우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.
우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 막 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합된 살아있는 세포 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하는 프로토콜 및 워크플로우를 제시합니다. 형광 강도의 변동이 각각의 형광 생체 분자의 동적 “지문”을 나타내는 이중 색 FCCS에서, 우리는 수용체의 공동 확산 또는 결합을 조사 할 수 있습니다. FRET는 분자 거리에 대한 높은 민감도를 가지고 있으며 분자 내 변화를 모니터링하는 잘 알려진 “나노 통치자”역할을합니다. 종합하면, 세포 설정에서 현지 수용체 농도 및 이동성 상수와 같은 형성적 변화와 주요 매개 변수가 접근할 수 있게 됩니다.
정량형 형광 접근법은 높은 소음 수준과 샘플의 취약성으로 인해 세포에서 도전적입니다. 여기서 는 eGFP 및 SNAP 태그-TAMRA로 표지된 2-adrenergic 수용체(β2AR)β 이중 색 라벨을 사용한 교정 단계를 포함하여 이 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다. 사용자 지정이 용이한 오픈 소스 소프트웨어 및 템플릿을 사용하여 단계별 데이터 분석 절차가 제공됩니다.
우리의 지침은 살아있는 세포 실험에 있는 제한된 신호-잡음 수준에도 불구하고 높은 신뢰성으로 그(것)에 있는 살아있는 세포에 있는 생체 분자의 분자 상호 작용을 해명하는 가능하게 합니다. FRET의 운영 창과 특히 낮은 농도의 FCCS는 거의 생리학적 조건에서 정량적 분석을 허용합니다.
형광 분광법은 세포 맥락에서 최소한의 교란으로 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 정량화하는 주요 방법 중 하나입니다. 공초점 형광 상관 분광법 (FCS)은 단일 분자 민감성, 고도로 선택적 및 라이브 셀 호환1이기때문에 분자 역학을 분석하는 강력한 방법 중 하나입니다. 다른 역학 지향 접근법과 비교하여 FCS는 ~ ns에서 ~ s에 이르는 광범위한 측정 가능한 시간 범위를 가지며, 가장 중요한 것은 이미징 기반 방법으로 는 종종 접근할 수 없는 빠른 시간 척도를 포괄합니다. 더욱이, 또한 막, 세포질 및 핵 분자 역학이 쉽게 구별될 수 있도록 공간 선택성을 제공한다 2. 따라서, 분자 깜박임, 평균 국부 농도 및 확산 계수는 FCS로 정량적으로 분석될 수 있다. 결합과 같은 분자 역학은 이중 색 접근법에서 형광 간 상관 분광법(FCCS) 분석3,4,5에서 두 분자 종의 공동 확산을 프로빙할 때 쉽게 접근할 수 있게 된다.
상관 분광법의 주요 기본 원리는 레이저 초점 안팎에서 확산되는 형광표시 생체 분자에 의해 방출되는 강도 변동의 통계적 분석이다(도1A). 결과 자동 또는 상호 상관 함수는 곡선 피팅에 의해 더 분석하여 결국 이자율 상수를 도출할 수 있습니다. 즉, 통계적 방법 FCS 및 FCCS는 단일 입자 추적과 같은 단일 분자 추적을 제공하지 않지만, 높은 시간적 분해능을 가진 프로브 표본의 동적 패턴 또는 “지문”을 제공한다. Förster 공명 에너지 전달(FRET)과 결합될 때, 형태 변화와 같은 분자 내 역학은 공통의 공초점 설정5,6에서동시에 모니터링될 수 있다. FRET는 두 개의 형광의 거리를 탐사하고 종종 분자 “나노 통치자”라고합니다. 에너지 전달은 분자가 가까운 부근(< 10nm)에 있을 때만 이루어지며, 기증자의 방출 스펙트럼은 수용체 분자의 흡수 스펙트럼과 현저히 겹치며, 기증자 및 수용자의 편골 방향은 (충분히) 평행하다. 따라서 FRET와 FCCS의 조합은 매우 높은 스파티오-측두성 해상도를 가진 기술을 제공합니다. 공간 선택성, 감도 및 라이브 셀 호환성이 필요한 경우 FRET-FCCS는 이소레말 적정 열량량법(ITC)7,표면 플라스몬 공명(SPR)8,또는 단백질 역학 및 상호 작용을 측정하기 위한 핵 자기 공명(NMR)9,10과 같은 다른 방법에 비해 명백히 유리하다.
이중색 형광 교차 상관 분광법(dc-FCCS)의 기능과 약속에도 불구하고, 라이브 셀에서 DC-FCCS를 수행하는 것은 채널3,4 사이의 스펙트럼 출혈 또는 크로스토크로 인해 기술적으로 도전적이며, 관상구별 레이저 라인3,4,11,배경 신호 및 노이즈 또는 제한된 사진 시료의 반사적 변화 또는 노면 또는12의제한된 광시로 인한 공초점 볼륨의 차이 13,14,15. FCCS에 펄스 인터리브 된 여기 (PIE)의 도입은채널(16)사이의 스펙트럼 크로스토크를 줄이기위한 다른 레이저 여기를 일시적으로 분리하는 중요한 조정이었다. 스펙트럼 출혈을 통해17,18,19 및 배경 보정에 대응하는 다른 보정 방법도 잘 받아 들여왔다17,18,19. FCS, PIE 또는 FRET에 대한 세부 사항 및 기본사항에 대해 독자는 다음 참조2,4,6,16,20, 21,22,23,24를참조한다.
여기서, 모든 필요한 교정 실험 및 분석은 프로토타입 G 단백질 결합 수용체의 실험 결과와 함께, β 2-아드레너기수용체(β2AR)를 제시한다: (1) 단일 표지 분자는 “녹색”(eGFP) 또는 “빨강”(SNAP 태그 기반 라벨링)25 플루오포를 운반한다. (2) N 단말 SNAP 태그및 세포 내 eGFP(NT-SNAP)를 운반하는 이중 표지 된 구조 (이 경우, 두 라벨모두 동일한 단백질에 있습니다. 따라서 100% 공동 확산이 예상됩니다]; (3) 두 형광이 세포막의 동일한 측면에 있는 이중 표지된 샘플(CT-SNAP). C 단말 SNAP 태그와 세포 내 eGFP를 전달합니다. 여기서, 다시 두 라벨은 다시 100% 공동 확산이 예상되는 동일한 단백질에 있습니다. 두 라벨모두 세포막의 같은 면에서 서로 매우 가깝기 때문에 FRET 및 항상관 적 행동을 관찰 할 수있는 잠재력을 보여줍니다. 모든 구조물은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 전염되었고, 나중에 CT-SNAP 구조에 대한 NT-SNAP 구조 및 멤브레인 투과성막에 대해 막을 침투할 수 없는 적색 형광기판으로 표지되었다. 마지막으로, 시뮬레이션된 데이터는 FRET 유도 된 항상관에 대한 실험 파라미터의 영향과 단백질 단백질 상호 작용이 공동 확산 진폭에 미치는 영향을 예시합니다.
따라서, 이 프로토콜은 기술/물리적 유물, 도전 및 가능한 해결책을 인식하면서 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 이해하기 위하여 살아있는 세포에 결합된 FRET-FCCS를 능력을 발휘하는 완전한 가이드를 제공합니다.
GPCRs에 있는 FCS 기술은 살아있는 세포 안쪽에 수용체의 이동성 그리고 상호 작용이 평가될 수 있습니다41. FRET-FCS 기술의 장점은 이동성과 함께 GPCR의 형성 역학을 조사 할 수 있다는 것입니다. 그러나, 살아있는 세포에서 FRET-FCS를 수행하는 것은 도전적이고 이해의 형광 표지 단백질, 잘 보정된 설정 및 데이터를 분석하기 위하여 좋은 파이프라인의 낮은 (또는 최대 온건한) 발현을 표시하는 세포를 요구합니다. 여기서, 먼저 샘플 제제 및 실험 절차의 임계점은 생물학적, 분광및 기술적 관점에 대해 논의된다.
중요한 실험 단계에는 배경 및 자동 불발(광범위하게 세척된 커버립 및 페놀-레드 프리 미디어를 사용하여), 경질 조건의 최적화(예: 플라스미드 DNA 및 트랜스페션 후 시간)를 최소화하여 낮은 발현 수준과 효율적인 라벨링을 달성하는 것이 포함됩니다. 물론 라벨이 부착된 단백질의 기능이 방해받지 않도록 하는 것도 중요합니다. 따라서, 라이브 셀 실험에서, 라벨링 전략 및 라벨 위치에 대한 결정은 종종 유연한 N-또는 C-종자(42)및43에부착된 형광 단백질 또는 SNAP/CLIP 태그에 찬성하여 이루어진다. 유기 형광소로 라벨링에 대한 반응성 측면 체인과 부자연스러운 아미노산을 삽입하는 것과 같은 대체 라벨링 전략은 지난 몇 년 동안44년에등장하고있다.
이중 색 PIE-FCS의 경우, 관심있는 두 분자의 상호 작용만을 조사해야하며, 형광은 다양한 확립 된 형광 단백질 또는 SNAP /CLIP 기판에서 선택 될 수 있습니다. 여기서, 분광법 현명한 목표는 작은 크로스토크 또는 직접 수락자 여기가 발생하는 쌍을 선택하는 것입니다. 또한, 선택된 형광은 포토스터블이어야 하며 선택한 실험 조건 하에서 표백을 거의 또는 전혀 표시하지 않아야 합니다. (1) 세포로부터의 자동 형광 배경이 감소되고 (2) 흥분광이 더 긴 파장의 경우, 따라서 더 적은광독성(14)으로적색 스펙트럼 범위에서 형광을 선택하는 것이 좋습니다. 레이저 전력이 단계적으로 증가하고 분자 밝기가 관찰되는 이른바 “파워 시리즈”를 먼저 수행하여 광표백을 최소화할 수 있습니다. 최적의 흥분 강도 범위는결과(45)의선형 범위에 있습니다.
두 라벨이 FRET를 통해 단백질 형성 역학에 대해서도 보고해야 하는 경우 사용 가능한 형광의 선택이 더 제한됩니다. 여기서, 두 형광호 사이의 가능한 최소/최대 거리는 예를 들어, 사용 가능한 구조 또는 분자 크기에 기초하여 미리 추정되어야 하며, 합리적인 Förster 반경 R0으로 선택된 형광쌍은 FRET가 실제로20을발생할 수 있도록 한다.
여기서, eGFP와 SNAP 태그는 라벨링을 위해 선택되었고, SNAP 태그는 세포내 또는 멤브레인 불투과성 표면 기판으로 레이블이 지정되었습니다. 스펙트럼은 도2C-D에표시된 것과 유사합니다. 이러한 형광의 조합은 eGFP의 높은 교차토크를 프롬프트 타임 윈도우에서 녹색 여기에 의한 SNAP 기판의 적색 검출 채널 및 직접 수락자 여기를 나타내며 프롬프트 타임 윈도우의 빨간색 채널에서 중요한 “거짓”신호를 초래한다. 이상적으로, 두 값, 크로스 토크 및 직접 수락자 여기, 5 %5,6,38을초과해서는 안됩니다. 그러나 Förster 반경이 57Å인 경우 담금질된 eGFP 수명(보충 주 5)에서 평가할 수 있는 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 구조에서 라벨 사이의 거리를 조사하는 것이 이상적입니다.
기술적으로, 어떤 형광 분광 실험에 관해서는, 장치는 잘 정렬되어야하며 적절한 흥분 소스, 방출 필터 및 민감한 검출기를 보유해야합니다. μs 시간 척도에서 검출기의 검출기를 피하려면 각 색상의 적어도 두 개의 검출기가 존재해야 하며, 이는 상호 상관관계가 있을 수 있습니다. 현대의 시간 상관 단일 광자 카운팅 전자에서, NS 시간 범위에서 검출 카드의 데드 타임은 독립적 인 라우팅 채널로 인해 거의 역할을하지 않지만, 관심의 시간 범위가 하위 μs / ns 시간 범위에 있는 경우 Müller et al 16에 의해 제안 된 바와 같이 확인 될 수 있습니다. 또한, ps 범위에서 더 높은 시간 해상도를 위해, 각 검출 채널은 두 배가되어야하며, 즉 색상당 4 개의검출기를 사용해야하며, 검출기를 데드 타임2,15,29,46을우회합니다. 평균 형광 수명은 비편광 검출을 사용하여 추정될 수 있지만, 형광 사이의 거리(~분포)의 분석을 위해 방출은 편광에 의존하여 수집되어야 한다. 이는 FRET의 에너지 전달 효율이 두 형광의 방향에 의존하기 때문입니다. 자세한 내용은 여기에서 찾을 수 있습니다20,28,47. 마지막으로, PIE 실험에서, 프롬프트와 지연 펄스 사이의 거리가 중요하며 형광의 형광 강도가 크게 부패하도록 선택되어야한다(도 1B). 일반적인 규칙은 2개의 펄스를 5배 떨어져 둘 것입니다, 즉 형광 수명을 가진 eGFP의 경우 2.5ns의 거리는 최소22에서12.5 ns이어야 한다.
실험 절차에 대한 모든 고려 사항을 자세히 고려한 후 데이터와 분석이 보다 자세하게 설명됩니다. 프로토콜 섹션에서 언급했듯이 교정 측정의 분석을 포함하여 매일 설정의 정렬을 확인해야 합니다. 도 2A-C에도시된 데이터는 예를 들어,8-40 μs 범위에서 추가 이완 성분을 나타낸다. 녹색 교정 형광의 전형적인 삼중 깜박이는 2-10 μs 범위13,15,48에서발생하는 것으로 알려져 있다. DNA 샘플의 모든 곡선에 필요한 느린 이완성분(도 3C)실제 트리플깜박임에 대해 너무 느리고, 형광구(39)와의 DNA의 상호작용으로부터 유래할 수 있다. 그러나 이 구성 요소는 CCFPIE에서예상되지 않으며 대부분 잔여 크로스토크에서 비롯될 가능성이 높습니다. 따라서, 하루의 정렬의 품질을 판단하기 위해 세포 실험을 진행하기 전에 교정 샘플의 분석을 직접 수행하는 것이 매우 바람직하다.
공초점 중첩 볼륨의 적절한 보정은 녹색 과 빨간색 라벨의 100 % 공동 확산샘플이 필요합니다. 여기서, 형광 표지된 이중 좌초 DNA가 사용됩니다. 두 DNA 가닥은 서로 필요한 거리에서 원하는 형광을 갖도록 맞춤화될 수 있다. 설계 된 가닥은 높은 수율로 어닐 수 있습니다. 그러나, 좋은 실험실 사례는 아가로즈 젤 전기포진에 의한 DNA 가닥의 무결성 및 라벨링 정도를 확인하고 흡수 스펙트럼을 측정하는 것이 좋습니다. 또한, 이중 가닥 어셈블리의 수율은 이 보정 측정이 빨간색 라벨과 녹색의 100% 공동 확산이 있다는 가정에 비판적으로 의존하기 때문에 확인되어야 한다. 가정이 유효하지 않은 경우 수정 요소를16,22로적용해야 할 수 있습니다. 도 2 및 도 3에도시된 교정 측정에서, 녹색 및 빨간색 채널에서 1.4 fL 및 1.9fL의 검출 부피를 각각 획득하였다. 이 크기 차이는 거의 회절 제한 흥분 볼륨(보충 주 2)와설정에 대한 예상된다. 이 조건하에서, 여기 부피의 크기는 흥분 파장을 가진 비늘. 이것은 차례로 도 3B에서관찰된 상이한 상관 관계 진폭을 설명합니다. 파생 보정 인자 rGR = 0.56 및 rRG = 0.72 이 크기 불일치 및 두 개의 여기 볼륨3,4의잠재적 비완벽한 중첩에 대해 올바른.
도 4, 도5, 도 6,및 도 7은 형성 단백질 역학을 이해하기 위한 PIE-F(C)CS 기반 연구의 워크플로우를 선보이고 있다. 먼저, 2개의 단일 라벨구조는 β2개의AR-IL3-eGFP 및 NT-SNAP-β2AR이 각각의 다른 플루오로포어(도4)가없는 상태에서 세포내형불소류 특성을 특성화하는 대조군역할을 한다. 다음으로, 이중 표지된 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP는 세포 외부를 향한 SNAP 태그를 탑재하고 세포질 측에 eGFP를 탑재하여 “100% 공동 확산” 제어(도5)의역할을 한다. 마지막 구조인Β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP은 세포질 측에 형광을 모두 운반하고 FRET를 받을 수 있을 만큼 충분히 가까이 있습니다. 여기서도, 다시 100% 공동 확산은 프롬프트 타임 윈도우에서 녹색 및 빨간색 채널 신호의 항 상관 성 강도 변동과 함께 예상될 것이다, 즉, 기증자 여기 후, FRET 효율에 영향을 미치는 단백질 역학으로 인해 FRET 효율31,32,33. 이 역학은 CCFFRET(그림 6-7)에서상관 관계 반대로 나타날 수 있습니다.
모든 GPCR β2AR 구문은 세포막에 바이모달 확산을 나타낸다(도4A). 반면 β2AR-IL3-eGFP는 예상 트리플깜박임(도5B)13,15,NT-SNAP-β2AR만을 나타내며, 추가적인 느린 휴식 시간(도5C-D)을나타낸다. tR2가 언바운드 SNAP 기판에서 비롯될 수 있습니다. 이는 수성 용액에서 사용된 SNAP 기판의 확산 및 광물리적 특성을 측정함으로써 추가 실험, 예를 들어 추가 실험에 의해 해명될 수 있다. 참고로, 확산과 휴식 시간을 구별하는 간단한 실험은 공초점 설정의 핀홀을 변경하는 것입니다, 즉, 효과적인 볼륨을 증가: 확산 시간이 증가하면서 유효 볼륨이 증가하면서, 이완 용어는 변경되지 않습니다13. 적합성 결과에 기초하여 형광 단백질(FP)의 농도를 결정할 때, 일반적으로 FPs가 성숙 과정을 거치며, 마침내 염색체가 형성되는12. 이 성숙 시간은 지역 화학 환경에 의존하는 광물리학 이외에 FP에 FP로 다를 수있습니다(13,15). 따라서 FCS에 의해 보고된 샘플에 존재하는 실제 단백질 농도는 일반적으로 과소 평가되며, 비형광 FPs의 분획이 실험에서 결정될 수 있는 경우 교정될 수 있다. 마지막으로, 대부분의 형광이 환경에 민감하게 반응하기 때문에, 대부분의 형광이 환경에 민감반응하기 때문에, 필요한 경우, α 및 δ 대한 값을 수정하기 위해 살아있는 세포에서 형광 스펙트럼을 확인하는 것이 좋습니다13,15,48. 빼기 배경은 비형감염 된 세포에서 수집 된 신호에 의해 결정됩니다. 또한, 각각의 다른 컬러 채널과 CCFPIE의 자가상관은 거짓 신호를 식별할 수 있도록 검사되어야 한다(보충참고 4 – 그림 30).
형광이 멤브레인의 다른 측면에 위치한 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP(도5D)의두 측정은 다른 날에 획득되었으며 시간 해결된 단일 분자 형광에서 통계의 중요성을 보여줍니다. 여기서, 상이한 결과는 라벨링의 다른 정도 때문일 수 있다: 한 셀에서 상대적으로 낮은 잡음(도5B)을초래한 측정의 높은 정도에서, 다른 셀에서, 단 2개의 측정만 수집될 수있었다(그림 5A). 충분한 양의 데이터를 수집하는 것 외에도 결과를 적시에 평가하고 라벨링 전략을 최적화하는 것이 중요합니다. 실험을 설계할 때 FRET는 민감하지만 최대 10nm 및 “블라인드”로 제한된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 우리의 경우,이 “실명”은 변경되지 않은 eGFP 형광 수명 (보충 주 5)에 의해 표시됩니다. β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 구조(도6A)에서FRET는 담금질된 eGFP 수명(보충 주 5)에서 정확히 파악할 수 있다. 그러나, 어떤 항상관 용어가 관찰되지않음(도 6B)은FRET가 변동하지 않거나 확산 시간보다 한 번에 더 느리다는 것을 의미한다. ACFgp,ACF rp,ACF rd 및 CCFFRET(그림 6C)에는최대 3개의 추가 이완 조건이 필요합니다. ACFrp, ACFrd 및 CCFFRET의 느린 구성 요소는 수용자 표백 때문일 수 있으며, 물론 이러한 곡선에서 발견되는 느린 확산의 얻은 값에 영향을 미칩니다 (ACFgp의117 ms에 비해 ~ 350 ms). 빨간색 채널의 tD는 크기가 다르기 때문에 녹색 채널(그림2)보다약간 크어야 하지만 크기 차이에 필적하는 요인에 의해서만 가능합니다. 3 μs의 매우 빠른 휴식 시간은형광13,15,48의삼중 깜박임을 반영하는 반면, 37 μs의 느린 휴식 시간은 FRET 때문일 수 있습니다: 마찬가지로 FRET는 CCFFRET에서항상관을 유도함에 따라, 양성 상관관계는31,32,33에서예상된다. CCFFRET에서 “긍정적”으로이 용어의 존재와 ACFRD에서의 존재는 높은 크로스 토크로 설명 될 수 있으며 더 해명해야합니다. CCFPIE는 예상대로 짧은 상관 관계 시간에 평평합니다.
한편, 관심 체계에서 FRET가 발생하면 상관 곡선6에비선형 효과가 초래된다는 점에 유의해야 한다. 분자 밝기 예를 들어, 분자의 저울은 상관 진폭 제곱및 각 FRET-상태(및 활성 수용체가 없는 항상 존재하는 분자)로 확장되어 다른 분자 밝기를 나타낸다. 실제로 FRET는 검출된 녹색 분자의 명백한 농도(즉, ACFgp 진폭증가)를 감소시키고 적색 분자(적색 프롬프트에서 결정)의 수가 과대평가된다 5. 두 효과 모두 CCFFRET 및 CCFPIE에서파생된 상호 작용의 양에 영향을 미칩니다. 그러나, 칼모둘린(31)또는32 또는 구문신(33)의 분자 내역학에 대해 예를 들어, 전 세계적으로 분석되면 단백질 역학을 나타낼 수 있다. 신중하게 보정될 때, 평균 FRET 효율은 상대 CCFPIE 및 ACF진폭(22)으로부터추출될 수 있고, 반면 제한 상태는 기증자 형광 수명분포(33)의분석으로부터 결정될 수 있다.
eGFP와 같은 대형 형광을 가진 살아있는 세포 실험에서 FRET 대비가 도 6에 표시된 시뮬레이션에 대해 가정보다 훨씬 낮을 가능성이 있으며, 시뮬레이션에 수용자의 직접적인 흥분이 추가되지 않았다는 사실을 고려할 때, 살아있는 세포 실험에서 의 반상관의 식별이 매우 어려운 이유를 설명할 수 있다. 유망한 분석 대안은 시간 상관 단일 광자 계수 데이터 수집29,30으로인해 광자 도착 시간 히스토그램(도1B)에인코딩된 정보를 수확하는 데의존한다. 시료 내부의 2종(또는 FRET) 종(또는 FRET)종(도 7A)또는 가중치의 형광 수명(~패턴)이 공지되는 경우(도 7B) 또는 가중치가 상관 과정 동안 적용될 수있다(도 7B)17,18,19. 따라서 얻은 상관 관계 곡선은 검출 채널의 상관 관계를 더 이상 나타내지 않고 오히려 두 개의 서로 다른 (FRET) 종 사이의 자동 또는 교차 상관관계를 나타내지 않으므로 종-ACF (sACF) 또는 종-CCF (sCCF)로 이름이 바뀝니다. 적당한 FRET 대비를 가진 시뮬레이션된 데이터에 이 접근 방식을 적용하면, 높은 크로스토크 및 삼중 깜박임은 반상관 용어(도7C-D)를회복한다. 그러나, 휴식 시간을 얻을 수 있지만 진폭과의 관계는18손실된다는 점에 유의해야합니다. 이러한 접근법은 이전에 살아있는 세포 실험에서 적용되어길항제(49)와 EGFR의 상호 작용을 연구하거나 eGFP 변이체에 부착된 단백질과 형광을 분리하여 매우 짧고 긴 형광 수명50을가진 것으로 나타났습니다.
정제된 단백질의 PIE 기반 FRET 측정은 주로 단백질 역학 을 연구하는 데 사용되지만3622,살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용을 이해하는 데 중점을 둡니다. 이러한 접근법은효모(51)에서 MAP 키나아제 활성의 조절을 연구하거나 최근 기사에서 요약된 세포성 결합 파트너와막 단백질의 상호 작용을 해결하기 위해 적용되었다52. 여기서, 녹색 형광의 중요한 크로스토크가 여전히 프롬프트 시간 창에서 녹색 채널또는 빨간색 신호의 지연 시간 창에 존재할 때 합병증이 발생할 수 있다. 전자는 녹색 펄스에 대하여 적색 펄스의 불충분 한 지연에 의해 발생할 수 있습니다 두 효과 선택 된 형광의 너무 강하게 겹치는 흥분 및 방출 스펙트럼에서 유래 하는 동안. 특히 매우 짧은 형광 수명을 가진 자가 형광이 또 다른 복잡한요인(22)이될 수 있는 세포에서, 특히 거짓 양성 CCFPIE 진폭에 대해 각각의 단일 표지된 구조를 주의 깊게 확인하고 올바른 지확인하는 것이 좋습니다.
결론적으로, 여기에서 기술된 FRET-FCS 접근은 거의 생리적인 농도에 살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 이해하는 중대한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에서, 살아있는 세포 측정 중에 수행해야 할 필요한 교정 측정 및 필요한 정량 적 분석에 초점을 맞추어졌다. 이를 위해 다양한 라이브 셀 측정이 시뮬레이션으로 보완된 것으로 나타났습니다. 시뮬레이션은 매개 변수가 각 데이터의 특정 이동성 및 광물리적 특성을 설명하는 맞춤형 맞춤 모델로 체계적으로 다양할 수 있기 때문에 여기에서 일반적인 이해를 제공합니다. 이 분석은 광범위한 단계별 프로토콜과 적응하기 쉬운 템플릿을 갖춘 오픈 소스 소프트웨어 도구로 수행되었습니다. 마지막으로, 기술 발전, 따라서 데이터 분석을위한 오픈 소스 소프트웨어의 확산과 함께 즉시 구매 할 수있는 안정적인 PIE-FCS 시스템의 가용성은 결국 높은 감도라이브 셀에서 단백질 상호 작용과 역학을 해명하기 위해 더 큰 연구 커뮤니티에 대한이 기술을 점점 더 쉽게 접근 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 도이치 포르충스게마인샤프트(SFB/TR 240, 프로젝트 번호 374031971, 프로젝트 INF)에서 J.B. 및 K.G.H.에 의해 지원되었다.
루돌프 버차우 센터의 재무 지원 및 기술 지원을 위한 핵심 유닛 형광 이미징에 감사드립니다. 또한, 우리는 철저한 증거 독서애쉬윈 발라크리슈난감사합니다.
1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
Biorender (Software) | Science Suite Inc – o/a BioRender (Toronto, Canada) | — | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | — | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | — | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 – 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | — | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | — | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 – 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |