Summary
We ontwierpen en bouwden een mobiel laboratorium om de ademhalingsfrequentie te meten in geïsoleerde mitochondriën van wilde dieren die op veldlocaties zijn gevangen. Hier beschrijven we het ontwerp en de inrichting van een mobiel mitochondriaal laboratorium en de bijbehorende laboratoriumprotocollen.
Abstract
Mitochondriale energetica is een centraal thema in de biochemie en fysiologie van dieren, waarbij onderzoekers mitochondriale ademhaling gebruiken als maatstaf om het metabolische vermogen te onderzoeken. Om de metingen van mitochondriale ademhaling te verkrijgen, moeten verse biologische monsters worden gebruikt en moet de volledige laboratoriumprocedure binnen ongeveer 2 uur worden voltooid. Bovendien zijn er meerdere gespecialiseerde apparaten nodig om deze laboratoriumtests uit te voeren. Dit vormt een uitdaging voor het meten van mitochondriale ademhaling in de weefsels van wilde dieren die ver van fysiologische laboratoria leven, aangezien levend weefsel niet lang na verzameling in het veld kan worden bewaard. Bovendien veroorzaakt het vervoeren van levende dieren over lange afstanden stress, wat de mitochondriale energetica kan veranderen.
Dit manuscript introduceert de Auburn University (AU) MitoMobile, een mobiel mitochondriaal fysiologielaboratorium dat in het veld kan worden meegenomen en ter plaatse kan worden gebruikt om het mitochondriale metabolisme te meten in weefsels die zijn verzameld van wilde dieren. De basiskenmerken van het mobiele laboratorium en de stapsgewijze methoden voor het meten van geïsoleerde mitochondriale ademhalingsfrequenties worden gepresenteerd. Bovendien valideren de gepresenteerde gegevens het succes van het uitrusten van het mobiele mitochondriale fysiologielaboratorium en het uitvoeren van mitochondriale ademhalingsmetingen. De nieuwigheid van het mobiele laboratorium ligt in de mogelijkheid om naar het veld te rijden en mitochondriale metingen uit te voeren op de weefsels van dieren die ter plaatse zijn gevangen.
Introduction
Tot op heden zijn studies die zijn ontworpen om mitochondriale energetica te meten beperkt tot proefdieren of dieren die zijn gevangen in de buurt van gevestigde fysiologische laboratoria, waardoor wetenschappers geen mitochondriale bio-energetische studies kunnen uitvoeren in weefsels die zijn verzameld van dieren tijdens activiteiten zoals migratie, duiken en winterslaap 1,2,3,4,5,6 . Hoewel veel onderzoekers met succes de basale en piekstofwisseling en het dagelijkse energieverbruik van wilde dieren hebben gemeten 7,8, is het vermogen van onderzoekers om de prestaties van mitochondriën te meten beperkt gebleven (maar zie 1,4,9). Dit is deels te wijten aan de behoefte aan vers weefsel voor het isoleren van mitochondriën en een laboratoriumfaciliteit om de isolaties binnen ongeveer 2 uur na het verkrijgen van het verse weefsel uit te voeren. Zodra de mitochondriën zijn geïsoleerd, moeten ook de mitochondriale ademhalingsmetingen binnen ~1 uur worden voltooid.
Geïsoleerde mitochondriale ademhalingsfrequenties worden meestal uitgevoerd door de zuurstofconcentratie te meten in een afgesloten container die is aangesloten op een Clark-elektrode. De theorie achter deze methode is gebaseerd op de basisobservatie dat zuurstof de laatste elektronenacceptor is van mitochondriale ademhaling tijdens oxidatieve fosforylering. Daarom wordt aangenomen dat de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) plaatsvindt als de zuurstofconcentratie tijdens een experiment daalt10. Verbruikte zuurstof is een proxy voor geproduceerde ATP. Onderzoekers kunnen specifieke experimentele omstandigheden creëren met behulp van verschillende substraten en adenosinedifosfaat (ADP)-gestimuleerde ademhaling initiëren (toestand 3) door vooraf bepaalde hoeveelheden ADP aan de kamer toe te voegen. Na de fosforylering van het exogene ADP tot ATP neemt het zuurstofverbruik af en wordt toestand 4 bereikt en kan worden gemeten. Bovendien maakt de toevoeging van specifieke remmers het mogelijk om informatie te verkrijgen over lekademhaling en ontkoppelde ademhaling10. De verhouding tussen toestand 3 en toestand 4 bepaalt de respiratoire controleratio (RCR), de indicator van de algehele mitochondriale koppeling10,11. Lagere RCR-waarden duiden op algehele mitochondriale disfunctie, terwijl hogere RCR-waarden een grotere mate van mitochondriale koppeling10 suggereren.
Zoals eerder vermeld, moeten het verzamelen van biologisch materiaal, mitochondriale isolatie en het meten van de ademhalingsfrequentie binnen 2 uur na het verkrijgen van weefsel worden voltooid. Om deze taak uit te voeren zonder dieren over grote afstanden naar gevestigde laboratoria te vervoeren, werd een mobiel mitochondriaal fysiologielaboratorium gebouwd dat naar veldlocaties kan worden gebracht waar deze gegevens kunnen worden verzameld. Een Jayco Redhawk-recreatievoertuig uit 2018 werd omgebouwd tot een mobiel moleculair fysiologielaboratorium en kreeg de naam Auburn University (AU) MitoMobile (Figuur 1A). Er werd gekozen voor een recreatievoertuig vanwege de ingebouwde koelkast, vriezer, wateropslagtank en sanitair, elektriciteit aangedreven door 12-volt batterijen, gasgenerator, propaantank en zelfnivellerend systeem. Verder biedt het recreatievoertuig de mogelijkheid om op afgelegen locaties te overnachten voor het verzamelen van gegevens. De voorkant van het voertuig is niet gewijzigd en biedt de rij- en slaapvertrekken (figuur 1B). Eerder geïnstalleerde slaapkamervoorzieningen (bed, tv en kast) aan de achterkant van het voertuig en de kookplaat werden verwijderd.
Op maat gemaakte roestvrijstalen rekken en een op maat gemaakt aanrechtblad van kwarts, ondersteund door een 80/20 aluminium frame, werden geïnstalleerd in plaats van de slaapkamervoorzieningen en de kookplaat (Figuur 1C). De laboratoriumbanken bieden voldoende ruimte voor het verzamelen van gegevens (figuur 1D). Er werd rekening gehouden met het stroomverbruik van elk apparaat (d.w.z. gekoelde centrifuge, mitochondriale ademhalingskamers, plaatlezers, computers, homogenisatoren, weegschalen, draagbare ultravriezers en andere algemene laboratoriumbenodigdheden). Om de grote spannings- en stroomvraag van de centrifuge te ondersteunen, werd het elektrische systeem geüpgraded naar dat van apparatuur van vliegtuigkwaliteit. Een extern compartiment aan de achterkant van het voertuig werd omgebouwd tot een opslagplaats voor vloeibare stikstof, die voldoet aan de richtlijnen van het Amerikaanse ministerie van Transport voor de opslag en het transport van vloeibare stikstof. Deze opbergunit is gemaakt van roestvrij staal en heeft een goede ventilatie om te voorkomen dat uitzettend stikstofgas in het passagierscompartiment van het voertuig lekt.
Om te bevestigen dat het mobiele laboratorium kan worden gebruikt in mitochondriale bio-energetische studies, werden mitochondriën geïsoleerd en werden de mitochondriale ademhalingsfrequenties van in het wild afgeleide huismuizen (Mus musculus) skeletspieren van de achterpoten gemeten. Omdat Mus musculus een modelorganisme is, zijn de mitochondriale ademhalingsfrequenties van deze soort goed vastgesteld12,13,14. Hoewel eerdere studies mitochondriale isolatie via differentiële centrifugatie 15,16,17 hebben gedocumenteerd, wordt hieronder een kort overzicht gegeven van de methoden die worden gebruikt in de mobiele mitochondriale fysiologische laboratoriummethoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In de volgende paragrafen worden de mitochondriale laboratoriummethoden beschreven. Alle procedures voor het hanteren van dieren en het verzamelen van weefsel zijn goedgekeurd door de Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee (#2019-3582).
1. Beschrijving van de buffers die worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens
OPMERKING: Deze buffers kunnen in een stationair laboratorium worden voorbereid en voorafgaand aan de excursie naar het mobiele laboratorium worden verplaatst (tenzij hieronder anders vermeld).
- Bereid de mitochondriale isolatiebuffer van de skeletspieren voor met runderserumalbumine (BSA), zoals te zien is in tabel 1.
- Los chemicaliën op in gedeïoniseerd water (~ 90% volume) behalve de vetzuurvrije BSA. Zet de buffer in de koelkast tot de temperatuur 4 °C is.
- Stel de oplossing in op een pH van 7,5 en houd de temperatuur op 4 °C.
- Voeg de vetzuurvrije BSA toe en breng het volume op 100%. Aliquot de oplossing in conische buisjes van 50 ml. Bewaar deze oplossing bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid de mitochondriale isolatiebuffer van de skeletspieren voor zonder BSA, zoals te zien is in tabel 1.
- Los de chemicaliën op in gedeïoniseerd water (~ 90% volume). Zet de buffer in de koelkast tot de temperatuur 4 °C is.
- Stel de oplossing in op een pH van 7,5 en houd de temperatuur op 4 °C.
- Breng het volume naar 100%. Aliquot de oplossing in conische buisjes van 50 ml. Bewaar deze oplossing bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid de resuspensiebuffer voor skeletspieren voor zoals te zien is in tabel 1.
- Los de chemicaliën op in gedeïoniseerd water (~ 90% volume). Zet de buffer in de koelkast tot de temperatuur 4 °C is.
- Stel de oplossing in op een pH van 7,4 en houd de temperatuur op 4 °C.
- Breng het volume naar 100%. Aliquot de oplossing in conische buisjes van 50 ml. Bewaar deze oplossing bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid de ademhalingsbuffer van de skeletspieren voor, zoals te zien is in tabel 2.
- Los de chemicaliën op in gedeïoniseerd water (~ 90% volume) behalve de vetzuurvrije BSA. Verwarm de buffer tot de temperatuur 37 °C is.
- Stel de oplossing in op een pH van 7,0 terwijl u de temperatuur op 37 °C houdt.
- Voeg de vetzuurvrije BSA toe en breng het volume op 100%. Aliquot de oplossing in conische buisjes van 50 ml. Bewaar deze oplossing bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid de ademhalingssubstraten voor zoals te zien is in tabel 2.
- Zorg ervoor dat deze substraten vers worden gemaakt op de dag van gegevensverzameling in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4. Bewaren op ijs tot gebruik.
OPMERKING: De opgegeven waarden zijn om een voldoende geconcentreerde oplossing te maken om voldoende substraat door de mitochondriën te laten opnemen. De uiteindelijke concentraties van de substraten zijn 2 mM pyruvaat, 2 mM malaat, 10 mM glutamaat en 5 mM succinaat.
- Zorg ervoor dat deze substraten vers worden gemaakt op de dag van gegevensverzameling in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4. Bewaren op ijs tot gebruik.
2. Mitochondriale isolatie uitvoeren (Figuur 2)
OPMERKING: Mitochondriale isolatie en mitochondriale ademhalingsmetingen worden uitgevoerd in de laboratoriumtafel van het mobiele laboratorium en alle oplossingen moeten bij 4 °C worden bewaard, tenzij anders vermeld.
- Parkeer het mobiele laboratorium op een vlakke ondergrond. Schakel de generator in en zet het voertuig waterpas. Schuif de schuif uit en stel de apparatuur op.
- Ontdooi de gewenste hoeveelheden buffers.
OPMERKING: Over het algemeen is per spier 30 ml skeletspierisolatiebuffer en 10 ml skeletspierisolatiebuffer zonder BSA nodig. - Stel de mitochondriale ademhalingskamers in en kalibreer ze op de gewenste temperatuur van experimenten en de huidige luchtdruk volgens de instructies van de fabrikant. Zie de Tabel met materialen voor specifieke kamers die in experimenten worden gebruikt.
- Euthanaseer het dier via onthoofding.
OPMERKING: De huidige studie gebruikte onthoofding voor euthanasie. Sommige gassen, zoals kooldioxide en isofluraan, beïnvloeden de mitochondriale functie18,19,20; Met deze effecten moet rekening worden gehouden bij het selecteren van de beste euthanasiemethode voor elk onderzoek. Welke methode voor elk onderzoek moet worden uitgevoerd, wordt bepaald door de wetenschappelijke vraag die wordt gesteld. - Snijd skeletspieren weg, snijd snel vet en bindweefsel weg, weeg en plaats de spier in een skeletspierisolatiebuffer met BSA (minimaal 1/10 w/v) (bijv. 1 g skeletspier op 10 ml buffer).
- Hak de skeletspier fijn met een schaar op ijs.
- Breng het gehakte weefsel over in een centrifugebuis van 50 ml met behulp van een afgesneden pipetpunt van 5 ml. Homogeniseer het met een mes (zie de tabel met materialen) op 50% vermogen gedurende 5 s. Voeg protease toe (5 mg/g natte spier) en verteer gedurende 7 minuten, meng de oplossing elke 30 s. Beëindig de reactie door een gelijk volume isolatiebuffer toe te voegen met BSA.
- Centrifugeer het homogenaat bij 500 × g gedurende 10 minuten. Breng het supernatans over door dubbellaagse kaasdoek met behulp van een afgesneden pipetpunt van 5 ml in een schone centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer het supernatans bij 3.500 × g gedurende 10 minuten om een bruine mitochondriale pellet neer te slaan.
- Giet de resterende supernatant eruit. Voeg hetzelfde volume isolatiebuffer met BSA toe aan de centrifugebuis. Resuspendeer de mitochondriale pellet met een flexibele schraper (politieagent) door de mitochondriale pellet voorzichtig van de wanden van de centrifugebuis te werken. Centrifugeer bij 3.500 × g gedurende 10 min.
- Giet de resterende supernatant eruit. Voeg hetzelfde volume isolatiebuffer zonder BSA toe aan de centrifugebuis. Resuspendeer de mitochondriale pellet door de mitochondriale pellet voorzichtig van de wanden van de centrifugebuis te werken met een schone politieagent. Centrifugeer bij 3.500 × g gedurende 10 min.
- Decanteer het supernatans en resuspendeer de mitochondriale pellet in suspensiebuffer door de mitochondriale pellet voorzichtig van de wanden van de centrifugebuis te werken met een schone politieagent.
OPMERKING: Het volume van de resuspensiebuffer is afhankelijk van de grootte van de mitochondriënpellet. - Breng de geresuspendeerde mitochondriën over naar een Dounce-homogenisator met een gesneden pipetpunt van 1 ml. Gebruik de Dounce-homogenisator om de suspensie voorzichtig te homogeniseren met 4-5 gangen.
- Plaats de mitochondriale suspensie in een gelabelde microcentrifugebuis van 2 ml met behulp van een andere afgesneden pipettip van 1 ml.
3. Mitochondriale ademhalingsmetingen (figuur 3)
- Complexe I substraten
- Voeg 945 μL ademhalingsbuffer toe aan de kamer. Zorg ervoor dat de roerder draait en dat de buffertemperatuur op 37 °C wordt gehouden. Start de registratie van de gegevensverzameling.
- Nadat de zuurstofconcentratie is gestabiliseerd, voegt u 20 μL mitochondriën toe en plaatst u het deksel op de kamer. Geef in de software aan dat mitochondriën aan de kamer zijn toegevoegd.
- Voeg 10 μL 1 M glutamaat, 10 μL 200 mM malaat en 10 μL 200 mM pyruvaat toe aan de kamer met afzonderlijke spuiten en wacht tot het signaal stabiliseert. Geef in de software aan dat er substraten zijn toegevoegd.
OPMERKING: Deze substraten worden meestal gebruikt om koolhydraatgestuurde ademhaling te meten. Voor andere combinaties van substraten die moeten worden gebruikt om de door vet aangedreven ademhaling te meten, zie21. - Voeg 5 μL ADP toe met een aparte spuit en observeer het snelle zuurstofverbruik (toestand 3). Geef in de software aan dat ADP is toegevoegd.
OPMERKING: Na de fosforylering van de toegevoegde ADP zal het zuurstofverbruik afvlakken tot toestand 4. - Na 4 minuten gegevensverzameling van status 4, beëindigt u de opname. Sla het gegevensbestand op.
- Complexe II-substraten
- Voeg 963 μL van de ademhalingsbuffer toe aan de kamer. Zorg ervoor dat de roerder draait en dat de buffertemperatuur op 37 °C wordt gehouden. Start de registratie van de gegevensverzameling.
- Nadat de zuurstofconcentratie is gestabiliseerd, voegt u 20 μL mitochondriën toe en plaatst u het deksel op de kamer. Geef in de software aan dat mitochondriën aan de oplossing zijn toegevoegd.
- Voeg 2 μL 4 μg/μL rotenon gevolgd door 10 μL 500 mM succinaat toe aan de kamer met behulp van afzonderlijke spuiten en wacht tot het signaal stabiliseert. Geef in de software aan dat er substraten zijn toegevoegd.
- Voeg 5 μL ADP toe met behulp van een aparte spuit en observeer het snelle zuurstofverbruik (toestand 3). Geef in de software aan dat ADP is toegevoegd.
OPMERKING: Na de fosforylering van de toegevoegde ADP zal het zuurstofverbruik afvlakken tot toestand 4. - Na 4 minuten gegevensverzameling van status 4, beëindigt u de opname. Sla het gegevensbestand op.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het huidige manuscript onderzocht de mitochondriale ademhaling van in het wild afgeleide Mus musculus (n = 7, man = 5, vrouw = 2; leeftijd = 1,30 ± 0,2 jaar) in een mobiel mitochondriaal fysiologisch laboratorium (Figuur 1). Om de mitochondriale ademhaling van skeletspieren te meten, werd de hele achterpoot, dus aërobe en anaërobe spier, gebruikt voor mitochondriale isolatie (Figuur 2). Voorbeelden van ruwe mitochondriale ademhalingsgegevens worden weergegeven in figuur 3. Figuur 3A en Figuur 3B geven complexe I-gestuurde mitochondriale ademhaling weer. De steile helling die in figuur 3A wordt waargenomen, vertegenwoordigt de hoge maximale ademhalingsfrequentie. Dit is de waarde die wordt gebruikt voor verdere gegevensanalyse. De succesvolle isolatie van mitochondriën van de skeletspier van de achterpoten wordt waargenomen door de scherpe bocht en de stabilisatie van een nieuwe helling, die toestand 4 bepaalt (Figuur 3B).
Deze gegevens kunnen ook worden geïnterpreteerd als de mitochondriën die goed functioneren vanwege de scherpe bocht om toestand 4 vast te stellen. Een soortgelijk patroon kan worden waargenomen voor complexe II-gestuurde mitochondriale ademhaling (Figuur 3C en Figuur 3D). Figuur 3E,F toont slecht functionerende mitochondriën, hetzij als gevolg van mitochondriale fysiologie, hetzij als gevolg van mislukte mitochondriale ademhaling. Figuur 3E toont de koppeling van de mitochondriën voor complexe I-gestuurde mitochondriale ademhaling, zoals te zien is aan de draai naar toestand 4. Figuur 3F toont echter ontkoppelde complex II mitochondriale ademhaling, zoals blijkt uit een vlakke lijn na toevoeging van ADP, en geen "draai" om toestand 4-gegevens te produceren. Deze gegevens suggereren mogelijke problemen tijdens mitochondriale isolatie, die hieronder worden besproken.
De numerieke waarden van toestand 3, toestand 4 en RCR voor zowel complex I als complex II van deze dieren zijn te vinden in figuur 4. Deze gegevens werden bepaald door 30 s van de steilste helling te meten na toevoeging van ADP om toestand 3 te bepalen (Figuur 3A,C) en de helling na de "bocht" gedurende 1 minuut te meten om toestand 4 te meten (Figuur 3B,D). Zodra deze waarden waren verkregen, werden de gegevens genormaliseerd naar het eiwitgehalte (via Bradford-test22). Met behulp van de genormaliseerde waarden werd de RCR berekend door de waarde van de genormaliseerde toestand 3 te delen door de waarde van de genormaliseerde toestand 4.
Figuur 1: De AU MitoMobile, een mobiel laboratorium voor mitochondriale fysiologie. (A) De buitenkant van de AU MitoMobile. (B) De binnenkant van het voertuig kijkend naar de voorkant waar geen wijzigingen zijn aangebracht. (C) De achterkant van het voertuig met de installatie van de banken, opbergvakken en centrifuge. (D) De opstelling van de apparatuur tijdens het verzamelen van gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mitochondriale isolatie- en ademhalingsmeetprocedure in skeletspieren. (1) Het weefsel wordt van het dier ontleed en in een buffer geplaatst waar het (2) wordt fijngehakt, gehomogeniseerd, behandeld met protease en onderworpen aan centrifugatie totdat de mitochondriale pellet is verkregen. (3) De mitochondriënpellet wordt geresuspendeerd en ademhalingsgegevens worden verkregen. (4) Gegevens over het zuurstofverbruik kunnen worden gebruikt om toestand 3, toestand 4 en RCR te berekenen. Afkorting: RCR = respiratory control ratio. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mitochondriale ademhalingsmetingen met complex I en complex II substraten. Zuurstofverbruik met complexe I-substraten, met de nadruk op de hellingsanalyse van toestand 3 (A) en toestand 4 (B). Zuurstofverbruik met complexe II-substraten, met de nadruk op de hellingsanalyse van toestand 3 (C) en toestand 4 (D). Suboptimale mitochondriale ademhaling kan worden gezien bij complexe I-gestuurde ademhaling (E) en complexe II-gestuurde ademhaling (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gegevens verzameld over huismuizen (Mus musculus) in de AU MitoMobile. Mitochondriale isolatie en ademhaling werden uitgevoerd met behulp van de hier beschreven procedure. Pyruvaat, malaat en glutamaat werden gebruikt om de ademhalingsfrequentie van complex I te bepalen. Succinaat en rotenon werden gebruikt om de ademhalingsfrequenties van complex II te meten. (A) Complex I toestand 3 metingen, (B) complex I toestand 4 metingen, (C) complex I RCR, (D) complex II toestand 3 metingen, (E) complex II toestand 4 metingen, en (F) complex II RCR. Afkorting: RCR = respiratory control ratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Mitochondriën isolatiebuffer voor skeletspieren | ||
| Reagens | met BSA, concentratie (mM) | zonder BSA, concentratie (mM) |
| Kcl | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| Tris-Basis | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| Vetzuurvrije BSA | 0.15% | - |
| Geïsoleerde mitochondriën resuspensiebuffer voor skeletspieren | ||
| Reagens | Concentratie (mM) | |
| Mannitol | 220 | |
| Sacharose | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA | 1 | |
Tabel 1: Mitochondriën-isolatiebuffers (met en zonder BSA) en geïsoleerde mitochondriën-resuspensiebuffer voor skeletspieren.
| Ademhalingsbuffer | |
| Reagens | Concentratie (mM) |
| Kcl | 100 |
| MOPS | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Glucose | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA | 1 |
| Vetzuurvrije BSA | 0.20% |
| Ademhalings substraten | |
| Reagens | Concentratie (mM) |
| Pyruvaat | 200 |
| Malaat | 200 |
| Succinaat | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamaat | 1000 |
Tabel 2: Ademhalingsbuffer en substraten.
| Staat 3 | Staat 4 | RCR | Studeren | Substraten |
| 368,3±80,4 | 68,9±25,0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 mM pyruvaat, 2 mM malaat |
| 241,8±22,5 | 28.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM pyruvaat, 2 mM malaat |
| 285,7±36,5 | 81,9±2,9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 mM succinaat, 4 μM rotenon |
| 493,4±105,4 | 61,3±9,6 | 8.2±2.2 | Huidige studie | 2 mM pyruvaat, 2 mM malaat, 10 mM glutamaat |
| 559,5±74,9 | 165,2±18,5 | 3,4±0,2 | Huidige studie | 5 mM succinaat, 4 μg/μL rotenon |
Tabel 3: Vergelijkende waarden van toestand 3, toestand 4 en RCR. Afkorting: RCR = respiratory control ratio. Toestand 3 en toestand 4 waarden weergegeven in moedervlekken O2/mg eiwit/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het mobiele laboratorium voor mitochondriale fysiologie stelt onderzoekers in staat om mitochondriën te isoleren en mitochondriale ademhalingsfrequenties te meten binnen 2 uur na weefselverzameling op afgelegen veldlocaties. De hierin gepresenteerde resultaten suggereren dat metingen van mitochondriale ademhaling in de AU MitoMobile vergelijkbaar zijn met metingen in een universitair onderzoekslaboratorium. In het bijzonder zijn de hier gepresenteerde waarden voor toestand 3, toestand 4 en RCR voor in het wild afgeleide Mus musculus vergelijkbaar met eerder gepubliceerde resultaten van hetzelfde laboratorium en anderen (tabel 3)12,23. Er moet echter worden opgemerkt dat vanwege de verschillende muizenstammen en gebruikte methoden, een directe vergelijking van deze onderzoeken niet kan worden gemaakt. Deze resultaten demonstreren een proof of concept voor het meten van mitochondriale ademhaling in dit mobiele mitochondriale fysiologische laboratorium.
Alle chemicaliën en materialen die nodig zijn voor de isolatie en ademhaling van mitochondriën kunnen worden vervoerd en opgeslagen in het mobiele laboratorium, waardoor ze gemakkelijk toegankelijk zijn bij het opzetten en uitvoeren van experimenten. Bovendien bieden geïsoleerde mitochondriën verzameld in een mobiel mitochondriaal laboratorium een uniek monster om andere biochemische metingen uit te voeren, zoals de emissie van reactieve zuurstofsoorten. Belangrijk is dat bevroren mitochondriën naar een stationair laboratorium kunnen worden getransporteerd voor aanvullende biochemische metingen (bijv. individuele enzymactiviteiten van de elektronentransportketen). Met name het isoleren van mitochondriën via centrifugatiedifferentiatie is niet de enige methode om mitochondriale ademhaling te meten. Andere laboratoria hebben succesvolle metingen uitgevoerd van mitochondriale ademhaling met gepermeabiliseerde vezels. Hoewel het huidige manuscript deze methode niet beschrijft (voor meer details van gepermeabiliseerde vezels, zie 24,25,26,27,28), is het belangrijk voor lezers om op te merken dat een mobiel mitochondriaal fysiologielaboratorium ook de materialen zou kunnen huisvesten die nodig zijn voor deze procedure. Zie andere beoordelingen over de sterke en zwakke punten van elk van deze methoden25,29,30.
Verschillende laboratoria die mitochondriaal bio-energetica-onderzoek uitvoeren, hebben aanbevelingen voor het oplossen van problemen gepubliceerd die lezers nuttig kunnen vinden15,17. Voor elk experimenteel project moet een enkele batch buffers worden gemaakt om alle gegevens te verzamelen. Het gebruik van buffers die op verschillende dagen zijn gemaakt, creëert de mogelijkheid voor variatie in oplossingen om mitochondriale ademhalingsmetingen te beïnvloeden. Tijdens het isolatieproces treedt schade op aan het buitenste mitochondriale membraan; Een goede uitvoering van de isolatiemethode door middel van laboratoriumtraining kan echter de schade minimaliseren die van nature optreedt bij deze procedure29,31. Tijdens het isolatieproces worden niet-functionele of overmatig beschadigde mitochondriën aangegeven door een witte pluizige mitochondriale pellet in plaats van een compacte bruine pellet. Niet-functionele of beschadigde mitochondriën kunnen worden veroorzaakt door een te hoog toerental tijdens het homogeniseren van het blad, te lang homogeniseren, te veel protease toevoegen of te lang verteren, of te veel slagen die worden gebruikt tijdens de laatste resuspensie van mitochondriën.
Bovendien zal de keuze van welke spier te isoleren en hoeveel spier wordt gebruikt de mitochondriale opbrengst beïnvloeden. Bij een dier met een hogere mitochondriale dichtheid, zoals een vogel21, zullen bijvoorbeeld meer mitochondriën neerslaan in vergelijking met een mix van skeletspiervezeltypes van een achterpoot van een rat. Dit zal ook de hoeveelheid weefsel veranderen die nodig is voor een succesvolle isolatie. Hoe groter de mitochondriale dichtheid in een weefsel, hoe lager de hoeveelheid weefsel die nodig is voor een succesvolle isolatie. Onderzoekers moeten ook rekening houden met het volume mannitol-sucrose-oplossing dat wordt toegevoegd aan de uiteindelijke geïsoleerde mitochondriën. Een dichter opeengepakte mitochondriale pellet heeft een hogere verdunning nodig, terwijl een minder dicht opeengepakte mitochondriale pellet een lagere verdunning nodig heeft. De mate van verdunning hangt af van het dier, de oxidatieve aard van de skeletspier die wordt geïsoleerd en hoe dicht de mitochondriale pellet is opeengepakt.
Het kan een uitdaging zijn om voldoende elektrisch vermogen te hebben om alle apparatuur te ondersteunen die nodig is voor het verzamelen van gegevens in een mobiel laboratorium. Met name de gekoelde centrifuge trekt een hoge stroom tijdens bedrijf (vooral tijdens de beginfase van de afkoelperiode). Daarom moeten speciale overwegingen worden gemaakt om ervoor te zorgen dat het elektrische vermogen van het voertuig overeenkomt met de elektrische vraag van de apparatuur die gelijktijdig moet werken. Een aanbeveling die deze beperking zou kunnen oplossen, is het toevoegen van meer stroombronnen (bijv. extra batterijen, extra generatoren). Met name de methode voor het meten van mitochondriale ademhaling met gepermeabiliseerde vezels vereist geen gebruik van een gekoelde centrifuge en kan ook een oplossing bieden voor de beperkte stroombron. Bij het gebruik van een mobiel laboratorium moet ook rekening worden gehouden met de milieuomstandigheden en de kwaliteit van de wegen. Het mobiele mitochondriale fysiologielaboratorium dat hierin wordt besproken, werd met succes gereden op interstatelijke wegen met helder weer. Onverharde wegen met barre weersomstandigheden zullen het moeilijker maken om het voertuig naar de gewenste locatie te rijden. Hoewel mitochondriale isolatie geen nieuwe methode is, biedt het gebruik ervan in een mobiel laboratorium een unieke manier om mitochondriale energetica in vrijlevende dieren te kwantificeren. Dit kan van cruciaal belang zijn bij het ophelderen van de verschillen tussen laboratorium- en wilde dieren32,33,34. Bovendien stelt het mobiele laboratorium voor mitochondriale fysiologie onderzoekers in staat om energetische beperkingen en energetische extremen te bestuderen die bij dieren in de natuurlijke wereld worden aangetroffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Mark Nelms en John Tennant van de afdeling Electrical and Computer Engineering van het Samuel Ginn College of Engineering aan de Auburn University voor hun hulp bij de structurele en elektrische uitrusting van de AU MitoMobile. Bovendien erkennen de auteurs de financiering om de AU MitoMobile uit te rusten en onderzoek te doen van een Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR) -beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
