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双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

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DOI：

10.3791/62954

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2021年12月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。

摘要

我们提出了一种结合荧光共振能量转移（FRET）的活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）实验方案与工作流程，利用现代荧光标记技术研究活细胞中膜受体的动力学行为。在双色FCCS中，荧光强度的波动反映了分子的动态过程 "指纹" 通过检测相应荧光生物分子的共扩散或受体结合情况。FRET 因其对分子间距离的高度敏感性，是一种广为人知的 "纳米标尺" 以监测分子内变化。综上所述，构象变化以及局部受体浓度和迁移率常数等关键参数可在细胞环境中被检测。

由于细胞中噪声水平较高且样本易受损伤，定量荧光方法在细胞中的应用具有挑战性。本文展示了如何开展该实验，包括使用双色标记进行校准的步骤 β2-肾上腺素能受体（β2AR）用 eGFP 和 SNAP-tag-TAMRA 标记。提供了一套使用开源软件和模板的逐步数据分析流程，易于定制。

我们的指南使研究人员能够解析活细胞中生物分子的分子相互作用 原位 尽管活细胞实验中的信噪比较低，仍具有高可靠性。FRET尤其是FCCS在低浓度下的工作窗口允许在接近生理条件下进行定量分析。

引言

荧光光谱法是定量研究蛋白质动态和蛋白质-蛋白质相互作用的主要方法之一，可在细胞环境中以最小干扰实现检测。共聚焦荧光相关光谱法（FCS）是一种强大的分子动力学分析方法，具有单分子灵敏度高、选择性强以及适用于活细胞等优点1。与其他以动力学为导向的 方法相比，FCS可测量的时间范围更广，从约纳秒（ns）到约 秒（s），尤其覆盖了基于成像的方法通常难以触及的快速时间尺度。此外，FCS还具备空间选择性，可轻松区分细胞膜、细胞质和细胞核内的分子动力学行为2。因此，利用FCS可对分子闪烁、局部平均浓度以及扩散系数进行定量分析。在双色检测模式下，通过荧光互相关光谱法（FCCS）分析两种分子物种的共扩散行为，可便捷地研究分子间动力学过程，例如分子结合事件3,4,5。

相关光谱学的基本原理是对荧光标记的生物分子在激光焦点内扩散进出时所产生的强度波动进行统计分析（图1A）。由此得到的自相关或互相关函数可通过曲线拟合进一步分析，最终获得感兴趣的动力学速率常数。换言之，FCS和FCCS这类统计方法并不像单颗粒追踪那样提供单个分子的运动轨迹，而是以高时间分辨率揭示被测样品的动态模式或"指纹"。当与 Förster 共振能量转移（FRET）结合时，可在共聚焦显微镜系统中同时监测分子内动力学过程，例如构象变化5,6。FRET 可探测两个荧光团之间的距离，常被称为分子"纳米尺"。能量转移仅在以下条件下发生：分子间距离非常接近（< 10 nm）、供体的发射光谱与受体分子的吸收光谱有显著重叠，且供体与受体的偶极取向（足够）平行。因此，FRET 与 FCCS 的结合提供了一种具有极高时空分辨率的技术。当需要空间选择性、高灵敏度以及活细胞兼容性时，FRET-FCCS 在测量蛋白质动力学与相互作用方面明显优于等温滴定 calorimetry（ITC）7、表面等离子体共振（SPR）8 或核磁共振（NMR）9,10 等其他方法。

尽管双色荧光互相关光谱技术（dc-FCCS）具有强大的功能和广阔的应用前景，但由于检测通道之间存在光谱渗漏或串扰3,4、不同激光谱线导致共焦体积差异3,4,11、背景信号、样品的噪声或光稳定性有限12,13,14,15等因素，使得在活细胞中实施dc-FCCS在技术上仍具挑战性。将脉冲交错激发（PIE）引入FCCS是一项重要的改进，通过在时间上分离不同激光激发，有效降低通道间的光谱串扰16。此外，针对光谱渗漏17,18,19和背景信号的其他校正方法也已被广泛接受17,18,19。有关FCS、PIE或FRET的详细内容及基本原理，读者可参考以下文献2,4,6,16,20,21,22,23,24。

此处，提供了所有必要的校准实验与分析，以及一种原型G蛋白偶联受体β2-肾上腺素能受体（β2AR），针对三种不同情景的结果如下：（1）单标记分子，携带 either a "绿色" （eGFP）或一个 "红色" （基于SNAP标签的标记）25 荧光团；（2）双标记构建体，其带有N端SNAP标签和细胞内eGFP（NT-SNAP）［在此情况下，两个标记位于同一蛋白质上，因此预期共扩散率为100%］ 以及（3）双标记样本，其中两种荧光团位于细胞膜的同一侧（CT-SNAP），该样本带有C端SNAP标签和细胞内eGFP。此处两种标记仍位于同一蛋白上，预期同样具有100%的共扩散。由于两种标记彼此非常接近，且位于细胞膜的同一侧，因此具备观察到FRET及反相关行为的潜力。所有构建体均转染至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，并随后用一种膜非通透性的红色荧光底物进行标记，该底物适用于NT-SNAP构建体 膜通透性适用于CT-SNAP构建体。最后，模拟数据展示了实验参数对FRET诱导的反相关性的影响，以及蛋白质-蛋白质相互作用对共扩散幅度的影响。

因此，本方案提供了在活细胞中进行FRET-FCCS联用实验的完整指南，旨在研究蛋白质动态及蛋白质-蛋白质相互作用，同时阐明可能存在的技术/物理伪影、面临的挑战以及相应的解决方案。

方案

1. 实验方案

  1. 样品制备
    注意：细胞接种和转染操作需在无菌条件下进行。
    1. 将一块清洁的盖玻片放入每孔中，置于6孔培养板内，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
      注意：盖玻片清洁方案详见补充说明1。
    2. 向每孔加入2 mL含酚红的完全细胞培养基（补充10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL青霉素和100 µg/mL链霉素），并将培养板暂置一旁。
    3. 在含酚红的相同培养基中，于37 °C和5% CO2条件下培养CHO细胞。用5 mL PBS洗涤细胞以去除死细胞。
    4. 加入2 mL胰蛋白酶，在室温（RT）下孵育2分钟。
    5. 用含酚红的8 mL培养基稀释已脱落的细胞，并通过移液小心混匀。
    6. 在Neubauer计数板中计数细胞，并以1.5 × 105 个细胞/孔的密度接种至含盖玻片的6孔细胞培养板中（按步骤1.1.1–1.1.2准备）。
    7. 将细胞置于培养箱（37 °C，5% CO2）中培养24小时，使其达到约80%汇合度。
    8. 将2 µg目标载体DNA（例如CT-SNAP或NT-SNAP）和6 µL转染试剂分别加入两个独立的离心管中，每管加入500 µL低血清培养基（对应每孔），于室温（RT）孵育5分钟。
    9. 将两种溶液混合，得到转染混合物，并于室温（RT）孵育20分钟。
    10. 在此期间，用无菌PBS洗涤已接种的CHO细胞一次。
    11. 用不含抗生素的、补充10% FBS的无酚红培养基替换PBS，每孔加入1 mL。
    12. 将全部1 mL转染混合物逐滴加入每孔中，并在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育细胞。
    13. 为标记SNAP构建体，将适当的SNAP底物储备液稀释于1 mL补充10% FBS的培养基中，使终浓度为1 µM。
    14. 用PBS洗涤转染后的细胞一次，每孔加入1 mL 1 µM SNAP底物溶液。在37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。
    15. 用无酚红培养基洗涤细胞三次，每孔加入2 mL无酚红培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。
    16. 将所有样品的盖玻片依次转移至成像室，用500 µL成像缓冲液洗涤。在转移至FRET-FCS系统前，加入500 µL成像缓冲液。
  2. 校准测量
    注意：FRET-FCS系统配备共聚焦显微镜水镜、两条激光线、时间相关单光子计数（TCSPC）系统、两个混合型光电倍增管（PMT）和两个雪崩光电二极管（APD）用于光子采集，以及数据采集软件。每次活细胞测量前必须对系统进行校准，这一点至关重要。系统详细描述见补充说明2。测量过程中，两条激光器及所有探测器（两个PMT和两个APD）始终开启，以确保所有测量在相同条件下进行。进行校准测量时，使用与细胞接种所用盖玻片同一批次的盖玻片，以减少环形校正的变异。
    1. 为调节焦平面、针孔和环形位置，将2 nM绿色校准溶液置于玻璃盖玻片上，开启485 nm和560 nm激光器。激光器以脉冲交错激发（PIE）模式运行16。
    2. 对准溶液焦点，并调节针孔和环形位置，以获得最高计数率和最小共焦体积，从而实现最大分子亮度。
    3. 对10 nM红色校准溶液以及绿色与红色校准溶液的混合液，重复上述过程用于红色通道。
    4. 将10 nM DNA溶液置于玻璃盖玻片上，调节焦点、针孔和环形位置，使绿色与红色检测通道之间的互相关达到最高，即显示最高振幅。
      注意：步骤1.2.1和1.2.4可能需要反复交替进行，以找到最佳校准状态。在绿色和红色检测通道及共焦重叠体积的焦点、针孔和环形位置优化后，对每种校准溶液进行3–5次、每次30 s–120 s的测量。
    5. 分别对ddH2O、成像培养基和未转染细胞各测量3–5次，每次30 s–120 s，以确定背景计数率。
    6. 采集仪器响应函数，进行3–5次、每次30 s–120 s的测量。此步骤为可选，但强烈建议执行。
  3. 活细胞测量
    1. 通过汞灯照明并经目镜观察，寻找合适的细胞。
      注意：合适的细胞应为存活状态，表现出相应贴壁细胞系的典型形态。目标蛋白（此处为表面受体）的荧光在整个细胞表面可见。由于FCS检测中分子数量较少时对比度更佳，因此荧光较弱的细胞比强荧光细胞更合适。
    2. 开启两条激光器（PIE模式），通过观察每秒最大计数率对细胞膜进行聚焦。
      注意：细胞样品的激光功率可能需要降低（物镜处小于5 µW），具体取决于所用荧光团和系统配置。
    3. 在数据采集软件的在线预览中观察eGFP或标记的SNAP-tag（连接至β2AR）的自相关和互相关曲线，采集多个短时测量（约2–10次），每次采集时间为60–180秒。
      注意：避免长时间连续激发细胞，以防荧光团漂白。但具体测量时长和总测量次数取决于每个细胞的亮度。

2. 数据分析

  1. 数据导出
    1. 导出相关曲线，G(tc），以及所有测量的计数率（CR）。
    2. 注意正确定义“prompt”和“delay”时间窗口，并在数据相关软件中使用“microtime gating”选项。
      注意：总共需要进行三种不同的相关性分析：（1）绿光通道在提示时间窗口内的自相关ACFgp)，（2）延迟时间窗口内红色通道的自相关（ACFrd)，最后（3）将绿色通道在即时时间窗口内的信号与红色通道在延迟时间窗口内的信号进行互相关分析（CCFPIE）。数据导出在不同软件中的操作步骤将逐步展示 补充说明 3.
  2. 校准测量
    1. 使用绿色的自相关函数（ACFgp）和红色（ACFrd荧光染料溶液，并根据需要将其拟合到包含额外三重态项的三维扩散模型（公式1），以校准两个所用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小：
      Fluorescence correlation spectroscopy equation, diagram for data analysis in molecular studies. 公式 1
      此处， b 是曲线的基线， N 焦点中的分子数量， tD 扩散时间（单位：ms），以及 s = z0/w0 共聚焦体积单元的形状因子。三重态闪烁或其他光物理过程由其幅值描述 aR 弛豫时间 tR.
      注意：本方案中使用的所有变量和符号均列于表1中。
    2. 使用已知的扩散系数 D 绿色26 红色校准标准27 以及获得的形状因子 s绿色 和 s红色 以确定尺寸（宽度 w0 和高度 z0）和体积 Veff 共聚焦体积单元（公式 2a-c）。
      Static equilibrium equation, \(w_0^2 = 4t_DD\), formula related to mechanical stability analysis.     eq. 2a
      z₀ = sw₀ formula, mathematical equation, symbols, algebraic representation     eq. 2b
      Equation for effective volume \(V_{\text{eff}} = \pi^{3/2} z_0 w_0^2\), optical analysis.     eq. 2c
      注意：校准参数计算的模板作为补充文件提供（S7）。
    3. 计算光谱串扰 α 绿色荧光信号（在通道0和2中采集）渗入红色检测通道（通道1和3）的背景校正后信号（BG）的比值（公式3）。
      Equation for alpha calculation using color ratios in image analysis methodology.
      公式 3
    4. 确定受体荧光团的直接激发 δ 通过“prompt”时间窗口（绿色激光激发）与“delay”时间窗口（红色激光激发）中经背景校正的红色校准测量计数率之比，除以供体激发波长（公式4）。
      Transient absorption formula, δ=(CR analysis)*100%; optical studies equation for data calculation.
      eq. 4
    5. 计算分子亮度 B 基于背景校正后的计数速率以及测得的聚焦分子数量，对绿色和红色荧光团（eq. 5a-b）进行定量分析。 N，来自三维扩散拟合（公式 1）：
      Mathematical formula for B_green, calculation in statistical analysis, educational research context.     eq. 5a
      Equation of biochemical ratio for colorimetric analysis, showing B_red calculation formula.     eq. 5b
    6. 安装两者 ACFgp 和 ACFrd 以及 CCFPIE 将双标记DNA的实验数据拟合到三维扩散模型（公式1）。保留所获得的形状因子， s绿色 和 s红色，恒定的 ACFgp 和 ACFrd，分别。该形状因子对于 CCFPIE，sPIE, 通常介于这两个值之间。
      注意：在理想设置中，两者均 Veff,绿色 和 Veff，红色 将具有相同的大小并完全重叠。
    7. 确定零相关时间处的幅度， G0(tc），根据测得的焦点中表观分子数（N绿色, N红色 和 NPIE).
    8. 计算振幅比 rGR 和 rRG 对于绿色和红色荧光探针完全共扩散的样品（公式6）。请注意 NPIE 不反映焦点中双标记分子的数量，而仅反映1/G0(tc).
      Equation: \( r_{GR} = \frac{G_{0, CCF}(t_c)}{G_{0, ACFqp}(t_c)} \); statistical analysis concept.  和  Static equilibrium formula, \( \gamma_{RG} = \frac{G_{0,CCF}(t_c)}{G_{0,ACF_{rd}}(t_c)} \), equation.     公式 6
  3. 活细胞实验
    1. 对于单标记构建体，将细胞样本拟合到适当的模型中。对于所示的膜受体，扩散表现为双模态形式，具有短扩散时间和长扩散时间。此外，还需考虑荧光团的光物理特性和闪烁行为：
      2D autocorrelation function formula for fluorescence correlation spectroscopy analysis. 公式 7
      此处， td1 和 td2 是所需的两个扩散时间，以及 a1 是第一次扩散时间的分数。
      注意：与校准测量中游离染料和DNA链在各个方向自由扩散不同，膜受体仅沿细胞膜进行二维扩散。这种三维与二维扩散的差异体现在修正后的扩散项中（见公式1），其中 tD 在二维情况下，不依赖于形状因子 s 共聚焦体积单元
    2. 计算浓度 c 绿色或红色标记蛋白分别来自 N 和 Veff 使用基础数学（公式 8）：
      Concentration formula C=N/(VeffNA), chemical analysis calculation, equation for molarity.     eq. 8
      其中 NA 阿伏伽德罗常数
    3. 对于N端SNAP标记和细胞内eGFP，拟合两个自相关曲线（ACFgp 和 ACFrd使用与单标记构建体相同的模型对双标记样品的ACF（公式7）进行拟合 CCFPIE 使用双峰扩散模型（公式 9）：
      2D correlation function formula, displaying static equilibrium and data fitting in spectroscopy analysis.      公式 9
      注意：为了对系统进行全局描述，必须同时拟合所有三条曲线：三条曲线的扩散项相同，唯一区别在于弛豫项 CCFPIE由于两种荧光团的光物理过程通常互不相关，因此无需引入关联项。这种弛豫项的缺失导致了平坦的 CCFPIE 在较短的关联时间内。然而，由于供体荧光团引起的受体串扰和直接激发可能导致假阳性信号强度，应通过校准测量仔细检查。
    4. 计算浓度 c 绿色或红色标记蛋白的 N 和 Veff 使用公式8。
    5. 估算组分或浓度， cGR 或 cRG，利用从DNA样本获得的校正因子，对细胞样本中相互作用的绿色和红色标记蛋白进行校正后的振幅比值 rGR 和 rRG 细胞样品及其各自获得的浓度（公式10）。
      Chromatic adaptation equation cGR=rGR·cgreen for colorimetry analysis and calibration. 和 Equation illustrating color transformation; formula: c_RG = γ_RG × c_red.     公式 10
    6. 对于C端SNAP标签和细胞内eGFP，拟合两个自相关曲线（ACFgp 和 ACFrdFRET 样品的浓度与单标记样品相同（公式 7），并且 CCFFRET 到一个包含反相关项的双峰扩散模型（方程 11）
      2D cross-correlation equation for data analysis, diagram illustrating symbol G_CCF,2D(t_c). eq. 11
      其中 af 反映总反相关性的幅度 aR 和 tR 相应的振幅和弛豫时间。
      注意：由于FRET导致荧光变化呈反相关时，可能需要一个或多个反相关项（公式11），从而产生一个“凹陷” CCFFRET 在相关时间较短时，伴随两个自相关函数的上升ACFgp 和 腺瘤性结肠息肉病灶rd然而，需要注意的是，三重态闪烁等光物理效应可能会通过抑制FRET诱导的反相关项而掩盖该信号。结合使用滤波FCS方法的联合分析可能有助于揭示反相关项。此外，应排除由计数电子设备在纳秒量级死时间引起的技术伪影16. 在ChiSurf中执行该分析的更详细逐步操作流程28 共聚焦体积或分子亮度计算的模板可在 Github 代码库（https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS）及补充文件中获取补充说明 4 和 补充说明 6此外，用于批量导出使用 Symphotime 软件获取的 .ptu 格式数据的 Python 脚本也可在该处找到。

结果

下文将讨论校准和活细胞测量的典型结果。此外，通过模拟数据展示了FRET对交叉相关曲线的影响，以及蛋白质-蛋白质相互作用对CCFPIE幅度的增强作用。

基于PIE的FCS数据导出
在PIE实验中，数据以时间标记时间分辨模式（TTTR）进行采集29,30。图1B展示了在所述装置上对一条双标记DNA链进行PIE测量所获得的光子到达时间直方图（补充说明1）。该装置具有四个检测通道。荧光发射首先按偏振方向分为“S”和“P”两个方向（分别对应光波电场振荡的垂直和平面方向）。随后，每个偏振方向再被分为两个颜色通道（绿色、红色），最终形成四个检测通道（S-绿色、S-红色、P-绿色、P-红色）。在“即时”时间窗口内，绿色荧光团被激发，由于FRET效应，信号可在绿色和红色通道中同时检测到；而在延迟时间窗口内，仅红色荧光团（在红色通道）可见。根据检测通道以及“即时”与“延迟”时间窗口的不同，至少可以获得五种不同的关联曲线（3条自关联曲线（ACFs）和2条互关联曲线（CCFs））（图1C-D）：（1）即时时间窗口中的绿色信号（ACFgp）；（2）即时时间窗口中的红色信号（在发生FRET时，ACFrp）；以及（3）延迟时间窗口中的红色信号（ACFrd）。这些ACF反映了蛋白质的扩散行为、光物理特性（例如三重态闪烁）以及其他与时间相关的荧光团亮度变化（例如由FRET引起的变化）。（4）基于PIE的互关联曲线CCFPIE，即即时时间窗口中的绿色信号与延迟时间窗口中的红色信号之间的互关联，可用于确定绿色与红色荧光团共扩散的比例16。（5）基于FRET的互关联曲线CCFFRET，即即时时间窗口中绿色信号与红色信号之间的互关联，反映了由FRET引起的绿色与红色信号之间反相关联的亮度变化31,32,33。

共聚焦装置示意图，包含FRET分析、强度与相关性图谱以及激发-发射研究。
图1：基于脉冲交错激发（PIE）的荧光（交叉）相关光谱（F(C)CS）。（A）在FCS中，荧光标记的分子在由聚焦激光束形成的（衍射极限）焦点体积内自由进出，激光在该微小体积内诱导产生荧光。分子进出该体积所引起的荧光强度涨落被进行相关分析，从而提供有关分子运动性的信息。（B）在PIE中，使用两条不同的激光线（“即时”和“延迟”）激发标记有两种不同荧光团（“绿色”和“红色”）的样品。两次激发脉冲之间的时间差被调节至与相应荧光团的荧光寿命相匹配，使得一种荧光团在另一种被激发前已基本衰减。在所示的双标记样品中，两个荧光团足够接近，可发生从“绿色”供体荧光团到“红色”受体荧光团的福斯特共振能量转移（FRET）。因此，在激发绿色供体时，可在“即时”时间窗口内检测到红色荧光发射。在所用装置中（补充说明2），每种颜色使用两个探测器，一个方向平行于激发光束方向（标记为“p”），另一个方向垂直（标记为“s”）。（C）在PIE实验中可测定三种不同的自相关函数：i）即时时间窗口中绿色通道信号的自相关函数（ACFgp）；ii）即时时间窗口中红色通道信号的自相关函数（ACFrp）；以及iii）延迟时间窗口中红色通道信号的自相关函数（ACFrd）。（D）可测定两种不同的交叉相关函数：iv）“PIE”交叉相关（CCFPIE），即即时时间窗口中的绿色通道信号与延迟时间窗口中的红色通道信号之间的相关，该曲线的幅度与荧光团的共扩散有关；以及v）“FRET”交叉相关（CCFFRET），即即时时间窗口中绿色通道信号与同一即时窗口中红色通道信号之间的相关；此处，在快于扩散的时间尺度上，该曲线的形状与FRET引起的强度变化相关。请点击此处查看该图的放大版本。

校准
图2A-B 分别展示了单扩散绿色和红色荧光染料的校准测量结果。根据使用公式1进行拟合的结果，以及已知的扩散系数 Dgreen26 和 Dred27，利用公式2a-c计算出检测体积的形状（z0 和 w0）和大小（Veff）。来自绿色荧光染料的 ACFgp 和来自红色荧光染料的 ACFrd 的拟合结果汇总于图2C。两种荧光染料分别显示出额外的弛豫时间常数，为8.6 µs（18%）和36 µs（15%）。绿色和红色荧光染料的分子亮度（公式5a-b）分别为每分子12.5 kHz和每分子2.7 kHz。

为了可靠地估算共聚焦体积的大小和形状以及分子亮度，建议每次校准实验进行3至5次测量，并对所有重复实验数据进行联合（或全局）拟合。

该荧光团对的串扰系数 α（图 2D，公式 3）以及绿色激光对受体的直接激发 δ（图 2E，公式 4）分别约为 15% 和 38%。

Fluorescence correlation spectroscopy data and spectral analysis; correlation amplitude graphs; normalized signal spectra; imaging results.
图2：游离扩散的绿色和红色校准标准品的校准测量。 (A-B代表性60秒测量结果，来自2 nM绿色（A）和10 nM红色（B) 包含附加弛豫时间的三维扩散模型拟合的校准标准测量eq. 1）。面板（C) 显示了拟合结果及基于此得出的参数 eq. 2a-c 和 方程 5a-b扩散系数取自文献。26,27. (D绿色信号在红色通道中的串扰系数α的测定公式 3）。绿色标准品的激发光谱以青色表示，发射光谱以绿色表示。485 nm（蓝色）和561 nm（橙色）的激发激光线以虚线表示。透明的绿色和品红色框表示采集的发射光范围（补充说明 2). (E) 485 nm 激光对红色荧光团直接激发的参数 δ 的测定（公式 4）。颜色编码与（D），浅橙色和深橙色分别表示红色标准品的激发光谱和发射光谱。 请点击此处以查看此图的放大版本。

为了确定并校准绿色和红色激发体积的重叠区域，使用双标记的DNA双链（图3A），如上所述。此处，荧光染料之间的间距为40个碱基对（bp），使得连接在DNA双链两端的绿色和红色荧光染料之间不会发生FRET。图3B显示了来自两种荧光染料的自相关曲线：绿色代表绿色荧光染料的自相关（ACFgp），品红色代表红色荧光染料的自相关（ACFrd），以及以青色显示的PIE交叉相关曲线CCFPIE。请注意，在CCFPIE中，绿色通道在即时时间窗口内的信号与红色通道在延迟时间窗口内的信号进行相关计算16。

此处获得 DNA 链的平均扩散系数为 DDNA = 77 µm²/s。有关该计算的更多细节，请参见分步实验方案中的补充说明 4。该数值是通过将校准后的绿色和红色检测体积大小（图 2）以及 DNA 链的 ACFgp 和 ACFrd 对应的扩散时间（图 3C）代入公式 2a 得到的。接下来，利用所获得的校正系数 rGR 和 rRG，并结合后续的公式 6，可从细胞样品中确定共扩散的量，即双标记分子（或在共转染两种不同蛋白质情况下的蛋白质复合物）的数量。

DNA荧光相关光谱示意图；图表与数据表；蛋白质相互作用分析。
图3：利用DNA样品校准绿色与红色重叠体积。（A）用于校准的DNA链携带一个绿色和一个红色校准荧光团，两者之间相距40个碱基对（bp）。染料间的距离必须足够大，以排除荧光团之间的FRET效应。（B）10 nM DNA溶液的代表性60秒测量结果。绿色（ACFgp，绿色标准）和品红色（ACFrd，红色标准）分别为两个荧光团的自相关曲线，蓝色为PIE互相关曲线CCFPIE。图（C）中的表格显示了基于包含额外弛豫项的三维扩散模型（公式1）拟合的结果，以及由此得出的DNA扩散系数DDNA（公式2a）、重叠体积的大小与形状（公式2a-c）和校正比值rGR与rRG（公式6）。请注意，绿色和红色检测体积的数值（标有*）取自图2中单个荧光团拟合的结果。请点击此处查看该图的放大版本。

活细胞实验
下文展示了针对不同β2AR构建体的活细胞实验分析。由于β2AR是一种膜蛋白，其扩散主要局限于细胞膜上的二维扩散（图4A），除非涉及向膜内运输或从膜回收的过程2。由于限制在二维扩散，公式1中的形状因子s = z0/w0不再适用，从而得到简化的扩散模型（公式9）。

单标记构建体：β2AR-IL3-eGFP 和 NT-SNAP-β2AR
图4展示了单标记构建体 β2AR-IL3-eGFP（图4B）的代表性测量结果，其中 eGFP 插入到细胞内环3（intracellular loop 3），以及构建体 NT-SNAP-β2AR（图4C），其中 SNAP 标签连接在 β2AR 的N端。SNAP 标签使用一种细胞膜非通透性的 SNAP 表面底物进行标记。代表性曲线显示了4–6次重复测量的平均值，每次采集时间为120–200秒。eGFP 和 SNAP 信号对应的自相关函数 ACFgp 和 ACFrd 均拟合至双峰二维扩散模型（公式9）。在快速动力学方面，eGFP 仅表现出在 tR1 ~ 9 µs 处预期的三重态闪烁，而 SNAP 信号则需要两个弛豫时间：一个位于典型的三重态闪烁时间 tR1 ~ 5 µs，另一个位于 tR2 ~ 180 µs。

在给定的激发条件下，活细胞中荧光团的分子亮度为每分子 0.8 KHz（eGFP）和 1.7 kHz（SNAP）（公式 5a-b）。标记的 β2AR 构建体在细胞膜中的浓度应处于纳摩尔（nM）范围，可通过分子平均数量（公式 9，图 4C）以及绿色和红色通道共聚焦体积的大小（图 2）结合公式 8 计算得出。

二维膜扩散、蛋白质相关性图、参数表、荧光分析。
图 4：单标记构建体的代表性测量结果。（A）本研究中以膜受体 β2AR 为例。与用于校准的可自由在检测体积中扩散的荧光团和DNA链不同，膜蛋白主要沿膜进行侧向扩散，即二维扩散。（B、D）单标记构建体 β2AR-IL3-eGFP（B）和 NT-SNAP-β2AR（D）的 ACFgp 和 ACFrd。图中显示的是每次测量持续 120 - 200 秒，共 4 - 6 次测量的平均值。面板（C）中的表格列出了将数据拟合至包含额外弛豫项的双峰二维扩散模型的结果（公式 7）。请点击此处查看该图的放大版本。

双标记构建体：NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
在双标记构建体 NT-SNAP-β 中2AR-IL3-eGFP（短NT-SNAP），eGFP插入至细胞内环3，SNAP标签连接于β的N末端2AR（雄激素受体）图 5A）。在此构型中，eGFP 位于膜内侧，SNAP 位于膜外侧，二者距离过远，无法产生 FRET。理想情况下，该构建体应显示绿色与红色荧光团 100% 的共扩散，且无 FRET 信号。 图5B- D 显示了在两个不同测量日对两个细胞的NT-SNAP进行的两次测量。拟合 ACFgp 和 ACFrd “更好”测量结果的展示 图5B 与公式7及 CCFPIE 利用公式9，可揭示焦点处有50-60个分子 ACFgp 和 ACFrd而 N应用程序，因此为 1/G0(tc）约 114 用于 CCFPIE (图5C）。标记受体的浓度约为100 nM，由公式8确定。为确定双标记分子的平均浓度，首先计算G0(tc)（由1/表示N（应用）) 的 CCFPIE 到 ACFgp 和 ACFrd分别计算（公式6）。接着，这些值， rGR细胞= 0.43 和 rRGcell = 0.53 与从 DNA 测量获得的值进行比较（rGR，DNA= 0.51 且 rRG，DNA = 0.79 的测量日）。根据比例规则，一个 rGR细胞= 0.43 来自 ACFgp eGFP信号的共扩散比例反映了一部分rGR细胞/r糖皮质激素受体，DNA0.84，而在另一种情况下 ACFrd SNAP底物信号的该值为0.67。最终可根据公式10计算双标记NT-SNAP构建体的平均浓度。相比之下，在所示测量中 图 5D 在另一天的实验中，受体浓度很低且数据噪声较大，导致拟合范围仅限于约 10 µs 以内。此外，仅观察到少量共扩散现象（15 - 26%）。

NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 分析的荧光相关光谱图与数据表。
图 5：双标记 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 构建体。（A）在双标记构建体中，eGFP 插入到细胞内环 3 中，SNAP 标签连接至 β2AR 的 N 末端（NT-SNAP）。（B, D）双标记构建体两次测量的 ACFgp、ACFrd 和 CCFPIE。数据拟合至双模二维扩散模型（公式 9，CCFPIE），并包含额外的弛豫项（公式 7，ACFgp 和 ACFrd）。面板（C）中的表格显示了拟合结果以及由此导出的参数浓度（公式 8）、零相关时间时相关幅度的比值（G0(tc)）和共扩散分子的比例（公式 10）。请注意，这些测量是在不同日期进行的，因此使用了略有不同的幅度校正因子（B：rGR,DNA = 0.51 且 rRG,DNA = 0.79；D：rGR,DNA = 0.51 且 rRG,DNA = 0.56）。请点击此处查看该图的放大版本。

经历FRET的双标记结构： β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
在双标记构建体 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP（图6A），eGFP 被插入至与 NT-SNAP-β 相同的细胞内环 3 中2带有SNAP标签连接至C末端的AR-IL3-eGFP构建体。在此构建体中，两个标记物位于细胞质膜的同一侧，使得荧光团彼此靠近，从而发生FRET，表现为eGFP荧光寿命被淬灭（补充说明 5）。考虑到C末端等结构相对松散的蛋白区域具有一定的灵活性34 以及G蛋白偶联受体的至少两种不同蛋白质构象35，“高FRET”（HF）或“低FRET”（LF），由于eGFP-SNAP距离变化引起的FRET效率动态变化可通过信号的反相关项进行观测和识别 CCFFRET （橙色曲线在 图6B。已发现FRET波动呈负相关，因为受体每次只能处于一种状态，即高FRET（HF）或低FRET（LF）状态。对全部五条关联曲线进行联合（或全局）拟合（图6B) 显示约 100 ms 时约有 70% 的分子扩散较慢，其余分子的扩散时间约为 1 ms。所有自相关及 CCFFRET 显示在 37 µs 和 3 µs 处的弛豫项；这些相关性以红色信号为主（ACFrp, ACFrd 和 CCFFRET) 显示一个额外的慢速成分，约 50 ms (图6C).

在不同条件下，CCFFRET 上由 FRET 引起的变化（图 6D）通过一系列模拟展示，该模拟为一个在低频（LF）态与高频（HF）态之间波动时间为 70 µs 的两态系统。当从 LF 态切换至 HF 态时，在即时时间窗口中可观察到反相关信号的变化：绿色信号减弱，红色信号增强（反之在 HF -> LF 切换时则相反）。如果 HF-LF 切换发生的时间尺度快于扩散时间，即在分子处于焦点区域的停留时间内发生，则可通过 CCFFRET6,31,36 中的反相关性推导出该转换速率。请注意，慢于扩散时间的动态过程在 FCS 中无法被观测到。

在本演示中，假设了两种不同的FRET情况，分别显示两种状态间FRET效率的中等程度或最大程度变化。模拟使用Burbulator进行37 并考虑三重态闪烁的有无以及供体串扰到红色通道的增加程度。扩散项被建模为双峰分布，其中30%为快速扩散分子 tD1 = 1 毫秒，其余分子扩散较慢，其 tD2 = 100 毫秒。总共 107 光子在一个三维高斯形状的体积内进行模拟 w0 = 0.5 µm 和 z0 = 1.5 µm，盒尺寸为 20，且 NFCS = 0.01.

图6E-F展示了在无（实线）和有三重态闪烁（虚线）情况下，中等（图6E）和最大FRET对比度（图6F）下FRET诱导的互相关CCFFRET的模拟结果。FRET诱导的负相关在图6F中清晰可见。引入额外的三重态所产生的“阻尼”效应会降低相关幅度（图6E-F）38,39。

动态FRET示意图、相关幅度图、参数表、FRET模拟结果。
图6：显示动态FRET的双标记样品模拟。（A）在细胞内环3中插入eGFP、C末端带有SNAP标签的双标记β2AR。两个荧光团距离足够近，可发生FRET；当受体发生蛋白质动态变化时，FRET效率也会发生变化。（B）一次典型测量的自相关曲线（ACFgp、ACFrp 和 ACFrd，使用公式7拟合）和互相关曲线（CCFFRET（公式7）和 CCFPIE（公式9））。面板（C）中的表格列出了拟合结果。（D–F）为展示实验参数对预期FRET诱导的反相关项的影响，共进行了12次模拟，其中模拟了FRET效率变化程度（小或大）、供体串扰进入受体通道的不同比例（0%、1% 或 10%），以及是否存在三重态闪烁。假设两种FRET状态的平衡比例为50:50，并调整其交换速率，使获得的弛豫时间 tR = 70 µs。有关模拟的更多细节见正文。（E）中等FRET对比度且无串扰（深橙色）、1%串扰（橙色）和10%串扰（浅橙色）条件下的模拟结果CCFFRET。实线表示无三重态情况下的结果，虚线表示存在三重态的情况。（F）最大FRET对比度条件下的模拟结果CCFFRET。颜色编码与（E）相同。请点击此处查看该图的放大版本。

然而，在与实验条件最接近的模拟中（α = 10%，15% 三重态闪烁及中等 FRET 对比度，图6E 中的黄色虚线），反相关项几乎消失。图7 展示了利用光子到达时间直方图中编码的信息（即荧光寿命），通过荧光寿命相关光谱法（FLCS）17,19 或物种过滤的 FCS（fFCS）18 分析该模拟数据的结果。此处，利用已知的 HF 和 LF 物种的荧光寿命（图7A）生成权重或“滤波器”（图7B），并在相关分析过程中加以应用。在获得的物种自相关和互相关曲线（图7C-D）中，可以清晰地观察到反相关现象。

时间分辨FLIM分析；图表显示强度、滤波、相关幅度；参数表。
图7：寿命过滤FCS可用于揭示在串扰严重、三重态闪烁显著或其他光物理或实验特性掩盖了CCFFRET中FRET诱导的反相关性的样品中，基于蛋白质动力学变化的FRET效率波动。此处以图6E所示数据为例进行说明，该模拟包含10%的串扰和5%的三重态闪烁。（A）两种FRET组分（浅绿色和深绿色分别代表高FRET和低FRET）以及仪器响应函数IRF（灰色）的归一化荧光强度衰减模式。实线表示平行检测通道的结果，虚线表示垂直检测通道的结果。（B）基于（A）中所示模式生成的加权函数或“滤波器”，颜色编码与（A）相同。请注意，此处仅考虑绿色检测通道中的信号，即FRET引起的供体猝灭。（C）获得四种不同组分选择性相关曲线：低FRET态的自相关（sACFLF-LF，深绿色）和高FRET态的自相关（sACFHF-HF，浅绿色），以及低FRET态到高FRET态的交叉相关（sCCFLF-HF，深橙色）和反向交叉相关（sCCFHF-LF，橙色）。sCCF明显显示出微秒范围内的反相关性。黑色虚线表示拟合结果。sACF采用公式9拟合，sCCF采用公式11拟合。（D）面板中的表格列出了拟合结果。请点击此处查看该图的放大版本。

用于研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的PIE交叉相关幅度
最后，基于PIE的FCS在活细胞中一个常见的应用是研究两种不同蛋白质之间的相互作用。此处的读出参数是CCFPIE的幅度，更准确地说，是自相关幅度ACFgp和ACFrd相对于CCFPIE幅度的比值。为了展示共扩散程度增加对CCFPIE幅度的影响，我们基于两种单标记构建体β2AR-IL3-eGFP和NT-SNAP-β2AR进行了模拟（图8A）。图8B显示了当共扩散分子比例从0%增加到100%时，CCFPIE幅度的变化情况。请注意，在延迟时间窗口中，已加入1%的绿色信号串扰至红色通道，其余扩散组分的建模方式如上所述。

蛋白质相互作用分析的共转染示意图及相关振幅图。
图 8：CCFPIE 可用于研究两种蛋白质之间的相互作用。（A）此处模拟了 β2AR-IL3-eGFP 与 NT-SNAP-β2AR（携带“红色”SNAP 标签）的共转染实验。（B）随着共扩散分子比例的增加（0%（深蓝色）>100%（浅蓝色）），相关振幅 G(tc) 随之升高。扩散项再次建模为双峰分布，其中 30% 的分子快速扩散，tD1 = 1 ms，其余分子缓慢扩散，tD2 = 100 ms。此外，还加入了 1% 的绿色信号串扰至红色延迟时间窗口。请点击此处查看该图的放大版本。

符号含义（常用单位）
α绿色荧光团在绿色激发后串扰至红色检测通道的程度（%）
a1膜受体双峰扩散模型中第一扩散组分的占比
af反相关项的总振幅
aR光物理过程/三重态闪烁的振幅
b相关曲线的基线/偏移量
B荧光团的分子亮度（每分子每秒千计数）
BG背景信号（例如来自适当对照样品：ddH₂O、缓冲液、未转染细胞等）
c浓度
CR计数率（kHz 或每秒（千）计数）
δ绿色激发后红色荧光团的直接激发程度（%）
D扩散系数（µm²/s）
G(tc)相关函数
N焦点中的分子数量
NA阿伏伽德罗常数（6.022×1023 mol−1）
rGR, rRG绿色或红色自相关函数与基于PIE的互相关函数的振幅比值
s共聚焦体积元的形状因子
tc相关时间（通常以毫秒为单位）
tD扩散时间（通常以毫秒或微秒为单位）
tR光物理过程的弛豫时间（通常以微秒为单位）
tT三重态闪烁的弛豫时间（通常以微秒为单位）
w0共聚焦体积元的半高宽（µm）
z0共聚焦体积元的半高高（µm）

表1：变量与缩写列表。 关于荧光和FRET实验中符号的使用与定义，建议参考FRET研究社区的指南40。

补充文件：

补充说明1_盖玻片清洗.docx 请点击此处下载该文件。

SuppNote2_Confocal Setup.docx 请点击此处下载此文件。

SuppNote3_Data export.docx 请点击此处下载该文件。

使用 ChiSurf 进行 FCCS 校准分析的补充说明4.docx 请点击此处下载该文件。

SuppNote5_荧光寿命直方图.docx 请点击此处下载该文件。

S6_Scripts.zip 请点击此处下载此文件。

S7_Excel_templates.zip 请点击此处下载此文件。

讨论

在活细胞中，FCS 技术可用于评估 G 蛋白偶联受体（GPCR）的受体运动性及其相互作用41。FRET-FCS 技术的优势在于，除了研究受体的运动性外，还可探究 GPCR 的构象动态。然而，在活细胞中实施 FRET-FCS 实验具有挑战性，需要满足以下条件：目标荧光标记蛋白的表达水平较低（或最多为中等水平）、实验装置经过良好校准，以及具备高效的数据分析流程。本文首先从生物学、光谱学和技术角度，讨论了样品制备和实验操作中的关键要点。

关键的实验步骤包括尽量减少背景信号和自发荧光（通过使用经过充分清洗的盖玻片和酚红-free培养基）、优化转染条件（例如质粒DNA用量及转染后时间），以实现低表达水平和高效标记。当然，确保标记蛋白的功能未受影响也至关重要。因此，在活细胞实验中，标记策略和标记位点的选择通常倾向于将荧光蛋白或SNAP/CLIP标签连接至蛋白灵活的N端或C端42，43。近年来，一些替代性标记策略也逐渐出现，例如插入带有可反应侧链的非天然氨基酸，用于与有机荧光染料进行标记44。

对于双色 PIE-FCS 实验，当仅需研究两种目标分子之间的相互作用时，荧光染料可从多种成熟的荧光蛋白或 SNAP/CLIP 底物中进行选择。从光谱学角度出发，应选择一对荧光染料，使其产生尽可能少的串扰或直接受体激发。此外，所选荧光染料应具备良好的光稳定性，在选定的实验条件下应表现出轻微或无光漂白现象。建议优先选择红色光谱范围内的荧光染料，原因如下：（1）细胞自身的自发荧光背景较低；（2）激发光波长较长，因而光毒性更小14。可通过首先进行所谓的“功率梯度实验”来最小化光漂白，即逐步增加激光功率并观察分子亮度变化。最佳激发光强度范围应位于该实验结果的线性区间内45。

如果两个荧光标签还需通过FRET报告蛋白质的构象动态，则可用荧光染料的选择将更为受限。此时，应事先根据已有结构或分子尺寸估算两个荧光染料之间可能的最小/最大距离，并选择具有合适Förster半径R0的荧光染料组合，以确保FRET能够实际发生20。

此处选择 eGFP 和 SNAP 标签用于标记，SNAP 标签使用细胞内或细胞膜不通透的表面底物进行标记。其光谱与图 2C-D所示相似。该荧光团组合在红光检测通道中表现出明显的 eGFP 串扰，以及在即时时间窗口内，绿色激发光对 SNAP 底物受体的直接激发，导致在即时时间窗口内红光通道中出现显著的“假”信号。理想情况下，串扰和受体直接激发这两个值均不应超过 5%5,6,38。然而，由于其 Förster 半径为 57 Å，非常适合用于探测 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 构建体中标签之间的距离，这一点可通过淬灭的 eGFP 寿命进行评估（补充说明 5）。

从技术上讲，与任何荧光光谱实验一样，仪器应经过良好校准，并配备合适的激发光源、发射滤光片和高灵敏度探测器。为避免探测器后脉冲引起的伪影 µ在时间尺度上，每种颜色至少应有两个检测器，以便进行互相关分析。在现代时间相关单光子计数电子系统中，由于具有独立的信号路由通道，检测卡在纳秒时间范围内的死时间几乎不起作用，但可根据Müller提出的方法进行检查。 等人 16 提供的感兴趣时间范围位于亚微秒至微秒量级µs/ns 时间范围。此外，为了在 ps 时间范围内实现更高的时间分辨率，应将每个检测通道加倍，即每种颜色使用四个检测器，以避免探测器的死时间2,15,29,46. 尽管平均荧光寿命可通过非偏振荧光检测进行估算，但在分析荧光团之间距离（~分布）时，必须收集偏振相关的发射信号。这是因为FRET中的能量转移效率依赖于两个荧光团的空间取向。更多详细信息参见此处20,28,47最后，在 PIE 实验中，激发脉冲与延迟脉冲之间的间隔至关重要，应选择合适的间隔，使得荧光团的荧光强度已基本衰减图1B）。一个通用的规则是将两个脉冲间隔设置为荧光寿命的5倍，即对于荧光寿命为2.5 ns的eGFP，最小间隔应为12.5 ns。22.

在详细阐述实验流程的所有注意事项后，接下来将更深入地讨论数据及其分析。如方案部分所述，必须每天检查仪器的准直情况，包括校准测量结果的分析。例如，图2A-C 所示数据在8-40 µs范围内显示出一个额外的弛豫组分。绿色校准荧光团典型的三重态闪烁通常出现在2-10 µs范围内13,15,48。而DNA样品所有曲线中均需引入的较慢弛豫组分（图3C），其速度远慢于实际的三重态闪烁，可能源于DNA与荧光团之间的相互作用39。然而，该组分在CCFPIE中不应出现，因此极有可能来源于残余的串扰信号。因此，强烈建议在开展细胞实验前立即分析校准样品，以评估当日仪器准直的质量。

正确的共聚焦重叠体积校准需要使用绿色和红色标记完全共扩散的样品。此处使用荧光标记的双链DNA。两条DNA链均可设计为在特定距离处带有所需的荧光团。设计好的单链可经退火形成双链，产率较高。然而，良好实验室规范建议通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA链的完整性及标记程度，并通过吸收光谱测量验证双链组装的产率，因为该校准测量的关键前提是绿色与红色标记之间存在100%的共扩散。若此前提不成立，则可能需要引入校正因子16,22。在图2和图3所示的校准测量中，绿色和红色通道的检测体积分别为1.4 fL和1.9 fL。对于接近衍射极限激发体积的光路系统，该体积差异是预期结果（补充说明2）。在此条件下，激发体积的大小与激发波长成正比，这也解释了图3B中观察到的不同关联幅度。由此得出的校正因子rGR = 0.56 和 rRG = 0.72，用于校正该体积差异以及两个激发体积之间可能存在的非完全重叠3,4。

图 4、图 5、图 6 和 图 7 展示了一项基于 PIE-F(C)CS 研究构象蛋白动态的工作流程。首先，两种单标记构建体 β2AR-IL3-eGFP 和 NT-SNAP-β2AR 作为对照，用于在无另一种荧光团存在的情况下表征细胞中荧光团的性质（图 4）。接着，双标记构建体 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 携带一个朝向细胞外侧的 SNAP 标签和一个位于胞质侧的 eGFP，作为“100% 共扩散”的对照（图 5）。最后一个构建体 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 在胞质侧同时携带两个荧光团，且彼此足够接近，可发生 FRET。在此情况下，预期会出现 100% 的共扩散，同时在绿色和红色通道的即时时间窗口中（即供体激发后）出现强度波动的反相关信号，这是由于蛋白动态影响了 FRET 效率31,32,33。这种动态可能在 CCFFRET 中表现为反相关（图 6-7）。

所有 GPCR β2AR 构建体在细胞膜上均表现出双峰扩散行为（图 4A）。β2AR-IL3-eGFP 仅显示出预期的三重闪烁现象（图 5B）13,15，而 NT-SNAP-β2AR 则额外表现出一个较慢的弛豫时间（图 5C-D）。该弛豫时间 tR2 可能源于未结合的 SNAP 底物。这一问题可通过进一步实验加以阐明，例如测量所用 SNAP 底物在水溶液中的扩散与光物理特性。值得注意的是，区分扩散时间与弛豫时间的一个直接实验方法是改变共聚焦系统的针孔尺寸，即增大有效检测体积：随着有效体积的增加，扩散时间会相应延长，而弛豫项则保持不变13。在根据拟合结果确定荧光蛋白（FP）浓度时，需注意荧光蛋白通常经历一个成熟过程，最终形成发色团12。该成熟时间因不同荧光蛋白而异，且其光物理特性还受局部化学环境的影响13,15。因此，FCS 报告的样品中实际蛋白浓度通常被低估；若实验中可确定非荧光荧光蛋白的比例，则可对此进行校正。最后，建议在活细胞中检测荧光团的光谱，必要时对 α 和 δ 的值进行校正，因为大多数荧光团对其环境高度敏感13,15,48。背景信号应通过未转染细胞中采集的信号来确定。此外，应检查相应另一颜色通道的自相关曲线以及 CCFPIE，以便识别假信号（补充说明 4 - 图 30）。

来自 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 的两次测量结果（图 5D），其中荧光团位于膜的两侧，分别在不同日期采集，体现了在时间分辨的单分子荧光研究中统计学的重要性。此处不同的结果可能源于标记程度的差异：在一个细胞中，较高的标记效率和多次测量的平均处理使得噪声相对较低（图 5B）；而在另一个细胞中，仅能采集到两次测量数据（图 5A）。除了收集足够数量的数据外，及时评估结果并可能优化标记策略也至关重要。在设计实验时，需牢记 FRET 虽然灵敏，但仅对不超过 10 nm 的距离有响应，超出此范围则“无感知”。在本例中，这种“无感知”表现为 eGFP 荧光寿命未发生改变（补充说明 5）。在 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 构建体中（图 6A），可通过 eGFP 寿命的淬灭明确检测到 FRET 的存在（补充说明 5）。然而，并未观察到反相关项（图 6B），这意味着 FRET 要么未发生波动，要么其变化时间尺度慢于扩散时间。在 ACFgp、ACFrp、ACFrd 和 CCFFRET 中，最多需要引入三个额外的弛豫项（图 6C）。ACFrp、ACFrd 和 CCFFRET 中的慢组分可能源于受体荧光团的漂白，这自然会影响这些曲线中测得的慢扩散时间值（约 350 ms，而 ACFgp 中为 117 ms）。由于共聚焦体积的差异，红色通道中的 tD 应略大于绿色通道（图 2），但差异仅与体积大小的差异相当。3 µs 的极快弛豫时间反映了荧光团的三重态闪烁行为13,15,48，而 37 µs 的较慢弛豫时间可能源于 FRET：类似于 FRET 在 CCFFRET 中引起反相关，预期在自相关曲线中会出现正相关31,32,33。该组分在 CCFFRET 中表现为“正”相关，并出现在 ACFrd 中，可能与较高的串扰有关，尚需进一步阐明。请注意，CCFPIE 在短相关时间下呈平坦状，符合预期。

另一方面，需要注意的是，所研究体系中发生FRET会导致相关曲线出现非线性效应6。例如，分子的亮度与相关幅度的平方成正比，而每种FRET状态（以及始终存在的无活性受体分子）均表现出不同的分子亮度。事实上，FRET会降低检测到的绿色分子表观浓度（即增加ACFgp幅度），同时高估红色分子的数量（由红光直接检测确定）5。这两种效应均会影响从CCFFRET和CCFPIE中推导出的相互作用程度。然而，全局分析方法——例如用于研究钙调蛋白31,32或突触融合蛋白33的分子内动力学——可以揭示蛋白质的动力学行为。在经过仔细校准后，可从相对的CCFPIE与ACF幅度中提取平均FRET效率22，而极限状态则可通过供体荧光寿命分布的分析来确定33。

考虑到在使用eGFP等大荧光团的活细胞实验中，FRET对比度可能比图6所示模拟中的假设值更低，且模拟中未加入受体的直接激发，这或许可以解释为何在活细胞实验中识别反相关信号极具挑战性。一种有前景的分析替代方法依赖于利用时间相关单光子计数数据采集所获得的光子到达时间直方图（图1B）中编码的信息29,30。如果样品内两种（或多种）（FRET）组分的荧光寿命（~模式）已知（图7A），则可在相关分析过程中应用相应的“滤波器”或权重（图7B）17,18,19。由此获得的相关曲线不再代表检测通道之间的自相关或互相关，而是代表两种不同（FRET）组分之间的自相关或互相关，因此被重新命名为组分自相关函数（sACF）或组分互相关函数（sCCF）。将该方法应用于具有中等FRET对比度、高串扰和三重态闪烁的模拟数据时，能够恢复出反相关项（图7C-D）。然而需要注意的是，虽然可以获得弛豫时间，但其与振幅之间的关系已丢失18。该方法此前已在活细胞实验中应用，例如用于研究EGFR与其拮抗剂之间的相互作用49，或用于区分与具有异常短和长荧光寿命eGFP变体结合的蛋白质所发出的荧光50。

尽管基于PIE的FRET测量已广泛用于研究纯化蛋白质的动态特性36 22，但在活细胞中，该方法主要用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该技术已被应用于研究酵母中MAP激酶活性的调控51，或解析膜蛋白与其胞质结合伴侣之间的相互作用，如近期一篇综述文章所总结52。在此过程中，若绿色荧光团在红色通道的延迟时间窗口内仍存在显著串扰，或红色信号在绿色通道的即时时间窗口内出现，则可能引发问题。前者可能是由于红色脉冲相对于绿色脉冲的延迟不足所致，而这两种效应均源于所选荧光团的激发和发射光谱重叠度过高。建议仔细检查相应的单标记构建体，并校正假阳性CCFPIE幅度，尤其是在细胞中，具有极短荧光寿命的自发荧光可能成为另一个复杂因素22。

总之，本文所述的FRET-FCS方法在接近生理浓度条件下研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学方面具有巨大潜力。本方案重点介绍了活细胞测量过程中所需的校准步骤以及必要的定量分析。为此，展示了多种活细胞测量结果，并结合了模拟分析。通过可系统调节参数的定制化拟合模型来描述特定数据的运动特性及光物理性质，模拟有助于深入理解实验现象。分析过程采用开源软件工具，并配有详尽的分步操作指南和易于调整的模板。最终，随着技术进步，即即插即用型PIE-FCS系统的商品化供应，以及开源数据分析软件的普及，该技术将日益为更广泛的研究群体所采用，从而以最高灵敏度揭示活细胞中蛋白质相互作用与动力学行为。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目由德国研究基金会（SFB/TR 240，项目编号 374031971，项目 INF）资助，资助对象为 J. B. 和 K.G.H.。

感谢鲁道夫·菲尔肖中心提供的经费支持以及荧光成像核心单元提供的技术支持。此外，感谢 Ashwin Balakrishnan 对本文的仔细校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× 4f 配置望远镜，包含五片透镜Qioptiq，雷尔，英国G063126000光学
2x 带通滤光片 BrightlineAHF, Tü德国宾根HC 525/50 和 HC 600/52筛选
2x 二向色分光镜AHF, Tü德国比ingenHC BS F38-573筛选
Nunc 6孔培养板Thermo Scientific（美国瓦尔瑟姆）140675试剂
Alexa Fluor 488 NHS 酯（绿色校准标准）Invitrogen，Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）A20000试剂
Alexa Fluor 568 NHS 酯（红色校准标准）Invitrogen，Life Technologies（Carlsbad，美国）A20003试剂
ASI载物台PZ-2000 XYZVisitron Systems GmbH，Puchheim，德国WK-XYB-PZ-IX71显微镜部件
Attofluor细胞培养皿，35 mm直径，用于  25 mm圆形盖玻片Invitrogen，Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）A7816玻璃盖玻片夹持器
雪崩光电二极管 Perkin Elmer（SPCM-AQR-14）Laser Components GmbH，Olching，德国SPCM-AQR-14单光子计数探测器
分光镜纽波特，达姆施塔特，德国10FC16PB.3筛选
BioRender（软件）Science Suite Inc - o/a BioRender（多伦多，加拿大）---用于创建 GPCR 示意图的软件，https://app.biorender.com/
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系ATCCCCL-61细胞系
ChiSurf（数据分析软件）Thomas-Otavio Peulen，美国加利福尼亚大学旧金山分校生物工程与治疗科学系---基于 tttrlib 的软件，用于分析荧光相关数据和荧光衰减直方图，https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
教程：https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&&；t=2秒
参考文献：Peulen 等. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
氯仿Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）472476-2.5L试剂
DMSOAppliChem GmbH（德国达姆施塔特）A3672,0250试剂
DNA链（40 bp荧光团间距）IBA Lifesciences GmbH (Gö德国哥廷根---试剂，5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
杜尔贝科’改良型伊格尔培养基：营养混合物 F12（含酚红与不含酚红）GIBCO，Life Technologies（Carlsbad，美国）P04-41250, P04-41650试剂
乙醇（纯）Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）34852-1L-M试剂
赤藓红B，染料含量 >=95 %Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）200964-5G试剂、仪器响应函数，用乙醇溶解至 10 mg/mL
胎牛血清（FBS）Biochrom  （德国柏林）S 0615试剂
荧光光源 X-Cite 120 QExcelitas Technologies，加拿大安大略省XI120-Q-5060显微镜部件
荧光 SNAP-底物细胞：SNAP Cell TMR-STARNew England BioLabs（德国美因河畔法兰克福）S9105S试剂
荧光 SNAP-底物表面：DY-549德国法兰克福美因河畔新英格兰生物实验室（New England BioLabs）S9112S试剂
玻璃盖玻片（尺寸：直径 24 mm，厚度 0.13 - 0.16 mm）马里恩费尔德-苏佩里奥（劳达-科önigshofen，德国111640试剂
激光控制器Picoquant，德国柏林910020（PDL 828-S） "SEPIA II")光学
激光线（480 nm 和 560 nm）Picoquant，德国柏林912485 (LDH-D-C-485)，912561 (LDH-D-TA-560)光学
Lipofectamine 2000Invitrogen，Life Technologies（美国卡尔尔斯巴德）11668-019试剂
MFD suite（软件）AG Seidel，德国杜塞尔多夫海因里希-海涅大学---用于单分子荧光实验分析的软件包，包括例如 Kristine（tttr 数据相关性分析）、Burbulator（单分子实验模拟），https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-packagе-for-mfd-fcs-and-mfis
消色差双胶合透镜，增透膜：400-700 nm，焦距 f=150 mm，直径 D=25.4 mmThorlabs，德国贝尔格基兴AC254-150-A-ML扩束器的第二部分
血细胞计数板（深度 0.1 mm）Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, 德国640110试剂
奥林巴斯 IX 71 显微镜平台Olympus，德国汉堡IX2-ILL100显微镜部件
Opti-MEM（减血清培养基）GIBCO，Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）31985-047试剂
青霉素/链霉素Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）049M4857V试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）GIBCO，Life Technologies（美国卡尔兹巴德）14190144试剂
针孔（50 µM)德国达姆施塔特纽波特PNH-50针孔
PMT Hybrid-40Picoquant，德国柏林932200（PMA Hybrid 40）单光子计数探测器
Python 脚本（软件）Katherina Hemmen，德国维尔茨堡大学整合与转化影像鲁道夫-菲尔肖中心---基于 tttrlib（https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib）编写的一系列 Python 自定义脚本，用于（1）确定平均计数率，（2）对数据进行关联分析，以及（3）构建荧光衰减直方图，https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
四通道二向色镜（zt405/473-488/561/640 rpc 相位 r uf1）AHF, Tü德国宾根F73-421PH筛选
单模光纤偏振保持，数值孔径 = 0.08，带准直器Picoquant，德国柏林02126光学
氢氧化钠（NaOH）卡尔·罗斯特（德国卡尔斯鲁厄）6771.1试剂
SymPhotime x64 软件（数据采集与数据导出软件）Picoquant，德国柏林931073（SPT64-1+2 单用户）在自主搭建的FCCS系统上进行时间标记时间分辨（tttr）数据采集，数据导出
时间相关单光子计数（TCSPC）系统 Hydraharp 400Picoquant，德国柏林930010（Hydraharp 400）光学
胰蛋白酶-EDTASigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）T4299-100ml试剂
未安装消色差双合透镜，增透膜：400 - 700 nm，直径=12.7 mm，焦距=-20 mmThorlabs，德国贝尔格基兴ACN127-020-A扩束器的第一部分
水浸物镜（UPlanSApo 60x/1.20 W）Olympus，德国汉堡UPLSAPO60XW目标

参考文献

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