Summary
Qui presentiamo un protocollo basato sul sistema di esca del verme della farina (Tenebrio molitor) che è stato utilizzato per isolare e selezionare funghi entomopatogeni (EPF) da campioni di suolo. Una formula efficace del numero di conidi (ECN) viene utilizzata per selezionare EPF ad alta tolleranza allo stress in base alle caratteristiche fisiologiche per il controllo microbico dei parassiti sul campo.
Abstract
I funghi entomopatogeni (EPF) sono uno degli agenti di controllo microbico per la gestione integrata dei parassiti. Per controllare i parassiti locali o invasivi, è importante isolare e selezionare l'EPF indigeno. Pertanto, il metodo dell'esca del suolo combinato con il sistema di esca per insetti (verme della farina, Tenebrio molitor) è stato utilizzato in questo studio con alcune modifiche. L'EPF isolato è stato quindi sottoposto al test di virulenza contro il parassita agricolo Spodoptera litura. Inoltre, i potenziali ceppi di EPF sono stati sottoposti a identificazioni morfologiche e molecolari. Inoltre, sono stati eseguiti i test di produzione e termotolleranza dei conidi per i promettenti ceppi di EPF e confrontati; questi dati sono stati ulteriormente sostituiti nella formula del numero di conidi effettivi (ECN) per la classificazione di laboratorio. Il sistema esche-vermi della farina del suolo e la formula ECN possono essere migliorati sostituendo le specie di insetti e integrando più fattori di stress per la valutazione della commercializzazione e dell'applicazione sul campo. Questo protocollo fornisce un approccio rapido ed efficiente per la selezione dell'EPF e migliorerà la ricerca sugli agenti di controllo biologico.
Introduction
Attualmente, i funghi entomopatogeni (EPF) sono ampiamente utilizzati nel controllo microbico di parassiti agricoli, forestali e orticoli. I vantaggi dell'EPF sono le sue ampie gamme di ospiti, la buona adattabilità ambientale, la natura ecocompatibile e il fatto che possa essere utilizzato con altre sostanze chimiche per mostrare l'effetto sinergico per la gestione integrata dei parassiti1,2. Per l'applicazione come agente di controllo dei parassiti, è necessario isolare un gran numero di EPF da insetti malati o dall'ambiente naturale.
Il campionamento di questi organismi dai loro ospiti aiuta a comprendere la distribuzione geografica e il tasso di prevalenza dell'EPF negli ospiti naturali3,4,5. Tuttavia, la raccolta di insetti infetti da funghi è solitamente limitata da fattori ambientali e popolazioni di insetti nel campo4. Considerando che gli ospiti degli insetti moriranno dopo l'infezione da EPF e poi cadranno nel terreno, l'isolamento dell'EPF dai campioni di suolo potrebbe essere una risorsa stabile3,6. Ad esempio, i saprofiti sono noti per utilizzare l'ospite morto come risorsa per la crescita. L'esca del suolo e i sistemi di mezzo selettivo sono stati ampiamente utilizzati per rilevare e isolare l'EPF dal suolo3,4,7,8,9,10.
Nel metodo del mezzo selettivo, la soluzione di terreno diluito viene placcata su un mezzo contenente antibiotici ad ampio spettro (ad esempio, cloramfenicolo, tetraciclina o streptomicina) per inibire la crescita dei batteri2,3,9,11. Tuttavia, è stato riportato che questo metodo può distorcere la diversità e la densità del ceppo e può causare una sovrastima o sottostima di molte comunità microbiche6. Inoltre, i ceppi isolati sono meno patogeni e competono con i saprofiti durante l'isolamento. È difficile isolare l'EPF dalla soluzione di terreno diluito3. Invece di utilizzare un mezzo selettivo, il metodo dell'esca del suolo isola l'EPF dagli insetti morti infetti, che possono essere conservati per 2-3 settimane, fornendo così un metodo di separazione EPF più efficiente e standard3,4,7,6. Poiché il metodo è facile da usare, è possibile isolare una varietà di ceppi patogeni a basso costo4. Pertanto, è ampiamente utilizzato da molti ricercatori.
Confrontando i diversi tipi di sistemi di esche per insetti, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae sono le specie di EPF più comuni che si trovano negli insetti appartenenti agli Hemiptera, Lepidoptera, Blattella e Coleoptera6,12,13,14. Tra queste esche per insetti, Galleria mellonella (ordine Lepidoptera) e Tenebrio molitor (ordine Coleoptera) mostrano tassi di recupero più elevati di Beauveria e Metarhizium spp., rispetto ad altri insetti. Pertanto, G. mellonella e T. molitor sono comunemente usati per l'esca degli insetti. Nel corso degli anni, il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) ha istituito una biblioteca EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) che contiene un'ampia varietà di specie, tra cui 4081 specie di Beauveria spp., 18 specie di Clonostachys spp., 878 specie di Cordyceps spp., 2473 specie di Metarhizium spp., 226 specie di Purpureocillium spp., e 13 specie di Pochonia spp. tra gli altri15. Un'altra biblioteca EPF è stata costruita dall'Entomology Research Laboratory (ERL) dell'Università del Vermont negli Stati Uniti per circa 30 anni. Comprende 1345 ceppi di EPF provenienti da Stati Uniti, Europa, Asia, Africa e Medio Oriente16.
Per controllare i parassiti locali o di invasione a Taiwan, è necessario l'isolamento e la selezione dell'EPF indigeno. Pertanto, in questo protocollo, abbiamo modificato e descritto la procedura del metodo dell'esca del suolo e l'abbiamo combinata con il sistema di esca per insetti (verme della farina, Tenebrio molitor)17. Sulla base di questo protocollo, è stata istituita una libreria EPF. Sono stati eseguiti due cicli di screening (quantificazione dell'inoculazione) per gli isolati preliminari di EPF. Gli isolati di EPF hanno mostrato patogenicità agli insetti. I ceppi potenziali sono stati sottoposti a identificazioni morfologiche e molecolari e ulteriormente analizzati mediante il test di termotolleranza e produzione conidiale. Inoltre, è stato proposto anche un concetto di numero di conidi effettivi (ECN). Utilizzando la formula ECN e l'analisi dei componenti principali (PCA), i ceppi potenziali sono stati analizzati sotto pressione ambientale simulata per completare il processo di creazione e screening della libreria EPF. Successivamente, la patogenicità di ceppi di EPF promettenti è stata testata per il parassita bersaglio (ad esempio, Spodoptera litura). L'attuale protocollo integra i dati di termotoleranza e produzione conidiale nella formula ECN e nell'analisi PCA, che può essere utilizzata come sistema di classificazione standard per la ricerca relativa all'EPF.
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Protocol
NOTA: l'intero diagramma di flusso è illustrato nella Figura 1.
1. Isolamento e selezione di potenziali funghi entomopatogeni (EPF)
- Raccogli il campione di terreno
- Rimuovere 1 cm del terreno superficiale e quindi raccogliere il terreno entro la profondità di 5-10 cm utilizzando una pala da ciascun sito di campionamento.
NOTA: i siti di campionamento sarebbero una montagna, una foresta o aree scarsamente popolate per evitare la contaminazione di ceppi di EPF spruzzati artificialmente. Assicurarsi che le aree per la raccolta dei campioni di terreno siano coperte con erba sulla superficie. Il terreno asciutto o il terreno umido non sono adatti per questo esperimento. - Registrare i dettagli di ciascun sito di campionamento, inclusi GPS, elevazione, tipo di campo, temperatura annuale, precipitazioni annuali, tempo di raccolta (stagione), tipo di suolo e valore del pH.
- Raccogliere 100 g del campione di terreno in un sacchetto di plastica e mantenerlo a temperatura ambiente se sottoposto al protocollo di isolamento fungino in laboratorio entro 3 ore.
NOTA: Se il campione non può essere utilizzato entro 3 ore, conservare il terreno a temperatura ambiente in condizioni di oscurità. Se l'esperimento non viene eseguito immediatamente, il campione di terreno può essere conservato a 4 °C per 1 settimana fino all'inizio del protocollo18,19.
- Rimuovere 1 cm del terreno superficiale e quindi raccogliere il terreno entro la profondità di 5-10 cm utilizzando una pala da ciascun sito di campionamento.
- Esca e isolare l'EPF con il verme della farina (Tenebrio molitor)
- Posizionare 100 g del campione di terreno in un bicchiere di plastica (diametro del cappuccio = 8,5 cm, altezza = 12,5 cm), quindi posizionare 5 vermi della farina sulla superficie del terreno a temperatura ambiente al buio per 2 settimane.
NOTA: è possibile utilizzare anche altri tipi di contenitori per bicchieri di plastica. Se i terreni sono troppo secchi (screpolati o sabbiosi), spruzzare ddH2O sterilizzato a spruzzo (circa 5-10 ml) sui terreni. La lunghezza del corpo c.a. 2,5 cm (14 ° instar) delle larve di T. molitor aiuta negli schermi di isolamento fungino20. - Osservare e registrare quotidianamente le larve per mortalità e micosi; tenere le larve morte nella tazza fino a 2 settimane per l'isolamento fungino.
NOTA: La spora di conidi fungini nei campioni di terreno si attaccherà alle larve di verme della farina durante il processo di cui sopra. La micosi fungina sarà osservata mentre le ife crescono dalla membrana intersegmentale, e quindi l'intero corpo sarà coperto dal micelio. La sporulazione inizierà dopo 7 giorni e il colore dell'infezione fungina cambierà nel colore della massa dei conidi. - Trasferire gli insetti morti in una panca pulita e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere i conidi. Strisciarli su un quarto di forza Sabouraud destrosio agar medio (1/4 SDA) piastra (55 mm) in laboratorio21. Incubare la piastra di coltura a 25 °C per 7 giorni per ottenere la coltura primaria di funghi.
NOTA: La piastra 1/4 SDA viene preparata come segue: Mescolare 1,5 g di brodo di destrosio Sabouraud e 3 g di agar in 200 ml di H2O, quindi sterilizzare per 20 minuti. Aliquota 1/4 SDA in ogni capsula di Petri da 55 mm prima della solidificazione. Le piastre solidificate 1/4 SDA vengono conservate a 4 °C fino all'uso. - Ri-strisciare ogni fungo di coltura primaria su una piastra SDA da 55 mm 1/4 in un flusso laminare e incubare la piastra di coltura a 25 °C per 7 giorni per ottenere singole colonie di funghi.
- Ripetere questo re-isolamento ~ 2-3 volte e osservare al microscopio ottico per ottenere colonie fungine morfologiche singole e pure.
NOTA: Isolare tutto l'EPF utilizzando T. molitor-bait e conservare come descritto nella sezione seguente. La separazione, la conservazione, la coltura pura e la striatura devono essere eseguite in un flusso laminare nelle sezioni successive.
- Posizionare 100 g del campione di terreno in un bicchiere di plastica (diametro del cappuccio = 8,5 cm, altezza = 12,5 cm), quindi posizionare 5 vermi della farina sulla superficie del terreno a temperatura ambiente al buio per 2 settimane.
- Conservare gli isolati EPF
- Tagliare 3 dei blocchi di agar da 5 mm sul bordo di ogni piastra isolata di coltura fungina pura con una piralide di sughero e posizionarla in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml come una replica.
NOTA: Tre repliche per ogni isolato fungino sono raccomandate per la conservazione dei ceppi EPF dopo il 2 ° test di virulenza. L'identificazione molecolare è raccomandata anche se lo spazio di archiviazione è limitato. - Aggiungere 250 μL di soluzione di tensioattivo allo 0,03% (Tabella dei materiali) e 250 μL di glicerolo al 60% nel tubo della microcentrghina da 1,5 mL utilizzando una micropipetta; quindi, vortice per 10 s.
- Sigillare il tubo della microcentrghina da 1,5 ml con film di paraffina e preraffreddarlo in un frigorifero a -20 °C per 24 ore. Quindi, trasferire le scorte fungine preraffreddate in un frigorifero a -80 °C per la crioconservazione.
NOTA: nel paragrafo 1.4 sono state utilizzate piastre di coltura fungina extra pure (a parte i campioni crioconservati).
- Tagliare 3 dei blocchi di agar da 5 mm sul bordo di ogni piastra isolata di coltura fungina pura con una piralide di sughero e posizionarla in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml come una replica.
- 1° screening di patogenicità per isolati fungini
- Posizionare cinque larve di T. molitor direttamente sulla superficie di ogni piastra di coltura fungina pura a 25 °C.
- Osservare e registrare la micosi e la mortalità per 10 giorni. Selezionare l'isolato fungino per ulteriori analisi.
NOTA: Gli isolati fungini che causano il 100% di mortalità sono selezionati per il 2 ° test di virulenza per confermare la loro virulenza alle larve di T. molitor . In alternativa, il ricercatore può regolare i criteri secondo il proprio studio.
- 2° test di virulenza di isolati fungini
NOTA: Sulla base del 1° screening di patogenicità, recuperare gli isolati fungini selezionati da -80 °C per il 2° test di virulenza. Lo scopo del 2° test di virulenza è quello di quantificare la patogenicità degli isolati fungini selezionati dopo il 1° ciclo di screening.- Raccogli i conidi di ciascun isolato fungino vorticosamente per 1 minuto e conta il numero di conidi usando un emocitometro.
- Regolare la sospensione di conidi ad una concentrazione di 1 x 107 conidi/mL in una soluzione di tensioattivo allo 0,03% (Tabella dei materiali).
- Distribuire 10 μL della sospensione fungina su piastre SDA da 55 mm 1/4 e crescere per 7 giorni a 25 °C al buio.
- Posizionare cinque larve di T. molitor direttamente sulla superficie di ogni piastra di coltura fungina pura (c.a. 6 x 107 conidi). Sigillare le piastre con pellicola di paraffina e incubare a 25 °C al buio.
- Osservare e registrare la micosi e la mortalità per 10 giorni.
- Ripetere il test (dal passo 1.51 al 1.5.5) in triplice copia per ogni isolato fungino.
NOTA: gli isolati fungini che causano il 100% di mortalità sono selezionati per il 3 ° test di virulenza per confermare la loro virulenza per colpire il parassita.
- 3° test di virulenza di isolati fungini per parassita bersaglio (Spodoptera litura come esempio)
- Ripetere i passaggi da 1.5.2 a 1.5.6 con isolati selezionati dalla 2a virulenza per testare la virulenza contro l'organismo nocivo bersaglio.
- Calcola l'LT50 di ogni isolato fungino22.
NOTA: L'LT50 di ciascun isolato fungino è stato calcolato attraverso modelli lineari generalizzati (GLM) utilizzando R studio (versione 3.4.1); la distribuzione dell'errore quasibinomiale e una funzione di collegamento di registro possono essere utilizzate per tenere conto della sovradispersione.
2. Identificazione molecolare dell'EPF
- Estrazione del DNA genomico fungino
- Raccogliere c.a. 1 cm2 EPF dalla piastra SDA 1/4 di 7 giorni.
- Estrarre il DNA genomico fungino utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico fungino secondo le istruzioni del produttore23 (Tabella dei materiali).
- Amplificazione PCR e sequenziamento del DNA
- Amplificare la regione ITS fungina mediante PCR del campione di DNA21 utilizzando il PCR Master Mix (2x), il set di primer ITS1F/ITS4R24 (Tabella 1) con il seguente programma PCR: 94 °C per 1 min, e poi 35 cicli di 94 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 1 min, seguiti da un'estensione finale di 7 min a 72 °C.
NOTA: il set di primer ITS1F/ITS4R è destinato all'identificazione a livello di genere. - Sequenziare la PCR per servizio di sequenziamento commerciale.
- Usa NCBI BLAST per cercare funghi simili nel database NCBI e seleziona le relative specie di tipo fungino per l'analisi filogenetica.
NOTA: Le specie fungine appartenenti al genere Metarhizium o Beauveria devono essere ulteriormente identificate a livello di specie con tef-983F/tef-2218R primer set25 (ripetere i passaggi da 2.1.1 a 2.2.3). Per i funghi che non appartengono ai generi Metarhizium o Beauveria, altri marcatori molecolari possono essere utilizzati per identificare la specie, tra cui DNA liasi (APN2), beta tubulina (BTUB), subunità più grande della RNA polimerasi II (RPB1), RNA polimerasi II seconda subunità più grande (RPB2) e 3' porzione di fattore di allungamento della traduzione 1 alfa (TEF)25,26 .
- Amplificare la regione ITS fungina mediante PCR del campione di DNA21 utilizzando il PCR Master Mix (2x), il set di primer ITS1F/ITS4R24 (Tabella 1) con il seguente programma PCR: 94 °C per 1 min, e poi 35 cicli di 94 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 1 min, seguiti da un'estensione finale di 7 min a 72 °C.
- Analisi filogenetica
- Utilizzare il software ClustalX 2.127 per allineare le sequenze multiple dai passaggi 2.2.2 e 2.2.3. Tagliare manualmente la regione delle sequenze conservate con GeneDoc28.
- Eseguire l'analisi filogenetica con il software MEGA729 in base ai metodi di evoluzione minima (ME), Neighbor-Joining (NJ) e massima probabilità (ML).
NOTA: l'esecuzione di tutti e tre i metodi può aiutare a confermare e concludere con precisione lo stato della classificazione. Gli isolati fungini sottoposti a screening dal 1° screening di patogenicità sono utilizzati per l'identificazione molecolare a livello di genere. Gli isolati fungini sottoposti a screening dal 2° test di virulenza sono utilizzati per l'identificazione molecolare e morfologica a livello di specie.
3. Identificazione morfologica dell'EPF
- Osservazione della morfologia della colonia fungina
- Usa una fotocamera per catturare la crescita della colonia di colture fungine per 7 giorni e registrare la crescita, la forma (soffice, soda) e il colore delle colonie.
- Osservazione di conidi e conidiofori
- Raschiare i conidi dalla colonia fungina di coltura pura con un anello di inoculazione e trasferire le spore in un vetrino con soluzione di Tween 80 allo 0,1%. Quindi, coprire con un coverslip per l'osservazione microscopica leggera dei conidi.
- Utilizzare un bisturi per tagliare un blocco di agar di 5 mm2 del filo ifale sul bordo della colonia fungina, quindi trasferire il blocco di agar su un vetrino.
- Eseguire la pulizia come segue: Aggiungere la soluzione 0,1% Tween 80 sul blocco di agar con un contagocce di plastica e lavare via la maggior parte dei conidi in eccesso usando una pinzetta. Quindi, coprilo con un coverslip per l'osservazione microscopica leggera.
NOTA: 0,1% Tween 80 può essere sostituito con un altro tensioattivo più potente (Tabella dei materiali) a seconda delle specie fungine e dell'idrofobicità. - Misurare e registrare la larghezza e la lunghezza dei conidi e dei conidiofori per confrontare le differenze tra i diversi isolati fungini.
- Usa il test ANOVA di Welch e il test Games-Howell (test post-hoc) per analizzare la larghezza e la lunghezza conidiale di ciascun ceppo usando R studio (versione 3.4.1).
NOTA: L'analisi dei dati dei caratteri morfologici può essere regolata per caso. Gli isolati fungini sottoposti a screening con il 3° test di virulenza sono utilizzati per la caratterizzazione fisiologica e la classificazione ECN nelle sezioni 4 e 5.
4. Studio della produttività conidiale e della termotolleranza
- Saggio di produzione conidiale
- Coltivare l'isolato fungino selezionato su 1/4 di terreno SDA a 25 ± 1 °C al buio per 10 giorni.
- Preparare 1 mL della sospensione conidiale dell'isolato fungino in soluzione tensioattiva allo 0,03% e regolare a 1 x 107 conidi/ml come descritto sopra.
- Rilasciare tre goccioline da 10 μL di sospensione conidiale su 1/4 di SDA e incubare a 25 °C al buio per 7, 10 e 14 giorni per contare la sporulazione dei funghi.
NOTA: 10 μL è il volume migliore per raccogliere il blocco di 5 mm con sporulazione fungina anche dopo la crescita fungina per 7-14 giorni. - Utilizzare la piralide del sughero per staccare il blocco di agar da 5 mm dal centro della colonia e trasferirlo in 1 mL di soluzione di tensioattivo allo 0,03% (Tabella dei materiali) in un tubo di microcentrificazione da 1,5 ml in ogni punto temporale.
- Ruotare il tubo a 3.000 giri / min a temperatura ambiente per 15 minuti e utilizzare un emocitometro per contare il numero di conidi.
NOTA: La formula utilizzata per il conteggio è il numero di conidi per 25 quadrati della cella più piccola (dimensione = 0,025 mm2; profondità della camera = 0,1 mm):
Numero totale di conidi in 5 quadrati ÷ 80 × (4 × 106) - Ripetere tre volte per ogni isolato.
- Saggio di termotolleranza
- Coltivare l'isolato fungino selezionato su 1/4 di terreno SDA a 25 ± 1 °C al buio per 10 giorni.
- Preparare 1 mL della sospensione conidiale di isolato fungino in soluzione tensioattiva allo 0,03% e regolare a 1 x 107 conidi/mL come descritto sopra.
- Vortice della sospensione conidiale e riscaldarla in un bagno secco di 45 °C per 0, 30, 60, 90 e 120 min. Far cadere tre goccioline da 5 μL della sospensione conidiale su un mezzo SDA da 55 mm 1/4 in ogni punto temporale dopo l'esposizione al calore e incubare a 25 ± 1 °C per 18 ore.
NOTA: Evitare di diffondere le goccioline fungine per potersi concentrare meglio sull'area. - Contare il numero di spore di conidi germinate con cinque campi selezionati casualmente sotto microscopia ottica 200x per determinare il tasso di germinazione.
- Eseguire tre repliche per ogni isolato.
5. Classificazione del numero di conidi effettivi (ECN)
- Calcolo ECN
NOTA: Ottenere i dati di produzione conidiale e di termotolleranza di ciascun potenziale ceppo fungino prima di calcolare l'ECN21 totale.- Calcola il cambio di piega (FC) della produzione conidiale in ogni punto temporale:
dove, x = punto temporale per la raccolta dei dati; ncp = numero di conidi dopo ogni giorno di crescita; e I = numero iniziale di conidi seminati. - Calcola il numero di conidi sotto il trattamento dello stress in ogni punto temporale usando la seguente formula:
Dove, y = l'ECN del punto temporale in esame; TT0 = il tasso di germinazione dei conidi che non subiscono stress termico (= tasso di germinazione del trattamento termico di 0 minuti); TTz = coefficiente di stress è il tasso di germinazione dei conidi in diversi momenti del trattamento termico (z). - Calcola l'ECN totale utilizzando la seguente formula:
- Confrontare l'ECN di ciascun ceppo fungino.
- Calcola il cambio di piega (FC) della produzione conidiale in ogni punto temporale:
- Analisi dei componenti principali (PCA) di ceppi fungini
NOTA: L'analisi PCA conferma la classifica dell'ECN e aiuta a comprendere la correlazione tra i valori fisiologici del carattere. Confrontare i valori ECN e selezionare gli isolati EPF con valori ECN più elevati. - Utilizzare il software R per creare PCA codificando:
#Input file di dati PCA
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Elaborazione dei dati di esempio
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=row.names(a)
df<- a[2:11] - #PCA calcolo
pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
valore = pca$x - #Output file di visualizzazione PCA
png(file = 'pca.png', altezza = 2000, larghezza = 2000, res = 300)
NOTA: utilizzare una produzione conidiale da 7 a 14 giorni e tutti i dati di termotolleranza per eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) per confermare la classifica ECN.
- # Elaborazione dei dati di esempio
- Seleziona i ceppi fungini più performanti basati su ECN o PCA ed esegui il test di virulenza dei parassiti bersaglio per ulteriori ricerche.
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Representative Results
Isolamento e selezione di potenziali funghi entomopatogeni (EPF)
Utilizzando il metodo di costruzione della libreria di funghi entomopatogeni mediati da Tenebrio molitor (EPF), il numero di funghi senza attività di uccisione degli insetti sarebbe escluso; pertanto, l'efficienza di isolamento e la selezione dell'EPF potrebbero essere ampiamente aumentate. Durante l'applicazione di questo metodo, sono state registrate le informazioni dei siti di campionamento, dei campioni di suolo e dei tassi di germinazione fungina (Tabella 2). Sulla base dei nostri dati precedenti, un totale di 101 isolati fungini sono stati ottenuti da 172 campioni di suolo, indicando un'elevata efficienza di isolamento del 64%. Tra i 101 isolati fungini, 26 isolati hanno mostrato attività insetticida contro T. molitor (mortalità al 100%) dopo il 1° screening della patogenicità, quindi l'eliminazione degli isolati fungini è stata del 26/101 = 25,7%. Nel 2° test di virulenza, è stata ulteriormente dimostrata l'elevata virulenza dei 26 isolati fungini contro T. molitor , 12 dei quali hanno mostrato un'elevata patogenicità nei confronti delle larve di T. molitor (mortalità al 100% a 5 giorni dopo l'inoculazione) (Figura 2A). Questi sono stati utilizzati per valutare il test di virulenza contro il parassita agricolo. Sulla base dei dati del 3 ° test di virulenza mortalità e LT50, un totale di sei isolati fungini (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 e 113) hanno rivelato una rapida attività di uccisione degli insetti contro Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96 e 1,13), valutati utilizzando il test fisiologico e il numero di conidi efficaci (ECN) (Figura 2B).
Identificazione molecolare dell'EPF
Per comprendere meglio le posizioni tassonomiche dei funghi, 26 isolati del 1° screening della patogenicità sono stati sottoposti ad analisi molecolare basata sulla regione ITS (Figura 3A). Il risultato ha mostrato che questi isolati fungini potrebbero essere chiaramente divisi in sette generi, tra cui Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium e Metarhizium (Figura 3A). Sulla base della regione ITS1-5.8S-ITS2, la classificazione del genere EPF è stata accuratamente confermata, mentre il livello della specie è ancora indistinguibile. Pertanto, la sequenza della regione tef viene utilizzata per classificare chiaramente il livello di specie per 12 promettenti isolati di EPF dal test di virulenza contro l'organismo nocivo agricolo. L'identificazione molecolare dei 12 isolati ha mostrato che 11 isolati appartengono a Metarhizium e contenevano quattro specie, tra cui M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) e M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). L'isolato rimanente è stato identificato come B. australis (NCHU-113) (Figura 3B,C). Secondo il risultato di cui sopra, la regione di sequenza di tef può distinguere efficacemente il genere Metarhizium a livello di specie, mentre altre specie hanno bisogno di trovare altre regioni di sequenza come marcatori molecolari per distinguere la specie.
Identificazione morfologica dell'EPF
Attraverso il metodo di pulizia (fase 3.2.3) delle osservazioni morfologiche dei funghi, le strutture dei conidiofori potevano essere viste chiaramente con la soluzione di Tween 80 allo 0,1% (Figura 4A), e queste osservazioni potrebbero servire come punto di riferimento per misurare le dimensioni della struttura e scattare una registrazione fotografica. Il colore, la forma e la disposizione dei conidi possono essere visti attraverso osservazioni microscopiche dei conidi della colonia (Figura 4B, C). Dopo l'osservazione, le dimensioni delle forme dei conidi e dei conidiofori potrebbero essere ulteriormente misurate e confrontate statisticamente (Tabella 3).
Studio della produttività conidiale, della termotolleranza e della classifica ECN
La formula ECN, proposta dalla relazione precedente21, potrebbe contribuire alla selezione di un carattere fisiologico basato sull'EPF ad alta tolleranza allo stress. L'ECN combina i dati di produzione di conidi e termotolleranza di ciascun EPF (Figura 5A, B), il che significa un'elevata vitalità del ceppo fungino quando il valore di ECN è elevato (Figura 5). Inoltre, la visualizzazione dell'analisi dei componenti principali (PCA) è stata utilizzata per verificare i risultati della formula ECN. Il risultato ha rivelato un elevato coordinamento tra PCA ed ECN, suggerendo che la formula ECN potrebbe essere utilizzata per valutare la gerarchia dei parametri relativi alla vitalità e il potenziale di sviluppo dei funghi per l'applicazione sul campo e l'ulteriore commercializzazione (Figura 5C, D).
Figura 1: Illustrazione della costruzione della libreria di funghi entomopatogeni mediati da Tenebrio molitor (EPF). Parte 1: Isolamento fungino dal campione di terreno; Parte 2: Screening basato sulla patogenicità e sulla virulenza e identificazione fungina; Parte 3. Caratterizzazione fisiologica e classificazione fungina. ECN = Numero di conidi effettivi; e PCA = Analisi dei componenti principali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mortalità dei vermi della farina e degli Spodoptera litura per la selezione di promettenti isolati di funghi entomopatogeni (EPF). (A) 26-selected fungal 2nd mealworm virulence test; Le micosi di 12 isolati fungini ad uccisione rapida e ad alta virulenza sono mostrate in parallelo. (B) 12 isolati fungini sono stati selezionati per il test di virulenza contro S. litura. Il test su ciascun ceppo fungino è stato ripetuto tre volte. d.p.i. = giorni dopo l'inoculazione. Figura modificata e legenda riprodotte con il permesso del Fronteris21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'analisi filogenetica dei ceppi di funghi entomopatogeni (EPF) a (A) a livello di genere basato sulla regione ITS e (B-C) a livello di specie basato su tef. L'analisi filogenetica della regione ITS e del tef è stata costruita utilizzando i metodi di massima probabilità (ML), evoluzione minima (ME) e avvicinamento (NJ). Le analisi di Bootstrap sono state eseguite per valutare la robustezza delle filogenie utilizzando 1.000 repliche e proporzioni di bootstrap superiori al 50% sono indicate sopra i rami. Grassetto = Ceppi di tipo Ex. Le frecce rosse e verdi indicano il promettente EPF. Figura modificata e legenda riprodotte con il permesso del Fronteris21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esame microscopico della morfologia dei funghi entomopatogeni (EPF) (M. anisopliae). Osservazione dei conidiofori (A) dopo il lavaggio. (B) L'osservazione della forma e del colore dei conidi. (C) Disposizione di conidi e fasci di stringhe di spore (SS) di M. anisopliae; Cp = conidiofori; cc = conidi cilindrici. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Caratterizzazione fisiologica di sei potenziali isolati e analisi efficace del numero di conidi (ECN). (A) Saggio di produzione conidiale. (B) Saggio di termotolleranza. (C) Il grafico a barre dei valori ECN. (D) L'analisi dei componenti principali ha mostrato la distribuzione di ciascun ceppo. Figura modificata e legenda riprodotte con il permesso del Fronteris21. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del primer | Amplicon Dimensione (bp) | Sequenza(5'-3') | Regione | Riferimento | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | SUO | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| tef-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | Tef | 26, 27, 41, 42 | |
| TEF-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabella 1: Coppie di primer per l'identificazione fungina.
Tabella 2: I parametri registrati per il metodo di costruzione della libreria EPF mediato da tenebrio molitor sono elencati di seguito. NIU = il campus della National Ilan University. NCHU = il campus della National Chung Hsing University. Tabella modificata e legenda riprodotte con il permesso di Fronteris21. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
| Specie | Sforzo | Fialidi μm±SD* | Conidia μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 · | Cilindrico, 7.3±0.67b×2.4±0.36a | Cilindrico, 6.5±0.45a×2.7±0.13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 · | Cilindrico, 8.6±0.68ab×2.6±0.30a | Cilindrico, 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 · | Cilindrico, 10.5±1.54a×2.4±0.32a | Cilindrico, 6.8±0.53a×2.9±0.31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 · | Cilindrico, 9.4±1.58a×2.7±0.32a | Cilindrico, 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 · | Cilindrico, 9.6±0.87a×2.6±0.29a | Cilindrico, 6.0±0.82b×2.9±0.29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 · | Ellissoide, NA×2.6±0.57 | Globose, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| *L'analisi statistica è stata eseguita sulla base del test ANOVA di Welch utilizzando R studio. | |||
| § Tabella e legenda modificate riprodotte con il permesso dei Fronteris (23). | |||
Tabella 3: Un esempio di osservazioni morfologiche di sei promettenti isolati fungini entomopatogeni. L'analisi statistica è stata eseguita sulla base del test ANOVA di Welch utilizzando R studio. Tabella modificata e legenda riprodotte con il permesso di Fronteris21.
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Discussion
I funghi entomopatogeni (EPF) sono stati utilizzati per il controllo degli insetti. Esistono diversi metodi per isolare, selezionare e identificare EPF30,31,32. Confrontando i diversi tipi di metodi di esca per insetti, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae sono stati comunemente trovati nelle esche per insetti6,12,13,14. Tra queste esche per insetti, Galleria mellonella e Tenebrio molitor hanno mostrato alti tassi di recupero di Beauveria e Metarhizium spp. È un dato di fatto, l'utilità del metodo del verme della farina (T. molitor)-esca è stata dimostrata come un metodo di convenienza per l'isolamento di EPF da campioni di terreno17,21. Tuttavia, è stato riportato che l'uso di insetti come esca mostrerebbe la tendenza a isolare specifiche specie fungine3,33. Pertanto, la combinazione di diverse specie di insetti (ad esempio, Galleria mellonella e T. molitor insieme) per esca l'EPF dai campioni di suolo potrebbe aumentare la diversità di EPF34.
Per valutare l'attività di uccisione degli insetti, ci sono due cicli di screening da parte del verme della farina (T. molitor) nel protocollo attuale per selezionare i ceppi fungini promettenti per ulteriori studi. A seguito di questo processo, il numero di isolati fungini, che sono isolati da campioni di suolo, potrebbe essere drasticamente ridotto e limitato agli isolati fungini che hanno mostrato un'elevata attività insetticida dopo il 1 ° e il 2 ° screening. La grande riduzione degli isolati fungini per il prossimo ciclo di screening consente di risparmiare tempo e di consumo di manodopera. Si potrebbe anche notare che gli isolati fungini selezionati hanno mostrato tendenze simili di patogenicità tra il verme della farina (T. molitor) e il verme del tabacco (Spodoptera litura), dimostrando un test coerente della patogenicità di diverse specie di insetti e potrebbe essere ulteriormente esteso ad altri parassiti delle colture21. Inoltre, il calcolo dell'ECN basato sui test fisiologici potrebbe facilitare la selezione di potenziali ceppi fungini da utilizzare nei campi coltivati. Metodi selettivi simili sono stati menzionati da altri rapporti, mentre i fattori come le caratteristiche abiotiche e di ceppo non sono stati inclusi12,8,31,35,36,37. Pertanto, questi ceppi possono essere influenzati da fattori ambientali che determinano un'influenza sulle prestazioni della germinazione fungina e quindi difficoltà a essere commercializzati. Questa conseguenza è anche la ragione principale dell'inapplicabilità dei ceppi di laboratorio sul campo38.
Dall'identificazione morfologica, ulteriori sforzi dovrebbero essere diretti verso la ricerca della chiara struttura del conidioforo e osservare le diverse caratteristiche di ciascun ceppo fungino. Gli studi possono includere vari metodi per risolvere la difficile identificazione morfologica39. Tuttavia, l'identificazione morfologica non riesce a distinguere le specie fungine strettamente correlate; pertanto, è necessario integrare i dati di identificazione molecolare. La regione del distanziatore trascritto interno (ITS) ha mostrato la discriminazione a livello di genere, mentre altri marcatori molecolari (ad esempio, tef per Metarhizium, blocco per Beauveria) sono necessari per l'identificazione a livello di specie26,40,41.
Nella caratterizzazione fisiologica, per ridurre la deviazione standard degli esperimenti, viene suggerito il vortice meccanico o manuale per almeno 10 minuti al regime massimo21. La sospensione di conidi accuratamente miscelata aumenterebbe la coerenza dei risultati del saggio di termotolleranza e del saggio di produzione conidiale. D'altra parte, nel saggio di produzione conidiale, il numero di conidi contati sotto un'area fissa (blocco di 5 mm nella parte centrale della colonia fungina in questo studio) sulla piastra coltivata in diverse fasi di crescita ha sollevato il problema che diverse specie fungine e persino ceppi diversi hanno rivelato prestazioni diverse della compattezza di crescita delle ife, che potrebbe portare alla non rappresentatività del campionamento. Pertanto, un metodo di prova rigoroso per la produzione di conidi può migliorare il problema, ad esempio contare con precisione il numero di conidi dell'intera colonia fungina e normalizzarsi con l'area di crescita42.
La formula del numero di conidi efficaci (ECN) è progettata in base all'influenza dello stress ambientale contro i conidi EPF, cioè simulare i conidi in condizioni di ambiente selvaggio per selezionare i ceppi fungini promettenti per la commercializzazione21. In questo protocollo, i dati sulla produzione di conidi e sul trattamento termico sono stati utilizzati per il calcolo del valore totale di ECN di ciascun ceppo fungino promettente, a seguito dello studio precedente21. Inoltre, in un ambiente naturale, ad eccezione della temperatura, altri stress ambientali, come l'umidità, le radiazioni ultraviolette (UV) e l'ospite potrebbero influenzare la germinazione dei conidi. In particolare, lo stress UV è un fattore principale che influenza la germinazione dei conidi perché i radicali liberi ad alta energia (come perossidi, gruppi ossidrilici e ossigeno singoletto) generati dai raggi UV possono ridurre la patogenicità e la persistenza dei pesticidi microbici43. Pertanto, lo stress UV potrebbe essere ulteriormente incluso nella formula ECN in futuro. Per evitare lo stress UV, la formula dovrebbe contenere olio o alginato di sodio per aumentare la tolleranza UV di conidia44,45,46, il che conferma che i potenziali ceppi hanno praticità per il controllo dei parassiti47.
Il presente protocollo ha fornito un metodo per l'isolamento rapido e preciso di potenziali ceppi di EPF per costruire una libreria EPF mediata da T. molitor. Questa è la base ed è necessaria per lo sviluppo della ricerca sul controllo biologico. Inoltre, la formula ECN potrebbe essere migliorata in modo flessibile per aiutare i ricercatori a cogliere il potenziale dell'EPF e svilupparlo in una merce da utilizzare nei sistemi agricoli.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi coinvolto in questo lavoro.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata da Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
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