Summary
Här presenterar vi ett protokoll baserat på mjölmask (Tenebrio molitor)-bete systemet som användes för att isolera och välja entomopathogena svampar (EPF) från jordprover. En effektiv conidia tal (ECN) formel används för att välja hög stresstolerans EPF baserat på fysiologiska egenskaper för skadedjur mikrobiell kontroll i fältet.
Abstract
Entomopathogena svampar (EPF) är ett av de mikrobiella bekämpningsmedlen för integrerat skadedjursbekämpning. För att bekämpa lokala eller invasiva skadedjur är det viktigt att isolera och välja inhemsk EPF. Därför användes jordbetemetoden i kombination med insektsbete (mjölmask, Tenebrio molitor) i denna studie med vissa modifieringar. Den isolerade EPF utsattes sedan för virulenstestet mot jordbruksskadedjuret Spodoptera litura. Dessutom utsattes de potentiella EPF stammarna för morfologiska och molekylära identifieringar. Dessutom utfördes conidiaproduktionen och termotoleranceanalysen för de lovande EPF-stammarna och jämfördes. Dessa uppgifter ersattes ytterligare med formeln för effektivt conidianummer (ECN) för laboratorierankning. Systemet med mjölmask av markbete och ECN-formeln kan förbättras genom att ersätta insektsarter och integrera fler stressfaktorer för utvärdering av kommersialisering och fälttillämpning. Detta protokoll ger ett snabbt och effektivt tillvägagångssätt för val av EPF och kommer att förbättra forskningen om biologiska kontrollmedel.
Introduction
För närvarande används entomopathogena svampar (EPF) ofta vid mikrobiell kontroll av jordbruks-, skogs- och trädgårdsskadedjur. Fördelarna med EPF är dess breda värdsortiment, god miljöanpassningsförmåga, miljövänlig natur och att det kan användas med andra kemikalier för att visa den synergistiska effekten för integrerat växtskydd1,2. För tillämpningen som skadedjursbekämpningsmedel är det nödvändigt att isolera ett stort antal EPF från antingen sjuka insekter eller den naturliga miljön.
Provtagningen av dessa organismer från deras värdar hjälper till att förstå den geografiska fördelningen och prevalensen av EPF i naturliga värdar3,4,5. Samlingen av svampinfekterade insekter begränsas dock vanligtvis av miljöfaktorer och insektspopulationer i fältet4. Med tanke på att insektsvärdar kommer att dö efter EPF-infektion och sedan falla i jorden, kan isolering av EPF från jordprover vara en stabil resurs3,6. Saprofyter är till exempel kända för att använda den döda värden som sin resurs för tillväxt. Jordbetet och selektiva mediumsystem har använts i stor utsträckning för att upptäcka och isolera EPF från jorden3,4,7,8,9,10.
I den selektiva mediummetoden pläteras den utspädda jordlösningen på ett medium som innehåller bredspektrumantibiotika (t.ex. kloramfenicol, tetracyklin eller streptomycin) för att hämma bakterietillväxten2,3,9,11. Det har dock rapporterats att denna metod kan snedvrida stammens mångfald och densitet och kan orsaka en över- eller underskattning av många mikrobiella samhällen6. Dessutom är de isolerade stammarna mindre patogena och konkurrerar med saprofyter under isolering. Det är svårt att isolera EPF från den utspädda jordlösningen3. I stället för att använda ett selektivt medium isolerar markbetesmetoden EPF från de infekterade döda insekterna, som kan lagras i 2-3 veckor, vilket ger en effektivare och standard EPF-separationsmetod3,4,7,6. Eftersom metoden är lätt att använda kan man isolera en mängd olika patogena stammar till en låg kostnad4. Därför används det ofta av många forskare.
När Beauveria bassiana och Metarhizium anisopliae jämför de olika typerna av insektsbetesystem är de vanligaste EPF-arterna som finns i insekter som tillhör Hemiptera, Lepidoptera, Blattella och Coleoptera6,12,13,14. Bland dessa insektsbeten visar Galleria mellonella (ordning Lepidoptera) och Tenebrio molitor (ordning Coleoptera) högre återhämtningshastigheter för Beauveria och Metarhizium spp., jämfört med andra insekter. Därför används G. mellonella och T. molitor ofta för insektsbete. Under årens lopp har USA: s jordbruksdepartement (USDA) etablerat ett EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) som innehåller en mängd olika arter, inklusive 4081 arter av Beauveria spp., 18 arter av Clonostachys spp., 878 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 226 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., 2473 arter av Metarhiz och 13 arter av Pochonia spp. bland andra15. Ett annat EPF-bibliotek byggdes av Entomology Research Laboratory (ERL) från University of Vermont i USA i omkring 30 år. Den omfattar 1345 stammar av EPF från USA, Europa, Asien, Afrika och Mellanöstern16.
För att bekämpa lokala skadedjur eller invasionsskadedjur i Taiwan krävs isolering och urval av inhemsk EPF. Därför har vi i detta protokoll modifierat och beskrivit förfarandet för jordbetemetoden och kombinerat det med insektsbete (mjölmask, Tenebrio molitor) system17. Baserat på detta protokoll inrättades ett EPF-bibliotek. Två screeningrundor (kvantifiering av inokulering) utfördes för de preliminära EPF-isolaten. EPF isolat visade patogenicitet till insekter. De potentiella stammarna utsattes för morfologiska och molekylära identifieringar och vidare analyseras av thermotolerance och conidial produktion analys. Vidare föreslogs också ett koncept med effektivt conidianummer. Med hjälp av ECN-formeln och huvudkomponentanalysen (PCA) analyserades de potentiella stammarna under simulerat miljötryck för att slutföra processen för att upprätta och granska EPF-biblioteket. Därefter testades patogenicitet av lovande EPF-stammar för målskadedjuret (t.ex. Spodoptera litura). Det nuvarande protokollet integrerar termotolerans- och konidiella produktionsdata i ECN-formeln och PCA-analysen, som kan användas som ett standardrankningssystem för EPF-relaterad forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Hela flödesschemat visas i figur 1.
1. Isolering och urval av potentiella entomopatiska svampar (EPF)
- Samla upp jordprovet
- Ta bort 1 cm av ytjorden och samla sedan jorden inom 5-10 cm djupet med en spade från varje provtagningsplats.
OBS: Provtagningsplatser skulle vara ett berg, skog eller glest befolkade områden för att undvika förorening av artificiellt sprutade EPF-stammar. Se till att områden för insamling av jordprover är täckta med ogräs på ytan. Torr jord eller fuktig jord är inte lämplig för detta experiment. - Registrera information om varje provtagningsplats, inklusive GPS, höjd, typ av fält, årlig temperatur, årlig nederbörd, insamlingstid (säsong), jordtyp och pH-värde.
- Samla 100 g av jordprovet i en plastpåse och håll det i rumstemperatur om det utsätts för svampisoleringsprotokollet i laboratoriet inom 3 timmar.
OBS: Om provet inte kan användas inom 3 timmar, förvara jorden i rumstemperatur under mörka förhållanden. Om försöket inte utförs omedelbart kan jordprovet lagras vid 4 °C i 1 vecka fram till protokollets början18,19.
- Ta bort 1 cm av ytjorden och samla sedan jorden inom 5-10 cm djupet med en spade från varje provtagningsplats.
- Bete och isolera EPF med mjölmask (Tenebrio molitor)
- Placera 100 g av jordprovet i en plastkopp (lockdiameter = 8,5 cm, höjd = 12,5 cm) och placera sedan 5 mjölmaskar på jordens yta vid rumstemperatur i mörkret i 2 veckor.
OBS: Andra typer av plastkoppbehållare kan också användas. Om jordarna är för torra (spruckna eller sandiga), spray steriliserad ddH2O (ca 5-10 ml) på marken. Kroppslängden c.a. 2,5 cm (14: e instar) av T. molitor larver hjälper till i svampisolatskärmar20. - Observera och registrera larverna dagligen för dödlighet och mykos; håll de döda larverna i koppen tills 2 veckor för svampisolering.
OBS: Svampkonidiasporen i jordproverna kommer att fästas på mjölmasklarverna under ovanstående process. Svampmykosen kommer att observeras när hyphae växer från det intersegmentala membranet, och då kommer hela kroppen att täckas med myceliet. Sporulation börjar efter 7 dagar och svampinfektionens färg kommer att ändras till färgen på conidiamassan. - Överför de döda insekterna till en ren bänk och använd en steril tandpetare för att samla conidia. Strila dem på en kvarts styrka Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) platta (55 mm) i laboratoriet21. Inkubera odlingsplattan vid 25 °C i 7 dagar för att få den primära svampkulturen.
OBS: 1/4 SDA-plattan bereds enligt följande: Blanda 1,5 g Sabouraud dextrosbuljong och 3 g agar i 200 ml H2O och sterilisera sedan i 20 min. Aliquot 1/4 SDA i varje 55 mm Petriskål före stelning. De stelnade 1/4 SDA-plattorna förvaras vid 4 °C fram till användning. - Re-streak varje primär odlingsvamp på en 55 mm 1/4 SDA-platta i ett laminärt flöde och inkubera odlingsplattan vid 25 °C i 7 dagar för att få enstaka kolonier av svampar.
- Upprepa denna återisolering ~ 2-3 gånger och observera under ljusmikroskopi för att få enstaka och rena morfologiska svampkolonier.
OBS: Isolera all EPF med T. molitor-bete och förvara enligt beskrivningen i följande avsnitt. Separation, bevarande, ren kultur och streaking måste utföras i ett laminärt flöde i de efterföljande sektionerna.
- Placera 100 g av jordprovet i en plastkopp (lockdiameter = 8,5 cm, höjd = 12,5 cm) och placera sedan 5 mjölmaskar på jordens yta vid rumstemperatur i mörkret i 2 veckor.
- Lagra EPF-isolat
- Skär 3 av de 5 mm agarblocken vid kanten av varje isolerad ren svamp odlad platta med en korkborr och placera den i ett 1,5 ml mikrocentrifugerrör som en replika.
OBS: Tre replikat för varje svampisolat rekommenderas för EPF-stammarnas lagring efter andra virulenstestet. Molekylär identifiering rekommenderas också om lagringsutrymmet är begränsat. - Tillsätt 250 μL 0,03 % tensidlösning (Materialtabell) och 250 μL 60 % glycerol i 1,5 ml mikrocentrifugerrör med hjälp av en mikropipett. sedan virvel i 10 s.
- Försegla 1,5 mL mikrocentrifugerrör med paraffinfilm och förkyl det i ett kylskåp på -20 °C i 24 timmar. Överför sedan de förkylda svampbestånden till ett kylskåp på -80 °C för kryopreservation.
OBS: Extra rena svampodlingsplattor (bortsett från kryobevarade prover) användes i avsnitt 1.4.
- Skär 3 av de 5 mm agarblocken vid kanten av varje isolerad ren svamp odlad platta med en korkborr och placera den i ett 1,5 ml mikrocentrifugerrör som en replika.
- Första patogenicitetsskärmen för svampisolat
- Placera fem T. molitor larver direkt på ytan av varje ren svamp odlingsplatta vid 25 °C.
- Observera och registrera mykos och dödlighet i 10 dagar. Välj svampisolat för vidare analys.
OBS: Svampisolat som orsakar 100% dödlighet väljs för andra virulenstestet för att bekräfta deras virulens mot T. molitor larver. Alternativt kan forskaren justera kriterierna enligt sin egen studie.
- Andra virulenstestet av svampisolat
OBS: Baserat på den första patogenicitetsskärmen, återställ de valda svampisolaten från -80 °C för det andra virulenstestet. Syftet med det andra virulenstestet är att kvantifiera patogeniciteten hos de utvalda svampisolaten efter den första screeningomgången.- Skörda conidia av varje svampisolat genom att virvla i 1 min och räkna antalet conidia med hjälp av en hemocytometer.
- Justera conidia suspensionen till en koncentration av 1 x 107 conidia/ml i en 0,03% tensidlösning (Materialtabell).
- Sprid 10 μL av svampfjädringen på 55 mm 1/4 SDA-plattor och växa i 7 dagar vid 25 °C i mörker.
- Placera fem T. molitor larver direkt på ytan av varje ren svamp odlingsplatta (c.a. 6 x 107 conidia). Försegla plattorna med paraffinfilm och inkubera vid 25 °C i mörker.
- Observera och registrera mykos och dödlighet i 10 dagar.
- Upprepa testet (från steg 1.51 till 1.5.5) i tre exemplar för varje svampisolat.
OBS: Svampisolat som orsakar 100% dödlighet väljs ut för tredje virulenstestet för att bekräfta deras virulens för att rikta in sig på skadedjuret.
- Tredje virulenstestet av svampisolat för målskadegörare (Spodoptera litura som exempel)
- Upprepa steg 1.5.2 till 1.5.6 med utvalda isolat från 2: a virulens för att testa virulens mot målskadegörare.
- Beräkna LT50 för varje svampisolat22.
OBS: LT50 för varje svampisolat beräknades genom generaliserade linjära modeller (GLMs) med R-studio (version 3.4.1); kvasibinomial felfördelning och en logglänkfunktion kan användas för att ta hänsyn till överdispersion.
2. Molekylär identifiering av EPF
- Extraktion av svampgenomiskt DNA
- Samla c.a. 1 cm2 EPF från 7-dagars 1/4 SDA-plattan.
- Extrahera svampgenomiskt DNA med hjälp av ett svampgenomiskt DNA-extraktionskit enligt tillverkarens instruktioner23 (Tabell över material).
- PCR-förstärkning och DNA-sekvensering
- Förstärk svampens ITS-region med PCR av DNA-provet21 med PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabell 1) med följande PCR-program: 94 °C i 1 min och sedan 35 cykler på 94 °C för 30 s, 55 °C för 30 s och 72 °C i 1 min, följt av en 7 minuters slutlig förlängning vid 7 minuter.
OBS: ITS1F/ITS4R primer setet är för identifieringen av släktnivån. - Sekvensera PCR med kommersiell sekvenseringstjänst.
- Använd NCBI BLAST-sökning efter liknande svampar i NCBI-databasen och välj den relativa svamptypen för fylogenetisk analys.
OBS: De svamparter som tillhör släktet Metarhizium eller Beauveria bör identifieras ytterligare på artnivå med tef-983F/tef-2218R primer set25 (upprepa steg 2.1.1-2.2.3). För svampar som inte tillhör släktena Metarhizium eller Beauveria kan andra molekylära markörer användas för att identifiera arten, inklusive DNA-lys (APN2), beta tubulin (BTUB), RNA-polymeras II största underenhet (RPB1), RNA-polymeras II näst största underenhet (RPB2) och 3' del av översättningsförlängningsfaktor 1 alfa (TEF)25,26 .
- Förstärk svampens ITS-region med PCR av DNA-provet21 med PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R primer set24 (tabell 1) med följande PCR-program: 94 °C i 1 min och sedan 35 cykler på 94 °C för 30 s, 55 °C för 30 s och 72 °C i 1 min, följt av en 7 minuters slutlig förlängning vid 7 minuter.
- Fylogenetisk analys
- Använd ClustalX 2.1-programvaran27 för att justera de flera sekvenserna från steg 2.2.2 och 2.2.3. Trimma området bevarade sekvenser manuellt med GeneDoc28.
- Utför den fylogenetiska analysen av MEGA7-programvaran29 baserat på minsta utveckling (ME), Neighbor-Joining (NJ) och maximal sannolikhet (ML) metoder.
OBS: Att utföra alla tre metoderna kan hjälpa till att bekräfta och exakt slutföra klassificeringsstatusen. Svampisolaten som screenas av den första patogenicitetsskärmen används för molekylär identifiering på släktnivå. De svampisolat som screenas av det andra virulenstestet används för artnivå molekylär och morfologisk identifiering.
3. Morfok identifiering av EPF
- Observation av svampkolonimorfologin
- Använd en kamera för att fånga svampodlingskolonitillväxten i 7 dagar och registrera koloniernas tillväxt, form (fluffig, fast) och färg.
- Observation av conidia och konidifoster
- Skrapa conidia från den rena svampkolonin med en inokuleringsslinga och överför sporerna till en glasrutschbana med 0,1% Tween 80-lösning. Täck sedan med ett täckslip för ljus mikroskopisk observation av conidia.
- Använd en skalpell för att skära ett 5 mm2 agarblock av bindestrecket vid kanten av svampkolonin och överför sedan agarblocket till en glasrutschbana.
- Utför rengöringen enligt följande: Tillsätt 0,1% Tween 80-lösningen på agarblocket med en plastdroppe och tvätta av det mesta av överskottet av conidia med pincett. Täck sedan den med ett täckslip för ljusmikroskopisk observation.
OBS: 0,1% Interpolering 80 kan ersättas med ett annat mer potent tensid (Materialtabell) beroende på svamparter och hydrofobi. - Mät och registrera bredden och längden på conidia och konidiforer för att jämföra skillnaderna mellan olika svampisolat.
- Använd Welchs ANOVA-test och Games-Howell-test (post hoc-test) för att analysera konidialbredden och längden på varje stam med R studio (version 3.4.1).
OBS: Dataanalys av morfologiska tecken kan justeras efter fall. Svampisolaten som screenas med det tredje virulenstestet används för fysiologisk karakterisering och ECN-rangordning i avsnitten 4 och 5.
4. Undersökning av konidial produktivitet och termotolerans
- Conidial produktionsanalys
- Odla det valda svampisolatet på 1/4 SDA-medium vid 25 ± 1 °C i mörker i 10 dagar.
- Förbered 1 ml av svampisolatets konidiella suspension i 0,03% tensidlösning och justera till 1 x 107 conidia/ml enligt beskrivningen ovan.
- Släpp tre droppar på 10 μL konidiell suspension på 1/4 SDA och inkubera vid 25 °C i mörker i 7, 10 och 14 dagar för att räkna svampens sporulering.
OBS: 10 μL är den bästa volymen för att samla 5 mm blocket med jämn svampsporulering efter svamptillväxt i 7-14 dagar. - Använd korkborren för att lossa 5 mm agarblock från mitten av kolonin och överföra till 1 ml 0,03% tensidlösning (Materialtabell) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör vid varje tidpunkt.
- Virvel röret vid 3 000 varv/min vid rumstemperatur i 15 minuter och använd en hemocytometer för att räkna antalet conidia.
OBS: Den formel som används för räkning är antalet conidia per 25 rutor i den minsta cellen (storlek = 0,025 mm2; kammarens djup = 0,1 mm):
Totalt antal conidia i 5 rutor ÷ 80 × (4 × 106) - Upprepa tre gånger för varje isolat.
- Termotoleransanalys
- Odla det valda svampisolatet på 1/4 SDA-medium vid 25 ± 1 °C i mörker i 10 dagar.
- Förbered 1 ml av den konidiella suspensionen av svampisolat i 0,03% tensidlösning och justera till 1 x 107 conidia/ml enligt beskrivningen ovan.
- Virvla den konidala suspensionen och värm den i ett 45 °C torrt bad i 0, 30, 60, 90 och 120 min. Släpp tre droppar på 5 μL av konidialfjädringen på 55 mm 1/4 SDA-medium vid varje tidpunkt efter värmeexponeringen och inkubera vid 25 ± 1 °C för 18 h.
OBS: Undvik att sprida svampdropparna för att bättre kunna fokusera på området. - Räkna antalet grodda conidiasporer med fem slumpmässigt utvalda fält under 200x ljusmikroskopi för att bestämma spiringshastigheten.
- Utför tre replikat för varje isolat.
5. Effektiv conidia-tal (ECN) ranking
- Ecn-beräkning
OBS: Inhämta konidiella produktions- och termotoleransdata för varje potentiell svampstam innan du beräknar det totala ECN21.- Beräkna vikförändringen (FC) för konidiell produktion vid varje tidpunkt:
var, x = tidspunkt för datainsamling; ncp = antal conidia efter varje tillväxtdag; och I = ursprungligt antal sådda conidia. - Beräkna conidianumret under stressbehandlingen vid varje tidpunkt med följande formel:
Om, y = ECN för den tidspunkt som behandlas, TT0 = spiringshastigheten för konidia som inte genomgår värmestress (= spiringshastighet på 0 min värmebehandling); TTz = stresskoefficient är konidiaspiringshastigheten vid olika tidpunkter för värmebehandling (z). - Beräkna det totala ECN med följande formel:
- Jämför ECN för varje svampstam.
- Beräkna vikförändringen (FC) för konidiell produktion vid varje tidpunkt:
- Huvudkomponentanalys (PCA) av svampstammar
OBS: PCA-analysen bekräftar rangordningen av ECN och hjälper till att förstå korrelationen mellan de fysiologiska teckenvärdena. Jämför ECN-värdena och välj EPF-isolat med högre ECN-värden. - Använd R-programvara för att skapa PCA genom kodning:
#Input PCA-datafil
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Bearbeta exempeldata
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=row.names(a)
df<- a[2:11] - #PCA beräkning
pca <- prcomp(df, center = TRUE, skala = SANT)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
värde = pca$x - #Output PCA-visualiseringsfil
png(fil = "pca.png", höjd = 2000, bredd = 2000, res = 300)
OBS: Använd 7 till 14 dagars konidial produktion och alla termotoleransdata för att utföra huvudkomponentanalys (PCA) för att bekräfta ECN-rankningen.
- # Bearbeta exempeldata
- Välj de bäst presterande svampstammarna baserat på ECN eller PCA och utför virulenstestet av målskadegörare för ytterligare forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering och urval av potentiella entomopathogena svampar (EPF)
Genom att använda tenebrio-smältor-medierad entomopathogenic svamp (EPF) bibliotek konstruktionsmetod, skulle antalet svampar utan insektsdödande aktivitet uteslutas. Isoleringseffektiviteten och urvalet av epf skulle därför till stor del kunna ökas. Vid tillämpningen av denna metod registrerades uppgifter om provtagningsplatser, jordprover och svampspiringshastigheter (tabell 2). Baserat på våra tidigare data erhölls totalt 101 svampisolat från 172 jordprover, vilket indikerar en hög isoleringseffektivitet på 64%. Bland de 101 svamp isolat visade 26 isolat insekticid aktivitet mot T. molitor (100% dödlighet) efter 1: a patogenicitet screening, därför eliminering av svamp isolat var 26/101 = 25,7%. I det andra virulenstestet påvisades den höga virulensen hos de 26 svampisolaten mot T. molitor ytterligare, varav 12 visade hög patogenicitet mot T. molitor larverna (100% dödlighet vid 5 dagar efter inokulering) (figur 2A). Dessa användes för att utvärdera virulenstestet mot jordbruksskadegöraren. Baserat på data från den tredje virulenstestdödligheten och LT50 visade totalt sex svampisolat (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 och 113) snabb insektsdödande aktivitet mot Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96).
Molekylär identifiering av EPF
För att bättre förstå svamp taxonomiska positioner, 26 isolat från den 1: a patogenicitet screeningen utsattes för molekylär analys baserad på ITS regionen (figur 3A). Resultatet visade att dessa svampisolat tydligt kunde delas in i sju släkten, inklusive Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium och Metarhizium (figur 3A). Baserat på regionen ITS1-5.8S-ITS2 bekräftades släktklassificeringen av EPF korrekt, medan artnivån fortfarande är oskiljbar. Därför används sekvensen i tefregionen för att tydligt klassificera artnivån för 12 lovande EPF-isolat från virulenstestet mot jordbruksskadegöraren. Den molekylära identifieringen av de 12 isolaten visade att 11 isolat tillhör Metarhizium och innehöll fyra arter, inklusive M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27). Det återstående isolatet identifierades som B. australis (NCHU-113) (figur 3B,C). Enligt ovanstående resultat kan sekvensregionen av tef effektivt skilja släktet Metarhizium på artnivå, medan andra arter behöver hitta andra sekvensregioner som molekylära markörer för att skilja arten.
Morfologisk identifiering av EPF
Genom rengöringsmetoden (steg 3.2.3) av svampmorfologiska observationer kunde konidifores strukturer ses tydligt med 0,1% Tween 80-lösning (figur 4A), och dessa observationer kunde fungera som ett riktmärke för att mäta strukturens storlek och ta en fotografering. Färgen, formen och arrangemanget av conidia kan ses genom mikroskopiska observationer av kolonin conidia (figur 4B, C). Efter observation kunde storleken på konidia- och konidiforformer mätas ytterligare och statistiskt jämföras (tabell 3).
Undersökning av konidial produktivitet, termotolerance och ECN-ranking
ECN-formeln, som föreslogs i den tidigare rapporten21, skulle kunna bidra till valet av en EPF-baserad fysiologisk karaktär med hög stresstolerans. ECN kombinerar konfidinernas produktions- och termotoleritetsdata för varje EPF (figur 5A,B), vilket innebär hög livskraft hos svampstammar när ECN-värdet är högt (figur 5). Dessutom användes visualisering av huvudkomponentanalys (PCA) för att verifiera resultaten från ECN-formeln. Resultatet visade på en hög samordning mellan pca och ECN, vilket tyder på att ECN-formeln skulle kunna användas för att utvärdera hierarkin av genomförbarhetsrelaterade parametrar och svampens utvecklingspotential till fälttillämpning och ytterligare kommersialisering (figur 5C, D).
Figur 1: Illustration av Tenebrio molitor-medierade entomopathogena svampar (EPF) bibliotek konstruktion. Del 1: Svampisolering från jordprov; Del 2: Patogenicitet och virulensbaserad screening och svampidentifiering. Del 3. Fysiologisk karakterisering och svamprankning. ECN = Effektivt conidianummer; och PCA = Huvudkomponentanalys. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Dödlighet hos mjölmaskar och Spodoptera litura för val av lovande entomopathogena svampar (EPF) isolat. (A) 26-utvalda svamp 2nd mealworm virulens test; Mykoserna av 12 snabba dödande och hög virulens svamp isolat visas parallellt. B) 12 svampisolat valdes ut för virulenstest mot S. litura. Testet på varje svampstam upprepades tre gånger. d.p.i. = dagar efter inokulering. Modifierad figur och förklaring reproducerad med tillstånd av Fronteris21. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Den fylogenetiska analysen av entomopathogena svampar (EPF) stammar på (A) släktenivå baserat på ITS-region och (B-C) Artnivå baserat på tef. Den fylogenetiska analysen av ITS-regionen och tef konstruerades med hjälp av maximal sannolikhet (ML), minsta evolution (ME) och neighbor-joining (NJ) metoder. Bootstrap analyser utfördes för att utvärdera robustheten hos fylogenierna med hjälp av 1 000 replikat, och bootstrap proportioner större än 50% anges ovanför grenar. Fet = Stammar av extyp. De röda och gröna pilarna anger den lovande EPF. Modifierad figur och förklaring reproducerad med tillstånd av Fronteris21. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Mikroskopisk undersökning av entomopathogena svampar (EPF) (M. anisopliae) morfologi. Observation av konidifoster (A) efter tvätt. B) Observation av conidia form och färg. C) Arrangemang av konidia och buntar av sporsträngar (SS) av M. anisopliae. Cp = konidifoster; cc = cylindrisk conidia. Skalningslist = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fysiologisk karakterisering av sex potentiella isolat och den effektiva analysen av conidianummer (ECN). B) Termotoleransanalys. C) Fältet med ECN-värden. D) Analysen av huvudkomponenter visade fördelningen av varje stam. Modifierad figur och förklaring reproducerad med tillstånd av Fronteris21. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Primer namn | Amplicon Storlek (bp) | Sekvens(5'-3') | Region | Hänvisning | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | DESS | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | Tef | 26, 27, 41, 42 | |
| tef-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabell 1: Primerpar för svampidentifiering.
Tabell 2: Parametrarna som registrerats för Tenebrio molitor-medierad EPF-bibliotekskonstruktionsmetod listas nedan. NIU = universitetsområdet för National Ilan University. NCHU = universitetsområdet av Medborgare Chung Hsing universitetar. Ändrad tabell och förklaring återges med tillstånd av Fronteris21. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
| Art | Anstränga | Phialides μm±SD* | Conidia μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 | Cylindrisk, 7,3±0,67b×2,4±0,36a | Cylindrisk, 6,5±0,45a×2,7±0,13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Cylindrisk, 8,6±0,68ab×2,6±0,30a | Cylindrisk, 6,3±0,41b×2,7±0,16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Cylindrisk, 10,5±1,54a×2,4±0,32a | Cylindrisk, 6,8±0,53a×2,9±0,31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Cylindrisk, 9,4±1,58a×2,7±0,32a | Cylindrisk, 6,3±0,34b×2,6±0,19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Cylindrisk, 9,6±0,87a×2,6±0,29a | Cylindrisk, 6,0±0,82b×2,9±0,29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Ellipsoid, NA×2.6±0.57 | Globose, 2,3±0,24×2,3±0,24 |
| *Statistisk analys utfördes baserat på Welchs ANOVA-test med hjälp av R-studion. | |||
| § Modifierad tabell och förklaring reproducerad med tillstånd av Fronteris (23). | |||
Tabell 3: Ett exempel på morfologiska observationer av sex lovande entomopathogenic svamp isolat. Statistisk analys utfördes baserat på Welchs ANOVA-test med hjälp av R-studion. Ändrad tabell och förklaring återges med tillstånd av Fronteris21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Entomopathogenic svampar (EPF) har använts för insektskontroll. Det finns flera metoder för att isolera, välja och identifiera EPF30,31,32. Genom att jämföra de olika typerna av insektsbetesmetoder hittades Beauveria bassiana och Metarhizium anisopliae ofta i insektsbeten6,12,13,14. Bland dessa insektsbeten visade Galleria mellonella och Tenebrio molitor höga återhämtningsnivåer av Beauveria och Metarhizium spp. I själva verket visades nyttan av metoden för mjölmask (T. molitor)-bete som en bekvämlighetsmetod för isolering av EPF från jordprover17,21. Det har dock rapporterats att använda insekter som bete skulle visa partiskheten att isolera specifika svamparter3,33. Därför kan en kombination av olika insektsarter (dvs. Galleria mellonella och T. molitor tillsammans) för att bete EPF från jordproverna öka mångfalden i EPF34.
För att utvärdera insektsdödningsaktiviteten finns det två rundor screening av mjölmask (T. molitor) i det nuvarande protokollet för att välja de lovande svampstammarna för vidare studier. Efter denna process kan antalet svampisolat, som isoleras från jordprover, minskas dramatiskt och begränsas till svampisolat som visade hög insekticid aktivitet efter den första och andra screeningen. Stor minskning av svampisolaten för nästa screeningrunda sparar tidskostnad och arbetskrävande. Det kan också noteras att de utvalda svampisolaten uppvisade liknande tendenser till patogenicitet mellan mjölmask (T. molitor) och tobaksskärmask (Spodoptera litura), vilket visade en konsekvent testning av patogenicitet hos olika insektsarter och kunde utvidgas ytterligare till andra växtskadegörare21. Dessutom skulle beräkningen av ecn på grundval av de fysiologiska testerna kunna underlätta valet av potentiella svampstammar som ska användas i odlingsfält. Liknande selektiva metoder nämndes i andra rapporter, medan faktorer som abiotiska egenskaper och stamegenskaper inte har inkluderats12,8,31,35,36,37. Därför kan dessa stammar påverkas av miljöfaktorer som leder till en inverkan på svampspiringens prestanda och därmed svårigheter att kommersialiseras. Denna konsekvens är också den främsta orsaken till att laboratoriestammar i fält38 inte är tillämpliga.
Från den morfologiska identifieringen bör ytterligare ansträngningar riktas mot att hitta den tydliga strukturen av konidifos och observera de olika egenskaperna hos varje svamp stam. Studierna kan omfatta olika metoder för att lösa den svåra morfologiska identifieringen39. Den morfologiska identifieringen gör dock ingen åtskillnad mellan närbesläktade svamparter. Därför är det nödvändigt att integrera data om molekylär identifiering. Den interna transkriberade distansregionen (ITS) visade diskriminering på släktnivå, medan andra molekylära markörer (dvs. tef för Metarhizium, block för Beauveria) behövs för identifiering på artnivå26,40,41.
I den fysiologiska karakteriseringen föreslås21 för att minska experimentens standardavvikelse i antingen maskinen eller den manuella virveln i minst 10 minuter vid max varvtal. Grundligt blandad conidia suspension skulle öka konsekvensen i resultaten av termotolerance analys och konidiell produktion analys. Å andra sidan, i den konidiella produktionsanalysen, det räknade conidia-numret under ett fast område (5 mm block i den centrala delen av svampkolonin i denna studie) på den odlade plattan vid olika tidpunkter ökade tillväxten problemet att olika svamparter och till och med olika stammar avslöjade olika prestanda av hyphaens tillväxtkomprimitet, vilket kan leda till att provtagningen inte är representativ. Därför kan en rigorös testmetod för conidiaproduktion förbättra problemet, såsom att noggrant räkna antalet conidia av hela svampkolonin och normalisera med tillväxtområdet42.
Den effektiva conidianummerformeln (ECN) är utformad baserat på påverkan av miljöbelastning mot EPF conidia, det vill säga simulera conidia under tillståndet av vild miljö för att välja de lovande svampstammarna för kommersialisering21. I detta protokoll användes data om produktion och värmebehandling av konidia för beräkning av det totala ECN-värdet för varje lovande svampstam, efter den tidigare studien21. Vidare, under en naturlig miljö, förutom temperaturen, kan annan miljöbelastning, såsom fuktighet, ultraviolett strålning (UV) och värd påverka konidiaspiring. Särskilt UV-stressen är en huvudfaktor som påverkar konidiaspiring eftersom de högenergifria radikalerna (såsom peroxider, hydroxylgrupper och singlet oxygen) som genereras av UV kan minska patogeniciteten och persistensen hos mikrobiella bekämpningsmedel43. UV-stress skulle således kunna inkluderas ytterligare i ECN-formeln i framtiden. För att undvika UV-stress bör formeln innehålla olja eller natriumalginat för att öka UV-toleransen för conidia44,45,46, vilket bekräftar att potentiella stammar har praktiskhet för skadedjursbekämpning47.
Detta protokoll tillhandahöll en metod för snabb och exakt isolering av potentiella EPF stammar att konstruera T. molitor-medierade EPF bibliotek. Detta är grunden och är nödvändigt för utvecklingen av forskning om biologisk bekämpning. Dessutom skulle ECN-formeln kunna förbättras flexibelt för att hjälpa forskare att förstå epf:s potential och utveckla den till en handelsvara för användning i jordbrukssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt involverad i detta arbete.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , Frederiksberg Denmark. Department of Ecology 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The 'Galleria bait method'for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D. Manual of Techniques in Insect Pathology. Lacy, L. , Academic. Amsterdam. 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Fungal database WorldWide Collection of Entomopathogenic Fungi. University of Vermont. , Available from: http://www.uvm.edu/~entlab/Fungus.html (2019).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17. , Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- National Resource for Biomedical Supercomputing. GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Pittsburgh Supercomputing Center's National Resource for Biomedical Supercomputing. , Available from: http://www.nrbsc.org/downloads (1997).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -Y., Choi, J. -B., Bae, S. -M., Koo, H. -N., Woo, S. -D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method'as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. Manual of techniques in insect pathology. , Elsevier. 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
