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살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 ...

Research Article

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

DOI: 10.3791/62954

December 11, 2021

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1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging,Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

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Summary

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

Abstract

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 막 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합된 살아있는 세포 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하는 프로토콜 및 워크플로우를 제시합니다. 형광 강도의 변동이 각각의 형광 생체 분자의 동적 "지문"을 나타내는 이중 색 FCCS에서, 우리는 수용체의 공동 확산 또는 결합을 조사 할 수 있습니다. FRET는 분자 거리에 대한 높은 민감도를 가지고 있으며 분자 내 변화를 모니터링하는 잘 알려진 "나노 통치자"역할을합니다. 종합하면, 세포 설정에서 현지 수용체 농도 및 이동성 상수와 같은 형성적 변화와 주요 매개 변수가 접근할 수 있게 됩니다.

정량형 형광 접근법은 높은 소음 수준과 샘플의 취약성으로 인해 세포에서 도전적입니다. 여기서 는 eGFP 및 SNAP 태그-TAMRA로 표지된 2-adrenergic 수용체(β2AR)β 이중 색 라벨을 사용한 교정 단계를 포함하여 이 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다. 사용자 지정이 용이한 오픈 소스 소프트웨어 및 템플릿을 사용하여 단계별 데이터 분석 절차가 제공됩니다.

우리의 지침은 살아있는 세포 실험에 있는 제한된 신호-잡음 수준에도 불구하고 높은 신뢰성으로 그(것)에 있는 살아있는 세포에 있는 생체 분자의 분자 상호 작용을 해명하는 가능하게 합니다. FRET의 운영 창과 특히 낮은 농도의 FCCS는 거의 생리학적 조건에서 정량적 분석을 허용합니다.

Introduction

형광 분광법은 세포 맥락에서 최소한의 교란으로 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 정량화하는 주요 방법 중 하나입니다. 공초점 형광 상관 분광법 (FCS)은 단일 분자 민감성, 고도로 선택적 및 라이브 셀 호환1이기때문에 분자 역학을 분석하는 강력한 방법 중 하나입니다. 다른 역학 지향 접근법과 비교하여 FCS는 ~ ns에서 ~ s에 이르는 광범위한 측정 가능한 시간 범위를 가지며, 가장 중요한 것은 이미징 기반 방법으로 는 종종 접근할 수 없는 빠른 시간 척도를 포괄합니다. 더욱이, 또한 막, 세포질 및 핵 분자 역학이 쉽게 구별될 수 있도록 공간 선택성을 제공한다 2. 따라서, 분자 깜박임, 평균 국부 농도 및 확산 계수는 FCS로 정량적으로 분석될 수 있다. 결합과 같은 분자 역학은 이중 색 접근법에서 형광 간 상관 분광법(FCCS) 분석3,4,5에서 두 분자 종의 공동 확산을 프로빙할 때 쉽게 접근할 수 있게 된다.

상관 분광법의 주요 기본 원리는 레이저 초점 안팎에서 확산되는 형광표시 생체 분자에 의해 방출되는 강도 변동의 통계적 분석이다(도1A). 결과 자동 또는 상호 상관 함수는 곡선 피팅에 의해 더 분석하여 결국 이자율 상수를 도출할 수 있습니다. 즉, 통계적 방법 FCS 및 FCCS는 단일 입자 추적과 같은 단일 분자 추적을 제공하지 않지만, 높은 시간적 분해능을 가진 프로브 표본의 동적 패턴 또는 "지문"을 제공한다. Förster 공명 에너지 전달(FRET)과 결합될 때, 형태 변화와 같은 분자 내 역학은 공통의 공초점 설정5,6에서동시에 모니터링될 수 있다. FRET는 두 개의 형광의 거리를 탐사하고 종종 분자 "나노 통치자"라고합니다. 에너지 전달은 분자가 가까운 부근(< 10nm)에 있을 때만 이루어지며, 기증자의 방출 스펙트럼은 수용체 분자의 흡수 스펙트럼과 현저히 겹치며, 기증자 및 수용자의 편골 방향은 (충분히) 평행하다. 따라서 FRET와 FCCS의 조합은 매우 높은 스파티오-측두성 해상도를 가진 기술을 제공합니다. 공간 선택성, 감도 및 라이브 셀 호환성이 필요한 경우 FRET-FCCS는 이소레말 적정 열량량법(ITC)7,표면 플라스몬 공명(SPR)8,또는 단백질 역학 및 상호 작용을 측정하기 위한 핵 자기 공명(NMR)9,10과 같은 다른 방법에 비해 명백히 유리하다.

이중색 형광 교차 상관 분광법(dc-FCCS)의 기능과 약속에도 불구하고, 라이브 셀에서 DC-FCCS를 수행하는 것은 채널3,4 사이의 스펙트럼 출혈 또는 크로스토크로 인해 기술적으로 도전적이며, 관상구별 레이저 라인3,4,11,배경 신호 및 노이즈 또는 제한된 사진 시료의 반사적 변화 또는 노면 또는12의제한된 광시로 인한 공초점 볼륨의 차이 13,14,15. FCCS에 펄스 인터리브 된 여기 (PIE)의 도입은채널(16)사이의 스펙트럼 크로스토크를 줄이기위한 다른 레이저 여기를 일시적으로 분리하는 중요한 조정이었다. 스펙트럼 출혈을 통해17,18,19 및 배경 보정에 대응하는 다른 보정 방법도 잘 받아 들여왔다17,18,19. FCS, PIE 또는 FRET에 대한 세부 사항 및 기본사항에 대해 독자는 다음 참조2,4,6,16,20, 21,22,23,24를참조한다.

여기서, 모든 필요한 교정 실험 및 분석은 프로토타입 G 단백질 결합 수용체의 실험 결과와 함께, β 2-아드레너기수용체(β2AR)를 제시한다: (1) 단일 표지 분자는 "녹색"(eGFP) 또는 "빨강"(SNAP 태그 기반 라벨링)25 플루오포를 운반한다. (2) N 단말 SNAP 태그및 세포 내 eGFP(NT-SNAP)를 운반하는 이중 표지 된 구조 (이 경우, 두 라벨모두 동일한 단백질에 있습니다. 따라서 100% 공동 확산이 예상됩니다]; (3) 두 형광이 세포막의 동일한 측면에 있는 이중 표지된 샘플(CT-SNAP). C 단말 SNAP 태그와 세포 내 eGFP를 전달합니다. 여기서, 다시 두 라벨은 다시 100% 공동 확산이 예상되는 동일한 단백질에 있습니다. 두 라벨모두 세포막의 같은 면에서 서로 매우 가깝기 때문에 FRET 및 항상관 적 행동을 관찰 할 수있는 잠재력을 보여줍니다. 모든 구조물은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 전염되었고, 나중에 CT-SNAP 구조에 대한 NT-SNAP 구조 및 멤브레인 투과성막에 대해 막을 침투할 수 없는 적색 형광기판으로 표지되었다. 마지막으로, 시뮬레이션된 데이터는 FRET 유도 된 항상관에 대한 실험 파라미터의 영향과 단백질 단백질 상호 작용이 공동 확산 진폭에 미치는 영향을 예시합니다.

따라서, 이 프로토콜은 기술/물리적 유물, 도전 및 가능한 해결책을 인식하면서 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 이해하기 위하여 살아있는 세포에 결합된 FRET-FCCS를 능력을 발휘하는 완전한 가이드를 제공합니다.

Protocol

1. 실험 프로토콜

  1. 샘플 준비
    참고: 멸균 조건하에서 세포 종착 및 트랜스페션을 수행합니다.
    1. 6웰 배양판에 잘 조리된 커버슬립을 넣고 멸균 인산염 완충식식염(PBS)으로 세 번 세척합니다.
      참고: 커버슬립 클리닝 프로토콜은 보충 참고 1에자세히 설명되어 있습니다.
    2. 각 우물에 페놀 레드(10% 태아소 혈청),100 μg/mL 페니실린 및 100 μg/mL 연쇄절제술을 함유한 완전한 세포 배양 배지의 2mL를 추가하고 플레이트를 제쳐두십시오.
    3. 37°C 및 5% CO 2에서 페놀 레드를 함유하는 동일한 배지에서 CHO 세포를배양한다. 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS의 5 mL로 세포를 씻어.
    4. 트립신 2mL을 추가하고 실온 (RT)에서 2 분 동안 배양하십시오.
    5. 페놀 레드를 함유한 8mL의 배지로 분리된 세포를 희석시키고 파이펫팅으로 조심스럽게 섞는다.
    6. 노이바우어 챔버에서 세포를 카운트하고 커버립을 포함하는 6웰 세포 배양판에서1.5 x 10 5 세포의 밀도/잘 종자(1.1.1-1.1.2 단계에서 준비).
    7. 세포가 약 80%의 인플루언서(37°C, 5%CO2)에서24시간 동안 성장하게 한다.
    8. 원하는 벡터 DNA(예를 들어, CT-SNAP 또는 NT-SNAP)의 2 μg를 희석시키고 2개의 개별 튜브에서 형질 검사 시약의 6 μL을 희석하고, 각각 각 우물에 대해 500 μL의 감소된 혈청 배지를 포함하고 RT에서 5분 동안 배양한다.
    9. 두 솔루션을 함께 섞어 트랜스펙트 혼합물을 얻고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
    10. 그 동안, 멸균 PBS로 한 번 시드 CHO 세포를 세척.
    11. PBS를 항생제 없이 10% FBS로 보충한 페놀 무자유 배지의 1mL/웰로 교체하십시오.
    12. 전체 1mL의 형질 혼합물을 각 우물에 드롭와이즈로 추가하고 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 5% CO2로한다.
    13. SNAP 시공물의 라벨링에 대해, 1μM의 최종 농도를 얻기 위해 10% FBS로 보충된 매체의 1mL에 적절한 SNAP 기판 스톡 솔루션을 희석한다.
    14. PBS로 감염된 세포를 한 번 세척하고 1 μM SNAP 기판 용액의 웰 당 1 mL을 추가합니다. 5% CO2에서37°C에서 20분 동안 세포를 배양한다.
    15. 페놀 무적 배지로 세 번 씻어 내고 페놀 무첨가 배지당 2mL를 추가합니다. 5% CO2에서37°C에서 30분 동안 세포를 배양한다.
    16. 이후 모든 샘플의 커버립을 이미징 챔버로 옮기고 500 μL 이미징 버퍼로 세척합니다. FRET-FCS 설정으로 이동하기 전에 500 μL 이미징 버퍼를 추가합니다.
  2. 교정 측정
    참고: FRET-FCS 설정에는 공초점 현미경 수문 목표, 두 개의 레이저 라인, 시간 상관 단일 광자 카운팅(TCSPC) 시스템, 2개의 하이브리드 광증 튜브(PMT) 및 광자 수집 및 데이터 수집 소프트웨어를 위한 2개의 눈사태 포토다이오드(APD)가 장착되어 있습니다. 라이브 셀 측정 전에 매번 설정을 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 자세한 설정 설명은 보충 참고 2에서찾을 수 있습니다. 모든 측정은 동일한 조건에서 수행해야 하므로 레이저와 모든 검출기(PMT 2개와 APD 2개)는 항상 ON입니다. 교정 측정의 경우, 셀이 시드된 것과 동일한 로트에서 커버슬립을 사용하면 칼라 링 보정의 변동이 감소합니다.
    1. 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치를 조정하기 위해 유리 커버슬립에 2nM 그린 교정 솔루션을 배치하고 485 nm 및 560 nm 레이저를 켭니다. 펄스 인터리브 엑시션(PIE)모드(16)에서레이저를 작동시한다.
    2. 최대의 분자 밝기를 얻기 위해 가장 높은 카운트 속도와 가장 작은 공초점 볼륨을 얻을 수 있도록 용액에 초점을 맞추고 핀홀과 칼라 링 위치를 조정합니다.
    3. 10nM 적색 보정 솔루션과 녹색 및 빨간색 교정 솔루션의 혼합물로 빨간색 채널에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
    4. 10nM DNA 용액을 유리 커버슬립에 놓고 녹색과 적색 검출 채널 간의 상관관계가 가장 높은 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치를 조정하여 가장 높은 진폭을 나타낸다.
      참고: 1.2.1 단계와 1.2.4 단계는 최적의 정렬을 찾기 위해 앞뒤로 반복해야 할 수 있습니다. 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치가 녹색 및 빨간색 감지 채널 및 공초점 중첩 볼륨에 대해 최적으로 정렬된 후 30-120s의 각 교정 솔루션에서 3-5측정을 수행합니다.
    5. ddH2O, 이미징 배지 및 비-전지 30-120s에 대해 각각 3-5회 씩 드롭을 측정하여 배경 수 비율을 결정합니다.
    6. 30-120s에 대해 3-5 측정으로 계측기 응답 기능을 수집합니다. 이것은 선택 사항이지만 매우 권장됩니다.
  3. 라이브 셀 측정
    1. 수은 램프를 비추고 안구를 통해 관찰하여 적합한 셀을 찾습니다.
      참고: 적합한 세포는 각각의 부착 세포주의 전형적인 형태를 보여주는 살아 있다. 관심 있는 단백질의 형광, 여기서 표면 수용체는 표면 전체에 걸쳐 볼 수 있다. 덜 밝은 세포는 낮은 수의 분자가 초점을 맞출 때 FCS에서 더 나은 대조때문에 밝은 세포보다 더 적합합니다.
    2. PIE 모드에서 두 레이저를 모두 켜고 초당 최대 카운트를 보고 멤브레인에 집중하십시오.
      참고: 셀 샘플의 경우 레이저 전력을 줄여야 할 수 있습니다(객관적으로 5 μW 미만). 이는 사용된 형광및 설정에 따라 다릅니다.
    3. 데이터 수집 소프트웨어의 온라인 미리 보기에서 β2AR에 부착된 eGFP 또는 레이블이 지정된 SNAP 태그의 자동 및 상호 상관 곡선을 관찰하고 60-180s 사이의 획득 시간으로 몇 가지 짧은 측정(~2-10)을 수집합니다.
      참고: 형광이 표백될 수 있기 때문에 세포를 장기간 흥분시키지 마십시오. 그러나 각 셀의 밝기, 측정 횟수 및 총 측정 횟수에 따라 달라집니다.

2. 데이터 분석

  1. 데이터 내보내기
    1. 모든 측정에서 상관 관계 곡선,G(tc)및 카운트 비율, CR을 내보냅니다.
    2. "프롬프트" 및 "지연" 시간 창을 올바르게 정의하고 데이터 상관 소프트웨어에서 "마이크로타임 게이팅" 옵션을 사용합니다.
      참고: 총 3개의 상이한 상관관계가 필요합니다: (1) 프롬프트 타임윈도우(ACFgp)에서그린 채널의 자동 상관관계( 2) 지연 시간 창(ACF rd)에서 적색 채널의 자기 상관관계(ACFrd),그리고 마지막으로 (3) 지연 시간 창(CCFPIE)에서적색 채널 신호와 함께 프롬프트 창에서 녹색 채널 신호의 상호 상관관계가 필요하다. 데이터 내보내기는 보충 참고 3에서다른 소프트웨어에 대해 단계별로 표시됩니다.
  2. 교정 측정
    1. 녹색(ACFgp)및빨간색(ACFrd)플루오로포어 용액의 자가상관 기능을 사용하고, 필요한 경우 추가 삼중용어(eq. 1)를 사용하여 두 개의 사용된 컬러 채널에 대한 공초점 검출 볼륨의 모양과 크기를 보정하는 3D 확산 모델에 적합합니다.
      Equation 1 eq. 1
      여기서, b는 곡선의 기준선, N초점 분자의 수, t D확산 시간(ms), 및 s =z0/w0의 형태 인자 공초점 체량 원소의 형태 인자이다. 삼중 깜박임 또는 기타 광물리학은 진폭에 의해 R 및 휴식 시간 tR에의해 설명된다.
      참고: 프로토콜 내에서 사용되는 모든 변수와 기호가 표 1에 나열됩니다.
    2. 공지된 확산 계수 D를 녹색(26) 및 적색 보정표준(27)과 얻어진 형상 인자 s녹색 및 s레드를 사용하여 공초점 볼륨 요소(eq. 2a-c)의 치수(너비 w0 및 높이 z0)및 부피 Veff를 결정한다.
      Equation 2eq. 2a
      Equation 3eq. 2b
      Equation 4eq. 2c
      참고: 교정 매개 변수를 계산하기 위한 템플릿은 보충 파일(S7)으로 제공됩니다.
    3. 녹색 형광 신호의 스펙트럼 크로스토크 α(채널 0 및 2에서 수집)을 적색 검출 채널(채널 번호 1 및 3)에 백그라운드 보정(BG) 신호(eq. 3)의 비율로 계산한다.
      Equation 5
      eq. 3
    4. "프롬프트" 시간 창(녹색 레이저에 의한 여기)에서 적색 교정 측정의 배경 보정 카운트 비율의 비율에 의해 기증자 의 δ 동의어 형광의 직접 여기를 "지연" 시간 창(eq 4)에서 백그라운드 보정 카운트 비율로 결정한다.
      Equation 6
      eq. 4
    5. 3D 확산 적합성(eq. 1)에서 배경 보정 수율과 획득한 분자 수에 기초하여 녹색 및 빨간색 형광(eq. 5a-b)의 분자 밝기 B를 계산합니다( eq. 1):
      Equation 7eq. 5a
      Equation 8eq. 5b
    6. ACFgp와 ACFrd뿐만 아니라 이중 표지 된 DNA의 CCFPIE를 3D 확산 모델 (eq. 1)에 모두 맞춥니다. 획득한 모양 계수, 녹색 및빨간색, ACFgp 및 ACFrd의상수를 각각 유지합니다. CCFPIE,sPIE의 셰이프 요소는 일반적으로 이 두 값 사이에 있습니다.
      참고: 이상적인 설정에서 Veff,녹색 및 V eff 모두 빨간색은 동일한 크기와 완벽하게 겹칩니다.
    7. 0 상관 시간, G0(tc)에서진폭을 결정하며, 초점에서 분자의 명백한 수의 발견된 값에 기초하여(N녹색, N레드 및 NPIE).
    8. 녹색 및 빨간색 형광의 100 % 공동 확산시 샘플에 대한 진폭 비율 rGR 및 rRG를 계산합니다 (eq. 6). NPIE는 초점에 이중 표지 된 분자의 수를 반영하지 않지만 만 1 /G0(tc)을반영한다는 점에 유의하십시오.
      Equation 9및 Equation 10 eq. 6
  3. 라이브 셀 실험
    1. 단일 레이블이 지정된 구문의 경우 셀 샘플을 적절한 모델에 맞춥시게 합니다. 표시된 멤브레인 수용체의 경우, 확산은 짧고 긴 확산 시간으로 양모달 방식으로 발생합니다. 또한, 형광의 광물리학 및 깜박임은 고려되어야 합니다:
      Equation 11 eq. 7
      여기서, td1 및 td2는 두 개의 필수 확산 시간이며, 1은 첫 번째 확산 시간의 분획이다.
      참고: 자유 염료와 DNA 가닥이 모든 방향으로 자유롭게 확산되는 교정 측정과는 달리 막 수용체는 세포막을 따라 2D 확산만 을 보여줍니다. 3D와 2D 확산 의 차이는 2D 케이스의 tD가 공초점 볼륨 요소의 형상 계수에 의존하지 않는 수정된 확산 용어(eq. 1을 비교)에 의해 반영됩니다.
    2. 기본 수학(eq. 8)을 사용하여 각각의 N 및 Veff에서 녹색 또는 빨간색 표지 단백질의 농도 c를 계산합니다.
      Equation 12eq. 8
      어디 NA = 아보가드로의 번호
    3. N단 SNAP 라벨 및 세포내 eGFP의 경우, 이중 표지된 샘플의 이중 라벨링 된 샘플의 두 개의 자가상관(ACFgp 및 ACFrd)에ACF(eq. 7) 및 이중 변조 모델을 사용하는 CCFPIE에 대해 동일한 모델을 사용하여 적합합니다(eq. 9) :
      Equation 13eq. 9
      참고: 시스템의 글로벌 설명의 경우, 세 곡선 모두 공동으로 적합해야 합니다: 확산 용어는 세 곡선 모두에 대해 동일하며 유일한 차이점은 CCFPIE의완화 용어입니다. 두 형광의 광물리학은 일반적으로 관련이 없기 때문에 상관 관계가 필요하지 않습니다. 이완 용어가 없으면 짧은 상관 관계에 평평한 CCFPIE가 발생합니다. 그러나, 기증자 형광로 인한 수락자의 교차토크 및 직접 흥분은 거짓 양성 진폭을 보일 수 있으며 교정 측정을 사용하기 위해 주의 깊게 검사해야합니다.
    4. 방정식 8을 사용하여 각각의 N 및 Veff로부터 녹색 또는 빨간색 표지 단백질의 농도 c를 계산합니다.
    5. DNA 샘플로부터 수득된 교정 인자를 이용하여 세포 샘플로부터 녹색 및 적색 표지 단백질을 상호 작용하는 분획 또는 농도, cGR 또는 cRG,세포 샘플의 진폭 비 rGR 및 rRG 및 각각의 수득 농도(eq. 10)를 추정한다.
      Equation 14 및 Equation 15 eq. 10
    6. C-단말 SNAP 라벨 및 세포내 eGFP의 경우, FRET 샘플의 두자가상관(ACFgp 및 ACFrd)을단일 표지 샘플(방정식 7) 및 CCFFRET를 반상관 용어(방정식 11)를 포함하는 바이모달 확산 모델에 맞춥니다.
      Equation 16 eq. 11
      여기서f는 총 항상관 및 R 및 t R의 진폭을 각각의 진폭 및 이완 시간을 반사한다.
      참고: FRET로 인한 상관 관계가 없는 형광 변화의 경우 하나 또는 여러 가지 상관관계 방지 조건이 필요할 수 있으며, 그 결과 두 가지 상관관계가 증가하는 것과 일치하는 낮은 상관 시간에 CCFFRET의 "딥"이 발생할 수있습니다(ACFgp 및 ACFrd). 그러나, 삼중 깜박임과 같은 광물리학은 FRET 유도된 항상관관계를 약화시킴으로써 반상관 용어를 가릴 수 있다는 점에 유의하십시오. 필터링된 FCS 방법으로 보완된 조인트 분석은 상관 관계 방지 용어의 마스크를 해제하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 나노초 범위에서 계수 전자 기기의 데드 타임으로부터 유래된 기술 유물은16을제외해야 한다. ChiSurf28에서 분석을 수행하는 방법에 대한 보다 상세한 단계별 절차 및 공초점 볼륨 또는 분자 밝기 계산을 위한 템플릿은 Github 리포지토리(https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS github repository)와 보충파일(보충 주 4 및 보충 주 6)에제공됩니다. 또한 .ptu 형식으로 Symphotime 소프트웨어로 획득한 데이터의 일괄 내보내기를 위한 파이썬 스크립트를 찾을 수 있습니다.

Representative Results

교정 및 라이브 셀 측정의 모범적인 결과는 아래에서 논의됩니다. 또한 FRET가 상호 상관 관계 곡선에 미치는 영향은 단백질 단백질-상호 작용이 CCFPIE 진폭을 증가시면 다음의 시뮬레이션 된 데이터를 기반으로 입증됩니다.

PIE 기반 FCS 데이터 내보내기
PIE 실험에서 데이터는 시간 태그 시간 해결 모드(TTTR)29,30에서수집됩니다. 도 1B는 설명된설정(보충 주 1)에서이중 표지된 DNA 가닥의 PIE 측정의 광자 도착 시간 히스토그램을 나타낸다. 설치에는 4개의 검색 채널이 있습니다. 형광 방출은 먼저 "S"와 "P"방향의 편광에 의해 분할됩니다 (광파의 전기장이 진동되는 수직 및 병렬 평면을 참조). 둘째, 각 편광 방향은 감지하기 전에 두 개의 색상 채널(녹색, 빨간색)으로 분할되어 4개의 채널(S-Green, S-Red, P-green, P-빨간색)이 생성됩니다. "프롬프트" 시간 창에서 녹색 불소호가 흥분되고 FRET로 인해 녹색 채널과 빨간색 채널 모두에서 신호가 감지됩니다. 지연 시간 창에서 빨간색 불소호레(빨간색 채널)만 표시됩니다. 검출 채널 및 "프롬프트" 대 "지연" 시간 창에 기초하여, 적어도 5개의 상이한 상관관계 곡선(3개의 자기상관 곡선(ACFs) 및 2개의 상호 상관 곡선(CCF)))을 얻을 수있습니다(도 1C-D): (도 1)프롬프트 윈도우에서 녹색신호(ACFgp),(2) 적신호(FRET의 경우) 및 (3) 지연 시간창(ACFrd)에서적색 신호. 이러한 ACFs는 단백질 이동성, 광물리학(예를 들어, 삼중 깜박임) 및 형광구의 기타 시간 상관 밝기 변화(예: FRET로 인한)에 대해 보고합니다. (4) 지연 시간 창에서 빨간색 신호와 함께 프롬프트 시간 창에서 녹색 신호의 PIE 계 상호 상관 CCFPIE는 녹색 및 빨간색 플루오로포어(16)의 공동 확산의 분수를 결정할 수 있다. (5) 프롬프트 타임 윈도우에서 빨간색 신호와 녹색의 FRET 계 상호 상관 CCFFRET는 녹색 및 빨간색신호(31,32,33)의FRET 유도, 항상관 밝기 변화와 관련이 있다.

Figure 1
도 1: 펄스 인터리브 된 여기 (PIE) 기반 형광 (크로스) 상관 분광 (F(C)CS). (A)FCS 형광 표지 분자에서 이 작은 부피 내에서 형광을 유도하는 집중 레이저 빔에 의해 형성된 초점 부피 안팎에서 자유롭게 확산된다. 부피를 입력하고 떠나는 분자의 결과 강도 변동은 상관 관계가 있고 분자의 이동성에 대한 정보를 제공합니다. (B)PIE에서는 두 개의 서로 다른 레이저 라인("프롬프트"및 "지연")이 두 개의 서로 다른 형광("녹색" 및 "빨간색")으로 표시된 샘플을 자극하는 데 사용됩니다. 두 흥분 펄스 사이의 시차는 각각의 형광의 형광 수명에 적응되어 다른 하나는 흥분되기 전에 부패합니다. 표시된 이중 표지 샘플에서, 두 형광은 "녹색"기증자 형광에서 "빨간색"수용자 형광에 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)을 받아야 하기에 충분히 가깝습니다. 따라서, 적색 형광 방출은 녹색 기증자의 여기에 따라 "프롬프트"시간 창에서 검출될 수 있다. 중고설정(보충 주 2)에서각 색상에 대해 두 개의 검출기가 사용되며, 하나는 각 색상에 평행하여 각 광선 방향("p"로 표시됨)과 두 번째 수직("s"표시)에 대해 배합합니다. (C) 3개의 상이한 자가상관 기능은 파이 실험에서 결정될 수 있다: i) 녹색 채널 신호의 프롬프트 타임윈도우(ACFgp),ii) 빨간색 채널신호(ACFrp)및 iii) 지연 시간창(ACFrd)에서적색 채널 신호. (D) 두 가지 상이한 상호 상관 기능 결정 될 수있다: iv) "PIE" 교차 상관 관계(CCFPIE)지연 창에서 빨간색 채널 신호와 상관 관계 프롬프트 시간 창에서 녹색 채널 신호와, 여기서 이 곡선의 진폭은 형광의 공동 확산과 관련이; v) 동일한 프롬프트 창에서 빨간색 채널 신호와 상관관계가 있는 프롬프트 타임 윈도우에서 녹색 채널 신호와 "FRET" 교차상관관계(CCFFRET); 여기서 확산보다 빠른 시간에 이 곡선의 형상은 FRET 유도 강도 변화와 관련이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

교정
도2A-B는 각각 녹색 및 빨간색 형광을 분산시키는 교정 측정을 나타낸다. eq. 1및 알려진 확산 계수 D그린(26)과 D레드(27)와 함께 장착된 핏을 기반으로 검출 부피의 형상(z0 및 w0)및크기(Veff)를사용하여 eq.2a-c를 사용하여 계산된다. 적색 불소에서 녹색 불소와 ACFrd로부터의 ACFgp의 적합성 결과는 도 2C로요약된다. 두 형광은 각각 8.6 μs (18%)와 36 μs (15%)의 추가 휴식 시간 상수를 보여줍니다. 녹색 및 적색 형광의 분자 밝기 (eq. 5a-b)는 분자 당 12.5 kHz 및 분자 당 2.7 kHz에 각각 해당합니다.

분자 밝기뿐만 아니라 공초점 볼륨 크기와 모양의 신뢰할 수 있는 추정을 위해 교정 실험당 3-5 측정을 수행하고 모든 반복의 조인트(또는 글로벌)에 맞는 것이 좋습니다.

이 불소조 쌍에 대한 크로스토크α(도 2D,eq. 3)과 그린 레이저 δ(도2E,eq. 4)에 의한 수락자의 직접 외발은 각각 ~15% 및 ~38%로 나타났다.

Figure 2
도 2: 자유롭게 확산 녹색및 적색 보정 표준의 교정 측정. (A-B)대표 60 의 측정 2 nM 녹색(A)및 10 nM 빨간색(B)추가 휴식 시간(eq. 1)을포함하는 3D 확산 모델에 장착 된 교정 표준 측정. 패널(C)의표는 eq. 2a-c 및 eq. 5a-b를기반으로 한 맞춤 결과 및 유래 파라미터를 나타낸다. *확산 계수는 문학26,27에서채취되었다. (D)녹색 신호의 α 크로스토크의판정(eq. 3). 녹색 표준의 흥분 스펙트럼은 녹색의 방출 스펙트럼인 시안으로 나타낸다. 485 nm (파란색) 및 561 nm (주황색)의 흥분 레이저 라인은 대시 라인으로 표시됩니다. 투명 녹색 및 마젠타 상자는 수집 된 방출 범위(보충 참고 2)를보여줍니다. (E)485 nm 레이저 (eq. 4)에 의해 적색 플루오로포어의 직접 여기 δ 결정. 색상 코드는(D)및 어두운 주황색과 동일하며 빨간색 표준의 발산 및 방출 스펙트럼을 각각 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

녹색 과 적 의 중복을 확인하고 보정하기 위해, 이중 표지 된 DNA 이중 가닥(그림 3A)이위에서 설명한 바와 같이 사용된다. 여기서, 형광은 DNA 이중 가닥의 끝에 부착된 녹색과 적색 형광사이에 FRET가 발생할 수 없다는 것을 40 bp 간격으로 간격을 두는다. 도 3B는 녹색(ACFgp)및 마젠타(ACFrd)및 파이 크로스 상관관계, CCFPIE,시안에서 두 형광소로부터의 자기 상관관계를 나타낸다. CCFPIE의 경우 프롬프트 타임 윈도우의 녹색 채널의 신호가 지연 시간창(16)의빨간색 채널의 신호와 상관관계가 있습니다.

여기서, DDNA =77 μm²/s의 DNA 가닥에 대한 평균 확산 계수가 얻어진다. 계산에 대한 자세한 내용은 단계별 프로토콜인 보충 주 4에서찾을 수 있습니다. 이 값은 보정된 녹색 및 적색 검출 볼륨크기(도 2)와DNA 가닥(도3C)의 ACFgp 및 ACFrd의 각각의 확산 시간을 방정식 2a에 삽입하여 얻어진다. 다음으로, 얻어진 교정값 rGR 및 rRG를 이용하여 나중에 eq.6을 사용하며, 공동 확산의 양, 즉 이중 표지분자(또는 2개의 상이한 단백질의 공동 배칭시 단백질 복합체)는 세포 샘플로부터 결정될 수 있다.

Figure 3
도 3: DNA 샘플을 사용하여 녹색-빨간색 중첩 부피의 보정. (A)교정에 사용되는 DNA 가닥은 녹색 및 적색 교정 형광을 전달하며, 그 사이에 40 bp의 거리가 있다. 인터디드 거리는 형광사이의 FRET를 제외하기에 충분히 커야 합니다. (B)대표 60 s 측정 10 nM DNA 용액. 녹색(ACFgp,녹색 표준) 및 마젠타(ACFrd,빨간색 표준)와 파이 크로스 상관, CCFPIE모두에서 자가 상관 관계, 파란색. 패널(C)의표는 추가 이완기간(eq. 1)과DNA, D DNA(eq. 2a), 중첩 부피(eq.2a-c)의 크기 및 형상및 교정비율 rGR 및 RG(eq 6eq 6)의 유래 파라미터 확산 계수를 포함하는 3D 확산 모델에 기반한 적합성 결과를 나타낸다. ). 녹색 및 빨간색 검출 볼륨(*로 표시)의 값은 도 2에표시된 개별 형광의 적합성에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

라이브 셀 실험
다음 섹션에서는, 상이한 β2AR구문에 대한 라이브 셀 실험의 분석이 제시된다. β2AR은 멤브레인 단백질이기 때문에, 그 확산은 주로 세포막을 따라 2차원확산(도 4A)으로제한된다(멤브레인을 통해 또는 로부터의 운송 또는 재활용 공정 제외) 2. 2D 확산에 대한 제한과 함께 형상계수 s =z0/w0eq. 1은 단순화된 확산 모델(eq. 9)의 결과로 사용되지 않게 된다.

단일 레이블 구조: β2AR-IL3-eGFP 및 NT-SNAP-β2AR
도 4는 eGFP가 세포내 루프 3에 삽입되는 단일 라벨 컨스트럭터 β2AR-IL3-eGFP(도4B)와Β2AR의 N-종자에 게공되는 NT-SNAP-β2AR(도4C)의예시적인 측정을 나타낸다. SNAP 태그는 멤브레인 불투과성 SNAP 표면 기판으로 레이블이 지정됩니다. 대표 곡선은 획득 시간 당 120 ~200s로 4-6 반복 측정의 평균을 보여줍니다. eGFP 및 SNAP 신호의 각각의 자가상관 ACFgp 및 ACFrd는 바이모달, 2차원 확산 모델(eq. 9)에 장착된다. 빠른 역학의 관점에서, eGFP는 TR1 ~ 9 μs에서 예상되는 삼중 깜박임만 나타내며 SNAP 신호는 두 개의 이완 시간을 필요로 하며, 하나는 tR1 ~ 5 μs의 전형적인 삼중 깜박임 시간에 하나, tR2 ~ 180 μs에서 두 번째 가합니다.

살아있는 세포에서 형광의 분자 밝기는 주어진 흥분 조건(eqs. 5a-b)하에서 분자당 0.8KHz(eGFP) 및 1.7kHz(SNAP)이다. 세포막에 통합된 표지된 β2개의AR 구문체의 농도는 나노-어어 범위에 있어야 하며, eq8을 이용하여 녹색 및 적색채널(그림 2)에대한 분자의 평균 수(eq. 9, 도 4C)와각각의 공초점 부피의 크기에 의해 결정될 수 있다.

Figure 4
도 4: 단일 라벨 구조의 대표적인 측정. (A)본 연구에서막 수용체 β2AR이 예로 사용되었다. 검출 부피를 자유롭게 플로팅할 수 있는 교정에 사용되는 형광및 DNA 가닥과 는 달리 멤브레인 단백질은 주로 2차원 확산으로 묘사되는 멤브레인을 따라 주로 확산됩니다. (B, D) 단일 레이블 의 ACFgp 및 ACFrd는 β 2AR-IL3-eGFP(B)및 NT-SNAP-β2AR(D). 120-200s에 대해 각각 수집된 4-6측정값의 평균이다. 패널(C)의표는 추가 이완조건(eq. 7)을포함하는 바이모달 2차원 확산 모델에 대한 데이터의 적합성 결과를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이중 레이블 구조: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
이중 표지 된 구조NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (짧은 NT-SNAP)에서, eGFP는 세포 내 루프 3에 삽입되고, Β2AR(그림 5A)의N 종자로 공각 된 SNAP 태그. 이 구성에서, eGFP는 FRET에 대한 너무 큰 거리를 가진 외부 측의 멤브레인과 SNAP의 내부 쪽에 있다. 이상적인 경우,이 구조는 녹색과 빨간색 불소 호레의 100 % 공동 확산을 표시하고 FRET 신호가 없습니다. 도5B-D는 두 개의 서로 다른 측정 일에 두 개의 셀에서 NT-SNAP의 두 가지 측정을 나타낸다. Eq. 7및 CCFPIE와 함께 도 5B에 도시된 "더 나은" 측정의 ACFgp 및 ACFrd를 피팅하면 ACFgp 및 ACFrd에초점을 맞춘 50-60 분자를 나타내고, 반면 N앱은 CCFPIE(도 5C)에 대해 1/G 0(t c) 114를 제시합니다(그림 5C)에 대한 1/G0(tc)114 ). 표지된 수용체의 농도는 eq. 8로 결정된 대로 ~100 nM 범위에 속한다. 이중 표지 된 분자의 평균 농도를 결정하기 위해, 먼저, CCFPIE의 G0(tc)의비율 (1/N(앱)으로표현되고 ACFgp 및 ACFrd,각각 계산 (eq. 6). 다음으로, 이러한 값, rGRcell= 0.43 및 rRGcell = 0.53은 DNA 측정(rGR, DNA= 0.51 및rR, DNA = 0.79)에서 얻은 값과 비교된다. 비율의 규칙을 사용하여, eGFP 신호의 ACFgp로부터 rGRcell= 0.43은 0.84의 공동 확산(rGRcell/rGR, DNA)의분수로 반사하며, 여기서 SNAP 기판 신호의 ACFrd의 다른 경우에는 0.67에 달한다. 이중 레이블NT-SNAP 구조의 평균 농도는 마지막으로 eq. 10을 기준으로 계산될 수 있습니다. 대조적으로, 다른 날로부터 도 5D에 도시된 측정에서, 수용체의 농도는 매우 낮으며, 매우 시끄러운 데이터로서 의 착용 범위가 최대 ~10 μs까지 제한됩니다. 또한, 소량의 공동 확산만 관찰된다(15 -26%).

Figure 5
그림 5: 이중 레이블NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 구조. (A)이중 라벨링 된 구조에서, eGFP는 세포 내 루프 3 및 β2AR (NT-SNAP)의 N 종착에 부착 된 SNAP 태그에 삽입된다. (B, D) 더블 라벨 구조의 두 측정의 ACFgp, ACFrd 및 CCFPIE. 데이터는 이중모달 2차원 확산모델(eq. 9, CCFPIE)에적합하며 추가 이완 조건(eq.7, ACFgp 및 ACFrd)을포함한다. 패널(C)의표는 0 상관시간(G0(tc)에서의 상관 진폭의 적합성 결과 및 유래 파라미터 농도(eq.8),상관 관계 진폭의비율(eq. 10)을나타낸다. 측정은 다른 날에 획득되었기 때문에 진폭 보정을위한 약간 다른 인자가 사용되었습니다 (B : rGR, DNA = 0.51 및 r RG, DNA = 0.79; D: rGR, DNA = 0.51 및 r RG, DNA = 0.56). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FRET 진행 중인 이중 레이블 구조: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
이중 표지 된 구조β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(도 6A),eGFP는 C-종래에 부착 된 SNAP 태그와 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 구조와 동일한 세포 내 루프 3에 삽입된다. 여기서, 두 라벨은 세포의 혈장 멤브레인의 동일한 측면에 있으므로 형광은 가까운 부근에 있으므로 FRET는 담금질 eGFP 수명(보충 참고 5)에의해 표시된 대로 발생합니다. C-terminus34 와 GPCRs35의적어도 두 개의 상이한 단백질 적합성, "높은 FRET" (HF) 또는 "낮은 FRET"(LF)와 같은 비교적 비정형 단백질 영역의 유연성을 고려할 때, eGFP-SNAP 거리 변화로 인한 FRET 효율의 동적 변화를 관찰하고 CCF FRET(6B피량의 주황색 곡선)에서 성상관 용어로 식별할 수 있었습니다. ). FRET 변동은 수용체가 한 번에 하나의 상태, HF 또는 LF에있을 수 있기 때문에 항상관성 것으로 나타났습니다. 5개의 상관관계곡선(도 6B)의조인트(또는 글로벌)는 ~100ms에서 천천히 확산되는 분자의 ~70%를 드러내고 나머지는 ~ 1ms로 확산된다. 모든 자기 상관 관계 및 CCFFRET는 37 μs 및 3 μs에서 완화 조건을 보여줍니다; 적색신호(ACFrp, ACFrd 및 CCFFRET)가지배하는 상관관계는 추가 느린 구성요소 ~ 50ms(도6C)를나타낸다.

상이한 조건하에서 CCFFRET에 대한 FRET 유도 된 변화는(도 6D)LF와 HF 상태 사이의 70 μs의 변동 시간을 갖는 2 상태 시스템의 일련의 시뮬레이션에 의해 입증된다. LF에서 HF 상태로 전환하면 프롬프트 타임 윈도우에서 항상관 성 신호의 변화가 관찰됩니다: 녹색 신호가 감소하고 적신호가 증가합니다(HF-> LF 스위칭의 경우 그 반대의 경우도 마찬가지입니다). HF-LF 스위칭이 확산 시간보다 더 빠른 시간 척도에서 발생하는 경우, 즉 초점 중분자의 체류 시간 동안, 속도는 CCFFRET6,31,36에서의 항상관으로부터 유래될 수 있다. 확산 시간보다 느린 동적 공정은 FCS에서 관찰할 수 없습니다.

이 데모에서는 두 가지 주 간의 FRET 효율성이 중등도또는 최대변경된 것으로 가정되었습니다. 시뮬레이션은 Burbulator(37)를 사용하여 수행되었으며, 삼중 깜박임의 부재 또는 존재를 고려하고 빨간색 채널로 기증자 크로스토크의 양을 증가. 확산 용어는 tD1 = 1 ms및 나머지 분자가 tD2 = 100 ms로 천천히 확산되는 빠른 확산 분자의 30%를 가진 바이모달 분포로 모델링되었다. 총107개의 광자가 w = 0=0.5 μm 및 z0 = 1.5 μm, 상자 크기 20 및 NFCS = 0.01을 가진 3D 가우시안 형 부피로 시뮬레이션되었습니다.

도6E-F는 중간(도 6E)에대한 FRET 유도 교차 상관 CCFFRET 및 최대 FRET 대비(도6F)에대한 시뮬레이션 결과를 나타내며, 부재 중(단선) 및 삼중 깜박임(dashed 라인)의 존재가 존재한다. FRET 유도 된 항 상관 관계는 도 6F에서쉽게 볼 수 있습니다. 추가 삼중 상태를 추가하면 "감쇠" 효과는 상관 관계 진폭을 감소시킵니다(도6E-F)38,39.

Figure 6
그림 6: 동적 FRET를 보여주는 이중 표지 된 샘플의 시뮬레이션 (A) 세포 내 루프 3 및 C 단말 SNAP 태그에 삽입 된 eGFP와 함께 β2AR을 이중 라벨. 두 형광은 FRET를 겪고 수용체가 단백질 역학을 겪는 경우 FRET 효율의 변화를 보여줄 만큼 가깝습니다. (B)자율상관(ACFgp, ACFrp 및 ACFrd, eq.7)와교차 상관 곡선(CCFFRET(eq. 7) 및 CCF PIE(eq.9)와함께 실시하였다. 패널(C)의테이블은 적합성 결과를 보여줍니다. (D-F) 예상, FRET 유도 항상관 용어, 12개의 시뮬레이션이 수행되었으며, FRET 효율(작거나 큰), 다른 양의 기증자 크로스토크가 수용채널로 의한(0%, 1% 또는 10%) 및 삼중 깜박임의 부재 및 존재를 모델링하였다. FRET-상태의 평형 분획은 50:50으로 추정되고 그들의 환율은 얻어진 휴식 시간 tR = 70 μs가 조정되었다. 시뮬레이션에 대한 자세한 내용은 텍스트에서 볼 수 있습니다. (E) 시뮬레이션의 CCFFRET는 적당한 FRET 대비와 크로스토크(다크 오렌지), 1% 크로스토크(오렌지) 및 10% 크로스토크(라이트 오렌지)가 없는 경우 결과를 낳는다. 솔리드 라인은 트리플렛이 있는 상태에서 트리플렛, 파선선이 없는 결과를 보여줍니다. (F)최대 FRET 대비시뮬레이션 결과의 CCFFRET. 색상 코드는(E)와동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그러나 실험 조건(α = 10%, 15% 트리플 깜박임 및 적당한 FRET 대비, 도 6E의파선 노란색 선)과 가장 유사한 시뮬레이션에서 반상관 용어가 거의 감소된다. 도 7은 광자 도착 시간 히스토그램(즉, 형광 수명)에 인코딩된 정보를 이 시뮬레이션된 데이터를 분석한 결과를 나타내며, 형광수 상관분광(FLCS)17,19 또는 종 여과FCS(fFCS)18을통해. 여기서, 알려진 HF 및 LF종(도 7A)의형광 수명은 상관 관계 절차 중에 적용되는 가중치 또는 "필터"(도7B)를생성하는 데 사용된다. 얻어진 종-자동 및 교차 상관 곡선(도7C-D)에서항상관은 명확하게 관찰될 수 있다.

Figure 7
그림 7: 평생 여과된 FCS는 CCFFRET에서FRET 유도 된 항상관을 마스킹하는 높은 크로스토크, 중요한 삼중 깜박임 또는 기타 광물리 또는 실험적 특성을 가진 샘플에서 FRET 효율의 단백질 역학 기반 변동을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서, 접근 방식은 10% 크로스토크 및 5% 삼중 깜박임이 포함된 시뮬레이션에 대해 도 6E에 도시된 데이터에 대한 예시적인 것으로 나타났다. (A)두 FRET 종(각각 높고 낮은 FRET용 밝고 어두운 녹색) 및 IRF(회색)에 대한 정규화된 형광 강도 붕괴 패턴을 정규화하였다. 병렬 검출 채널의 패턴은 수직 검출 채널에 대한 단선, 파선선으로 표시됩니다. (B)가중치 함수 또는 "필터"는(A)에표시된 패턴에 기초하여 생성되었으며, 색상 코드는(A)와동일하다. 녹색 검출 채널의 신호만, 따라서 FRET 유도 기증자 담금질, 여기에 고려된다. (C)4개의 다른 종 선택적 상관관계가 얻어진다: 낮은 FRET 상태(sACFLF-LF,다크 그린)와 높은 FRET 상태(sACF HF-HF, 밝은 녹색)와 높은 FRET상태(sACFHF-HF,light Green)의 종-자기 상관관계, 그리고 높은 FRET상태(sCCFLF-HF,오렌지)에 대한 낮은 FRET 사이의 두 종-교차상관 , 오렌지). sCCF는 μs 범위의 항상관을 명확하게 보여줍니다. 파선 된 검은 색 라인은 적합을 보여줍니다. sACF는 eq. 9 및 sCCF와 eq. 11에적합했습니다. 패널(D)의테이블은 적합성 결과를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단백질 단백질 상호 작용(PPI)을 연구하는 CCFPIE 진폭
마지막으로, 살아있는 세포에 있는 PIE 기지를 둔 FCS를 위한 일반적인 사용 케이스는 2개의 다른 단백질 사이 상호 작용을 공부하는 것입니다. 여기서, 판독 파라미터는 CCFPIE의진폭, 또는 보다 정밀하게 CCFPIE의진폭에 대한 자기 상관 진폭 ACFgp 및 ACFrd의 비율이다. CCFPIE에대한 공동 확산증가 효과를 보여주기 위해, 시뮬레이션은2개의AR-IL3-eGFP 및 NT-SNAP-β2AR(그림8A)을β 두 개의 단일 레이블 구조에 기초하여 수행되었다. 도 8B는 공동 확산 분자의 분획이 0%에서 100%로 변할 때 CCFPIE의 진폭이 어떻게 증가하는지를 보여줍니다. 지연 시간 창의 빨간색 채널에 녹색 신호의 1 % 교차 토크가 확산 성분과 함께 추가된 다른 쪽과 같이 모델링된 경우 유의하시기 바랍니다.

Figure 8
도 8: CCFPIE는 2개의 단백질의 상호작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있다. (A)여기에서, NT-SNAP-β2AR을 가진 β 2AR-IL3-eGFP의 공동 형질 전환 연구 ("빨간" SNAP 라벨을 운반)를 시뮬레이션하였다. (b)증가량의 공동 확산 분자(0%(다크 블루) -> 100% (연한 파란색)) 진폭 G(tc)가증가한다. 확산 용어는 tD1 = 1 ms에서 빠른 확산 분자의 30 %와 다른 분자가 tD2 = 100 ms로 천천히 확산되는 비모달 분포로 다시 모델링되었습니다. 또한 빨간색 지연 시간 창에 녹색 신호의 1 % 교차 토크가 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

상징 의미(공통 단위)
α 녹색 불소의 크로스토크 후 녹색 흥분후 적색 검출 채널로 (%)
a 1 막 수용체의 이중 모달 확산 모델에서 첫 번째 확산 성분의 분수
a f 반상관 용어의 총 진폭
A R 광물리학/삼중깜박이진 진폭
b 상관 곡선의 기준/오프셋
B 불소로포(킬로-)의 분자 밝기(분자당 킬로-카운트 및 초)
BG 배경(예: 적절한 참조 샘플: ddH2O, 버퍼, 감염되지 않은 셀 등)
c 농도
CR 카운트 비율(KHz 또는 초당 킬로 수)
δ 녹색 흥분 후 붉은 불소의 직접 흥분 (%)
D 확산 계수(μm²/s)
G(tc) 상관 기능
N 초점에 있는 분자의 수
NA 아보가드로의 번호 (6.022*1023 몰-1)
rGR,r RG PIE 기반 상호 상관 함수에 대한 녹색 또는 빨간색 자기 상관 기능의 진폭 비율
s 공초점 볼륨 요소의 형상 계수
tc 상관 관계 시간(일반적으로 밀리초)
tD 확산 시간(보통 밀리초 또는 마이크로초)
tR 광물리학의 휴식 시간 (보통 마이크로초)
tT 삼중 깜박임의 휴식 시간 (일반적으로 마이크로 초)
w0 공초점 볼륨 요소의 절반 폭 (μm)
z0 공초점 부피 요소의 반 높이 (μm)

표 1: 변수 및 약어 목록입니다. 형광 및 FRET 실험에서 기호와 정의를 사용하기 위해 FRET 커뮤니티40의 지침을 권장합니다.

보충 파일:

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SuppNote3_Data 내보내기.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SuppNote4_FCCS 치서프를 이용한 교정 분석.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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Disclosures

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

Acknowledgements

이 프로젝트는 도이치 포르충스게마인샤프트(SFB/TR 240, 프로젝트 번호 374031971, 프로젝트 INF)에서 J.B. 및 K.G.H.에 의해 지원되었다.

루돌프 버차우 센터의 재무 지원 및 기술 지원을 위한 핵심 유닛 형광 이미징에 감사드립니다. 또한, 우리는 철저한 증거 독서애쉬윈 발라크리슈난감사합니다.

Materials

---,
5개의 렌즈가 있는 4f 구성의 1x 망원경Qioptiq, Rhyl, UKG063126000광학
2x 밴드 패스 필터 BrightlineAHF, Tü bingen, 독일HC 525/50 및 HC 600/52필터
2x 이색성 빔 스플리터AHF, Tü Bingen, GermanyHC BS F38-573Filter
6-well culture plate NuncThermo Scientific (Waltham, USA)140675시약
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)A20000Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)A20003Reagent
ASI 스테이지 PZ-2000 XYZVisitron Systems GmbH, Puchheim, GermanyWK-XYB-PZ-IX71현미경 부품
Attofluor Cell Chamber, 직경 35mm  25mm 라운드 커버슬립Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)A7816유리 커버슬립 홀더
Avalanche 포토다이오드 Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)Laser Components GmbH, Olching, GermanySPCM-AQR-14단일 광자 계수 검출기
BeamsplitterNewport, 다름슈타트, 독일10FC16PB.3Filter
Biorender (Software)Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)---GPCR 스케치 생성에 사용되는 소프트웨어, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) 세포주ATCCCCL-61세포주
ChiSurf (데이터 분석 소프트웨어)Thomas-Otavio Peulen, 미국 샌프란시스코 캘리포니아 대학교 생명공학 및 치료과학과형광 상관 관계 데이터 및 형광 감쇠 히스토그램을 분석하기 위한 tttrlib 기반 소프트웨어, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
튜토리얼: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
참조: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
클로로포름시그마-알드리치(미국 세인트루이스)472476-2.5L시약
DMSOAppliChem GmbH(독일 다름슈타트)A3672,0250시약
DNA 가닥(40bp 형광단 거리)IBA Lifesciences GmbH(Gö ttingen, Germany)---시약, 5' CGC, 행위, GAA, CAG, 고양이, ATG, ACA, CGC, GAT는, AGG, CTA, TCC, TGC, AGT, ACG, CT(Alexa568)C, AGG, 3', 3' GCG, TGA, CT(Alexa488), T, GTC, GTA, TAC, TGT, GCG, CTA, TCC, GAT, AGG, ACG, TCA, TGC, TGC, GAG, TCC, 5'
둘베코' s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)P04-41250, P04-41650시약
에탄올(절대)Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)34852-1L-M시약
Erythrosin B,염료 함량 >=95 %Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)200964-5G시약, 기기 응답 기능, EtOH에서 10 mg/mL
로 해결소태아 세럼 (FBS)바이오크롬  (독일 베를린)S 0615시약
형광 광원 X-Cite 120 QExcelitas Technologies, Ontario, CanadaXI120-Q-5060현미경 부품
형광 SNAP-기판 셀 : SNAP Cell TMR- STARNew England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)S9105S시약
형광 SNAP-기판 표면 : DY-549New England BioLabs (독일 프랑크푸르트)S9112S시약
유리 커버 슬립 (크기 : 직경 24mm, 두께 0.13-0.16mm)Marienfeld-Superior (Lauda-K ö nigshofen, Germany)111640시약
레이저 컨트롤러Picoquant, Berlin, Germany910020 (PDL 828-S "SEPIA II")광학
레이저 라인(480nm 및 560nm)Picoquant, Berlin, Germany912485(LDH-D-C-485), 912561(LDH-D-TA-560)Optics
Lipofectamine 2000Invitrogen, Life Technologies(Carlsbad, USA)11668-019시약
MFD suite (Software)AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany---Kristine(tttr 데이터의 상관관계), Burbulator(단분자 실험 시뮬레이션), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mmThorlabs, Bergkirchen, Germany를 포함한 단일분자 형광 실험 분석을 위한 소프트웨어 패키지AC254-150-A-ML빔 확장기
Neubauer 챔버의 두 번째 부분 (깊이 0.1 mm)Marienfeld-Superior (Lauda-Kö nigshofen, Germany)640110시약
Olympus IX 71 standOlympus, Hamburg, GermanyIX2-ILL100Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)31985-047Reagent
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich (St. Louis, USA)049M4857VReagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)GIBCO, Life Technologies(미국 칼즈배드)14190144시약
핀홀(50 &마이크로; M)Newport, Darmstadt, GermanyPNH-50Pinhole
PMT Hybrid-40Picoquant, Berlin, Germany932200 (PMA Hybrid 40)Single photon counting detector
Python scripts (Software)Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany---(1) 평균 계수를 결정하고, (2) 데이터를 상관 관계를 파악하고, (3) 형광 감쇠 히스토그램을 구축하는 데 사용되는 tttrlib(https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib)를 기반으로 자체 작성된 Python 스크립트 모음
https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)AHF, Tü Bingen, GermanyF73-421PHFilter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimatorPicoquant, Berlin, Germany02126Optics
Sodium Hydroxide (NaOH)Carl Roth (Karlsruhe, Germany)6771.1Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)Picoquant, Berlin, Germany931073 (SPT64-1+2 single user)자체 구축된 FCCS 설정에서 시간 태그 시간 분해(tttr) 데이터 수집, 데이터 내보내기
TCSPC(Time-Correlated Single Photon Counting ) 시스템 Hydraharp 400Picoquant, Berlin, Germany930010 (Hydraharp 400)Optics
Trypsin-EDTASigma-Aldrich (St. Louis, USA)T4299-100ml시약
비장착 무채색 이중선, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mmThorlabs, Bergkirchen, GermanyACN127-020-A빔 확장기
침수 대물렌즈의 첫 번째 부분(UPlanSApo 60x/1.20 W)Olympus, 함부르크, 독일UPLSAPO60XW대물렌즈

References

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