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Biology

अलगाव और मिट्टी के नमूनों से Entomopathogenic कवक का चयन और कीट कीटों के खिलाफ कवक वायरस का मूल्यांकन

Published: September 28, 2021 doi: 10.3791/62882
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Entomology, National Chung Hsing University, 2Department of Agricultural biology, Jeonbuk National University, 3Department of Agricultural Convergence Technology, Jeonbuk National University

Summary

यहां हम मीलवर्म (टेनेब्रियो मोलिटर) के आधार पर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं - चारा प्रणाली जिसका उपयोग मिट्टी के नमूनों से एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) को अलग करने और चुनने के लिए किया गया था। एक प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) सूत्र का उपयोग क्षेत्र में कीट माइक्रोबियल नियंत्रण के लिए शारीरिक विशेषताओं के आधार पर उच्च तनाव सहिष्णु ईपीएफ का चयन करने के लिए किया जाता है।

Abstract

एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) एकीकृत कीट प्रबंधन के लिए माइक्रोबियल नियंत्रण एजेंटों में से एक हैं। स्थानीय या आक्रामक कीटों को नियंत्रित करने के लिए, स्वदेशी ईपीएफ को अलग करना और चुनना महत्वपूर्ण है। इसलिए, कीट चारा (mealworm, Tenebrio molitor) प्रणाली के साथ संयुक्त मिट्टी चारा विधि कुछ संशोधनों के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। अलग-थलग ईपीएफ को तब कृषि कीट स्पोडोप्टेरा लिटुरा के खिलाफ विषाणु परीक्षण के अधीन किया गया था। इसके अलावा, संभावित ईपीएफ उपभेदों को रूपात्मक और आणविक पहचान के अधीन किया गया था। इसके अलावा, conidia उत्पादन और thermotolerance परख होनहार ईपीएफ उपभेदों के लिए प्रदर्शन किया गया था और तुलना की; इन आंकड़ों को प्रयोगशाला रैंकिंग के लिए प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) के सूत्र में प्रतिस्थापित किया गया था। मिट्टी चारा-mealworm प्रणाली और ECN सूत्र कीट प्रजातियों को प्रतिस्थापित करने और व्यावसायीकरण और क्षेत्र अनुप्रयोग के मूल्यांकन के लिए अधिक तनाव कारकों को एकीकृत करके सुधार किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ईपीएफ चयन के लिए एक त्वरित और कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है और जैविक नियंत्रण एजेंटों पर अनुसंधान में सुधार करेगा।

Introduction

वर्तमान में, एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) का व्यापक रूप से कृषि, वन और बागवानी कीटों के माइक्रोबियल नियंत्रण में उपयोग किया जाता है। ईपीएफ के फायदे इसकी विस्तृत मेजबान श्रेणियां, अच्छी पर्यावरणीय अनुकूलनशीलता, पर्यावरण के अनुकूल प्रकृति हैं, और इसका उपयोग अन्य रसायनों के साथ एकीकृत कीट प्रबंधन 1,2 के लिए सहक्रियात्मक प्रभाव दिखाने के लिए किया जा सकता है। एक कीट नियंत्रण एजेंट के रूप में आवेदन के लिए, या तो रोगग्रस्त कीड़ों या प्राकृतिक वातावरण से बड़ी संख्या में ईपीएफ को अलग करना आवश्यक है।

उनके मेजबानों से इन जीवों का नमूना प्राकृतिक मेजबान3,4,5 में ईपीएफ के भौगोलिक वितरण और प्रसार दर को समझने में मदद करता है। हालांकि, कवक संक्रमित कीड़ों का संग्रह आमतौर पर पर्यावरणीय कारकों और फील्ड 4 में कीट आबादी द्वारा सीमित होता है। यह देखते हुए कि कीट मेजबान ईपीएफ संक्रमण के बाद मर जाएंगे और फिर मिट्टी में गिर जाएंगे, मिट्टी के नमूनों से ईपीएफ का अलगाव एक स्थिर संसाधन हो सकता है3,6। उदाहरण के लिए, सैप्रोफाइट्स को विकास के लिए अपने संसाधन के रूप में मृत मेजबान का उपयोग करने के लिए जाना जाता है। मिट्टी के चारा और चयनात्मक मध्यम प्रणालियों का व्यापक रूप से उपयोग मिट्टी से ईपीएफ का पता लगाने और अलग करने के लिए किया गया है3,4,7,8,9,10।

चयनात्मक मध्यम विधि में, पतला मिट्टी के घोल को बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए व्यापक-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, क्लोरैम्फेनिकोल, टेट्रासाइक्लिन, या स्ट्रेप्टोमाइसिन) वाले माध्यम पर चढ़ाया जाता है2,3,9,11। हालांकि, यह बताया गया है कि यह विधि तनाव की विविधता और घनत्व को विकृत कर सकती है और कई माइक्रोबियल समुदायों के अधिक या कम अनुमान का कारण बन सकती है। इसके अलावा, अलग-थलग उपभेद कम रोगजनक होते हैं और अलगाव के दौरान सैप्रोफाइट्स के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। पतली मिट्टी के घोल से ईपीएफ को अलग करना मुश्किल है3। एक चयनात्मक माध्यम का उपयोग करने के बजाय, मिट्टी का चारा विधि संक्रमित मृत कीड़ों से ईपीएफ को अलग करती है, जिसे 2-3 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, जिससे अधिक कुशल और मानक ईपीएफ पृथक्करण विधि प्रदान की जा सकती है3,4,7,6। क्योंकि विधि को संचालित करना आसान है, इसलिए कोई भी कम लागत पर विभिन्न प्रकार के रोगजनक उपभेदों को अलग कर सकता है। इसलिए, यह व्यापक रूप से कई शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है।

विभिन्न प्रकार के कीट चारा प्रणालियों की तुलना करने पर, Beauveria bassiana और Metarhizium anisopliae सबसे आम ईपीएफ प्रजातियां हैं जो हेमिप्टेरा, लेपिडोप्टेरा, ब्लैटेला और कोलिओप्टेरा 6,12,13,14 से संबंधित कीड़ों में पाई जाती हैं। इन कीट चारा के बीच, गैलेरिया मेलोनेला (ऑर्डर लेपिडोप्टेरा) और टेनेब्रियो मोलिटर (ऑर्डर कोलोप्टेरा) अन्य कीड़ों की तुलना में ब्यूवेरिया और मेटारिज़ियम एसपीपी की उच्च वसूली दर दिखाते हैं। इसलिए, जी मेलोनेला और टी मोलिटर आमतौर पर कीट चारा के लिए उपयोग किए जाते हैं। इन वर्षों में, संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग (यूएसडीए) ने एक ईपीएफ लाइब्रेरी (ईपीएफ संस्कृतियों का कृषि अनुसंधान सेवा संग्रह, एआरएसईएफ) की स्थापना की है, जिसमें विभिन्न प्रकार की प्रजातियां शामिल हैं, जिसमें ब्यूवेरिया एसपीपी की 4081 प्रजातियां, क्लोनोस्टैचिस एसपीपी की 18 प्रजातियां, कॉर्डिसेप्स एसपीपी की 878 प्रजातियां, मेटारिज़ियम एसपीपी की 2473 प्रजातियां, पुरपुरियोसिलियम एसपीपी की 226 प्रजातियां शामिल हैं। और पोचोनिया एसपीपी की 13 प्रजातियां दूसरों के बीच 15। एक और ईपीएफ लाइब्रेरी का निर्माण संयुक्त राज्य अमेरिका में वर्मोंट विश्वविद्यालय से एंटोमोलॉजी रिसर्च लेबोरेटरी (ईआरएल) द्वारा 30 वर्षों के लिए किया गया था। इसमें संयुक्त राज्य अमेरिका, यूरोप, एशिया, अफ्रीका और मध्य पूर्व से ईपीएफ के 1345 उपभेद शामिल हैं।

ताइवान में स्थानीय या आक्रमण कीटों को नियंत्रित करने के लिए, स्वदेशी ईपीएफ के अलगाव और चयन की आवश्यकता होती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हमने मिट्टी के चारा विधि की प्रक्रिया को संशोधित और वर्णित किया है और इसे कीट चारा (मीलवर्म, टेनेब्रियो मोलिटर) सिस्टम 17 के साथ जोड़ा है। इस प्रोटोकॉल के आधार पर, एक ईपीएफ लाइब्रेरी स्थापित की गई थी। प्रारंभिक ईपीएफ आइसोलेट्स के लिए स्क्रीनिंग के दो दौर (टीकाकरण का परिमाणीकरण) किए गए थे। ईपीएफ आइसोलेट्स ने कीड़ों को रोगजनकता दिखाई। संभावित उपभेदों को रूपात्मक और आणविक पहचान के अधीन किया गया था और आगे थर्मोटोलरेंस और कोनिडियल उत्पादन परख द्वारा विश्लेषण किया गया था। इसके अलावा, प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) की एक अवधारणा भी प्रस्तावित की गई थी। ईसीएन सूत्र और प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करते हुए, ईपीएफ लाइब्रेरी की स्थापना और स्क्रीनिंग की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए सिम्युलेटेड पर्यावरणीय दबाव के तहत संभावित उपभेदों का विश्लेषण किया गया था। बाद में, होनहार ईपीएफ उपभेदों की रोगजनकता का लक्ष्य कीट (जैसे, स्पोडोप्टेरा लिटुरा) के लिए परीक्षण किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल ईसीएन सूत्र और पीसीए विश्लेषण में थर्मोटॉलरेंस और कोनिडियल उत्पादन डेटा को एकीकृत करता है, जिसका उपयोग ईपीएफ से संबंधित अनुसंधान के लिए एक मानक रैंकिंग प्रणाली के रूप में किया जा सकता है।

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Protocol

नोट:: पूरे फ़्लोचार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. अलगाव और संभावित Entomopathogenic कवक (ईपीएफ) का चयन

  1. मिट्टी का नमूना लीजिए
    1. सतह की मिट्टी के 1 सेमी को हटा दें, और फिर प्रत्येक नमूना साइट से फावड़ा का उपयोग करके 5-10 सेमी गहराई के भीतर मिट्टी एकत्र करें।
      नोट: नमूना साइटें कृत्रिम रूप से स्प्रे किए गए ईपीएफ उपभेदों के संदूषण से बचने के लिए एक पहाड़, जंगल, या विरल आबादी वाले क्षेत्र होंगे। सुनिश्चित करें कि मिट्टी के नमूने संग्रह के लिए क्षेत्रों को सतह पर खरपतवार के साथ कवर किया गया है। सूखी मिट्टी या नम मिट्टी इस प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं है।
    2. जीपीएस, ऊंचाई, क्षेत्र के प्रकार, वार्षिक तापमान, वार्षिक वर्षा, संग्रह समय (मौसम), मिट्टी के प्रकार, और पीएच मूल्य सहित प्रत्येक नमूना साइट का विवरण रिकॉर्ड करें।
    3. एक प्लास्टिक बैग में मिट्टी के नमूने के 100 ग्राम ले लीजिए और इसे कमरे के तापमान पर बनाए रखें यदि इसे 3 घंटे के भीतर प्रयोगशाला में कवक अलगाव प्रोटोकॉल के अधीन किया जाता है।
      नोट: यदि नमूने का उपयोग 3 घंटे के भीतर नहीं किया जा सकता है, तो मिट्टी को अंधेरे परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर स्टोर करें। यदि प्रयोग तुरंत नहीं किया जाता है, तो मिट्टी के नमूने को प्रोटोकॉल 18,19 की शुरुआत तक 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. चारा और mealworm के साथ ईपीएफ को अलग (Tenebrio molitor)
    1. एक प्लास्टिक कप में मिट्टी के नमूने के 100 ग्राम रखें (टोपी व्यास = 8.5 सेमी, ऊंचाई = 12.5 सेमी), और फिर 2 सप्ताह के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर मिट्टी की सतह पर 5 मीलवर्म रखें।
      नोट: अन्य प्रकार के प्लास्टिक कप कंटेनरों का भी उपयोग किया जा सकता है। यदि मिट्टी बहुत सूखी (फटी हुई या रेतीली) है, तो मिट्टी पर निष्फल ddH2O (लगभग 5-10 mL) स्प्रे करें। टी मोलिटर लार्वा के शरीर की लंबाई 2.5 सेमी (14 वें इंस्टार) फंगल आइसोलेट स्क्रीन 20 में मदद करती है।
    2. मृत्यु दर और माइकोसिस के लिए दैनिक लार्वा का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें; कवक अलगाव के लिए 2 सप्ताह तक कप में मृत लार्वा रखें।
      नोट: मिट्टी के नमूनों में कवक कोनिडिया बीजाणु उपरोक्त प्रक्रिया के दौरान मीलवर्म लार्वा से जुड़ जाएगा। कवक माइकोसिस को देखा जाएगा क्योंकि हाइफे इंटरसेग्मेंटल झिल्ली से बढ़ता है, और फिर पूरे शरीर को माइसेलियम के साथ कवर किया जाएगा। स्पोरुलेशन 7 दिनों के बाद शुरू होगा और फंगल संक्रमण का रंग कोनिडिया द्रव्यमान के रंग में बदल जाएगा।
    3. मृत कीड़ों को एक साफ बेंच पर स्थानांतरित करें और कोनिडिया को इकट्ठा करने के लिए एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करें। प्रयोगशाला 21 में एक चौथाई ताकत Sabouraud dextrose आगर माध्यम (1/4 एसडीए) प्लेट (55 मिमी) पर उन्हें लकीर। कवक की प्राथमिक संस्कृति प्राप्त करने के लिए 7 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: 1/4 SDA प्लेट निम्नानुसार तैयार की जाती है: H2O के 200 mL में Sabouraud dextrose शोरबा के 1.5 ग्राम और आगर के 3 ग्राम मिश्रण, और फिर 20 मिनट के लिए निष्फल। ठोसीकरण से पहले प्रत्येक 55 मिमी पेट्री डिश में 1/4 एसडीए को एलीकोट करें। ठोस 1/4 एसडीए प्लेटों को उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    4. एक लैमिनर प्रवाह में एक 55 मिमी 1/4 एसडीए प्लेट पर प्रत्येक प्राथमिक संस्कृति कवक को फिर से लकीरें और कवक के एकल उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए 7 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. इस पुन: अलगाव ~ 2-3 बार दोहराएं और एकल और शुद्ध रूपात्मक कवक उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत निरीक्षण करें।
      नोट:: T. molitor-चारा और संग्रह निम्न अनुभाग में वर्णित के रूप में सभी EPF को अलग करें। अलगाव, संरक्षण, शुद्ध संस्कृति, और लकीर को बाद के वर्गों में एक लैमिनर प्रवाह में किया जाना चाहिए।
  3. EPF आइसोलेट्स को स्टोर करें
    1. कॉर्क बोरर के साथ प्रत्येक अलग शुद्ध कवक सुसंस्कृत प्लेट के किनारे पर 5 मिमी आगर ब्लॉकों में से 3 को काटें और इसे एक प्रतिकृति के रूप में 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
      नोट: प्रत्येक कवक अलग के लिए तीन प्रतिकृतियों को ईपीएफ उपभेदों के भंडारण के लिए 2 वायरस परीक्षण के बाद अनुशंसित किया जाता है। आणविक पहचान की भी सिफारिश की जाती है यदि भंडारण स्थान सीमित है।
    2. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.03% surfactant समाधान (सामग्री की तालिका) और 60% ग्लिसरॉल के 250 μL के 250 μL जोड़ें; फिर, 10 s के लिए भंवर.
    3. पैराफिन फिल्म के साथ 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सील करें और इसे 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में प्रीकूल करें। फिर, क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए प्रीकूल्ड फंगल स्टॉक को -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्थानांतरित करें।
      नोट: अतिरिक्त शुद्ध कवक संस्कृति प्लेटों (क्रायो-संरक्षित नमूनों के अलावा) का उपयोग अनुभाग 1.4 में किया गया था।
  4. फंगल आइसोलेट्स के लिए पहली रोगजनकता स्क्रीन
    1. 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक शुद्ध कवक संस्कृति प्लेट की सतह पर सीधे पांच टी मोलिटर लार्वा रखें।
    2. 10 दिनों के लिए माइकोसिस और मृत्यु दर का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें। आगे के विश्लेषण के लिए कवक पृथक का चयन करें।
      नोट: 100% मृत्यु दर के कारण फंगल आइसोलेट्स को टी मोलिटर लार्वा के लिए उनके वायरस की पुष्टि करने के लिए दूसरे वायरस परीक्षण के लिए चुना जाता है। वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ता अपने स्वयं के अध्ययन के अनुसार मानदंडों को समायोजित कर सकता है।
  5. कवक आइसोलेट्स का दूसरा विषाणु परीक्षण
    नोट: 1 रोगजनकता स्क्रीन के आधार पर, चयनित कवक आइसोलेट्स को -80 डिग्री सेल्सियस से दूसरे वायरस परीक्षण के लिए पुनर्प्राप्त करें। दूसरे विषाणु परीक्षण का उद्देश्य स्क्रीनिंग के पहले दौर के बाद चयनित कवक आइसोलेट्स की रोगजनकता को मापना है।
    1. 1 मिनट के लिए भंवर द्वारा प्रत्येक कवक आइसोलेट की फसल conidia और एक hemocytometer का उपयोग कर conidia की संख्या की गिनती.
    2. एक 0.03% surfactant समाधान (सामग्री की तालिका) में 1 x 107 conidia / mL की एकाग्रता के लिए कोनिडिया निलंबन समायोजित करें।
    3. 55 मिमी 1/4 एसडीए प्लेटों पर फंगल निलंबन के 10 μL फैलाएं और अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए बढ़ें।
    4. प्रत्येक शुद्ध कवक संस्कृति प्लेट (सीए 6 x 107 कोनिडिया) की सतह पर सीधे पांच टी मोलिटर लार्वा रखें। पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों को सील करें और अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 10 दिनों के लिए माइकोसिस और मृत्यु दर का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें।
    6. प्रत्येक फंगल आइसोलेट के लिए तीन प्रतियों में परीक्षण (चरण 1.51 से 1.5.5 तक) को दोहराएं।
      नोट: 100% मृत्यु दर के कारण फंगल आइसोलेट्स को कीट को लक्षित करने के लिए उनके वायरस की पुष्टि करने के लिए तीसरे विषाणु परीक्षण के लिए चुना जाता है।
  6. लक्ष्य कीट के लिए कवक आइसोलेट्स का तीसरा विषाणु परीक्षण (एक उदाहरण के रूप में स्पोडोप्टेरा लिटुरा )
    1. चरण 1.5.2 से 1.5.6 को 2 वायरस से चयनित आइसोलेट्स के साथ लक्ष्य कीट के खिलाफ वायरस का परीक्षण करने के लिए दोहराएँ।
    2. प्रत्येक फंगल आइसोलेट 22 के LT50 की गणना करें।
      नोट: प्रत्येक कवक आइसोलेट के LT50 की गणना R स्टूडियो (संस्करण 3.4.1) का उपयोग करके सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (GLMs) के माध्यम से की गई थी; quasibinomial त्रुटि वितरण और एक लॉग लिंक फ़ंक्शन overdispersion के लिए खाते के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

2. ईपीएफ की आणविक पहचान

  1. फंगल जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण
    1. 7-दिन 1/4 एसडीए प्लेट से सीए 1 सेमी 2 ईपीएफ एकत्र करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक फंगल जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके फंगल जीनोमिक डीएनए निकालें23 (सामग्री की तालिका)।
  2. PCR प्रवर्धन और डीएनए अनुक्रमण
    1. पीसीआर मास्टर मिक्स (2x), ITS1F / ITS4R प्राइमर सेट 24 (तालिका 1) का उपयोग करके डीएनए सैंपल 21 के पीसीआर द्वारा फंगल आईटीएस क्षेत्र को निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम के साथ बढ़ाना: 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, और फिर 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट का अंतिम विस्तार।
      नोट: ITS1F/ITS4R प्राइमर सेट जीनस स्तर की पहचान के लिए है।
    2. वाणिज्यिक अनुक्रमण सेवा द्वारा पीसीआर अनुक्रमित करें।
    3. एनसीबीआई डेटाबेस में समान कवक के लिए एनसीबीआई ब्लास्ट खोज का उपयोग करें और फाइलोजेनेटिक विश्लेषण के लिए सापेक्ष कवक प्रकार प्रजातियों का चयन करें।
      नोट: Metarhizium या Beauveria के जीनस से संबंधित कवक प्रजातियों को आगे tef-983F / tef-2218R प्राइमर सेट 25 (चरण 2.1.1 से 2.2.3 दोहराने) के साथ प्रजातियों के स्तर पर पहचाना जाना चाहिए। कवक के लिए जो जेनेरा मेटारिज़ियम या ब्यूवेरिया से संबंधित नहीं हैं, अन्य आणविक मार्करों का उपयोग प्रजातियों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें डीएनए लाइस (एपीएन 2), बीटा ट्यूबुलिन (बीटीयूबी), आरएनए पोलीमरेज़ II सबसे बड़ी सबयूनिट (आरपीबी 1), आरएनए पोलीमरेज़ II दूसरा सबसे बड़ा सबयूनिट (आरपीबी 2), और अनुवाद दीर्घीकरण कारक 1 अल्फा (टीईएफ) 25,26 का 3 'हिस्सा) 25,26 शामिल है। .
  3. Phylogenetic विश्लेषण
    1. चरण 2.2.2 और 2.2.3 से एकाधिक अनुक्रमों को संरेखित करने के लिए ClustalX 2.1 software27 का उपयोग करें। GeneDoc28 के साथ मैन्युअल रूप से संरक्षित अनुक्रम क्षेत्र ट्रिम करें।
    2. न्यूनतम विकास (ME), पड़ोसी-शामिल होने (NJ), और अधिकतम संभावना (ML) विधियों के आधार पर MEGA7 software29 द्वारा phylogenetic विश्लेषण निष्पादित करें।
      नोट:: सभी तीन विधियों का प्रदर्शन करने से पुष्टि करने और सही ढंग से वर्गीकरण स्थिति को समाप्त करने में मदद मिल सकती है। पहली रोगजनकता स्क्रीन द्वारा स्क्रीन किए गए फंगल आइसोलेट्स का उपयोग जीनस स्तर पर आणविक पहचान के लिए किया जाता है। दूसरे विषाणु परीक्षण द्वारा जांचे गए कवक आइसोलेट्स का उपयोग प्रजातियों के स्तर आणविक और रूपात्मक पहचान के लिए किया जाता है।

3. ईपीएफ की रूपात्मक पहचान

  1. कवक कॉलोनी आकृति विज्ञान का अवलोकन
    1. 7 दिनों के लिए कवक संस्कृति कॉलोनी विकास पर कब्जा करने के लिए एक कैमरे का उपयोग करें, और उपनिवेशों के विकास, रूप (शराबी, फर्म), और रंग को रिकॉर्ड करें।
  2. कोनिडिया और कोनिडियोफोर का अवलोकन
    1. एक इनोक्यूलेशन लूप के साथ शुद्ध संस्कृति कवक कॉलोनी से कोनिडिया को स्क्रैप करें और बीजाणुओं को 0.1% ट्वीन 80 समाधान के साथ एक ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें। फिर, कोनिडिया के प्रकाश माइक्रोस्कोपिक अवलोकन के लिए एक कवरस्लिप के साथ कवर करें।
    2. फंगल कॉलोनी के किनारे पर हाइफल स्ट्रैंड के 5 मिमी 2 आगर ब्लॉक को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, और फिर आगर ब्लॉक को ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें।
    3. इस प्रकार सफाई करें: एक प्लास्टिक ड्रॉपर के साथ आगर ब्लॉक पर 0.1% ट्वीन 80 समाधान जोड़ें और चिमटी का उपयोग करके अधिकांश अतिरिक्त कोनिडिया को धोएं। फिर, इसे लाइटमाइक्रोस्कोपिक अवलोकन के लिए एक कवरस्लिप के साथ कवर करें।
      नोट: 0.1% Tween 80 कवक प्रजातियों और हाइड्रोफोबिकिटी के आधार पर एक और अधिक शक्तिशाली surfactant (सामग्री की तालिका) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    4. मापने और चौड़ाई और conidia और conidiophores की लंबाई रिकॉर्ड करने के लिए विभिन्न कवक आइसोलेट्स के बीच अंतर की तुलना करने के लिए.
    5. आर स्टूडियो (संस्करण 3.4.1) का उपयोग करके प्रत्येक तनाव की कोनिडियल चौड़ाई और लंबाई का विश्लेषण करने के लिए वेल्च के एनोवा परीक्षण और गेम्स-हॉवेल परीक्षण (पोस्ट-हॉक परीक्षण) का उपयोग करें।
      नोट: रूपात्मक वर्णों के डेटा विश्लेषण को मामलों द्वारा समायोजित किया जा सकता है। तीसरे विषाणु परीक्षण के साथ स्क्रीन किए गए फंगल आइसोलेट्स का उपयोग अनुभाग 4 और 5 में शारीरिक लक्षण वर्णन और ईसीएन रैंकिंग के लिए किया जाता है।

4. कोनिडियाल उत्पादकता और थर्मोटॉलरेंस की जांच

  1. कोनिडीअल उत्पादन परख
    1. 1/4 एसडीए माध्यम पर चयनित कवक को 10 दिनों के लिए अंधेरे में 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर अलग-थलग करें।
    2. 0.03% surfactant समाधान में कवक आइसोलेट के conidial निलंबन के 1 mL तैयार करें और ऊपर वर्णित के रूप में 1 x 107 conidia / mL को समायोजित करें।
    3. 1/4 एसडीए पर कोनिडियल निलंबन की 10 μL की तीन बूंदों को छोड़ दें और कवक के स्पोरुलेशन की गिनती करने के लिए 7, 10 और 14 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: 10 μL 7-14 दिनों के लिए कवक विकास के बाद भी कवक sporulation के साथ 5 मिमी ब्लॉक इकट्ठा करने के लिए सबसे अच्छी मात्रा है।
    4. कॉलोनी के केंद्र से 5 मिमी अगर ब्लॉक को अलग करने के लिए कॉर्क बोरर का उपयोग करें और प्रत्येक समय बिंदु पर 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.03% सर्फेक्टेंट समाधान (सामग्री की तालिका) के 1 एमएल में स्थानांतरित करें।
    5. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3,000 आरपीएम पर ट्यूब को भंवर करें और कोनिडिया की संख्या की गणना करने के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
      नोट: गिनती के लिए उपयोग किया जाने वाला सूत्र सबसे छोटे सेल के प्रति 25 वर्गों में कोनिडिया की संख्या है (आकार = 0.025 मिमी 2; कक्ष की गहराई = 0.1 मिमी):
      5 वर्गों में कोनिडिया की कुल संख्या 80 × ÷ (4 × 106)
    6. प्रत्येक अलग-थलग के लिए तीन बार दोहराएं।
  2. थर्मोटॉलरेंस परख
    1. 1/4 एसडीए माध्यम पर चयनित कवक को 10 दिनों के लिए अंधेरे में 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर अलग-थलग करें।
    2. 0.03% surfactant समाधान में कवक आइसोलेट के conidial निलंबन के 1 mL तैयार करें और ऊपर वर्णित के रूप में 1 x 107 conidia / mL को समायोजित करें।
    3. भंवर conidial निलंबन और 0, 30, 60, 90, और 120 मिनट के लिए एक 45 डिग्री सेल्सियस सूखे स्नान में यह गर्मी. 55 मिमी 1/4 एसडीए माध्यम पर कोनिडियाल निलंबन की 5 μL की तीन बूंदों को प्रत्येक समय बिंदु पर गर्मी-एक्सपोजर के बाद छोड़ दें और 25 ± 18 घंटे के लिए 1 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: क्षेत्र पर बेहतर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम होने के लिए कवक बूंदों को फैलाने से बचें।
    4. अंकुरण दर निर्धारित करने के लिए 200x प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत पांच यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों के साथ अंकुरित कोनिडिया बीजाणुओं की संख्या की गणना करें।
    5. प्रत्येक अलग के लिए तीन प्रतिकृतियाँ निष्पादित करें।

5. प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) रैंकिंग

  1. ECN परिकलन
    नोट: कुल ECN21 की गणना करने से पहले प्रत्येक संभावित कवक तनाव के conidial उत्पादन और thermotolerance डेटा प्राप्त करें।
    1. प्रत्येक समय बिंदु पर कोनिडियल उत्पादन के गुना-परिवर्तन (FC) की गणना करें:
      Equation 1
      जहां, डेटा संग्रह के लिए x = समय बिंदु; ncp = विकास के प्रत्येक दिन के बाद conidia की संख्या; और मैं = सीडेड कोनिडिया की प्रारंभिक संख्या।
    2. निम्न सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर तनाव उपचार के अंतर्गत कोनिडिया संख्या की गणना करें:
      Equation 2
      जहां, y = उपचार के तहत समय बिंदु का ईसीएन; TT0 = कोनिडिया की अंकुरण दर गर्मी तनाव से नहीं गुजर रही है (= 0 मिनट गर्मी उपचार की अंकुरण दर); TTz = तनाव गुणांक गर्मी उपचार (z) के विभिन्न समय पर कोनिडिया अंकुरण दर है।
    3. निम्न सूत्र का उपयोग कर कुल ECN परिकलित करें:
      Equation 3
    4. प्रत्येक कवक तनाव के ईसीएन की तुलना करें।
  2. कवक उपभेदों का मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए)
    नोट: पीसीए विश्लेषण ईसीएन की रैंकिंग की पुष्टि करता है और शारीरिक चरित्र मूल्यों के बीच सहसंबंध को समझने में मदद करता है। ECN मानों की तुलना करें और उच्च ECN मान वाले EPF आइसोलेट्स का चयन करें.
  3. कोडिंग द्वारा पीसीए बनाने के लिए R सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें:
    #Input PCA डेटा फ़ाइल
    a = read.table ("PCA.csv",sep=',',header=T)
    1. # प्रसंस्करण नमूना डेटा
      row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
      X = row.names(a)
      df<- a[2:11]
    2. #PCA परिकलन
      pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
      pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
      मान = pca$x
    3. #Output PCA विज़ुअलाइज़ेशन फ़ाइल
      png(file = 'pca.png', height = 2000, width = 2000, res = 300)
      नोट: ECN रैंकिंग की पुष्टि करने के लिए प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) निष्पादित करने के लिए 7 से 14 दिनों के conidial उत्पादन और सभी thermotolerance डेटा का उपयोग करें।
  4. ईसीएन या पीसीए के आधार पर सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले फंगल उपभेदों का चयन करें और आगे के शोध के लिए लक्ष्य कीटों का वायरस परीक्षण करें।

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Representative Results

संभावित एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) का अलगाव और चयन
टेनेब्रियो मोलिटर-मध्यस्थता एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) पुस्तकालय निर्माण विधि का उपयोग करके, कीट-हत्या गतिविधि के बिना कवक की संख्या को बाहर रखा जाएगा; इस प्रकार, ईपीएफ की अलगाव दक्षता और चयन को काफी हद तक बढ़ाया जा सकता है। इस विधि के आवेदन के दौरान, नमूना साइटों, मिट्टी के नमूनों और कवक अंकुरण दरों की जानकारी दर्ज की गई थी (तालिका 2)। हमारे पिछले आंकड़ों के आधार पर, 172 मिट्टी के नमूनों से कुल 101 फंगल आइसोलेट्स प्राप्त किए गए थे, जो 64% की उच्च अलगाव दक्षता का संकेत देते हैं। 101 कवक आइसोलेट्स में से, 26 आइसोलेट्स ने पहली रोगजनकता स्क्रीनिंग के बाद टी मोलिटर (100% मृत्यु दर) के खिलाफ कीटनाशक गतिविधि दिखाई, इसलिए फंगल आइसोलेट्स का उन्मूलन 26/101 = 25.7% था। दूसरे विषाणु परीक्षण में, टी. मोलिटर के खिलाफ 26 फंगल आइसोलेट्स की उच्च उग्रता को आगे प्रदर्शित किया गया था, जिनमें से 12 ने टी. मोलिटर लार्वा (5 दिनों के बाद 100% मृत्यु दर) (चित्रा 2 ए) के खिलाफ उच्च रोगजनकता दिखाई। इनका उपयोग कृषि कीट के खिलाफ विषाणु परीक्षण का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। तीसरे विषाणु परीक्षण मृत्यु दर और LT50 के आंकड़ों के आधार पर, कुल छह कवक आइसोलेट्स (NCHU-9, 11, 64, 69, 95, और 113) ने स्पोडोप्टेरा लिटुरा (LT50 = 2.94, 2.22, 2.84, 2.57, 2.96, और 1.13) के खिलाफ तेजी से कीट-हत्या गतिविधि का खुलासा किया, जिसका मूल्यांकन शारीरिक परख और प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) का उपयोग करके किया गया था।

EPF की आणविक पहचान
कवक टैक्सोनोमिक पदों को बेहतर ढंग से समझने के लिए, पहली रोगजनकता स्क्रीनिंग से 26 आइसोलेट्स को आईटीएस क्षेत्र (चित्रा 3 ए) के आधार पर आणविक विश्लेषण के अधीन किया गया था। परिणाम से पता चला है कि इन कवक आइसोलेट्स को स्पष्ट रूप से सात जेनेरा में विभाजित किया जा सकता है, जिसमें ब्यूवेरिया, क्लोनोस्टैचिस, फुसेरियम, कॉर्डिसेप्स, पेनिसिलियम, पुरपियोसिलियम और मेटारिज़ियम (चित्रा 3 ए) शामिल हैं। ITS1-5.8S-ITS2 क्षेत्र के आधार पर, EPF के जीनस वर्गीकरण की सटीक रूप से पुष्टि की गई थी, जबकि प्रजातियों का स्तर अभी भी अप्रभेद्य है। इसलिए, टीईएफ क्षेत्र के अनुक्रम का उपयोग स्पष्ट रूप से 12 होनहार ईपीएफ आइसोलेट्स के लिए प्रजातियों के स्तर को वर्गीकृत करने के लिए किया जाता है, जो कृषि कीट के खिलाफ वायरस परीक्षण से अलग हो जाते हैं। 12 आइसोलेट्स की आणविक पहचान से पता चला है कि 11 आइसोलेट्स मेटारिज़ियम से संबंधित हैं और इसमें चार प्रजातियां शामिल हैं, जिनमें एम. लेपिडिओटे (एनसीएचयू -9, एनसीएचयू -102), एम. पिन्गेनसे (एनसीएचयू -10, एनसीएचयू -11, एनसीएचयू -30, एनसीएचयू -32, एनसीएचयू -64), एम ब्रून्यूम (एनसीएचयू -27, एनसीयू -29), और एम एनीसोप्लिया (एनसीएचयू-69) शामिल हैं। शेष आइसोलेट की पहचान बी ऑस्ट्रेलिस (एनसीएचयू -113) (चित्रा 3 बी, सी) के रूप में की गई थी। उपर्युक्त परिणाम के अनुसार, टीईएफ का अनुक्रम क्षेत्र प्रजातियों के स्तर पर जीनस मेटारिज़ियम को प्रभावी ढंग से अलग कर सकता है, जबकि अन्य प्रजातियों को प्रजातियों को अलग करने के लिए आणविक मार्करों के रूप में अन्य अनुक्रम क्षेत्रों को खोजने की आवश्यकता होती है।

EPF की रूपात्मक पहचान
कवक रूपात्मक टिप्पणियों की सफाई विधि (चरण 3.2.3) के माध्यम से, कोनिडियोफोर की संरचनाओं को 0.1% ट्वीन 80 समाधान (चित्रा 4 ए) के साथ स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है, और ये अवलोकन संरचना के आकार को मापने और एक फोटो रिकॉर्ड लेने के लिए एक बेंचमार्क के रूप में काम कर सकते हैं। कोनिडिया के रंग, आकार और व्यवस्था को कॉलोनी कोनिडिया (चित्रा 4 बी, सी) के सूक्ष्म अवलोकनों के माध्यम से देखा जा सकता है। अवलोकन के बाद, कोनिडिया और कोनिडियोफोर आकृतियों के आकार को आगे मापा जा सकता है और सांख्यिकीय रूप से तुलना की जा सकती है (तालिका 3)।

कोनिडियल उत्पादकता, थर्मोटोलरेंस और ईसीएन रैंकिंग की जांच
ईसीएन सूत्र, जिसे पिछली रिपोर्ट 21 द्वारा प्रस्तावित किया गया था, एक उच्च तनाव-सहिष्णुता ईपीएफ आधारित शारीरिक चरित्र के चयन में मदद कर सकता है। ECN प्रत्येक EPF (चित्रा 5A, B) के कोनिडिया उत्पादन और थर्मोटॉलरेंस डेटा को जोड़ता है, जिसका अर्थ है कि ईसीएन मान अधिक होने पर कवक तनाव की उच्च व्यवहार्यता (चित्रा 5)। इसके अलावा, ईसीएन सूत्र से परिणामों को सत्यापित करने के लिए प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग किया गया था। परिणाम ने पीसीए और ईसीएन के बीच एक उच्च समन्वय का खुलासा किया, यह सुझाव देते हुए कि ईसीएन सूत्र का उपयोग व्यवहार्यता से संबंधित मापदंडों के पदानुक्रम और क्षेत्र अनुप्रयोग और आगे के व्यावसायीकरण (चित्रा 5 सी, डी) के लिए कवक की विकास क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: टेनेब्रियो मोलिटर-मध्यस्थता एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) पुस्तकालय निर्माण का चित्रण। भाग 1: मिट्टी के नमूने से फंगल अलगाव; भाग 2: रोगजनकता और वायरस-आधारित स्क्रीनिंग और कवक पहचान; भाग ३ । शारीरिक लक्षण वर्णन और कवक रैंकिंग. ECN = प्रभावी कोनिडिया संख्या; और पीसीए = प्रमुख घटक विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: होनहार एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) आइसोलेट्स के चयन के लिए मीलवर्म्स और स्पोडोप्टेरा लिटुरा की मृत्यु दर अलग हो जाती है। (ए) 26-चयनित कवक दूसरा मीलवर्म वायरस परीक्षण; 12 तेजी से हत्या और उच्च वायरस कवक आइसोलेट्स के mycoses समानांतर में दिखाया गया है। (बी) 12 कवक आइसोलेट्स को एस लिटुरा के खिलाफ वायरस परीक्षण के लिए चुना गया था। प्रत्येक कवक तनाव पर परीक्षण तीन बार दोहराया गया था। d.p.i. = दिन के बाद टीका लगाने. संशोधित आंकड़ा और किंवदंती Fronteris21 की अनुमति के साथ reproduced. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) उपभेदों का फाइलोजेनेटिक विश्लेषण (ए) जीनस-स्तर पर आईटीएस क्षेत्र के आधार पर और (बी-सी) प्रजाति-स्तर पर टीईएफ के आधार पर। ITS क्षेत्र और tef के phylogenetic विश्लेषण का निर्माण अधिकतम संभावना (एमएल), न्यूनतम विकास (एमई), और पड़ोसी-शामिल होने (एनजे) विधियों का उपयोग करके किया गया था। बूटस्ट्रैप विश्लेषण 1,000 प्रतिकृतियों का उपयोग करके फाइलोजेनियों की मजबूती का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था, और 50% से अधिक बूटस्ट्रैप अनुपात शाखाओं के ऊपर इंगित किए गए हैं। बोल्ड = पूर्व प्रकार उपभेदों. लाल और हरे तीर होनहार ईपीएफ को इंगित करते हैं। संशोधित आंकड़ा और किंवदंती Fronteris21 की अनुमति के साथ reproduced. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) (एम एनिसोप्लिया) आकृति विज्ञान की सूक्ष्म परीक्षा। धोने के बाद कोनिडियोफोर (ए) का अवलोकन। (बी) कोनिडिया आकार और रंग का अवलोकन। (ग) कोनिडिया और एम एनिसोप्लाई के बीजाणु तारों (एसएस) के बंडलों की व्यवस्था; सीपी = conidiophores; cc = बेलनाकार शंकु। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: छह संभावित आइसोलेट्स और प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) विश्लेषण के शारीरिक लक्षण वर्णन। (ए) कोनिडियल उत्पादन परख। (बी) थर्मोटोलरेंस परख। (C) ECN मानों का बार प्लॉट. (घ) मुख्य घटक विश्लेषण ने प्रत्येक स्ट्रेन के वितरण को दर्शाया। संशोधित आंकड़ा और किंवदंती Fronteris21 की अनुमति के साथ reproduced. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर नाम Amplicon आकार (bp) अनुक्रम(5'-3') क्षेत्र संदर्भ
ITS1F 550 TCCGTAGGTGAACCTGCGG यह है 25
ITS4R TCCTCCGCTTATTGATATGC
tef-983F 1000 GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT tef 26, 27, 41, 42
tef-2218R ATGACACCRACRGCRACRGTYTG

तालिका 1: फंगल पहचान के लिए प्राइमर जोड़े।

तालिका 2: टेनेब्रियो मोलिटर-मध्यस्थता ईपीएफ लाइब्रेरी निर्माण विधि के लिए दर्ज पैरामीटर नीचे सूचीबद्ध हैं। एनआईयू = राष्ट्रीय इलन विश्वविद्यालय का परिसर। NCHU = राष्ट्रीय चुंग Hsing विश्वविद्यालय के परिसर। संशोधित तालिका और किंवदंती Fronteris21 की अनुमति के साथ reproduced. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

प्रजातियां मोच Phialides μm±SD* कोनिडिया μm±SD*
मेटाराइजियम लेपिडिओटे NCHU-9 बेलनाकार, 7.3±0.67b×2.4±0.36a बेलनाकार, 6.5±0.45a×2.7±0.13b
मेटाराइजियम पिन्गेन्स NCHU-11 बेलनाकार, 8.6±0.68ab×2.6±0.30a बेलनाकार, 6.3±0.41b×2.7±0.16b
मेटाराइजियम पिन्गेन्स NCHU-64 बेलनाकार, 10.5±1.54a×2.4±0.32a बेलनाकार, 6.8±0.53a×2.9±0.31a
मेटाराइजियम एनिसोप्लाई NCHU-69 बेलनाकार, 9.4±1.58a×2.7±0.32a बेलनाकार, 6.3±0.34b×2.6±0.19b
मेटाराइजियम एनिसोप्लाई NCHU-95 बेलनाकार, 9.6±0.87a×2.6±0.29a बेलनाकार, 6.0±0.82b×2.9±0.29a
ब्यूवेरिया ऑस्ट्रेलिस NCHU-113 अंडाकार, एनए×2.6±0.57 ग्लोबोज़, 2.3±0.24×2.3±0.24
* सांख्यिकीय विश्लेषण आर स्टूडियो का उपयोग करके वेल्च के एनोवा परीक्षण के आधार पर किया गया था।
§ संशोधित तालिका और किंवदंती Fronteris (23) की अनुमति के साथ reproduced.

तालिका 3: छह होनहार entomopathogenic कवक आइसोलेट्स के रूपात्मक टिप्पणियों का एक उदाहरण। सांख्यिकीय विश्लेषण आर स्टूडियो का उपयोग करके वेल्च के एनोवा परीक्षण के आधार पर किया गया था। संशोधित तालिका और किंवदंती Fronteris21 की अनुमति के साथ reproduced.

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Discussion

कीट नियंत्रण के लिए एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) का उपयोग किया गया है। EPF30,31,32 को अलग करने, चुनने और पहचानने के लिए कई तरीके हैं। विभिन्न प्रकार के कीट चारा विधियों की तुलना करते हुए, ब्यूवेरिया बेसियाना और मेटारिज़ियम एनिसोप्लाई आमतौर पर कीट चारा 6,12,13,14 में पाए जाते थे। इन कीट चारा के बीच, गैलेरिया मेलोनेला और टेनेब्रियो मोलिटर ने ब्यूवेरिया और मेटारिज़ियम एसपीपी की उच्च वसूली दर दिखाई। तथ्य की बात के रूप में, mealworm (T. molitor)-चारा विधि की उपयोगिता मिट्टी के नमूनों से EPF के अलगाव के लिए एक सुविधा विधि के रूप में प्रदर्शित किया गया था17,21. फिर भी, यह बताया गया है कि चारा के रूप में कीड़ों का उपयोग विशिष्ट कवक प्रजातियों को अलग करने के लिए पूर्वाग्रह दिखाएगा3,33। इसलिए, मिट्टी के नमूनों से ईपीएफ को चारा देने के लिए विभिन्न कीट प्रजातियों (यानी, गैलेरिया मेलोनेला और टी मोलिटर) का संयोजन ईपीएफ 34 की विविधता को बढ़ा सकता है।

कीट हत्या गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, आगे के अध्ययन के लिए होनहार फंगल उपभेदों का चयन करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल में mealworm (T. molitor) द्वारा स्क्रीनिंग के दो दौर हैं। इस प्रक्रिया के बाद, कवक आइसोलेट्स की संख्या, जो मिट्टी के नमूनों से अलग हो जाती है, को नाटकीय रूप से कम किया जा सकता है और फंगल आइसोलेट्स तक सीमित किया जा सकता है जो पहली और दूसरी स्क्रीनिंग के बाद उच्च कीटनाशक गतिविधि दिखाते हैं। स्क्रीनिंग के अगले दौर के लिए फंगल आइसोलेट्स की बड़ी कमी समय लागत और श्रम-खपत की बचत करती है। यह भी ध्यान दिया जा सकता है कि चयनित कवक आइसोलेट्स ने मीलवर्म (टी मोलिटर) और तम्बाकू कटवर्म (स्पोडोप्टेरा लिटुरा) के बीच रोगजनकता के समान रुझान दिखाए, जो विभिन्न कीट प्रजातियों की रोगजनकता के लगातार परीक्षण का प्रदर्शन करते हैं और इसे अन्य फसल कीटों तक बढ़ाया जा सकता है21। इसके अलावा, शारीरिक परीक्षणों के आधार पर ईसीएन की गणना फसल के खेतों में उपयोग किए जाने वाले संभावित कवक उपभेदों के चयन की सुविधा प्रदान कर सकती है। इसी तरह के चयनात्मक तरीकों का उल्लेख अन्य रिपोर्टों द्वारा किया गया था, जबकि अजैविक और तनाव विशेषताओं जैसे कारकों को शामिल नहीं किया गया है12,8,31,35,36,37। इसलिए, ये उपभेद पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप कवक अंकुरण के प्रदर्शन पर प्रभाव पड़ता है और इस प्रकार व्यावसायीकरण करने में कठिनाई होती है। यह परिणाम भी field38 में प्रयोगशाला उपभेदों की अप्रयोज्यता का मुख्य कारण है।

रूपात्मक पहचान से, कोनिडियोफोर की स्पष्ट संरचना को खोजने और प्रत्येक कवक तनाव की विभिन्न विशेषताओं का निरीक्षण करने के लिए आगे के प्रयासों को निर्देशित किया जाना चाहिए। अध्ययनों में कठिन रूपात्मक पहचान को हल करने के लिए विभिन्न तरीकों को शामिल किया जा सकता है39। हालांकि, रूपात्मक पहचान निकटता से संबंधित कवक प्रजातियों को अलग करने में विफल रहती है; इसलिए, आणविक पहचान के डेटा को एकीकृत करना आवश्यक है। आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र ने जीनस स्तर के भेदभाव को दिखाया, जबकि अन्य आणविक मार्करों (यानी, मेटारिज़ियम के लिए टीईएफ, ब्यूवेरिया के लिए ब्लॉक) को प्रजातियों के स्तर 26,40,41 पर पहचान के लिए आवश्यक है।

शारीरिक लक्षण वर्णन में, प्रयोगों के मानक विचलन को कम करने के लिए, अधिकतम आरपीएम पर कम से कम 10 मिनट के लिए मशीन या मैनुअल भंवर का सुझाव दिया जाता है21। अच्छी तरह से मिश्रित conidia निलंबन thermotolerance परख और conidial उत्पादन परख के परिणामों की स्थिरता में वृद्धि होगी. दूसरी ओर, कोनिडियल उत्पादन परख में, एक निश्चित क्षेत्र के तहत गिने गए कोनिडिया संख्या (इस अध्ययन में फंगल कॉलोनी के केंद्रीय भाग में 5 मिमी ब्लॉक) अलग-अलग समय के विकास पर सुसंस्कृत प्लेट पर इस समस्या को उठाया कि विभिन्न कवक प्रजातियां और यहां तक कि विभिन्न उपभेदों ने हाइफे के विकास कॉम्पैक्टनेस के विभिन्न प्रदर्शन का खुलासा किया, जो नमूनाकरण के गैर-प्रतिनिधि को जन्म दे सकता है। इसलिए, कोनिडिया उत्पादन के लिए एक कठोर परीक्षण विधि समस्या में सुधार कर सकती है, जैसे कि पूरे कवक कॉलोनी के कोनिडिया की संख्या को सटीक रूप से गिनती करें और विकास क्षेत्र 42 के साथ सामान्य हो जाएं।

प्रभावी कोनिडिया नंबर (ईसीएन) सूत्र ईपीएफ कोनिडिया के खिलाफ पर्यावरणीय तनाव के प्रभाव के आधार पर डिज़ाइन किया गया है, अर्थात, व्यावसायीकरण के लिए होनहार कवक उपभेदों का चयन करने के लिए जंगली वातावरण की स्थिति के तहत कोनिडिया का अनुकरण करें21। इस प्रोटोकॉल में, कोनिडिया उत्पादन और गर्मी उपचार के डेटा का उपयोग पिछले अध्ययन 21 के बाद प्रत्येक होनहार कवक तनाव के कुल ईसीएन मूल्य की गणना के लिए किया गया था। इसके अलावा, एक प्राकृतिक वातावरण के तहत, तापमान को छोड़कर, अन्य पर्यावरणीय तनाव, जैसे कि आर्द्रता, पराबैंगनी विकिरण (यूवी), और मेजबान कोनिडिया अंकुरण को प्रभावित कर सकते हैं। विशेष रूप से, यूवी तनाव कोनिडिया अंकुरण को प्रभावित करने वाला एक मुख्य कारक है क्योंकि यूवी द्वारा उत्पन्न उच्च ऊर्जा मुक्त कण (जैसे पेरोक्साइड, हाइड्रॉक्सिल समूह और एकल ऑक्सीजन) रोगजनकता और माइक्रोबियल कीटनाशकों की दृढ़ता को कम कर सकते हैं। इस प्रकार, यूवी तनाव को भविष्य में ईसीएन सूत्र में और शामिल किया जा सकता है। यूवी तनाव से बचने के लिए, सूत्र में कोनिडिया 44,45,46 की यूवी सहिष्णुता को बढ़ाने के लिए तेल या सोडियम एल्गिनेट होना चाहिए, जो पुष्टि करता है कि संभावित उपभेदों में कीट नियंत्रण के लिए व्यावहारिकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल ने संभावित ईपीएफ उपभेदों के त्वरित और सटीक अलगाव के लिए एक विधि प्रदान की ताकि टी मोलिटर-मध्यस्थता ईपीएफ लाइब्रेरी का निर्माण किया जा सके। यह आधार है और जैविक नियंत्रण अनुसंधान के विकास के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, ईसीएन सूत्र को शोधकर्ताओं को ईपीएफ की क्षमता को समझने और इसे कृषि प्रणालियों में उपयोग के लिए एक वस्तु के रूप में विकसित करने में मदद करने के लिए लचीले ढंग से सुधार किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि इस काम में शामिल हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST) से अनुदान 109-2313-B-005 -048 -MY3 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bacteriological grade BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. AGR001 Suitable in most cell culture/molecular, biology applications.
AGAROSE, Biotechnology Grade BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. AGA001 For DNA electrophoresis.
BioGreen Safe DNA Gel Buffer BIOMAN SDB001T
Brass cork borer Dogger D89A-44001
Canon kiss x2 Canon EOS 450D For record strain colony morphology
Constant temperature incubator Yihder Co., Ltd. LE-509RD Fungal keeping.
cubee Mini-Centrifuge GeneReach MC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image System TOPBIO DGIS-12S
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette Thermo Scientific 4642010
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette Thermo Scientific 4642030
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette Thermo Scientific 4642070
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette Thermo Scientific 4642090
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette Thermo Scientific 4642060
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette Thermo Scientific 4642080
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems 4342718
GenepHlow Gel/PCR Kit Geneaid DFH100
Genius Dry Bath Incubator Major Science MD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mL SIBATA SABP-1195906 Measure the volume of reagents.
Hand tally counter SDI NO.1055
Hemocytometer bioman AP-0650010 Calculate the number of spore
Inoculating loop Dogger D8GA-23000
lid IDEAHOUSE RS92004
Micro cover glass MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD 24241
Microscope imaging system SAGE VISION CO.,LTD SGHD-3.6C
Microscope Slides DOGGER DG75001-07105
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis ADVANCE AD110
Nikon optical microscope SAGE VISION CO.,LTD Eclipse CI-L
Plastic cup IDEAHOUSE CS60016
Presto Mini gDNA Yeast Kit Geneaid GYBY300 Fungal genomic DNA extraction kit
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) HiMedia Leading BioSciences Company M033 Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms.
Scalpel Blade No.23 Swann-Morton 310
Scalpel Handle No.4 AGARWAL SURGICALS SSS -FOR-01-91
Shovel Save & Safe A -1580242 -00
Silwet L-77 bioman(phytotech) S7777 Surfactant
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Thermo Scientific 75002403
Steel Tweezers SIPEL ELECTRONIC SA GG-SA
Sterile Petri Dish BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. 1621 Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use.
ThermoCell MixingBlock BIOER MB-101
Tween 80 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 164-21775
TwinGuard ULT Freezer Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. MDF-DU302VX -80°C sample stored.
Vertical floor type cabinet Chih Chin BSC-3 Fungal operating culturing.
Vortex Genie II Scientific SIG560
Zipper storage bags Save & Safe A -1248915 -00
100 bp DNA Ladder Geneaid DL007
-20°C Freezer FRIGIDAIRE Frigidaire FFFU21M1QW -20°C sample and experimental reagents stored.
2X SuperRed PCR Master Mix TOOLS TE-SR01
50X TAE Buffer BIOMAN TAE501000

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References

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  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
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जीव विज्ञान अंक 175 entomopathogenic कवक Tenebrio molitor Beauveria Metarhizium प्रभावी conidia संख्या जैविक नियंत्रण एजेंट
अलगाव और मिट्टी के नमूनों से Entomopathogenic कवक का चयन और कीट कीटों के खिलाफ कवक वायरस का मूल्यांकन
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Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., Nai, Y. S. Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests. J. Vis. Exp. (175), e62882, doi:10.3791/62882 (2021).

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