente de tensión es la tasa de germinación de los conidios en diferentes momentos del tratamiento térmico (z). - Calcule el ECN total utilizando la siguiente fórmula:
- Compare el ECN de cada cepa fúngica.
- Calcule el cambio de pliegue (FC) de la producción conidial en cada punto de tiempo:
- Análisis de componentes principales (PCA) de cepas fúngicas
NOTA: El análisis de PCA confirma la clasificación de ECN y ayuda a comprender la correlación entre los valores de caracteres fisiológicos. Compare los valores de ECN y seleccione los aislados de EPF que tengan valores de ECN más altos. - Utilice el software R para crear PCA mediante codificación:
#Input archivo de datos PCA
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Procesamiento de datos de muestra
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=row.names(a)
df<- a[2:11] - #PCA cálculo de la tecnología
pca <- prcomp(df, center = TRUE, escala = TRUE)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
valor = pca$x - #Output archivo de visualización PCA
png(archivo = 'pca.png', altura = 2000, ancho = 2000, res = 300)
NOTA: Utilice de 7 a 14 días la producción conidial y todos los datos de termotolerancia para ejecutar el análisis de componentes principales (PCA) para confirmar la clasificación ECN.
- # Procesamiento de datos de muestra
- Seleccione las cepas de hongos de mejor rendimiento basadas en ECN o PCA y realice la prueba de virulencia de las plagas objetivo para una mayor investigación.
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Representative Results
Aislamiento y selección de posibles hongos entomopatógenos (EPF)
Mediante el uso del método de construcción de la biblioteca de hongos entomopatógenos (EPF) mediado por Tenebrio molitor, se excluiría el número de hongos sin actividad de eliminación de insectos; por lo tanto, la eficiencia del aislamiento y la selección de EPF podrían aumentarse en gran medida. Durante la aplicación de este método, se registró la información de los sitios de muestreo, las muestras de suelo y las tasas de germinación de hongos (Tabla 2). Sobre la base de nuestros datos anteriores, se obtuvieron un total de 101 aislamientos de hongos de 172 muestras de suelo, lo que indica una alta eficiencia de aislamiento del 64%. Entre los 101 aislados de hongos, 26 aislados mostraron actividad insecticida contra T. molitor (100% de mortalidad) después del 1er cribado de patogenicidad, por lo que la eliminación de aislados de hongos fue de 26/101 = 25,7%. En la 2ª prueba de virulencia, se demostró aún más la alta virulencia de los 26 aislados de hongos contra T. molitor , 12 de los cuales mostraron alta patogenicidad contra las larvas de T. molitor (100% de mortalidad a los 5 días después de la inoculación) (Figura 2A). Estos se utilizaron para evaluar la prueba de virulencia contra la plaga agrícola. Sobre la base de los datos de la 3ª prueba de mortalidad de virulencia y LT50, un total de seis aislados de hongos (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 y 113) revelaron una rápida actividad de matanza de insectos contra Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96 y 1,13), evaluados mediante el ensayo fisiológico y el número efectivo de conidios (ECN) (Figura 2B).
Identificación molecular de EPF
Para comprender mejor las posiciones taxonómicas fúngicas, 26 aislados del 1er cribado de patogenicidad fueron sometidos a análisis moleculares basados en la región ITS (Figura 3A). El resultado mostró que estos aislados de hongos podrían dividirse claramente en siete géneros, incluidos Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium y Metarhizium (Figura 3A). Sobre la base de la región ITS1-5.8S-ITS2, la clasificación del género EPF se confirmó con precisión, mientras que el nivel de la especie sigue siendo indistinguible. Por lo tanto, la secuencia de la región tef se utiliza para clasificar claramente el nivel de especie para 12 aislamientos EPF prometedores de la prueba de virulencia contra la plaga agrícola. La identificación molecular de los 12 aislados mostró que 11 aislados pertenecen a Metarhizium y contenían cuatro especies, incluyendo M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) y M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). El aislado restante fue identificado como B. australis (NCHU-113) (Figura 3B,C). De acuerdo con el resultado anterior, la región de secuencia de tef puede distinguir efectivamente el género Metarhizium a nivel de especie, mientras que otras especies necesitan encontrar otras regiones de secuencia como marcadores moleculares para distinguir la especie.
Identificación morfológica de la EPF
A través del método de limpieza (paso 3.2.3) de observaciones morfológicas de hongos, las estructuras de los conidióforos se pudieron ver claramente con una solución de Tween 80 al 0,1% (Figura 4A), y estas observaciones podrían servir como punto de referencia para medir el tamaño de la estructura y tomar un registro fotográfico. El color, la forma y la disposición de los conidios se pueden ver a través de observaciones microscópicas de los conidios de la colonia (Figura 4B, C). Después de la observación, los tamaños de las formas de conidios y conidióforos podrían medirse y compararse estadísticamente (Tabla 3).
Investigación de la productividad conidial, termotolerancia y clasificación ECN
La fórmula ECN, propuesta en el informe anterior21, podría ayudar a seleccionar un carácter fisiológico basado en la EPF de alta tolerancia al estrés. El ECN combina los datos de producción de conidios y termotolerancia de cada EPF (Figura 5A, B), lo que significa una alta viabilidad de la cepa fúngica cuando el valor de ECN es alto (Figura 5). Además, se utilizó la visualización del análisis de componentes principales (PCA) para verificar los resultados de la fórmula ECN. El resultado reveló una alta coordinación entre PCA y ECN, lo que sugiere que la fórmula ECN podría usarse para evaluar la jerarquía de parámetros relacionados con la viabilidad y el potencial de desarrollo de hongos para la aplicación en el campo y la comercialización posterior (Figura 5C, D).
Figura 1: Ilustración de la construcción de la biblioteca de hongos entomopatógenos (EPF) mediados por Tenebrio molitor. Parte 1: Aislamiento de hongos de la muestra de suelo; Parte 2: Detección basada en patogenicidad y virulencia e identificación de hongos; Parte 3. Caracterización fisiológica y clasificación fúngica. ECN = Número de conidios efectivos; y PCA = Análisis de componentes principales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mortalidad de gusanos de la harina y Spodoptera litura para la selección de aislados prometedores de hongos entomopatógenos (EPF). (A) 26-seleccionados hongos 2ª prueba de virulencia del gusano de la harina; Las micosis de 12 aislados de hongos de muerte rápida y alta virulencia se muestran en paralelo. (B) Se seleccionaron 12 aislados de hongos para la prueba de virulencia contra S. litura. La prueba en cada cepa fúngica se repitió tres veces. d.p.i. = días después de la inoculación. Figura modificada y leyenda reproducida con permiso del Fronteris21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El análisis filogenético de cepas de hongos entomopatógenos (EPF) a nivel de género (A) basado en la región ITS y (B-C) a nivel de especie basado en tef. El análisis filogenético de la región ITS y tef se construyó utilizando los métodos de máxima probabilidad (ML), evolución mínima (ME) y unión de vecinos (NJ). Se realizaron análisis de bootstrap para evaluar la robustez de las filogenias utilizando 1.000 réplicas, y las proporciones de bootstrap superiores al 50% se indican por encima de las ramas. Negrita = Cepas de tipo Ex. Las flechas rojas y verdes indican el prometedor EPF. Figura modificada y leyenda reproducida con permiso del Fronteris21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Examen microscópico de la morfología de hongos entomopatógenos (EPF) (M. anisopliae). Observación de conidióforos (A) después del lavado. (B) La observación de la forma y el color de los conidios. (C) Disposición de conidios y haces de cuerdas de esporas (SS) de M. anisopliae; Cp = conidióforos; cc = conidios cilíndricos. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caracterización fisiológica de seis aislamientos potenciales y análisis efectivo del número de conidios (ECN). (A) Ensayo de producción conidial. (B) Ensayo de termotolerancia. (C) El gráfico de barras de los valores ECN. (D) El análisis de los componentes principales mostró la distribución de cada cepa. Figura modificada y leyenda reproducida con permiso del Fronteris21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la cartilla | Tamaño del amplicón (bp) | Secuencia (5'-3') | Región | Referencia | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | SU | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | Tef | 26, 27, 41, 42 | |
| tef-2218R | ATGACACCRACRGCRGTYTG | ||||
Tabla 1: Pares de imprimaciones para la identificación de hongos.
Tabla 2: Los parámetros registrados para el método de construcción de la biblioteca EPF mediada por Tenebrio molitor se enumeran a continuación. NIU = el campus de la Universidad Nacional de Ilan. NCHU = el campus de la Universidad Nacional Chung Hsing. Tabla y leyenda modificadas reproducidas con permiso del Fronteris21. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
| Especie | Colar | Phialides μm±SD* | Conidios μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 | Cilíndrico, 7.3±0.67b×2.4±0.36a | Cilíndrico, 6.5±0.45a×2.7±0.13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Cilíndrico, 8.6±0.68ab×2.6±0.30a | Cilíndrico, 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Cilíndrico, 10.5±1.54a×2.4±0.32a | Cilíndrico, 6.8±0.53a×2.9±0.31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Cilíndrico, 9.4±1.58a×2.7±0.32a | Cilíndrico, 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Cilíndrico, 9.6±0.87a×2.6±0.29a | Cilíndrico, 6.0±0.82b×2.9±0.29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Elipsoide, NA×2.6±0.57 | Globosa, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| *El análisis estadístico se realizó en base a la prueba ANOVA de Welch mediante el uso de R studio. | |||
| § Tabla y leyenda modificadas reproducidas con permiso del Fronteris (23). | |||
Tabla 3: Un ejemplo de observaciones morfológicas de seis prometedores aislados de hongos entomopatógenos. El análisis estadístico se realizó en base a la prueba ANOVA de Welch mediante el uso de R studio. Tabla y leyenda modificadas reproducidas con permiso del Fronteris21.
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Discussion
Los hongos entomopatógenos (EPF) se han utilizado para el control de insectos. Existen varios métodos para aislar, seleccionar e identificar EPF30,31,32. Comparando los diferentes tipos de métodos de cebo de insectos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae se encontraron comúnmente en cebos de insectos6,12,13,14. Entre estos cebos de insectos, Galleria mellonella y Tenebrio molitor mostraron altas tasas de recuperación de Beauveria y Metarhizium spp. De hecho, se demostró la utilidad del método de cebo del gusano de la harina (T. molitor) como método de conveniencia para el aislamiento de EPF a partir de muestras de suelo17,21. No obstante, se ha reportado que el uso de insectos como cebo mostraría el sesgo para aislar especies fúngicas específicas3,33. Por lo tanto, la combinación de diferentes especies de insectos (es decir, Galleria mellonella y T. molitor juntas) para cebar el EPF de las muestras de suelo podría aumentar la diversidad de EPF34.
Para evaluar la actividad de matanza de insectos, hay dos rondas de detección por gusano de la harina (T. molitor) en el protocolo actual para seleccionar las cepas fúngicas prometedoras para su posterior estudio. Después de este proceso, el número de aislados de hongos, que se aíslan de muestras de suelo, podría reducirse drásticamente y restringirse a aislados de hongos que mostraron una alta actividad insecticida después del 1er y 2do cribado. La gran reducción de los aislados de hongos para la próxima ronda de detección ahorra tiempo y requiere mano de obra. También se pudo observar que los aislados de hongos seleccionados mostraron tendencias similares de patogenicidad entre el gusano de la harina (T. molitor) y el gusano cortador del tabaco (Spodoptera litura), demostrando una prueba consistente de patogenicidad de diferentes especies de insectos y podría extenderse aún más a otras plagas de cultivos21. Además, el cálculo de la ECN basado en las pruebas fisiológicas podría facilitar la selección de posibles cepas fúngicas para ser utilizadas en los campos de cultivo. Otros informes mencionaron métodos selectivos similares, mientras que los factores como las características abióticas y de cepas no se han incluido12,8,31,35,36,37. Por lo tanto, estas cepas pueden verse afectadas por factores ambientales que resultan en una influencia en el rendimiento de la germinación fúngica y, por lo tanto, dificultad para ser comercializadas. Esta consecuencia es también la razón principal de la inaplicabilidad de las cepas de laboratorio en el campo38.
A partir de la identificación morfológica, se deben dirigir esfuerzos adicionales hacia la búsqueda de la estructura clara del conidióforo y observar las diferentes características de cada cepa fúngica. Los estudios pueden incluir diversos métodos para resolver la difícil identificación morfológica39. Sin embargo, la identificación morfológica no distingue especies fúngicas estrechamente relacionadas; por lo tanto, es necesario integrar los datos de identificación molecular. La región del espaciador transcrito interno (ITS) mostró la discriminación a nivel de género, mientras que otros marcadores moleculares (es decir, tef para Metarhizium, bloque para Beauveria) son necesarios para la identificación a nivel de especie26,40,41.
En la caracterización fisiológica, para reducir la desviación estándar de los experimentos, se sugiere el vórtice de máquina o manual durante al menos 10 min a rpm máximas21. La suspensión de conidios completamente mezclada aumentaría la consistencia de los resultados del ensayo de termotolerancia y el ensayo de producción de conidiales. Por otro lado, en el ensayo de producción conidial, el número de conidios contados bajo un área fija (bloque de 5 mm en la parte central de la colonia de hongos en este estudio) en la placa cultivada en diferentes momentos de crecimiento planteó el problema de que diferentes especies de hongos e incluso diferentes cepas revelaron un rendimiento diferente de la compacidad de crecimiento de las hifas, lo que podría dar lugar a la no representatividad del muestreo. Por lo tanto, un método de prueba riguroso para la producción de conidios puede mejorar el problema, como contar con precisión el número de conidios de toda la colonia de hongos y normalizarse con el área de crecimiento42.
La fórmula efectiva del número de conidios (ECN) está diseñada en base a la influencia del estrés ambiental contra los conidios EPF, es decir, simular conidios bajo la condición de ambiente silvestre para seleccionar las cepas fúngicas prometedoras para su comercialización21. En este protocolo, se utilizaron los datos de producción de conidios y tratamiento térmico para el cálculo del valor total de ECN de cada cepa fúngica prometedora, siguiendo el estudio previo21. Además, en un entorno natural, excepto la temperatura, otros esfuerzos ambientales, como la humedad, la radiación ultravioleta (UV) y el huésped podrían influir en la germinación de los conidios. Especialmente, el estrés UV es un factor principal que afecta la germinación de los conidios porque los radicales libres de alta energía (como los peróxidos, los grupos hidroxilo y el oxígeno singlete) generados por los rayos UV pueden reducir la patogenicidad y la persistencia de los pesticidas microbianos43. Por lo tanto, el estrés UV podría incluirse aún más en la fórmula ECN en el futuro. Para evitar el estrés UV, la fórmula debe contener aceite o alginato de sodio para aumentar la tolerancia a los rayos UV de los conidios44,45,46, lo que confirma que las cepas potenciales tienen practicidad para el control de plagas47.
El presente protocolo proporcionó un método para el aislamiento rápido y preciso de posibles cepas de EPF para construir la biblioteca de EPF mediada por T. molitor. Esta es la base y es necesaria para el desarrollo de la investigación de control biológico. Además, la fórmula ECN podría mejorarse de manera flexible para ayudar a los investigadores a comprender el potencial de EPF y convertirlo en un producto básico para su uso en sistemas agrícolas.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses involucrado en este trabajo.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la Subvención 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
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