Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.
Abstract
Entomopathogene Pilze (EPF) sind eines der mikrobiellen Bekämpfungsmittel für den integrierten Pflanzenschutz. Um lokale oder invasive Schädlinge zu bekämpfen, ist es wichtig, einheimische EPF zu isolieren und auszuwählen. Daher wurde in dieser Studie die Bodenködermethode in Kombination mit dem Insektenködersystem (Mehlwurm, Tenebrio molitor) mit einigen Modifikationen verwendet. Die isolierten EPF wurden dann dem Virulenztest gegen den landwirtschaftlichen Schädling Spodoptera litura unterzogen. Darüber hinaus wurden die potenziellen EPF-Stämme morphologischen und molekularen Identifizierungen unterzogen. Darüber hinaus wurden die Konidienproduktion und der Thermotoleranztest für die vielversprechenden EPF-Stämme durchgeführt und verglichen; Diese Daten wurden weiter in die Formel der effektiven Konidienzahl (ECN) für das Laborranking substituiert. Das Bodenköder-Mehlwurm-System und die ECN-Formel können verbessert werden, indem Insektenarten ersetzt und mehr Stressfaktoren für die Bewertung der Kommerzialisierung und Feldanwendung integriert werden. Dieses Protokoll bietet einen schnellen und effizienten Ansatz für die EPF-Selektion und wird die Forschung an biologischen Bekämpfungsmitteln verbessern.
Introduction
Derzeit werden entomopathogene Pilze (EPF) häufig bei der mikrobiellen Bekämpfung von landwirtschaftlichen, forstwirtschaftlichen und gartenbaulichen Schädlingen eingesetzt. Die Vorteile von EPF sind seine große Wirtsbreite, gute Umweltanpassungsfähigkeit, umweltfreundliche Natur und dass es mit anderen Chemikalien verwendet werden kann, um den Synergieeffekt für den integrierten Pflanzenschutz zu zeigen1,2. Für die Anwendung als Schädlingsbekämpfungsmittel ist es notwendig, eine große Anzahl von EPF entweder aus erkrankten Insekten oder der natürlichen Umgebung zu isolieren.
Die Probenahme dieser Organismen von ihren Wirten hilft beim Verständnis der geografischen Verteilung und Prävalenzrate von EPF in natürlichen Wirten3,4,5. Die Sammlung von pilzinfizierten Insekten ist jedoch in der Regel durch Umweltfaktoren und Insektenpopulationen im Feld begrenzt4. In Anbetracht der Tatsache, dass Insektenwirte nach einer EPF-Infektion sterben und dann in den Boden fallen, könnte die Isolierung von EPF aus Bodenproben eine stabile Ressource sein3,6. Zum Beispiel sind Saprophyten dafür bekannt, den toten Wirt als ihre Ressource für das Wachstum zu nutzen. Die Bodenköder- und selektiven Mediumsysteme wurden häufig verwendet, um EPF aus dem Boden zu erkennen und zu isolieren3,4,7,8,9,10.
Bei der Methode des selektiven Mediums wird die verdünnte Bodenlösung auf ein Medium plattiert, das Breitbandantibiotika (z. B. Chloramphenicol, Tetracyclin oder Streptomycin) enthält, um das Wachstum von Bakterien zu hemmen2,3,9,11. Es wurde jedoch berichtet, dass diese Methode die Vielfalt und Dichte des Stammes verzerren und zu einer Über- oder Unterschätzung vieler mikrobieller Gemeinschaften führen kann6. Darüber hinaus sind die isolierten Stämme weniger pathogen und konkurrieren während der Isolierung mit Saprophyten. Es ist schwierig, EPF aus der verdünnten Bodenlösung zu isolieren3. Anstatt ein selektives Medium zu verwenden, isoliert die Bodenködermethode EPF von den infizierten toten Insekten, die für 2-3 Wochen gelagert werden können, wodurch eine effizientere und standardisierte EPF-Trennmethode3,4,7,6 bereitgestellt wird. Da die Methode einfach zu bedienen ist, kann man eine Vielzahl von pathogenen Stämmen zu geringen Kosten isolieren4. Daher ist es von vielen Forschern weit verbreitet.
Beim Vergleich der verschiedenen Arten von Insektenködersystemen sind Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae die häufigsten EPF-Arten, die in Insekten der Hemiptera, Lepidoptera, Blattella und Coleoptera gefunden werden6,12,13,14. Unter diesen Insektenködern zeigen Galleria mellonella (Ordnung Lepidoptera) und Tenebrio molitor (Ordnung Coleoptera) im Vergleich zu anderen Insekten höhere Erholungsraten von Beauveria und Metarhizium spp.. Daher werden G. mellonella und T. molitor häufig für Insektenköder verwendet. Im Laufe der Jahre hat das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten (USDA) eine EPF-Bibliothek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) eingerichtet, die eine Vielzahl von Arten enthält, darunter 4081 Arten von Beauveria spp., 18 Arten von Clonostachys spp., 878 Arten von Cordyceps spp., 2473 Arten von Metarhizium spp., 226 Arten von Purpureocillium spp., und 13 Arten von Pochonia spp. unter anderem15. Eine weitere EPF-Bibliothek wurde vom Entomology Research Laboratory (ERL) der University of Vermont in den Vereinigten Staaten für ca. 30 Jahre gebaut. Es umfasst 1345 Stämme von EPF aus den Vereinigten Staaten, Europa, Asien, Afrika und dem Nahen Osten16.
Um lokale oder Invasionsschädlinge in Taiwan zu kontrollieren, ist die Isolierung und Auswahl der einheimischen EPF erforderlich. Daher haben wir in diesem Protokoll das Verfahren der Bodenködermethode modifiziert und beschrieben und mit dem Insektenködersystem (Mehlwurm, Tenebrio molitor) kombiniert17. Basierend auf diesem Protokoll wurde eine EPF-Bibliothek eingerichtet. Für die vorläufigen EPF-Isolate wurden zwei Screening-Runden (Quantifizierung der Impfung) durchgeführt. EPF-Isolate zeigten Pathogenität gegenüber Insekten. Die potenziellen Stämme wurden morphologischen und molekularen Identifizierungen unterzogen und durch den Thermotoleranz- und Konidialproduktionstest weiter analysiert. Darüber hinaus wurde auch ein Konzept der effektiven Konidienzahl (ECN) vorgeschlagen. Unter Verwendung der ECN-Formel und der Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurden die potenziellen Stämme unter simuliertem Umgebungsdruck analysiert, um den Prozess der Einrichtung und des Screenings der EPF-Bibliothek abzuschließen. Anschließend wurde die Pathogenität vielversprechender EPF-Stämme auf den Zielschädling (z.B. Spodoptera litura) getestet. Das aktuelle Protokoll integriert Thermotoleranz- und konidiale Produktionsdaten in die ECN-Formel und PCA-Analyse, die als Standard-Ranking-System für EPF-bezogene Forschung verwendet werden kann.
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Protocol
HINWEIS: Das gesamte Flussdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Isolierung und Selektion potenzieller entomopathogener Pilze (EPF)
- Sammeln Sie die Bodenprobe
- Entfernen Sie 1 cm der Oberflächenerde und sammeln Sie dann den Boden innerhalb der 5-10 cm Tiefe mit einer Schaufel von jeder Probenahmestelle.
HINWEIS:Probenahmestellen wären Berg-, Wald- oder dünn besiedelte Gebiete, um die Kontamination künstlich versprühter EPF-Stämme zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Bereiche für die Bodenprobenentnahme an der Oberfläche mit Unkraut bedeckt sind. Trockener Boden oder feuchter Boden ist für dieses Experiment nicht geeignet. - Zeichnen Sie die Details jedes Probenahmestandorts auf, einschließlich GPS, Höhe, Art des Feldes, Jahrestemperatur, jährlicher Niederschlag, Erfassungszeit (Saison), Bodentyp und pH-Wert.
- Sammeln Sie 100 g der Bodenprobe in einer Plastiktüte und halten Sie sie bei Raumtemperatur, wenn Sie sie innerhalb von 3 h im Labor dem Pilzisolationsprotokoll unterziehen.
HINWEIS: Wenn die Probe nicht innerhalb von 3 h verwendet werden kann, lagern Sie den Boden bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen. Wird das Experiment nicht sofort durchgeführt, kann die Bodenprobe 1 Woche lang bis zum Beginn des Protokolls bei 4 °C gelagert werden18,19.
- Entfernen Sie 1 cm der Oberflächenerde und sammeln Sie dann den Boden innerhalb der 5-10 cm Tiefe mit einer Schaufel von jeder Probenahmestelle.
- Köder und Isolierung der EPF mit Mehlwurm (Tenebrio molitor)
- 100 g der Bodenprobe in einen Plastikbecher geben (Kappendurchmesser = 8,5 cm, Höhe = 12,5 cm) und dann 5 Mehlwürmer bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 Wochen auf die Bodenoberfläche legen.
HINWEIS: Andere Arten von Plastikbecherbehältern können ebenfalls verwendet werden. Wenn die Böden zu trocken sind (rissig oder sandig), sprühen Sie sterilisiertes ddH2O (ca. 5-10 ml) auf die Böden. Die Körperlänge ca. 2,5 cm (14. Stadium) von T. molitor-Larven hilft bei Pilzisolationssieben20. - Beobachten und notieren Sie die Larven täglich auf Mortalität und Mykose; Halten Sie die toten Larven bis 2 Wochen in der Tasse für die Pilzisolierung.
HINWEIS: Die Pilz-Conidia-Spore in den Bodenproben wird während des obigen Prozesses an den Mehlwurmlarven anhaften. Die Pilzmykose wird beobachtet, wenn die Hyphen aus der intersegmentalen Membran wachsen, und dann wird der ganze Körper mit dem Myzel bedeckt. Die Sporulation beginnt nach 7 Tagen und die Farbe der Pilzinfektion ändert sich in die Farbe der Konidienmasse. - Übertragen Sie die toten Insekten auf eine saubere Bank und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um die Konidien zu sammeln. Streifen Sie sie im Labor auf einer Viertelstärke Sabouraud Dextrose Agar Medium (1/4 SDA) Platte (55 mm)21. Die Kulturplatte bei 25 °C für 7 Tage inkubieren, um die Primärkultur der Pilze zu erhalten.
HINWEIS: Die 1/4 SDA-Platte wird wie folgt zubereitet: Mischen Sie 1,5 g Sabouraud Dextrosebrühe und 3 g Agar in 200 ml H2O und sterilisieren Sie dann für 20 min. Aliquot 1/4 SDA in jede 55 mm Petrischale vor der Erstarrung. Die erstarrten 1/4 SDA-Platten werden bis zum Gebrauch bei 4 °C gelagert. - Streift jeden Primärkulturpilz auf einer 55 mm 1/4 SDA-Platte in einer laminaren Strömung erneut und inkubiert die Kulturplatte bei 25 °C für 7 Tage, um einzelne Pilzkolonien zu erhalten.
- Wiederholen Sie diese erneute Isolierung ~ 2-3 Mal und beobachten Sie unter Lichtmikroskopie, um einzelne und reine morphologische Pilzkolonien zu erhalten.
HINWEIS: Isolieren Sie alle EPF mit T. molitor-bait und lagern Sie sie wie im folgenden Abschnitt beschrieben. Die Trennung, Konservierung, Reinkultur und Streifenbildung müssen in den nachfolgenden Abschnitten in einer laminaren Strömung durchgeführt werden.
- 100 g der Bodenprobe in einen Plastikbecher geben (Kappendurchmesser = 8,5 cm, Höhe = 12,5 cm) und dann 5 Mehlwürmer bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 Wochen auf die Bodenoberfläche legen.
- Lagern der EPF-Isolate
- Schneiden Sie 3 der 5 mm Agarblöcke am Rand jeder isolierten reinen Pilzkulturplatte mit einem Korkbohrer ab und legen Sie sie als ein Replikat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Für die Lagerung der EPF-Stämme nach dem 2. Virulenztest werden drei Replikate für jedes Pilzisolat empfohlen. Die molekulare Identifizierung wird auch empfohlen, wenn der Lagerraum begrenzt ist. - 250 μL 0,03%ige Tensidlösung (Materialtabelle) und 250 μL 60%ige Glycerin unter Verwendung einer Mikropipette in das 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben; dann Wirbel für 10 s.
- Verschließen Sie das 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Paraffinfolie und kühlen Sie es in einem -20 °C kühlschrank für 24 h vor. Anschließend werden die vorgekühlten Pilzvorräte zur Kryokonservierung in einen -80 °C warmen Kühlschrank überführt.
ANMERKUNG: In Abschnitt 1.4 wurden extra reine Pilzkulturplatten (abgesehen von den kryokonservierten Proben) verwendet.
- Schneiden Sie 3 der 5 mm Agarblöcke am Rand jeder isolierten reinen Pilzkulturplatte mit einem Korkbohrer ab und legen Sie sie als ein Replikat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- 1. Pathogenitätsscreening für Pilzisolate
- Fünf T. molitor-Larven direkt auf die Oberfläche jeder reinen Pilzkulturplatte bei 25 °C auftragen.
- Beobachten und notieren Sie die Mykose und Mortalität für 10 Tage. Wählen Sie das Pilzisolat zur weiteren Analyse aus.
HINWEIS: Pilzisolate, die eine Mortalität von 100% verursachen, werden für den 2. Virulenztest ausgewählt, um ihre Virulenz gegenüber T. molitor-Larven zu bestätigen. Alternativ kann der Forscher die Kriterien gemäß seiner eigenen Studie anpassen.
- 2. Virulenztest von Pilzisolaten
HINWEIS: Basierend auf dem 1. Pathogenitätsscreening die ausgewählten Pilzisolate von -80 °C für den 2. Virulenztest wiederherstellen . Der Zweck des 2. Virulenztests besteht darin, die Pathogenität der ausgewählten Pilzisolate nach der 1. Screening-Runde zu quantifizieren.- Ernten Sie Konidien jedes Pilzisolats durch Wirbeln für 1 min und zählen Sie die Anzahl der Konidien mit einem Hämozytometer.
- Die Konidiensuspension wird auf eine Konzentration von 1 x 107 Konidien/ml in einer 0,03%igen Tensidlösung eingestellt (Materialtabelle).
- 10 μL der Pilzsuspension auf 55 mm 1/4 SDA-Platten verteilen und 7 Tage bei 25 °C im Dunkeln wachsen lassen.
- Fünf T. molitor-Larven direkt auf die Oberfläche jeder reinen Pilzkulturplatte (ca. 6 x 107 Konidien) legen. Die Platten mit Paraffinfolie verschließen und bei 25 °C im Dunkeln inkubieren.
- Beobachten und notieren Sie die Mykose und Mortalität für 10 Tage.
- Wiederholen Sie den Test (von Schritt 1.51 bis 1.5.5) in dreifacher Ausfertigung für jedes Pilzisolat.
HINWEIS: Pilzisolate, die eine Mortalität von 100% verursachen, werden für den 3. Virulenztest ausgewählt, um ihre Virulenz gegen den Schädling zu bestätigen.
- 3. Virulenztest von Pilzisolaten für Zielschädlinge (Spodoptera litura als Beispiel)
- Wiederholen Sie die Schritte 1.5.2 bis 1.5.6 mit ausgewählten Isolaten aus der 2. Virulenz, um die Virulenz gegen den Zielschädling zu testen.
- Berechnen Sie den LT50 jedes Pilzisolats22.
HINWEIS: Der LT50 jedes Pilzisolats wurde durch verallgemeinerte lineare Modelle (GLMs) mit R Studio (Version 3.4.1) berechnet; Die quasibinomiale Fehlerverteilung und eine Log-Link-Funktion können verwendet werden, um eine Überdispersion zu berücksichtigen.
2. Molekulare Identifizierung von EPF
- Extraktion von pilzlicher genomischer DNA
- Sammeln Sie ca. 1 cm2 EPF von der 7-tägigen 1/4 SDA-Platte.
- Extrahieren Sie die genomische Pilz-DNA mit einem Pilz-Genom-DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers23 (Materialtabelle).
- PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung
- Amplifizieren Sie die Fungal ITS-Region durch PCR der DNA-Probe21 mit dem PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R Primer Set24 (Tabelle 1) mit dem folgenden PCR-Programm: 94 °C für 1 min und dann 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 1 min, gefolgt von einer 7 min abschließenden Verlängerung bei 72 °C.
HINWEIS: Der ITS1F/ITS4R-Primersatz dient zur Identifizierung auf Gattungsebene. - Sequenzieren Sie die PCR nach kommerziellem Sequenzierungsdienst.
- Verwenden Sie die NCBI BLAST-Suche nach ähnlichen Pilzen in der NCBI-Datenbank und wählen Sie die relative Pilztypart für die phylogenetische Analyse aus.
ANMERKUNG: Die Pilzarten der Gattung Metarhizium oder Beauveria sollten mit tef-983F/tef-2218R primer set25 weiter auf Artebene identifiziert werden (Wiederholungsschritte 2.1.1 bis 2.2.3). Für Pilze, die nicht zu den Gattungen Metarhizium oder Beauveria gehören, können andere molekulare Marker zur Identifizierung der Spezies verwendet werden, einschließlich DNA-Lyase (APN2), Beta-Tubulin (BTUB), RNA-Polymerase II größte Untereinheit (RPB1), RNA-Polymerase II zweitgrößte Untereinheit (RPB2) und 3'-Anteil des Translationsdehnungsfaktors 1 alpha (TEF)25,26 .
- Amplifizieren Sie die Fungal ITS-Region durch PCR der DNA-Probe21 mit dem PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R Primer Set24 (Tabelle 1) mit dem folgenden PCR-Programm: 94 °C für 1 min und dann 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 1 min, gefolgt von einer 7 min abschließenden Verlängerung bei 72 °C.
- Phylogenetische Analyse
- Verwenden Sie ClustalX 2.1 software27 , um die verschiedenen Sequenzen aus den Schritten 2.2.2 und 2.2.3 auszurichten. Schneiden Sie den konservierten Sequenzbereich manuell mit GeneDoc28 zu.
- Führen Sie die phylogenetische Analyse mit MEGA7 software29 basierend auf den Methoden Minimale Evolution (ME), Neighbor-Joining (NJ) und Maximum Likelihood (ML) durch.
HINWEIS: Die Durchführung aller drei Methoden kann helfen, den Klassifizierungsstatus zu bestätigen und genau abzuschließen. Die pilzlichen Isolate, die durch den 1. Pathogenitätsscreening gescreent werden, werden zur molekularen Identifizierung auf Gattungsebene verwendet. Die durch den 2. Virulenztest gescreenten Pilzisolate werden zur molekularen und morphologischen Identifizierung auf Speziesebene verwendet.
3. Morphologische Identifizierung von EPF
- Beobachtung der Morphologie der Pilzkolonie
- Verwenden Sie eine Kamera, um das Wachstum der Pilzkulturkolonie für 7 Tage zu erfassen, und zeichnen Sie das Wachstum, die Form (flauschig, fest) und die Farbe der Kolonien auf.
- Beobachtung von Konidien und Konidiophoren
- Kratzen Sie Konidien aus der Reinkultur-Pilzkolonie mit einer Impfschleife und übertragen Sie die Sporen auf einen Glasobjektträger mit 0,1% Tween 80-Lösung. Dann mit einem Deckglas für die lichtmikroskopische Beobachtung von Konidien abdecken.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 5 mm2 großen Agarblock des Hyphenstrangs am Rand der Pilzkolonie zu schneiden, und übertragen Sie den Agarblock dann auf einen Glasträger.
- Führen Sie die Reinigung wie folgt durch: Fügen Sie die 0,1% Tween 80-Lösung mit einer Kunststofftropfer auf den Agarblock und waschen Sie die meisten überschüssigen Konidien mit einer Pinzette ab. Dann bedecken Sie es mit einem Deckglas für die lichtmikroskopische Beobachtung.
HINWEIS: 0,1% Tween 80 können je nach Pilzart und Hydrophobie durch ein anderes stärkeres Tensid (Materialtabelle) ersetzt werden. - Messen und notieren Sie die Breite und Länge der Konidien und Konidiophoren, um die Unterschiede zwischen verschiedenen Pilzisolaten zu vergleichen.
- Verwenden Sie den Welch's ANOVA-Test und den Games-Howell-Test (Post-hoc-Test), um die Konidialbreite und -länge jedes Stammes mit R Studio (Version 3.4.1) zu analysieren.
HINWEIS: Die Datenanalyse morphologischer Merkmale kann fallweise angepasst werden. Die mit dem 3. Virulenztest gescreenten Pilzisolate werden für die physiologische Charakterisierung und das ECN-Ranking in den Abschnitten 4 und 5 verwendet.
4. Untersuchung der konidialen Produktivität und Thermotoleranz
- Assay der konidialen Produktion
- Kultur des ausgewählten Pilzisolats auf 1/4 SDA-Medium bei 25 ± 1 °C im Dunkeln für 10 Tage.
- 1 mL der konidialen Suspension des Pilzisolats in 0,03%iger Tensidlösung zubereiten und wie oben beschrieben auf 1 x 107 Konidien/ml einstellen.
- Drei Tröpfchen von 10 μL konidialer Suspension auf 1/4 SDA fallen lassen und bei 25 °C im Dunkeln für 7, 10 und 14 Tage inkubieren, um die Sporulation von Pilzen zu zählen.
HINWEIS: 10 μL ist das beste Volumen, um den 5 mm Block mit gleichmäßiger Pilzsporulation nach Pilzwachstum für 7-14 Tage zu sammeln. - Verwenden Sie den Korkbohrer, um den 5 mm Agarblock von der Mitte der Kolonie zu lösen und zu jedem Zeitpunkt in 1 ml 0,03% ige Tensidlösung (Materialtabelle) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
- Wirbeln Sie das Rohr bei 3.000 U / min bei Raumtemperatur für 15 min und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Konidien zu zählen.
HINWEIS: Die für die Zählung verwendete Formel ist die Anzahl der Konidien pro 25 Quadrate der kleinsten Zelle (Größe = 0,025 mm2; Kammertiefe = 0,1 mm):
Gesamtzahl der Konidien in 5 Quadraten ÷ 80 × (4 × 106) - Wiederholen Sie dies dreimal für jedes Isolat.
- Thermotoleranz-Assay
- Kultur des ausgewählten Pilzisolats auf 1/4 SDA-Medium bei 25 ± 1 °C im Dunkeln für 10 Tage.
- 1 ml der konidialen Suspension von Pilzisolat in 0,03%iger Tensidlösung herstellen und wie oben beschrieben auf 1 x 107 Konidien/ml einstellen.
- Die Konidialsuspension aufwirbeln und in einem 45 °C trockenen Bad für 0, 30, 60, 90 und 120 min erhitzen. Drei Tröpfchen von 5 μL der Konidialsuspension zu jedem Zeitpunkt nach der Hitzeexposition auf 55 mm 1/4 SDA-Medium fallen lassen und bei 25 ± 1 °C für 18 h inkubieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Pilztröpfchen zu verteilen, um sich besser auf den Bereich konzentrieren zu können. - Zählen Sie die Anzahl der gekeimten Konidiensporen mit fünf zufällig ausgewählten Feldern unter 200-facher Lichtmikroskopie, um die Keimrate zu bestimmen.
- Führen Sie drei Replikate für jedes Isolat durch.
5. Effektives ECN-Ranking (Conidia Number)
- ECN-Berechnung
ANMERKUNG: Erhalten Sie die Konidialproduktions- und Thermotoleranzdaten jedes potenziellen Pilzstamms, bevor Sie den Gesamt-ECN21 berechnen.- Berechnen Sie den Faltenwechsel (FC) der konidialen Produktion zu jedem Zeitpunkt:
wobei x = Zeitpunkt für die Datenerhebung ist; ncp = Anzahl der Konidien nach jedem Wachstumstag; und I = Anfangszahl der gesetzten Konidien. - Berechnen Sie die Konidienzahl unter der Stressbehandlung zu jedem Zeitpunkt mit der folgenden Formel:
Dabei ist y = die ECN des zu behandelnden Zeitpunkts; TT0 = Keimrate von Konidien, die keiner Hitzebelastung ausgesetzt sind (= Keimrate von 0 min Wärmebehandlung); TTz = Spannungskoeffizient ist die Keimrate der Konidien zu verschiedenen Zeiten der Wärmebehandlung (z). - Berechnen Sie den Gesamt-ECN mit der folgenden Formel:
- Vergleichen Sie den ECN jedes Pilzstamms.
- Berechnen Sie den Faltenwechsel (FC) der konidialen Produktion zu jedem Zeitpunkt:
- Hauptkomponentenanalyse (PCA) von Pilzstämmen
HINWEIS:Die PCA-Analyse bestätigt das Ranking von ECN und hilft beim Verständnis der Korrelation zwischen den physiologischen Charakterwerten. Vergleichen Sie die ECN-Werte und wählen Sie EPF-Isolate mit höheren ECN-Werten aus. - Verwenden Sie die R-Software, um PCA durch Codierung zu erstellen:
#Input PCA-Datendatei
a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)- # Verarbeitung von Beispieldaten
row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
X=Zeilennamen(a)
df<- a[2:11] - #PCA Berechnung
pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
vars <- (pca$sdev)^2
pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
Wert = pca$x - #Output PCA-Visualisierungsdatei
png(datei = 'pca.png', höhe = 2000, breite = 2000, res = 300)
HINWEIS: Verwenden Sie 7 bis 14 Tage konidiale Produktion und alle Thermotoleranzdaten, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) zur Bestätigung des ECN-Rankings durchzuführen.
- # Verarbeitung von Beispieldaten
- Wählen Sie die leistungsstärksten Pilzstämme basierend auf ECN oder PCA aus und führen Sie den Virulenztest von Zielschädlingen für weitere Forschungen durch.
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Representative Results
Isolierung und Selektion potentieller entomopathogener Pilze (EPF)
Durch die Verwendung der Tenebrio molitor-vermittelten entomopathogenen Pilze (EPF) Bibliotheksbauweise würde die Anzahl der Pilze ohne insektentötende Aktivität ausgeschlossen; somit könnte die Isolationseffizienz und selektion von EPF stark erhöht werden. Bei der Anwendung dieser Methode wurden die Informationen über Probenahmestellen, Bodenproben und die Pilzkeimungsraten erfasst (Tabelle 2). Basierend auf unseren bisherigen Daten wurden aus 172 Bodenproben insgesamt 101 Pilzisolate gewonnen, was auf eine hohe Isolationseffizienz von 64% hindeutet. Unter den 101 Pilzisolaten zeigten 26 Isolate nach dem 1. Pathogenitätsscreening eine insektizide Aktivität gegen T. molitor (100% Mortalität), so dass die Eliminierung von Pilzisolaten 26/101 = 25,7% betrug. Im 2. Virulenztest wurde die hohe Virulenz der 26 Pilzisolate gegen T. molitor weiter nachgewiesen, von denen 12 eine hohe Pathogenität gegen die T. molitor-Larven zeigten (100% Mortalität 5 Tage nach der Impfung) (Abbildung 2A). Diese wurden verwendet, um den Virulenztest gegen den landwirtschaftlichen Schädling zu bewerten. Basierend auf den Daten der Mortalität des 3. Virulenztests und LT50 zeigten insgesamt sechs Pilzisolate (NCHU-9, 11, 64, 69, 95 und 113) eine schnelle Insektentötungsaktivität gegen Spodoptera litura (LT50 = 2,94, 2,22, 2,84, 2,57, 2,96 und 1,13), die anhand des physiologischen Assays und der effektiven Konidienzahl (ECN) bewertet wurden (Abbildung 2B).
Molekulare Identifizierung von EPF
Um die taxonomischen Positionen der Pilze besser zu verstehen, wurden 26 Isolate aus dem 1. Pathogenitätsscreening einer molekularen Analyse basierend auf der ITS-Region unterzogen (Abbildung 3A). Das Ergebnis zeigte, dass diese Pilzisolate eindeutig in sieben Gattungen unterteilt werden konnten, darunter Beauveria, Clonostachys, Fusarium, Cordyceps, Penicillium, Purpureocillium und Metarhizium (Abbildung 3A). Basierend auf der ITS1-5.8S-ITS2-Region wurde die Gattungsklassifikation von EPF genau bestätigt, während die Artenebene immer noch nicht unterscheidbar ist. Daher wird die Sequenz der TEF-Region verwendet, um die Artenebene für 12 vielversprechende EPF-Isolate aus dem Virulenztest gegen den landwirtschaftlichen Schädling eindeutig zu klassifizieren. Die molekulare Identifizierung der 12 Isolate zeigte, dass 11 Isolate zu Metarhizium gehören und vier Spezies enthielten, darunter M. lepidiotae (NCHU-9, NCHU-102), M. pinghaense (NCHU-10, NCHU-11, NCHU-30, NCHU-32, NCHU-64), M. brunneum (NCHU-27, NCHU-29) und M. anisopliae (NCHU-69, NCHU-95). Das verbleibende Isolat wurde als B. australis (NCHU-113) identifiziert (Abbildung 3B,C). Nach dem obigen Ergebnis kann die Sequenzregion von tef die Gattung Metarhizium auf Artenebene effektiv unterscheiden, während andere Arten andere Sequenzregionen als molekulare Marker finden müssen, um die Art zu unterscheiden.
Morphologische Identifizierung von EPF
Durch die Reinigungsmethode (Schritt 3.2.3) der morphologischen Beobachtungen von Pilzen konnten die Strukturen von Konidiophoren mit 0,1% Tween 80-Lösung deutlich gesehen werden (Abbildung 4A), und diese Beobachtungen könnten als Benchmark dienen, um die Größe der Struktur zu messen und eine Fotoaufnahme zu machen. Die Farbe, Form und Anordnung der Konidien kann durch mikroskopische Beobachtungen der Koloniekonidien gesehen werden (Abbildung 4B,C). Nach der Beobachtung konnten die Größen von Konidien und Konidiophorformen weiter gemessen und statistisch verglichen werden (Tabelle 3).
Untersuchung der konidialen Produktivität, Thermotoleranz und ECN-Rangfolge
Die ECN-Formel, die im vorherigen Bericht21 vorgeschlagen wurde, könnte bei der Auswahl eines EPF-basierten physiologischen Charakters mit hoher Stresstoleranz helfen. Das ECN kombiniert die Konidienproduktions- und Thermotoleranzdaten jedes EPF (Abbildung 5A,B), was eine hohe Lebensfähigkeit der Pilzdehnung bei hohem ECN-Wert bedeutet (Abbildung 5). Darüber hinaus wurde die Visualisierung der Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet, um die Ergebnisse der ECN-Formel zu überprüfen. Das Ergebnis zeigte eine hohe Koordination zwischen PCA und ECN, was darauf hindeutet, dass die ECN-Formel verwendet werden könnte, um die Hierarchie der lebensfähigkeitsbezogenen Parameter und das Entwicklungspotenzial von Pilzen für die Feldanwendung und weitere Kommerzialisierung zu bewerten (Abbildung 5C, D).
Abbildung 1: Illustration der Bibliothekskonstruktion von Tenebrio molitor-vermittelten entomopathogenen Pilzen (EPF). Teil 1: Pilzisolierung aus Bodenproben; Teil 2: Pathogenitäts- und Virulenz-basiertes Screening und Pilzidentifikation; Teil 3. Physiologische Charakterisierung und Pilzrangfolge. ECN = Effektive Konidienzahl; und PCA = Hauptkomponentenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mortalität von Mehlwürmern und Spodoptera litura bei der Auswahl vielversprechender Isolate entomopathogener Pilze (EPF). (A) 26-selektierter Pilz-2. Mehlwurm-Virulenztest; Die Mykosen von 12 schnell abtötenden und hochvirulenzstarken Pilzisolaten werden parallel gezeigt. (B) 12 Pilzisolate wurden für den Virulenztest gegen S. litura ausgewählt. Der Test an jedem Pilzstamm wurde dreimal wiederholt. d.p.i. = Tage nach der Impfung. Modifizierte Figur und Legende mit Genehmigung des Fronteris21 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die phylogenetische Analyse von Entomopathogenen Pilzstämmen (EPF) auf (A) Gattungsebene basierend auf ITS-Region und (B-C) Artenebene basierend auf TEF. Die phylogenetische Analyse der ITS-Region und des TEF wurde unter Verwendung der Methoden Maximum Likelihood (ML), Minimum Evolution (ME) und Neighbor-Joining (NJ) erstellt. Bootstrap-Analysen wurden durchgeführt, um die Robustheit der Phylogenien anhand von 1.000 Replikaten zu bewerten, und Bootstrap-Anteile von mehr als 50% sind über den Zweigen angegeben. Fett = Ex-Typ-Stämme. Die roten und grünen Pfeile zeigen die vielversprechende EPF an. Modifizierte Figur und Legende mit Genehmigung des Fronteris21 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikroskopische Untersuchung der Morphologie entomopathogener Pilze (EPF) (M. anisopliae). Beobachtung von Konidiophoren (A) nach dem Waschen. (B) Die Beobachtung von Konidienform und -farbe. (C) Anordnung von Konidien und Bündeln von Sporensträngen (SS) von M. anisopliae; Cp = Konidiophore; cc = zylindrische Konidien. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Physiologische Charakterisierung von sechs potentiellen Isolaten und die Analyse der effektiven Konidienzahl (ECN ). (A) Konidialer Produktionstest. B) Thermotoleranz-Assay. (C) Das Balkendiagramm der ECN-Werte. (D) Die Hauptkomponentenanalyse zeigte die Verteilung jedes Stammes. Modifizierte Figur und Legende mit Genehmigung des Fronteris21 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name des Primers | Amplicon Größe (bp) | Sequenz(5'-3') | Region | Referenz | |
| ITS1F | 550 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | SEIN | 25 | |
| ITS4R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||||
| TEF-983F | 1000 | GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT | Tef | 26, 27, 41, 42 | |
| TEF-2218R | ATGACACCRACRGCRACRGTYTG | ||||
Tabelle 1: Primerpaare zur Pilzidentifikation.
Tabelle 2: Die parameter, die für die Tenebrio molitor-vermittelte EPF-Bibliotheksbaumethode aufgezeichnet wurden, sind unten aufgeführt. NIU = der Campus der National Ilan University. NCHU = der Campus der National Chung Hsing University. Geänderte Tabelle und Legende mit Genehmigung von Fronteris21 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
| Spezies | Dehnung | Philiden μm±SD* | Konidien μm±SD* |
| Metarhizium lepidiotae | NCHU-9 | Zylindrisch, 7.3±0.67b×2.4±0.36a | Zylindrisch, 6,5±0,45a×2,7±0,13b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-11 | Zylindrisch, 8,6±0,68ab×2,6±0,30a | Zylindrisch, 6.3±0.41b×2.7±0.16b |
| Metarhizium pinghaense | NCHU-64 | Zylindrisch, 10,5±1,54a×2,4±0,32a | Zylindrisch, 6,8±0,53a×2,9±0,31a |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-69 | Zylindrisch, 9,4±1,58a×2,7±0,32a | Zylindrisch, 6.3±0.34b×2.6±0.19b |
| Metarhizium anisopliae | NCHU-95 | Zylindrisch, 9,6±0,87a×2,6±0,29a | Zylindrisch, 6,0±0,82b×2,9±0,29a |
| Beauveria australis | NCHU-113 | Ellipsoid, NA×2,6±0,57 | Globose, 2.3±0.24×2.3±0.24 |
| *Die statistische Analyse wurde auf der Grundlage des Welch's ANOVA-Tests mit R Studio durchgeführt. | |||
| § Geänderte Tabelle und Legende, die mit Genehmigung der Fronteris reproduziert wurden (23). | |||
Tabelle 3: Ein Beispiel für morphologische Beobachtungen von sechs vielversprechenden entomopathogenen Pilzisolaten. Die statistische Analyse wurde auf der Grundlage des Welch's ANOVA-Tests mit R Studio durchgeführt. Geänderte Tabelle und Legende mit Genehmigung von Fronteris21 reproduziert.
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Discussion
Entomopathogene Pilze (EPF) wurden zur Insektenbekämpfung eingesetzt. Es gibt mehrere Methoden zum Isolieren, Auswählen und Identifizieren von EPF30,31,32. Im Vergleich der verschiedenen Arten von Insektenködermethoden wurden Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae häufig in Insektenködern gefunden6,12,13,14. Unter diesen Insektenködern zeigten Galleria mellonella und Tenebrio molitor hohe Erholungsraten von Beauveria und Metarhizium spp. Tatsächlich wurde der Nutzen der Mehlwurm-Ködermethode (T. molitor) als Convenience-Methode zur Isolierung von EPF aus Bodenproben nachgewiesen17,21. Dennoch wurde berichtet, dass die Verwendung von Insekten als Köder die Neigung zeigen würde, bestimmte Pilzarten zu isolieren3,33. Daher könnte die Kombination verschiedener Insektenarten (z. B. Galleria mellonella und T. molitor zusammen), um den EPF aus den Bodenproben zu ködern, die Vielfalt von EPF34 erhöhen.
Um die Insektentötungsaktivität zu bewerten, gibt es im aktuellen Protokoll zwei Screening-Runden durch Mehlwurm (T. molitor), um die vielversprechenden Pilzstämme für weitere Studien auszuwählen. Nach diesem Prozess könnte die Anzahl der Pilzisolate, die aus Bodenproben isoliert werden, drastisch reduziert und auf Pilzisolate beschränkt werden, die nach dem 1. und 2. Screening eine hohe insektizide Aktivität zeigten. Eine große Reduzierung der Pilzisolate für die nächste Screening-Runde spart Zeit und Arbeitsaufwand. Es konnte auch festgestellt werden, dass die ausgewählten Pilzisolate ähnliche Tendenzen der Pathogenität zwischen Mehlwurm (T. molitor) und Tabakschnittwurm (Spodoptera litura) aufwiesen, was eine konsistente Prüfung der Pathogenität verschiedener Insektenarten zeigte und auf andere Pflanzenschädlinge ausgeweitet werden könnte21. Darüber hinaus könnte die Berechnung des ECN auf der Grundlage der physiologischen Tests die Auswahl potenzieller Pilzstämme für den Einsatz auf Getreidefeldern erleichtern. Ähnliche selektive Methoden wurden in anderen Berichten erwähnt, während die Faktoren wie abiotische und Stammeigenschaften nicht einbezogen wurden12,8,31,35,36,37. Daher können diese Stämme durch Umweltfaktoren beeinflusst werden, was zu einem Einfluss auf die Leistung der Pilzkeimung und damit zu einer Schwierigkeit der Kommerzialisierung führt. Diese Konsequenz ist auch der Hauptgrund für die Nichtanwendbarkeit von Laborstämmen im Feld38.
Ausgehend von der morphologischen Identifizierung sollten weitere Anstrengungen unternommen werden, um die klare Struktur der Konidiophoren zu finden und die unterschiedlichen Eigenschaften jedes Pilzstamms zu beobachten. Studien können verschiedene Methoden zur Lösung der schwierigen morphologischen Identifizierung umfassen39. Die morphologische Identifizierung unterscheidet jedoch nicht zwischen eng verwandten Pilzarten; Daher ist es notwendig, die Daten der molekularen Identifizierung zu integrieren. Die interne transkribierte Spacer-Region (ITS) zeigte die Unterscheidung auf Gattungsebene, während andere molekulare Marker (z.B. Tef für Metarhizium, Block für Beauveria) für die Identifizierung auf Artenebene benötigt werden26,40,41.
Bei der physiologischen Charakterisierung wird vorgeschlagen, um die Standardabweichung der Experimente zu reduzieren, entweder die Maschine oder den manuellen Wirbel für mindestens 10 min bei maximaler Drehzahl21. Eine gründlich gemischte Conidia-Suspension würde die Konsistenz der Ergebnisse des Thermotoleranz-Assays und des Conidial-Production-Assays erhöhen. Auf der anderen Seite warf die gezählte Konidienzahl unter einer festen Fläche (5 mm Block im zentralen Teil der Pilzkolonie in dieser Studie) auf der kultivierten Platte zu unterschiedlichen Zeitpunkten das Problem auf, dass verschiedene Pilzarten und sogar verschiedene Stämme unterschiedliche Leistungen der Wachstumsverdichtung der Hyphen zeigten. was zur Nichtrepräsentation der Stichprobe führen könnte. Daher kann eine strenge Testmethode für die Konidienproduktion das Problem verbessern, z. B. die Anzahl der Konidien der gesamten Pilzkolonie genau zählen und sich mit der Wachstumsfläche normalisieren42.
Die effektive Konidienzahlformel (ECN) basiert auf dem Einfluss von Umweltstress auf EPF-Konidien, dh simuliert Konidien unter der Bedingung der wilden Umgebung, um die vielversprechenden Pilzstämme für die Kommerzialisierung auszuwählen21. In diesem Protokoll wurden die Daten der Konidienproduktion und der Wärmebehandlung für die Berechnung des Gesamt-ECN-Wertes jedes vielversprechenden Pilzstamms im Anschluss an die vorherige Studie21 verwendet. Darüber hinaus können unter einer natürlichen Umgebung, mit Ausnahme der Temperatur, andere Umweltbelastungen wie Feuchtigkeit, ultraviolette Strahlung (UV) und Wirt die Keimung von Konidien beeinflussen. Insbesondere der UV-Stress ist ein Hauptfaktor, der die Keimung von Konidien beeinflusst, da die durch UV erzeugten energiereichen freien Radikale (wie Peroxide, Hydroxylgruppen und Singulett-Sauerstoff) die Pathogenität und die Persistenz mikrobieller Pestizide reduzieren können43. So könnte die UV-Spannung in Zukunft weiter in die ECN-Formel aufgenommen werden. Um UV-Stress zu vermeiden, sollte die Formel Öl oder Natriumalginat enthalten, um die UV-Toleranz von conidia44,45,46 zu erhöhen, was bestätigt, dass potenzielle Stämme für die Schädlingsbekämpfung praktikabel sind47.
Das vorliegende Protokoll bot eine Methode zur schnellen und präzisen Isolierung potenzieller EPF-Stämme, um eine T. molitor-vermittelte EPF-Bibliothek zu konstruieren. Dies ist die Grundlage und notwendig für die Entwicklung der biologischen Bekämpfungsforschung. Darüber hinaus könnte die ECN-Formel flexibel verbessert werden, um Forschern zu helfen, das Potenzial von EPF zu erfassen und es zu einer Ware für den Einsatz in landwirtschaftlichen Systemen zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass in dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch Grant 109-2313-B-005-048-MY3 des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
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