Summary
Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.
Abstract
Os fungos entomopatômicos (EPF) são um dos agentes de controle microbiano para o manejo integrado de pragas. Para controlar pragas locais ou invasivas, é importante isolar e selecionar ePF indígena. Por isso, o método de isca de solo combinado com o sistema isca de inseto (minhoca, Tenebrio molitor) foi utilizado neste estudo com algumas modificações. Os EPF isolados foram então submetidos ao teste de virulência contra a praga agrícola Spodoptera litura. Além disso, as cepas potenciais de EPF foram submetidas a identificações morfológicas e moleculares. Além disso, foram realizados ensaios de produção conidia e termotolerância para as promissoras cepas de EPF e comparadas; esses dados foram substituídos ainda na fórmula do número efetivo de conidia (ECN) para classificação laboratorial. O sistema de isca-míope do solo e a fórmula ECN podem ser melhorados substituindo espécies de insetos e integrando mais fatores de estresse para a avaliação da comercialização e aplicação do campo. Este protocolo fornece uma abordagem rápida e eficiente para a seleção da EPF e melhorará a pesquisa sobre agentes de controle biológico.
Introduction
Atualmente, os fungos entomopatômicos (EPF) são amplamente utilizados no controle microbiano de pragas agrícolas, florestais e horticulturais. As vantagens do EPF são suas amplas faixas de hospedagem, boa adaptabilidade ambiental, natureza ecológica, e que pode ser usada com outros produtos químicos para mostrar o efeito sinérgico para o manejo integrado de pragas1,2. Para a aplicação como agente de controle de pragas, é necessário isolar um grande número de EPF de insetos doentes ou do ambiente natural.
A amostragem desses organismos de seus hospedeiros ajuda na compreensão da distribuição geográfica e da prevalência da EPF em hospedeiros naturais3,4,5. No entanto, a coleta de insetos infectados fúngicos são geralmente limitadas por fatores ambientais e populações de insetos no campo4. Considerando que os hospedeiros de insetos morrerão após a infecção pelo EPF e, em seguida, cairão no solo, o isolamento do EPF das amostras do solo pode ser um recurso estável3,6. Por exemplo, saprophytes são conhecidos por usar o hospedeiro morto como seu recurso para o crescimento. A isca do solo e os sistemas médios seletivos têm sido amplamente utilizados para detectar e isolar o EPF do solo3,4,7,8,9,10.
No método médio seletivo, a solução de solo diluído é banhada em um meio contendo antibióticos de amplo espectro (por exemplo, clorofenicol, tetraciclina ou estreptomicina) para inibir o crescimento de bactérias2,3,9,11. No entanto, foi relatado que esse método pode distorcer a diversidade e densidade da cepa e pode causar uma super ou subestimação de muitas comunidades microbianas6. Além disso, as cepas isoladas são menos patogênicas e competem com saprofitos durante o isolamento. É difícil isolar a EPF da solução de solo diluída3. Em vez de usar um meio seletivo, o método de isca do solo isola o EPF dos insetos mortos infectados, que podem ser armazenados por 2-3 semanas, fornecendo assim um método de separação EPF mais eficiente e padrão3,4,7,6. Como o método é fácil de operar, pode-se isolar uma variedade de cepas patogênicas a um baixo custo4. Portanto, é amplamente utilizado por muitos pesquisadores.
Ao comparar os diferentes tipos de sistemas de isca de insetos, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae são as espécies EPF mais comuns que são encontradas em insetos pertencentes à Hemiptera, Lepidoptera, Blattella e Coleoptera6,12,13,14. Entre essas iscas de insetos, Galleria mellonella (ordem Lepidoptera) e Tenebrio molitor (ordem Coleoptera) mostram maiores taxas de recuperação de Beauveria e Metarhizium spp., quando comparados com outros insetos. Portanto, G. mellonella e T. molitor são comumente usados para isca de insetos. Ao longo dos anos, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estabeleceu uma Biblioteca EPF (Coleção de Serviços de Pesquisa Agrícola de culturas EPF, ARSEF) que contém uma grande variedade de espécies, incluindo 4081 espécies de Beauveria spp., 18 espécies de Clonostachys spp., 878 espécies de Cordyceps spp., 2473 espécies de Metarhizium spp., 226 espécies de Purpureocillium spp., e 13 espécies de Pochonia spp. entre outras15. Outra Biblioteca EPF foi construída pelo Laboratório de Pesquisa em Entomologia (ERL) da Universidade de Vermont, nos Estados Unidos, por 30 anos. Inclui 1345 cepas de EPF dos Estados Unidos, Europa, Ásia, África e Oriente Médio16.
Para controlar pragas locais ou de invasão em Taiwan, é necessário o isolamento e a seleção de EPF indígenas. Portanto, neste protocolo, modificamos e descrevemos o procedimento do método de isca do solo e o combinamos com o sistema isca de inseto (minhoca, Tenebrio molitor)17. Com base neste protocolo, foi criada uma biblioteca da EPF. Foram realizadas duas rodadas de triagem (quantificação da inoculação) para os isolados preliminares da EPF. Os isolados do EPF apresentaram patogenicidade aos insetos. As cepas potenciais foram submetidas a identificações morfológicas e moleculares e posteriormente analisadas pelo ensaio termotolerância e produção conidial. Além disso, também foi proposto um conceito de número de conidia eficaz (ECN). Utilizando a fórmula ECN e a análise de componentes principais (PCA), as cepas potenciais foram analisadas sob pressão ambiental simulada para concluir o processo de criação e triagem da biblioteca do EPF. Posteriormente, foram testadas patogenicidades de cepas promissoras de EPF para a praga alvo (por exemplo, Spodoptera litura). O protocolo atual integra dados de termotolerância e produção conidial na fórmula ECN e análise pca, que podem ser utilizados como um sistema de classificação padrão para pesquisas relacionadas ao EPF.
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Protocol
NOTA: Todo o fluxograma é mostrado na Figura 1.
1. Isolamento e seleção de potenciais fungos entomopatogênicos (EPF)
- Coletar a amostra do solo
- Remova 1 cm do solo superficial e colete o solo dentro da profundidade de 5-10 cm usando uma pá de cada local de amostragem.
NOTA:Os locais de amostragem seriam uma montanha, floresta ou áreas pouco povoadas para evitar a contaminação de cepas de EPF artificialmente pulverizadas. Certifique-se de que as áreas para a coleta de amostras de solo estejam cobertas com a identidade na superfície. Solo seco ou solo úmido não é adequado para este experimento. - Regissua os detalhes de cada local de amostragem, incluindo GPS, elevação, tipo de campo, temperatura anual, precipitação anual, tempo de coleta (estação), tipo de solo e valor de pH.
- Colete 100 g da amostra do solo em um saco plástico e mantenha-o à temperatura ambiente se submá-lo ao protocolo de isolamento fúngico em laboratório dentro de 3h.
NOTA: Se a amostra não puder ser usada dentro de 3h, armazene o solo à temperatura ambiente em condições escuras. Se o experimento não for realizado imediatamente, a amostra do solo pode ser armazenada a 4 °C por 1 semana até o início do protocolo18,19.
- Remova 1 cm do solo superficial e colete o solo dentro da profundidade de 5-10 cm usando uma pá de cada local de amostragem.
- Isca e isolar o EPF com minhoca (Tenebrio molitor)
- Coloque 100 g da amostra do solo em um copo plástico (diâmetro da tampa = 8,5 cm, altura = 12,5 cm), e depois coloque 5 minhocas na superfície do solo à temperatura ambiente no escuro por 2 semanas.
NOTA: Outros tipos de recipientes de copo plástico também podem ser usados. Se os solos estiverem muito secos (rachados ou arenosos), pulverize ddH2O esterilizado (cerca de 5-10 mL) nos solos. O comprimento do corpo c.a. 2,5 cm (14th instar) de larvas T. molitor ajuda em telas de isolamento fúngico20. - Observar e registrar as larvas diariamente para mortalidade e micose; manter as larvas mortas no copo até 2 semanas para isolamento fúngico.
NOTA: O esporo de conidia fúngica nas amostras do solo se anexará às larvas de minhoca durante o processo acima. A micose fúngica será observada à medida que a hifa crescer a partir da membrana intersegmental, e então todo o corpo será coberto com o micélio. A esporulação começará após 7 dias e a cor da infecção fúngica mudará para a cor da massa conidia. - Transfira os insetos mortos para um banco limpo e use um palito estéril para coletar a conidia. Listra-los em um quarto de força Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) placa (55 mm) no laboratório21. Incubar a placa de cultura a 25 °C durante 7 dias para obter a cultura primária dos fungos.
NOTA: A placa 1/4 SDA é preparada da seguinte forma: Misture 1,5 g de caldo de dextrose Sabouraud e 3 g de ágar em 200 mL de H2O e, em seguida, esterilize por 20 min. Alíquota 1/4 SDA em cada placa de Petri de 55 mm antes da solidificação. As placas SDA solidificadas 1/4 são armazenadas a 4 °C até usar. - Re-raiar cada fungo de cultura primária em uma placa SDA de 55 mm 1/4 em um fluxo laminar e incubar a placa de cultura a 25 °C por 7 dias para obter colônias únicas de fungos.
- Repita este re-isolamento ~2-3 vezes e observe sob microscopia leve para obter colônias fúngicas morfológicas únicas e puras.
NOTA: Isole todo o EPF usando T. molitor-isca e armazene conforme descrito na seção a seguir. A separação, preservação, cultura pura e estonteamento devem ser realizadas em um fluxo laminar nas seções subsequentes.
- Coloque 100 g da amostra do solo em um copo plástico (diâmetro da tampa = 8,5 cm, altura = 12,5 cm), e depois coloque 5 minhocas na superfície do solo à temperatura ambiente no escuro por 2 semanas.
- Armazene os isolados do EPF
- Corte 3 dos blocos de ágar de 5 mm na borda de cada placa cultivada pura e pura isolada com um borer de rolha e coloque-o em um tubo de microcrédito de 1,5 mL como uma réplica.
NOTA: São recomendadas três réplicas para cada isolado fúngico para o armazenamento das cepas EPF após o 2º teste de virulência. A identificação molecular também é recomendada se o espaço de armazenamento for limitado. - Adicione 250 μL de solução surfactante de 0,03% (Tabela de Materiais) e 250 μL de 60% de glicerol no tubo de microcrédito de 1,5 mL usando uma micropipette; então, vórtice para 10 s.
- Sele o tubo de microcrédito de 1,5 mL com filme de parafina e pré-la em uma geladeira de -20 °C por 24 h. Em seguida, transfira os estoques fúngicos pré-cozidos para um refrigerador de -80 °C para criopreservação.
NOTA: Foram utilizadas placas de cultura fúngica extra pura (além das amostras preservadas por criocultura) na seção 1.4.
- Corte 3 dos blocos de ágar de 5 mm na borda de cada placa cultivada pura e pura isolada com um borer de rolha e coloque-o em um tubo de microcrédito de 1,5 mL como uma réplica.
- 1ª tela de patogenicidade para isolados fúngicos
- Coloque cinco larvas T. molitor diretamente na superfície de cada placa de cultura fúngica pura a 25 °C.
- Observe e regise a micose e a mortalidade por 10 dias. Selecione o isolado fúngico para análise posterior.
NOTA: Isolados fúngicos que causam 100% de mortalidade são selecionados para o 2º teste de virulência para confirmar sua virulência às larvas T. molitor . Alternativamente, o pesquisador pode ajustar os critérios conforme seu próprio estudo.
- 2º teste de virulência de isolados fúngicos
NOTA: Com base na 1ª tela de patogenicidade, recupere os isolados fúngicos selecionados a partir de -80 °C para o 2º teste de virulência. O objetivo do 2º teste de virulência é quantificar a patogenicidade dos isolados fúngicos selecionados após a 1ª rodada de triagem.- Colher conidia de cada fúngico isolado por vórtice por 1 min e contar o número de conidia usando um hemótmetro.
- Ajuste a suspensão conidia a uma concentração de 1 x 107 conidia/mL em uma solução surfactante de 0,03% (Tabela de Materiais).
- Espalhe 10 μL da suspensão fúngica em placas 55 mm 1/4 SDA e cresça por 7 dias a 25 °C no escuro.
- Coloque cinco larvas T. molitor diretamente na superfície de cada placa de cultura fúngica pura (c.a. 6 x 107 conidia). Sele as placas com filme de parafina e incubar a 25 °C no escuro.
- Observe e regise a micose e a mortalidade por 10 dias.
- Repita o teste (da etapa 1,51 a 1,5,5) em triplicado para cada isolado fúngico.
NOTA: Isolados fúngicos que causam 100% de mortalidade são selecionados para o 3º teste de virulência para confirmar sua virulência para atingir a praga.
- 3º teste de virulência de isolados fúngicos para pragas alvo (Spodoptera litura como exemplo)
- Repetir as etapas 1.5.2 a 1.5.6 com isolados selecionados da 2ª virulência para testar a virulência contra praga alvo.
- Calcule o LT50 de cada isolado fúngico22.
NOTA: O LT50 de cada isolado fúngico foi calculado através de modelos lineares generalizados (GLMs) utilizando o estúdio R (versão 3.4.1); a distribuição de erros quaseibinomiais e uma função de link de registro podem ser usadas para explicar a superdispersão.
2. Identificação molecular da EPF
- Extração de DNA genômico fúngico
- Recolher c.a. 1 cm2 EPF da placa SDA de 7 dias 1/4.
- Extrair o DNA genômico fúngico usando um kit de extração de DNA genômico fúngico de acordo com as instruções do fabricante23 (Tabela de Materiais).
- Amplificação pcr e sequenciamento de DNA
- Amplie a região de FUNGAL ITS por PCR da amostra de DNA21 usando o conjunto de primer PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R24 (Tabela 1) com o seguinte programa PCR: 94 °C por 1 min, e, em seguida, 35 ciclos de 94 °C para 30 s, 55 °C para 30 s e 72 °C para 1 min, seguido por uma extensão final de 7 min a 72 °C.
NOTA: O conjunto de primer ITS1F/ITS4R é para identificação do nível do gênero. - Sequenciar o PCR pelo serviço de sequenciamento comercial.
- Use a pesquisa NCBI BLAST para fungos semelhantes no banco de dados NCBI e selecione as espécies relativas do tipo fúngico para análise filogenética.
NOTA: As espécies fúngicas pertencentes ao gênero de Metarhizium ou Beauveria devem ser identificadas ainda mais ao nível da espécie com tef-983F/tef-2218R primer set25 (passos repetidos 2.1.1 a 2.2.3). Para fungos que não pertencem aos gêneros Metarhizium ou Beauveria, outros marcadores moleculares podem ser usados para identificar as espécies, incluindo DNA lyase (APN2), beta tubulin (BTUB), RNA polymerase II maior subunidade (RPB1), RNA polymerase II segunda maior subunidade (RPB2) e porção de 3' do fator de alongamento de tradução 1 alfa (TEF)25,26 .
- Amplie a região de FUNGAL ITS por PCR da amostra de DNA21 usando o conjunto de primer PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R24 (Tabela 1) com o seguinte programa PCR: 94 °C por 1 min, e, em seguida, 35 ciclos de 94 °C para 30 s, 55 °C para 30 s e 72 °C para 1 min, seguido por uma extensão final de 7 min a 72 °C.
- Análise filogenética
- Use o software ClustalX 2.127 para alinhar as múltiplas sequências das etapas 2.2.2 e 2.2.3. Apare manualmente a região de sequências conservadas com GeneDoc28.
- Realize a análise filogenética pelo software MEGA729 com base nos métodos de evolução mínima (ME), Junção de Vizinhos (NJ) e probabilidade máxima (ML).
NOTA: A execução dos três métodos pode ajudar a confirmar e concluir com precisão o status de classificação. Os isolados fúngicos rastreados pela 1ª tela de patogenicidade são usados para identificação molecular no nível do gênero. Os isolados fúngicos examinados pelo 2º teste de virulência são usados para a identificação molecular e morfológica do nível da espécie.
3. Identificação morfológica da EPF
- Observação da morfologia da colônia fúngica
- Use uma câmera para capturar o crescimento da colônia de cultura fúngica por 7 dias, e registrar o crescimento, forma (fofa, firme) e cor das colônias.
- Observação de conidia e conidioforos
- Raspe conidia da colônia fúngica de cultura pura com um laço de inoculação e transfira os esporos para um escorregador de vidro com solução 0,1% Tween 80. Em seguida, cubra com um tapa-tampa para observação microscópica leve de conidia.
- Use um bisturi para cortar um bloco de 5 mm2 de ágar da cadeia de hignênicos na borda da colônia fúngica e, em seguida, transfira o bloco de ágar para um slide de vidro.
- Realize a limpeza da seguinte forma: Adicione a solução 0,1% Tween 80 no bloco de ágar com um conta-gotas de plástico e lave a maior parte do excesso de conidia usando pinças. Em seguida, cubra-o com um tapa-tampa para observação leve.
NOTA: 0,1% Interpol 80 pode ser substituída por outra surfactante mais potente (Tabela de Materiais) dependendo de espécies fúngicas e hidroofobidade. - Meça e regisse a largura e o comprimento das conidia e conidioforos para comparar as diferenças entre diferentes isolados fúngicos.
- Use o teste ANOVA da Welch e o teste Games-Howell (teste pós-hoc) para analisar a largura e o comprimento conidiais de cada cepa usando o estúdio R (versão 3.4.1).
NOTA: A análise de dados de caracteres morfológicos pode ser ajustada por casos. Os isolados fúngicos selecionados com o 3º teste de virulência são utilizados para a caracterização fisiológica e o ranking ECN nas seções 4 e 5.
4. Investigação de produtividade conidial e termotolerância
- Ensaio de produção conidial
- Cultura o fúngico selecionado isolar em 1/4 SDA médio a 25 ± 1 °C no escuro por 10 dias.
- Prepare 1 mL da suspensão conidial do isolado fúngico em solução surfactante de 0,03% e ajuste para 1 x 107 conidia/mL conforme descrito acima.
- Solte três gotículas de 10 μL de suspensão conidial on1/4 SDA e incubar a 25 °C no escuro por 7, 10 e 14 dias para contar a esporulação de fungos.
NOTA: 10 μL é o melhor volume para coletar o bloco de 5 mm com esporulação fúngica uniforme após o crescimento fúngico por 7-14 dias. - Use o borer de cortiça para desconectar 5 mm do bloco de ágar do centro da colônia e transferir para 1 mL de solução surfactante de 0,03% (Tabela de Materiais) em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mL em cada ponto de tempo.
- Vórtice o tubo a 3.000 rpm à temperatura ambiente por 15 minutos e use um hemótmetro para contar o número de conidia.
NOTA: A fórmula utilizada para a contagem é o número de conidia por 25 quadrados da menor célula (tamanho = 0,025 mm2; profundidade da câmara = 0,1 mm):
Total Não de conidia em 5 praças ÷ 80 × (4 × 106) - Repita três vezes para cada isolado.
- Ensaio de termotolerância
- Cultura o fúngico selecionado isolar em 1/4 SDA médio a 25 ± 1 °C no escuro por 10 dias.
- Prepare 1 mL da suspensão conidial do isolado fúngico em solução surfactante de 0,03% e ajuste para 1 x 107 conidia/mL conforme descrito acima.
- Vórtice a suspensão conidial e aqueça-a em um banho seco de 45 °C por 0, 30, 60, 90 e 120 min. Solte três gotículas de 5 μL da suspensão conidial em 55 mm 1/4 SDA médio em cada ponto após a exposição ao calor e incubar a 25 ± 1 °C por 18 h.
NOTA: Evite espalhar as gotículas fúngicas para poder se concentrar melhor na área. - Conte o número de esporos de conidia germinados com cinco campos selecionados aleatoriamente sob microscopia leve de 200x para determinar a taxa de germinação.
- Execute três réplicas para cada isolado.
5. Classificação de número de conidia eficaz (ECN)
- Cálculo da ECN
NOTA: Obtenha os dados de produção conidial e termotolerância de cada cepa fúngica potencial antes de calcular o ECN21 total.- Calcule a troca de dobras (FC) da produção conidial em cada ponto de tempo:
onde, x = ponto de tempo para coleta de dados; ncp = número de conidia após cada dia de crescimento; e I = número inicial de conidia semeada. - Calcule o número de conidia sob o tratamento de estresse em cada ponto de tempo usando a seguinte fórmula:
Onde, y = o ECN do ponto de tempo em tratamento; TT0 = a taxa de germinação da conidia não submetida ao estresse térmico (= taxa de germinação de 0 min tratamento térmico); TTz = coeficiente de estresse é a taxa de germinação conidia em diferentes momentos de tratamento térmico (z). - Calcule o ECN total usando a seguinte fórmula:
- Compare a ECN de cada cepa fúngica.
- Calcule a troca de dobras (FC) da produção conidial em cada ponto de tempo:
- Análise de componentes principais (PCA) de cepas fúngicas
NOTA:A análise do PCA confirma o ranking da ECN e ajuda na compreensão da correlação entre os valores do caráter fisiológico. Compare os valores ECN e selecione isolados EPF com valores de ECN mais elevados. - Use o software R para criar PCA codificando:
#Input arquivo de dados PCA
a = read.table ("PCA.csv",sep=',',cabeçalho=T)- # Processamento de dados amostrais
row.names(a) <- c("NCHU-9", "NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=row.names(a)
df<- a[2:11] - cálculo #PCA
pca <-prcomp(df, centro = TRUE, escala = TRUE)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / soma(vars)
pc2_percent = vars[2] / soma(vars)
valor = pca$x - #Output arquivo de visualização PCA
png (arquivo = 'pca.png', altura = 2000, largura = 2000, res = 300)
NOTA: Utilize de 7 a 14 dias de produção conidial e todos os dados de termotolerância para executar a análise de componentes principais (PCA) para confirmar o ranking da ECN.
- # Processamento de dados amostrais
- Selecione as cepas fúngicas de melhor desempenho com base na ECN ou PCA e realize o teste de virulência de pragas-alvo para novas pesquisas.
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Representative Results
Isolamento e seleção de potenciais fungos entomopatômicos (EPF)
Utilizando o método de construção da biblioteca de fungos entomopatômicos mediados pelo Tenebrio molitor (EPF), o número de fungos sem atividade de matança de insetos seria excluído; assim, a eficiência de isolamento e seleção de EPF poderia ser em grande parte aumentada. Durante a aplicação deste método, foram registradas as informações dos locais de amostragem, amostras de solo e as taxas de germinação fúngica (Tabela 2). Com base em nossos dados anteriores, um total de 101 isolados fúngicos foram obtidos de 172 amostras de solo, indicando uma alta eficiência de isolamento de 64%. Entre os 101 isolados fúngicos, 26 isolados apresentaram atividade inseticida contra T. molitor (100% de mortalidade) após o 1º rastreamento de patogenicidade, portanto, a eliminação dos isolados fúngicos foi de 26/101 = 25,7%. No 2º teste de virulência, foi ainda demonstrada a alta virulência dos 26 isolados fúngicos contra T. molitor , dos quais 12 apresentaram alta patogenicidade contra as larvas T. molitor (100% de mortalidade aos 5 dias após a inoculação) (Figura 2A). Estes foram utilizados para avaliar o teste de virulência contra a praga agrícola. Com base nos dados da mortalidade do 3º teste de virulência e LT50, um total de seis isolados fúngicos (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 e 113) revelaram atividade rápida de matança de insetos contra Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96 e 1,13), avaliada utilizando o ensaio fisiológico e o número de conidia eficaz (ECN) (Figura 2B).
Identificação molecular da EPF
Para melhor compreender as posições taxonômicas fúngicas, 26 isolados do 1º rastreamento de patogenicidade foram submetidos à análise molecular com base na região de ITS (Figura 3A). O resultado mostrou que esses isolados fúngicos poderiam ser claramente divididos em sete gêneros, incluindo Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium e Metarhizium (Figura 3A). Com base na região ITS1-5.8S-ITS2, a classificação do gênero de EPF foi confirmada com precisão, enquanto o nível da espécie ainda é indistinguível. Portanto, a sequência da região do tef é usada para classificar claramente o nível de espécie para 12 isolados promissores da EPF do teste de virulência contra a praga agrícola. A identificação molecular dos 12 isolados mostrou que 11 isolados pertencem a Metarhizium e continham quatro espécies, incluindo M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) e M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). O isolado restante foi identificado como B. australis (NCHU-113) (Figura 3B,C). De acordo com o resultado acima, a região sequencial do tef pode efetivamente distinguir o gênero Metarhizium ao nível das espécies, enquanto outras espécies precisam encontrar outras regiões sequenciais como marcadores moleculares para distinguir a espécie.
Identificação morfológica da EPF
Através do método de limpeza (etapa 3.2.3) das observações morfológicas de fungos, as estruturas dos conidioforos puderam ser vistas claramente com solução 0,1% Tween 80 (Figura 4A), e essas observações poderiam servir de referência para medir o tamanho da estrutura e tirar um registro fotográfico. A cor, a forma e o arranjo da conidia podem ser vistos através de observações microscópicas da colônia conidia (Figura 4B,C). Após observação, os tamanhos das formas conidia e conidiophore poderiam ser ainda mais medidos e estatisticamente comparados (Tabela 3).
Investigação de produtividade conidial, termotolerância e ranking ECN
A fórmula da ECN, proposta pelo relatório anterior21, poderia ajudar na seleção de um caráter fisiológico baseado em EPF de alta tolerância ao estresse. A ECN combina os dados de produção de conidia e termotolerância de cada EPF (Figura 5A,B), o que significa alta viabilidade da cepa fúngica quando o valor de ECN é alto (Figura 5). Além disso, a visualização da análise de componentes principais (PCA) foi utilizada para verificar os resultados da fórmula ECN. O resultado revelou uma alta coordenação entre o PCA e a ECN, sugerindo que a fórmula ECN poderia ser usada para avaliar a hierarquia de parâmetros relacionados à viabilidade e potencial de desenvolvimento de fungos à aplicação em campo e posterior comercialização (Figura 5C,D).
Figura 1: Ilustração da construção da biblioteca de fungos entomopatômicos mediados por Tenebrio molitor (EPF). Parte 1: Isolamento fúngico da amostra do solo; Parte 2: Triagem baseada em patogenicidade e virulência e identificação fúngica; Parte 3. Caracterização fisiológica e classificação fúngica. ECN = Número de conidia eficaz; e PCA = Análise de componentes principais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mortalidade de minhocas e Spodoptera litura para seleção de fungos entomopatômicos promissores (EPF) isolados. (A) 26-selecionados fúngico 2º teste de virulência de minhocas; As micoses de 12 mortes rápidas e isolados fúngicos de alta virulência são mostradas em paralelo. (B) Foram selecionados 12 isolados fúngicos para o teste de virulência contra S. litura. O teste em cada cepa fúngica foi repetido três vezes. d.p.i. = dias pós inoculação. Figura e lenda modificadas reproduzidas com permissão do Fronteris21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A análise filogenética dos fungos entomopatômicos (EPF) é baseada em (A) nível de gênero com base na região de ITS e (B-C) Nível de espécies com base no tef. A análise filogenética da região de ITS e do tef foi construída utilizando-se os métodos de probabilidade máxima (ML), evolução mínima (ME) e junção de vizinhos (NJ). Foram realizadas análises de bootstrap para avaliar a robustez dos filogenias utilizando 1.000 réplicas, e proporções de botas superiores a 50% são indicadas acima dos ramos. Negrito = Cepas do tipo ex. As setas vermelha e verde indicam o promissor EPF. Figura e lenda modificadas reproduzidas com permissão do Fronteris21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exame microscópico de fungos entomopatômicos (EPF) (M. anisopliae). Observação de conidioforos (A) após lavagem. (B) Observação da forma e cor conidia. (C) Arranjo de conidia e feixes de cordas de esporos (SS) de M. anisopliae; Cp = conidioforos; cc = conidia cilíndrica. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Caracterização fisiológica de seis isolados potenciais e a análise efetiva do número de conidia (ECN). (B) Ensaio de termotolerância. (C) O parcela de barras dos valores da ECN. (D) A análise dos componentes principais mostrou a distribuição de cada cepa. Figura e lenda modificadas reproduzidas com permissão do Fronteris21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do primer | Tamanho da amplicon (bp) | Sequência(5'-3') | Região | Referência | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | SEU | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | Tef | 26, 27, 41, 42 | |
| tef-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabela 1: Pares de primer para identificação fúngica.
Tabela 2: Os parâmetros registrados para o método de construção da biblioteca EPF mediada por Molitor tenebrio estão listados abaixo. NIU = o campus da Universidade Nacional de Ilan. NCHU = o campus da Universidade Nacional Chung Hsing. Tabela e legenda modificadas reproduzidas com permissão do Fronteris21. Clique aqui para baixar esta Tabela.
| Espécie | Coar | Phialides μm±SD* | Conidia μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 | Cilíndrico, 7.3±0.67b×2.4±0.36a | Cilíndrico, 6,5±0.45a×2,7±0.13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Cilíndrico, 8,6±0,68ab×2,6±0,30a | Cilíndrico, 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Cilíndrico, 10,5±1,54a×2,4±0,32a | Cilíndrico, 6.8±0.53a×2.9±0.31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Cilíndrico, 9,4±1,58a×2,7±0.32a | Cilíndrico, 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Cilíndrico, 9.6±0.87a×2.6±0.29a | Cilíndrico, 6.0±0.82b×2.9±0.29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Elipsoide, NA×2.6±0.57 | Globose, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| *A análise estatística foi realizada com base no teste ANOVA da Welch usando o estúdio R. | |||
| § Tabela e legenda modificadas reproduzidas com permissão dos Fronteris (23). | |||
Tabela 3: Um exemplo de observações morfológicas de seis promissores isolados fúngicos entomopatômicos. A análise estatística foi realizada com base no teste ANOVA de Welch usando o estúdio R. Tabela e legenda modificadas reproduzidas com permissão do Fronteris21.
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Discussion
Fungos entomopatômicos (EPF) têm sido usados para o controle de insetos. Existem vários métodos para isolar, selecionar e identificar EPF30,31,32. Comparando os diferentes tipos de métodos de isca de insetos, a anisopliae Beauveria bassiana e Metarhizium foram comumente encontradas em iscas de insetos6,12,13,14. Entre essas iscas de insetos, Galleria mellonella e Tenebrio molitor apresentaram altas taxas de recuperação de Beauveria e Metarhizium spp. De fato, a utilidade do método minhoca (T. molitor)-isca foi demonstrada como um método de conveniência para o isolamento do EPF a partir de amostras de solo17,21. No entanto, foi relatado que o uso de insetos como isca mostraria o viés de isolar espécies fúngicas específicas3,33. Portanto, a combinação de diferentes espécies de insetos (ou seja, Galleria mellonella e T. molitor juntos) para isca do EPF das amostras do solo pode aumentar a diversidade de EPF34.
Para avaliar a atividade de matança de insetos, há duas rodadas de triagem por minhoca (T. molitor) no protocolo atual para selecionar as promissoras cepas fúngicas para estudos posteriores. Após esse processo, o número de isolados fúngicos, isolados das amostras do solo, poderia ser drasticamente reduzido e restrito a isolados fúngicos que apresentavam alta atividade inseticida após a 1ª e 2ª triagem. Grande redução dos isolados fúngicos para a próxima rodada de triagem economizam custo de tempo e consumo de mão-de-obra. Também pode-se notar que os isolados fúngicos selecionados apresentaram tendências semelhantes de patogenicidade entre minhoca (T. molitor) e minhoca de tabaco (Spodoptera litura), demonstrando um teste consistente de patogenicidade de diferentes espécies de insetos e poderiam ser ainda mais estendidos a outras pragas de cultura21. Além disso, o cálculo da ECN com base nos testes fisiológicos poderia facilitar a seleção de potenciais cepas fúngicas a serem utilizadas em campos de cultivo. Métodos seletivos semelhantes foram mencionados por outros relatórios, enquanto os fatores como características abióticas e de tensão não foram incluídos12,8,31,35,36,37. Portanto, essas cepas podem ser afetadas por fatores ambientais que resultam em uma influência no desempenho da germinação fúngica e, assim, dificuldade de comercialização. Essa consequência também é a principal razão para a inaplicabilidade das cepas laboratoriais no campo38.
A partir da identificação morfológica, outros esforços devem ser direcionados para encontrar a estrutura clara do conidiophore e observar as diferentes características de cada cepa fúngica. Os estudos podem incluir vários métodos para resolver a difícil identificação morfológica39. No entanto, a identificação morfológica não distingue espécies fúngicas intimamente relacionadas; portanto, é necessário integrar os dados de identificação molecular. A região do espaçador transcrito interno (ITS) mostrou a discriminação do nível do gênero, enquanto outros marcadores moleculares (ou seja, tef para Metarhizium, bloco para Beauveria) são necessários para a identificação no nível da espécie26,40,41.
Na caracterização fisiológica, para reduzir o desvio padrão dos experimentos, ou a máquina ou vórtice manual por pelo menos 10 min no máximo rpm é sugerido21. A suspensão conidia completamente mista aumentaria a consistência dos resultados do ensaio termotolerância e do ensaio de produção conidial. Por outro lado, no ensaio de produção conidial, o número conidia contado sob uma área fixa (bloco de 5 mm na parte central da colônia fúngica neste estudo) na placa cultivada em diferentes épocas de crescimento levantou o problema de que diferentes espécies fúngicas e até mesmo cepas diferentes revelaram diferentes desempenhos da compactação de crescimento da hifa, o que pode levar à não representatividade da amostragem. Portanto, um rigoroso método de teste para a produção de conidia pode melhorar o problema, como contar com precisão o número de conidia de toda a colônia fúngica e normalizar com a área de crescimento42.
A fórmula do número de conidia eficaz (ECN) é projetada com base na influência do estresse ambiental contra a conidia EPF, ou seja, simular conidia sob a condição de ambiente selvagem para selecionar as promissoras cepas fúngicas para comercialização21. Neste protocolo, foram utilizados os dados de produção de conidia e tratamento térmico para o cálculo do valor total da ECN de cada cepa fúngica promissora, seguindo o estudo anterior21. Além disso, em um ambiente natural, exceto a temperatura, outros estresses ambientais, como umidade, radiação ultravioleta (UV), e hospedeiro poderiam influenciar a germinação conidia. Especialmente, o estresse UV é um fator principal que afeta a germinação conidia porque os radicais livres de alta energia (como peróxidos, grupos hidroxil e oxigênio único) gerados por UV podem reduzir a patogenicidade e a persistência de pesticidas microbianos43. Assim, o estresse UV poderia ser incluído na fórmula ECN no futuro. Para evitar o estresse UV, a fórmula deve conter óleo ou alginato de sódio para aumentar a tolerância uv de conidia44,45,46, o que confirma que as cepas potenciais têm praticidade para o controle de pragas47.
O presente protocolo forneceu um método para o isolamento rápido e preciso de potenciais cepas de EPF para a construção da biblioteca EPF mediada por T. molitor. Essa é a base e é necessária para o desenvolvimento de pesquisas de controle biológico. Além disso, a fórmula ECN poderia ser flexívelmente melhorada para ajudar os pesquisadores a compreender o potencial da EPF e desenvolvê-la em uma mercadoria para uso em sistemas agrícolas.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesse envolvido neste trabalho.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
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