双色荧光互相关光谱研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质动力学

荧光光谱是在细胞环境中以最小的扰动量化蛋白质动力学和蛋白质 - 蛋白质相互作用的主要方法之一。共聚焦荧光相关光谱（FCS）是分析分子动力学的强大方法之一，因为它具有单分子敏感性，高选择性和活细胞相容^性1。与其他面向动力学的方法相比，FCS具有更广泛的可测量时间范围，从~ns到~s，最重要的是涵盖了基于成像的方法通常无法访问的快速时间尺度。此外，它还提供了空间选择性，因此可以很容易地区分膜，细胞质和细胞核分子动力学^2。因此，分子闪烁，平均局部浓度和扩散系数可以用FCS定量分析。当在双色方法中探测荧光互相关光谱（FCCS）分析^3，4，5中两种分子物种的共扩散时^，诸如结合的分子间动力学变得容易获得。

相关光谱学的主要基本原理是对荧光标记的生物分子在激光焦点中扩散和扩散的强度波动进行统计分析（图1A）。然后，可以通过曲线拟合进进一步分析生成的自相关或互相关函数，以最终推导出感兴趣的速率常数。换句话说，FCS和FCCS的统计方法不像单粒子跟踪那样提供单分子迹线，而是提供具有高时间分辨率的探针标本的动态模式或"指纹"。当与Förster共振能量转移（FRET）结合使用时，可以在共同的共聚焦设置^5，6中同时监测分子内动力学^，例如构象变化。FRET探测两个荧光团的距离，通常被称为分子"纳米规则"。只有当分子靠近（<10nm）时，能量转移才会发生，供体的发射光谱与受体分子的吸收光谱显着重叠，并且供体和受体的偶极子方向（足够）平行。因此，FRET和FCCS的结合提供了一种具有非常高时空分辨率的技术。当需要空间选择性、灵敏度和活细胞相容性时，FRET-FCCS比其他方法（如等温滴定量热法^{（ITC）7、}表面等离子体共振（SPR）8或核磁共振（NMR）9、10具有明显的优势^，用于测量蛋白质动力学和相互作用。

尽管双色荧光互相关光谱（dc-FCCS）具有功能和前景，但由于通道之间的光谱渗漏或串扰，在活细胞中执行dc-FCCS在技术上具有挑战性^3，4，由于光谱不同的激光线^{3，4，11，}背景信号和样品的噪声或有限的光稳定性而导致的共聚焦体积差异^12， 13，14，15 。在FCCS中引入脉冲交错激励（PIE）是一项重要的调整，以暂时解耦不同的激光激发，以减少通道¹⁶之间的光谱串扰。其他用于对抗光谱渗漏^17、18、19和背景校正的校正方法也得到了很好的接受17、18、19。有关FCS，PIE或FRET的详细信息和基础知识，请参阅以下参考文献2，4，6，16，20，21，22，23，24。

在这里，提出了所有必要的校准实验和分析以及原型G蛋白偶联受体_{β 2-}肾上腺素能受体（β 2 AR）的实验结果，用于三种不同的情况:（1）携带"绿色"（eGFP）或"红色"（基于SNAP标签的标记）的单标记分子²⁵荧光团;（2）双标记结构，携带N端SNAP标签和细胞内eGFP（NT-SNAP）[在这种情况下，两个标签位于同一蛋白质。因此，预计100%共扩散];（3）双标记样品，其中两个荧光团位于细胞膜的同一侧（CT-SNAP）。它携带C端SNAP标签和细胞内eGFP。在这里，两个标签再次处于相同的蛋白质中，预计再次具有100%的共扩散。由于两个标记彼此非常接近，在细胞膜的同一侧，它显示出观察FRET和反相关行为的潜力。所有构建体均在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中转染，然后用红色荧光底物标记，该底物对于NT-SNAP构建体是膜不透水的，对于CT-SNAP构建体是膜通透的。最后， 仿真数据验证了实验参数对FRET诱导的反相关的影响， 以及蛋白质-蛋白质相互作用对共扩散幅度的影响.

因此，该协议为在活细胞中执行组合的FRET-FCCS提供了完整的指南，以了解蛋白质动力学和蛋白质 - 蛋白质相互作用，同时了解技术/物理伪影，挑战和可能的解决方案。

1. 实验方案

1. 样品制备
   注意:在无菌条件下进行细胞接种和转染。
   1. 将每孔清洁的盖玻片放入6孔培养板中，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。
      注:盖玻片清洁规程详见补充说明1。
   2. 向每个孔中加入2mL含有酚红的完整细胞培养基（补充10%胎牛血清（FBS），100μg/ mL青霉素和100μg/ mL链霉素），并将板放在一边。
   3. 在37°C和5%CO₂ 下将CHO细胞培养在含有酚红的同一培养基中。用5 mL PBS洗涤细胞以除去死细胞。
   4. 加入2毫升胰蛋白酶，在室温（RT）下孵育2分钟。
   5. 用8mL含有酚红的培养基稀释分离的细胞，并通过移液小心混合。
   6. 在Neubauer室中计数细胞，并在含有盖玻片的6孔细胞培养板中以1.5×10⁵ 个细胞/孔的密度接种（在步骤1.1.1-1.1.2中制备）。
   7. 让细胞在培养箱（37°C，5%CO_2）中生长24小时，以达到约80%的汇合度。
   8. 将2μg所需载体DNA（例如CT-SNAP或NT-SNAP）和6μL转染试剂稀释在两个单独的管中，每个试管中每个试管含有500μL还原血清培养基，并在室温下孵育5分钟。
   9. 将两种溶液混合在一起以获得转染混合物，并在室温下孵育20分钟。
   10. 同时，用无菌PBS洗涤接种的CHO细胞一次。
   11. 用 1 mL/孔的酚类无红培养基代替 PBS，并补充 10% FBS，不含任何抗生素。
   12. 将整个1mL转染混合物滴加到每个孔中，并在37°C下在5%CO₂中孵育细胞过夜。
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校准和活细胞测量的示例性结果将在下面讨论。此外，基于蛋白质 - 蛋白质 - 相互作用增加 CCFPIE 振幅的效应旁边的模拟数据，证明了FRET对互相关曲线的影响。

基于 PIE 的食品接触物质数据导出
在 PIE 实验中，数据以时间标记时间分辨模式 （TTTR）29，30 收集。图1B显示了在所述装置上测量双标记DNA链的PIE测量的光子到达时间直方图（补充注1）。该设置有四个检测通道。荧光发射首先通过"S"和"P"方向的偏振分裂（指光波的电场振荡的垂直和平行平面）。其次，在检测之前，将每个偏振方向分成两个颜色通道（绿色，红色），从而产生四个通道（S-绿色，S-红色，P-绿色，P-红色）。在"提示"时间窗口内，绿色荧光团被激发，并且由于FRET，信号在绿色和红色通道中被检测到。在延迟时间窗口中，只有红色荧光团（在红色通道中）可见。基于检测通道和"提示"与"延迟"时间窗口，可以获得至少五种不同的相关曲线（3条自相关曲线（ACF）和2条互相关曲线（CCF））:（1）提示时间窗口中的绿色信号（ACFgp），（2）提示时间窗口中的红色信号（在FRET，ACF rp的情况下）， 和（3）红色信号在延迟时间窗口（ACFrd）。这些ACF报告了蛋白质迁移率，光物理（例如，三重态闪烁）和荧光团中其他时间相关的亮度变化（例如，由于FRET）。（4）基于PIE的CCF PIE在提示时间窗口内的绿色信号与延迟时间窗口中的红色信号的互相关CCFPIE可以确定绿色和红色荧光团16的共扩散比例。（5）基于FRET的CCF FRET在提示时间窗口内绿色与红色信号的互相关与FRET诱导的、反相关的绿色和红色信号的亮度变化有关31、32、33。

图1:基于脉冲交错激发（PIE）的荧光（交叉）相关光谱（F（C）CS）。（A）在FCS中，荧光标记的分子自由地扩散进出（衍射极限）焦距体积，该焦点体积由聚焦激光束塑造，该激光束在此微小体积内诱导荧光。进入和离开体积的分子所产生的强度波动是相关的，并提供有关分子迁移率的信息。（B） 在PIE中，使用两条不同的激光线（"提示"和"延迟"）来激发用两种不同的荧光团（"绿色"和"红色"）标记的样品。两个激发脉冲之间的时间差适应了各自荧光团的荧光寿命，因此一个脉冲在另一个被激发之前已经衰变。在所示的双标记样品中，两个荧光团都足够接近，可以从"绿色"供体荧光团到"红色"受体荧光团进行Förster共振能量转移（FRET）。因此，在激发绿色供体时，可以在"提示"时间窗口内检测到红色荧光发射。在所使用的设置（补充注2）中，每种颜色使用两个探测器，一个平行于激发光束方向（表示"p"）和第二个垂直（表示"s"）。（C）在PIE实验中可以确定三种不同的自相关函数:i）提示时间窗口中的绿色通道信号（ACFgp），ii）提示时间窗口中的红色通道信号（ACFrp）和iii）延迟时间窗口中的红色通道信号（ACFrd）的相关性。（D）可以确定两种不同的互相关函数:iv）提示时间窗口中绿色通道信号的"PIE"互相关（CCFPIE）与延迟窗口中的红色通道信号相关，其中该曲线的幅度与荧光团的共扩散有关;和v）"FRET"互相关（CCFFRET）与提示时间窗口中的绿色通道信号与同一提示窗口中的红色通道信号相关;在这里，该曲线的形状有时比扩散快，与FRET诱导的强度变化有关。请点击此处查看此图的放大版本。

校准
图2A-B分别显示了单独扩散的绿色和红色荧光团的校准测量值。根据与等式1和已知扩散系数D绿色26和D红27的拟合，使用等式2a-c计算检测体积的形状（z 0和w0）和大小（Veff）。来自绿色荧光团的ACFgp和来自红色荧光团的ACFrd的拟合结果总结在图2C中。两种荧光团分别显示出8.6 μs（18%）和36 μs（15%）的额外弛豫时间常数。绿色和红色荧光团的分子亮度（等式5a-b）分别为每分子12.5 kHz和每分子2.7 kHz。

为了可靠地估计共聚焦体积大小和形状以及分子亮度，建议每个校准实验执行3-5次测量，并对所有重复进行联合（或全局）拟合。

对于该荧光团对，串扰α（图2D，等式3）和绿光激光δ对受体的直接激发（图2E，等式4）分别为~15%和~38%。

图2:自由扩散的绿色和红色校准标准的校准测量。（A-B）代表60 s测量2 nM绿色（A）和10 nM红色（B）校准标准测量，适合3D扩散模型，包括额外的弛豫时间（等式1）。图（C）中的表格显示了拟合结果和基于方程2a-c和等式5a-b的推导参数。*扩散系数取自文献26，27。（D） 确定串扰α绿色信号进入红色通道（等式3）。绿色标准的激励光谱以青色显示，发射光谱以绿色显示。485 nm（蓝色）和 561 nm（橙色）处的激发激光线显示为虚线。透明的绿色和洋红色框显示收集的发射范围（补充注2）。（E） 通过485 nm激光测定红色荧光团的直接激发δ（等式4）。颜色代码与（D）相同，浅橙色和深橙色分别表示红色标准的激发光谱和发射光谱。请点击此处查看此图的放大版本。

为了确定和校准绿色和红色激发体积的重叠，如上所述，使用了双标记的DNA双链（图3A）。在这里，荧光团间隔40 bp，使得附着在DNA双链末端的绿色和红色荧光团之间不会发生FRET。图3B显示了绿色荧光团（ACFgp）和洋红色（ACFrd）的自相关，以及青色的PIE互相关CCFPIE。请注意，对于CCFPIE，提示时间窗口中绿色通道中的信号与延迟时间窗口16中红色通道中的信号相关。

在这里，获得了D DNA的DNA链的平均扩散系数= 77μm² / s。有关计算的更多详细信息，请参阅分步协议，补充说明4。该值是通过将校准的绿色和红色检测体积大小（图2）以及DNA链的ACFgp和ACFrd的相应扩散时间（图3C）插入等式2a来获得的。接下来，使用获得的校正值r GR和rRG以及稍后使用等式6，可以从细胞样品中确定共扩散的量，即双标记分子（或在两种不同蛋白质共转染的情况下的蛋白质复合物）。

图3:使用DNA样品校准绿红色重叠体积（A）用于校准的DNA链携带绿色和红色校准荧光团，中间距离为40 bp。朔间距离必须足够大，以排除荧光团之间的FRET。（B） 10 nM DNA 溶液的代表性 60 秒测量。绿色荧光团（ACFgp，绿色标准）和洋红色（ACFrd，红色标准）的自相关以及蓝色的PIE交叉相关CCFPIE。图（C）中的表格显示了基于3D扩散模型的拟合结果，包括一个额外的弛豫项（等式1）和DNA的推导参数扩散系数，DDNA（等式2a），重叠体积的大小和形状（等式2a-c）以及校正比rGR和rRG（等式6）).请注意，绿色和红色检测体积（标有*）的值取自图2所示的单个荧光团的拟合。请点击此处查看此图的放大版本。

活细胞实验
在下一节中，介绍了对不同β 2AR构建体的活细胞实验的分析。由于β 2AR是膜蛋白，其扩散在很大程度上被限制在沿细胞膜的二维扩散（图4A）（除了运输或再循环过程进出膜 ）2。由于对2D扩散的限制，方程1中的形状因子 s = z0/w0 变得过时，导致简化的扩散模型（等式9）。

单标签结构:β 2个 AR-IL3-eGFP 和 NT-SNAP-β2个 AR
图4显示了单标签构建体β 2AR-IL3-eGFP的示例性测量（图4B），其中eGFP插入细胞内环路3，以及构建NT-SNAP-β 2 AR（图4C），其中SNAP标签与β 2 AR的N端偶联。SNAP标签标有膜不透水的SNAP表面基板。代表性曲线显示了4-6次重复测量的平均值，每次采集时间为120-200秒。eGFP 和 SNAP 信号的相应自相关ACFgp和ACFrd拟合到双峰二维扩散模型（等式 9）。在快速动力学方面，eGFP仅显示预期的三重态在tR1~9 μs处闪烁，而SNAP信号需要两个弛豫时间，一个在tR1~ 5 μs的典型三重态闪烁时间，另一个在tR2 ~ 180 μs处。

在给定的激发条件（等式5a-b）下，活细胞中荧光团的分子亮度为每分子0.8 KHz（eGFP）和1.7 kHz（SNAP）。掺入细胞膜中的标记β 2AR构建体的浓度应在纳米摩尔范围内，并且可以通过分子的平均数量（等式9， 图4C）和绿色和红色通道的相应共聚焦体积的大小（图2）使用方程8来确定。

图4:单标签结构的代表性测量（A）在本研究中，以膜受体β 2 AR为例。与用于校准的荧光团和DNA链相反，它们可以自由地漂浮在检测体积中，膜蛋白主要沿着膜横向扩散，称为二维扩散。（B， D）ACFgp和ACF rd的单标签结构β 2 AR-IL3-eGFP（B）和NT-SNAP-β 2AR（D）。图中显示了 4-6 次测量值的平均值，每次测量值为 120 - 200 秒。图（C）中的表格显示了数据与双峰二维扩散模型的拟合结果，包括额外的弛豫项（等式7）。请点击此处查看此图的放大版本。

双标签结构:NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
在双标记结构NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP（短NT-SNAP）中，将eGFP插入细胞内环3中，并且，SNAP标签与β 2 AR的N端偶联（图5A）。在这种配置中，eGFP位于膜的内侧，SNAP位于外侧，距离太大，无法进行FRET。在理想情况下，这种结构将显示绿色和红色荧光团的100%共扩散，并且没有FRET信号。图5B-D显示了两个不同测量日在两个单元中NT-SNAP的两次测量。将图5B所示的"更好"测量值的ACF gp和ACF rd与等式7和CCFPIE与方程9拟合，显示ACFgp和ACF rd的焦点为50-60个分子，而Napp，因此CCFPIE为1/ G0（tc）〜114（图5C).标记受体的浓度在~100 nM范围内，如等式8确定的那样。为了确定双标记分子的平均浓度，首先，计算CCFPIE的G0（tc）（由1 /N（app）表示）分别与ACFgp和ACFrd的比率（等式6）。接下来，将这些值rGRcell= 0.43 和 rRGcell = 0.53 与从 DNA 测量中获得的值（在此测量日，rGR，DNA= 0.51 和 rRG，DNA = 0.79）进行比较。使用比例法则，来自eGFP信号的ACFgp的rGRcell= 0.43反映为0.84的共扩散（rGRcell/rGR，DNA）的一部分，其中对于SNAP底物信号的ACFrd的另一种情况，该值等于0.67。双标记NT-SNAP结构的平均浓度最终可以基于等式10计算。相反，在图5D所示的测量中，来自不同日期的受体浓度相当低，数据非常嘈杂，使得拟合范围限制为〜10μs。此外，仅观察到少量的共扩散（15-26%）。

图5:双标签NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP结构。（A）在双标记结构中， eGFP 入到细胞内环 3 中， SNAP 标签连接到β 2AR （ NT - SNAP ）的 N 端。（B， D）ACFgp、ACF rd和CCFPIE的两个测量值的双标记构造。数据拟合到双峰二维扩散模型（方程9，CCF PIE），并包括额外的弛豫项（方程7，ACF gp和ACFrd）。图（C）中的表格显示了拟合结果和推导的参数浓度（等式8），零相关时间（G0（tc））与共扩散分子分数（等10）的相关幅度之比。请注意，测量是在不同的日子获得的，因此使用了略有不同的幅度校正因子（B:r GR，DNA = 0.51和rRG，DNA = 0.79;D:rGR，DNA = 0.51 和rRG，DNA = 0.56）。请点击此处查看此图的放大版本。

经历 FRET 的双标签结构:β 2个 AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
在双标记结构β 2AR - IL3 - eGFP - CT - SNAP （图 6A ）中， eGFP 入到与 NT - SNAP - β 2 AR - IL3 - eGFP 结构相同的细胞内环 3 中， SNAP 标签连接到 C 端。在这里，两个标记都位于细胞质膜的同一侧，因此荧光团靠近，因此FRET发生如淬灭的eGFP寿命所示（补充注5）。考虑到相对非结构化蛋白质区域（如C端34）和GPCRs35的至少两种不同蛋白质构象的灵活性，"高FRET"（HF）或"低FRET"（LF），由于eGFP-SNAP距离变化引起的FRET效率的动态变化可以通过CCFFRET中的反相关项进行观察和识别（图6B中的橙色曲线）).FRET波动已被证明是反相关的，因为受体一次只能处于一种状态，无论是HF还是LF。所有五条相关曲线的联合（或全局）拟合（图6B）显示约70%的缓慢扩散分子在~100 ms时，而其余分子以~1 ms扩散。所有自相关和CCFFRET在37 μs和3 μs处显示松弛项;那些以红色信号为主的相关性（ACFrp、ACF rd和CCFFRET）显示出一个额外的慢分量~50毫秒（图6C）。

FRET引起的在不同条件下CCFFRET的变化（图6D）通过一系列双态系统的模拟来证明，LF和HF状态之间的波动时间为70 μs。从低频切换到高频状态时，在提示时间窗口中观察到反相关信号的变化:绿色信号减小，红色信号增加（HF ->低频切换则相反）。如果HF-LF切换发生在比扩散时间更快的时间尺度上，换句话说，在焦点中分子停留期间，速率可以从CCFFRET6，31，36中的反相关推导出来。请注意，在FCS中无法观察到比扩散时间慢的动态过程。

在本演示中，假设了两种不同的FRET情景，表明两种状态之间FRET效率的适度或最大变化。使用Burbulator37进行模拟，并考虑不存在或存在三重态闪烁以及进入红色通道的供体串扰量增加。扩散项被建模为双峰分布，其中30%的快速扩散分子在tD1 = 1 ms时，其余分子在tD2 = 100 ms时缓慢扩散。总共在3D高斯形体积中模拟了10个7个光子，w 0 = 0.5μm，z 0 = 1.5μm，盒子尺寸为20，N FCS = 0.01。

图6E-F显示了在无（实线）和三重闪烁（虚线）的情况下，在中等（图6E）和最大FRET对比度（图6F）下，FRET诱导的互相关CCF FRET的仿真结果。FRET诱导的反相关可以很容易地在图6F中看到。增加一个额外的三重态时的"阻尼"效应降低了相关幅度（图6E-F）38，39。

图6:双标记样品的模拟，显示动态FRET.（A）双标记β 2 AR，将eGFP插入细胞内环3和C端SNAP标签。两个荧光团都足够接近以进行FRET，并且如果受体经历蛋白质动力学，则显示FRET效率的变化。（B）自相关（ACFgp，ACF rp和ACFrd，拟合方程7）和互相关曲线（CCFFRET（等式7）和CCFPIE（方程9））的示例测量。图（C）中的表格显示了拟合结果。（D-F）为了表明实验参数对预期的FRET诱导的反相关项的影响，进行了12次模拟，其中FRET效率的变化（小或大），不同量的供体串扰进入受体通道（0%，1%或10%）以及三重态闪烁的缺失和存在。假设两种FRET态的平衡分数为50:50，并且它们的汇率调整，使得获得的弛豫时间tR = 70 μs。有关模拟的更多详细信息，请参阅文本。（E）CCFFRET的仿真结果具有适度的FRET对比度，并且在没有串扰（深橙色），1%串扰（橙色）和10%串扰（浅橙色）的情况下。实线表示没有三元组的结果，虚线表示三元组存在的结果。（F） CCFFRET的仿真结果与最大FRET对比度。颜色代码与 （E） 相同。请点击此处查看此图的放大版本。

然而，在模拟中与实验条件最相似的（α=10%，15%的三重闪烁和适度的FRET对比度，图6E中的虚线黄线），反相关项几乎减弱。图7显示了使用光子到达时间直方图中编码的信息（即荧光寿命）通过荧光寿命相关光谱（FLCS）17，19或物种过滤FCS（fFCS）18分析该模拟数据的结果。在这里，已知HF和LF物种的荧光寿命（图7A）被用来产生砝码或"滤光片"（图7B），这些砝码或"滤光片"在相关过程中被应用。在得到的物种自相关曲线和互相关曲线（图7C-D）中，可以清楚地观察到反相关。

图7:终生滤波FCS可以帮助揭示基于蛋白质动力学的FRET效率波动，这些样品具有高串扰，显着的三重闪烁或其他光物理或实验特性，掩盖了 CCFFRET中FRET诱导的反相关。 在这里，该方法对于包含10%串扰和5%三重闪烁的仿真如图 6E 所示的数据的示例性显示。（A） 两种 FRET 物种（高和低 FRET 分别为浅绿色和深绿色）和 IRF（灰色）的归一化荧光强度衰变模式。平行检测通道的模式以实线显示，垂直检测通道的虚线显示。（B）加权函数或"过滤器"是根据（A）所示的图案生成的，颜色代码与（A）相同。请注意，这里只考虑绿色检测通道中的信号，因此是FRET诱导的供体淬灭。（C）获得了四种不同的物种选择性相关性:低FRET状态（sACFLF-LF，深绿色）和高FRET状态（sACFHF-HF，浅绿色）的物种自相关，以及低FRET与高FRET状态（sCCFLF-HF，深橙色）和反之亦然（sCCFHF-LF-LF）之间的两种互相关。、橙色）。sCCF清楚地显示了μs范围内的反相关。黑色虚线表示适合度。sACF与 等式9 拟合，sCCF与 等式11拟合。图（D）中的表格显示了拟合结果。 请点击此处查看此图的放大版本。

CCFPIE 振幅研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）
最后，活细胞中基于PIE的FCS的常见用例是研究两种不同蛋白质之间的相互作用。在这里，读出参数是CCFPIE的振幅，或者更准确地说是自相关振幅ACFgp和ACFrd与CCF PIE振幅的比值。为了显示增加共扩散对CCFPIE的影响，基于两个单标记结构进行了仿真，β 2 AR-IL3-eGFP和NT-SNAP-β 2 AR（图8A）。图8B显示了当共扩散分子的比例从0%变为100%时，CCFPIE的振幅如何增加。请注意，在延迟时间窗口中，绿色信号与红色通道的1%串扰被添加，扩散分量以其他方式建模，如上所示。

图8:CCFPIE可用于研究两种蛋白质的相互作用（A）这里，模拟了β 2AR-IL3-eGFP与NT-SNAP-β 2 AR（携带"红色"SNAP标签）的共转染研究。（B）对于越来越多的共扩散分子（0%（深蓝色）->100%（浅蓝色）），振幅G（tc）增加。扩散项再次建模为双峰分布，其中30%的快速扩散分子在tD1 = 1 ms时，其余分子在tD2 = 100 ms时缓慢扩散。此外，还增加了1%的绿色信号串扰进入红色延迟时间窗口。请点击此处查看此图的放大版本。

表 1:变量和缩写列表。 对于在荧光和FRET实验中使用符号和定义，建议使用FRET社区40 的指南。

补充文件:

SuppNote1_Coverslip清理.docx请单击此处下载此文件。

SuppNote2_Confocal设置.docx请单击此处下载此文件。

SuppNote3_Data导出.docx请点击这里下载此文件。

SuppNote4_FCCS使用ChiSurf进行校准分析.docx请单击此处下载此文件。

SuppNote5_Fluorescence生命周期直方图.docx请单击此处下载此文件。

S6_Scripts.zip 请单击此处下载此文件。

S7_Excel_templates.zip 请点击这里下载此文件。

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