Summary
Wir haben ein mobiles Labor entworfen und gebaut, um die Atmungsraten in isolierten Mitochondrien von Wildtieren zu messen, die an Feldstandorten gefangen wurden. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Ausstattung eines mobilen mitochondrialen Labors und die dazugehörigen Laborprotokolle.
Abstract
Die mitochondriale Energetik ist ein zentrales Thema in der Biochemie und Physiologie von Tieren, wobei Forscher die mitochondriale Atmung als Metrik verwenden, um die Stoffwechselfähigkeit zu untersuchen. Um die Messungen der mitochondrialen Atmung zu erhalten, müssen frische biologische Proben verwendet werden, und das gesamte Laborverfahren muss innerhalb von ca. 2 h abgeschlossen sein. Darüber hinaus sind mehrere Spezialgeräte erforderlich, um diese Labortests durchzuführen. Dies stellt eine Herausforderung für die Messung der mitochondrialen Atmung in den Geweben von Wildtieren dar, die weit entfernt von physiologischen Labors leben, da lebendes Gewebe nach der Entnahme im Feld nicht sehr lange konserviert werden kann. Darüber hinaus führt der Transport lebender Tiere über große Entfernungen zu Stress, der die Energetik der Mitochondrien verändern kann.
Dieses Manuskript stellt das MitoMobile der Auburn University (AU) vor, ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie, das vor Ort zur Messung des mitochondrialen Stoffwechsels in Geweben von Wildtieren eingesetzt werden kann. Die Grundzüge des mobilen Labors und die Schritt-für-Schritt-Methoden zur Messung isolierter mitochondrialer Atmungsraten werden vorgestellt. Darüber hinaus bestätigen die präsentierten Daten den Erfolg der Ausstattung des mobilen Labors für mitochondriale Physiologie und der Durchführung von Messungen der mitochondrialen Atmung. Die Neuheit des mobilen Labors liegt in der Möglichkeit, zum Feld zu fahren und mitochondriale Messungen an den Geweben von Tieren durchzuführen, die vor Ort gefangen wurden.
Introduction
Bisher waren Studien zur Messung der mitochondrialen Energetik auf Labortiere oder Tiere beschränkt, die in der Nähe etablierter Physiologielabors gefangen wurden, was Wissenschaftler daran hinderte, mitochondriale bioenergetische Studien an Geweben durchzuführen, die von Tieren während Aktivitäten wie Migration, Tauchen und Winterschlaf gesammelt wurden 1,2,3,4,5,6 . Während viele Forscher erfolgreich die Grund- und Spitzenumsatzraten und den täglichen Energieverbrauch von Wildtieren gemessen haben7,8, ist die Fähigkeit der Forscher, die Leistung der Mitochondrien zu messen, begrenzt geblieben (sieheaber 1,4,9). Dies ist zum Teil auf den Bedarf an frischem Gewebe zur Isolierung von Mitochondrien und einer Laboreinrichtung zurückzuführen, um die Isolierungen innerhalb von etwa 2 Stunden nach der Gewinnung des frischen Gewebes durchzuführen. Sobald die Mitochondrien isoliert wurden, sollten auch die mitochondrialen Atmungsmessungen innerhalb von ~1 h abgeschlossen sein.
Isolierte mitochondriale Atmungsraten werden in der Regel durch Messung der Sauerstoffkonzentration in einem versiegelten Behälter durchgeführt, der mit einer Clark-Elektrode verbunden ist. Die Theorie hinter dieser Methode basiert auf der grundlegenden Beobachtung, dass Sauerstoff der letzte Elektronenakzeptor der mitochondrialen Atmung während der oxidativen Phosphorylierung ist. Wenn die Sauerstoffkonzentration während eines Experiments sinkt, wird daher angenommen, dass die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) stattfindet10. Der verbrauchte Sauerstoff ist ein Proxy für das produzierte ATP. Die Forscher können mit verschiedenen Substraten spezifische Versuchsbedingungen schaffen und eine Adenosindiphosphat (ADP)-stimulierte Atmung (Zustand 3) einleiten, indem sie der Kammer vorgegebene Mengen an ADP hinzufügen. Nach der Phosphorylierung des exogenen ADP zu ATP sinkt die Sauerstoffverbrauchsrate und der Zustand 4 ist erreicht und kann gemessen werden. Darüber hinaus können durch die Zugabe spezifischer Inhibitoren Informationen über die Leckatmung und die entkoppelte Atmung gewonnen werden10. Das Verhältnis von Zustand 3 zu Zustand 4 bestimmt das Atmungskontrollverhältnis (RCR), das der Indikator für die gesamte mitochondriale Kopplung ist10,11. Niedrigere RCR-Werte deuten auf eine allgemeine mitochondriale Dysfunktion hin, während höhere RCR-Werte auf ein größeres Ausmaß der mitochondrialen Kopplung hindeuten10.
Wie bereits erwähnt, müssen die Entnahme von biologischem Material, die mitochondriale Isolierung und die Messung der Atemfrequenz innerhalb von 2 Stunden nach der Gewebeentnahme abgeschlossen sein. Um diese Aufgabe zu erfüllen, ohne die Tiere über große Entfernungen in etablierte Labore zu transportieren, wurde ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie gebaut, das an Feldorte gebracht wird, an denen diese Daten gesammelt werden können. Ein Freizeitfahrzeug des Typs Jayco Redhawk aus dem Jahr 2018 wurde in ein mobiles Labor für molekulare Physiologie umgewandelt und auf den Namen MitoMobile der Auburn University (AU) getauft (Abbildung 1A). Ein Freizeitfahrzeug wurde aufgrund des eingebauten Kühlschranks, des Gefrierschranks, des Wasserspeichers und der Sanitäranlagen, des Stroms mit 12-Volt-Batterien, des Gasgenerators, des Propangastanks und des Selbstnivellierungssystems ausgewählt. Darüber hinaus bietet das Freizeitfahrzeug die Möglichkeit, über Nacht an abgelegenen Standorten zu bleiben, um Daten zu sammeln. Die Front des Fahrzeugs wurde nicht verändert und dient als Fahrer- und Schlafraum (Bild 1B). Zuvor installierte Schlafzimmerausstattungen (Bett, Fernseher und Schrank) im Heck des Fahrzeugs und auf dem Herd wurden entfernt.
Anstelle der Schlafzimmerausstattung und des Herds wurden maßgefertigte Edelstahlregale und eine maßgefertigte Quarz-Arbeitsplatte installiert, die von einem 80/20-Aluminiumrahmen getragen wird (Abbildung 1C). Die Labortische bieten ausreichend Platz für die Datenerfassung (Abbildung 1D). Der Stromverbrauch der einzelnen Geräte (d. h. gekühlte Zentrifugen, mitochondriale Atmungskammern, Plattenleser, Computer, Homogenisatoren, Waagen, tragbare Ultrafroster und andere allgemeine Labormaterialien) wurde berücksichtigt. Um den hohen Spannungs- und Stromanforderungen der Zentrifuge gerecht zu werden, wurde das elektrische System auf das von Flugzeuggeräten aufgerüstet. Ein externes Fach im Heck des Fahrzeugs wurde zu einer Lagerbucht für flüssigen Stickstoff umgebaut, die den Richtlinien des US-Verkehrsministeriums für die Lagerung und den Transport von flüssigem Stickstoff entspricht. Dieser Speicher wurde aus Edelstahl gefertigt und verfügt über eine entsprechende Entlüftung, um zu verhindern, dass sich ausdehnendes Stickstoffgas in den Fahrgastraum des Fahrzeugs gelangt.
Um zu bestätigen, dass das mobile Labor in mitochondrialen bioenergetischen Studien eingesetzt werden kann, wurden Mitochondrien isoliert und mitochondriale Atmungsraten von wild gewonnenen Hausmäusen (Mus musculus) des Skelettmuskels der hinteren Gliedmaßen gemessen. Da Mus musculus ein Modellorganismus ist, sind die mitochondrialen Atmungsraten dieser Spezies gut etabliert12,13,14. Obwohl frühere Studien die mitochondriale Isolierung mittels Differentialzentrifugation dokumentiert haben15,16,17, wird im Folgenden ein kurzer Überblick über die Methoden der mobilen mitochondrialen Physiologie im Labor beschrieben.
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Protocol
In den folgenden Abschnitten werden die mitochondrialen Labormethoden beschrieben. Alle Verfahren zur Handhabung von Tieren und zur Gewebeentnahme wurden vom Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (#2019-3582).
1. Beschreibung der für die Datenerhebung verwendeten Puffer
HINWEIS: Diese Puffer können in einem stationären Labor hergestellt und vor der Exkursion in das mobile Labor gebracht werden (sofern unten nicht anders angegeben).
- Bereiten Sie den mitochondrialen Isolationspuffer der Skelettmuskulatur mit Rinderserumalbumin (BSA) vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.
- Lösen Sie Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf, mit Ausnahme der fettsäurefreien BSA. Stellen Sie den Puffer in den Kühlschrank, bis die Temperatur 4 °C beträgt.
- Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein, während Sie die Temperatur bei 4 °C halten.
- Fügen Sie das fettsäurefreie BSA hinzu und erhöhen Sie das Volumen auf 100%. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Bereiten Sie den mitochondrialen Isolationspuffer der Skelettmuskulatur ohne BSA vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.
- Lösen Sie die Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf. Stellen Sie den Puffer in den Kühlschrank, bis die Temperatur 4 °C beträgt.
- Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein, während Sie die Temperatur bei 4 °C halten.
- Erhöhen Sie die Lautstärke auf 100 %. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Bereiten Sie den Puffer für die Resuspension der Skelettmuskulatur vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.
- Lösen Sie die Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf. Stellen Sie den Puffer in den Kühlschrank, bis die Temperatur 4 °C beträgt.
- Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 ein, während Sie die Temperatur bei 4 °C halten.
- Erhöhen Sie die Lautstärke auf 100 %. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Bereiten Sie den Puffer für die Skelettmuskelatmung vor, wie in Tabelle 2 dargestellt.
- Lösen Sie die Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf, mit Ausnahme des fettsäurefreien BSA. Erhitzen Sie den Puffer, bis die Temperatur 37 °C beträgt.
- Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 ein, während Sie die Temperatur bei 37 °C halten.
- Fügen Sie das fettsäurefreie BSA hinzu und erhöhen Sie das Volumen auf 100%. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Bereiten Sie die Atmungssubstrate wie in Tabelle 2 dargestellt vor.
- Stellen Sie sicher, dass diese Substrate am Tag der Datenerfassung in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, frisch hergestellt werden. Bis zur Verwendung auf Eis lagern.
ANMERKUNG: Die angegebenen Werte sollen eine ausreichend konzentrierte Lösung ergeben, damit genügend Substrat von den Mitochondrien aufgenommen werden kann. Die Endkonzentrationen der Substrate sind 2 mM Pyruvat, 2 mM Malat, 10 mM Glutamat und 5 mM Succinat.
- Stellen Sie sicher, dass diese Substrate am Tag der Datenerfassung in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, frisch hergestellt werden. Bis zur Verwendung auf Eis lagern.
2. Durchführung der mitochondrialen Isolierung (Abbildung 2)
HINWEIS: Messungen der mitochondrialen Isolierung und der mitochondrialen Atmung werden im Laborbereich des mobilen Labors durchgeführt, und alle Lösungen sollten bei 4 °C aufbewahrt werden, sofern nicht anders angegeben.
- Parken Sie das mobile Labor auf ebenem Gelände. Schalten Sie den Generator ein und nivellieren Sie das Fahrzeug. Fahren Sie die Rutsche aus und richten Sie das Gerät ein.
- Tauen Sie die gewünschten Mengen an Puffern auf.
HINWEIS: Im Allgemeinen werden pro Muskel 30 ml Skelettmuskelisolationspuffer und 10 ml Skelettmuskelisolationspuffer ohne BSA benötigt. - Richten Sie die mitochondrialen Atemkammern ein und kalibrieren Sie sie auf die gewünschte Temperatur der Experimente und den aktuellen Luftdruck gemäß den Anweisungen des Herstellers. In der Materialtabelle finden Sie spezifische Kammern, die in Experimenten verwendet werden.
- Euthanasieren Sie das Tier durch Enthauptung.
ANMERKUNG: In der aktuellen Studie wurde die Enthauptung zur Euthanasie verwendet. Einige Gase, wie Kohlendioxid und Isofluran, beeinflussen die mitochondriale Funktion18,19,20; Diese Effekte sollten bei der Auswahl der besten Euthanasiemethode für jede Studie berücksichtigt werden. Welche Methode für jede Studie durchgeführt werden soll, hängt von der gestellten wissenschaftlichen Fragestellung ab. - Entfernen Sie die Skelettmuskulatur, schneiden Sie Fett und Bindegewebe schnell ab, wiegen Sie sie und legen Sie den Muskel in einen Skelettmuskelisolationspuffer mit BSA (mindestens 1/10 w/v) (z. B. 1 g Skelettmuskel auf 10 ml Puffer).
- Hacken Sie den Skelettmuskel mit einer Schere auf Eis.
- Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe mit einer abgeschnittenen 5-ml-Pipettenspitze in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Homogenisieren Sie es mit einer Klinge (siehe Materialtabelle) bei 50 % Leistung für 5 Sekunden. Fügen Sie Protease (5 mg/g feuchter Muskel) hinzu und verdauen Sie sie 7 Minuten lang, wobei die Lösung alle 30 Sekunden gemischt wird. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie ein gleiches Volumen des Isolationspuffers mit BSA hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 500 × g für 10 min. Übertragen Sie den Überstand durch ein doppellagiges Mulltuch mit einer abgeschnittenen 5-ml-Pipettenspitze in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.500 × g für 10 Minuten, um ein braunes mitochondriales Pellet auszufällen.
- Gießen Sie den restlichen Überstand aus. Geben Sie das gleiche Volumen des Isolationspuffers mit BSA in das Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet mit einem flexiblen Schaber (Polizist), indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten. Bei 3.500 × g 10 min zentrifugieren.
- Gießen Sie den restlichen Überstand aus. Geben Sie das gleiche Volumen des Isolationspuffers ohne BSA in das Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet, indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig mit einem sauberen Polizisten von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten. Bei 3.500 × g 10 min zentrifugieren.
- Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet im Resuspensionspuffer, indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig mit einem sauberen Polizisten von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten.
HINWEIS: Das Volumen des Resuspensionspuffers hängt von der Größe des Mitochondrienpellets ab. - Übertragen Sie die resuspendierten Mitochondrien in einen Dounce-Homogenisator mit einer abgeschnittenen 1-ml-Pipettenspitze. Mit dem Dounce-Homogenisator die Suspension mit 4-5 Durchgängen vorsichtig homogenisieren.
- Geben Sie die mitochondriale Suspension in ein beschriftetes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer weiteren abgeschnittenen 1-ml-Pipettenspitze.
3. Messungen der mitochondrialen Atmung (Abbildung 3)
- Komplexe I-Substrate
- 945 μl Atmungspuffer in die Kammer geben. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührer dreht und die Puffertemperatur bei 37 °C gehalten wird. Starten Sie die Aufzeichnung der Datenerfassung.
- Nachdem sich die Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, fügen Sie 20 μl der Mitochondrien hinzu und legen Sie den Deckel auf die Kammer. Geben Sie in der Software an, dass der Kammer Mitochondrien hinzugefügt wurden.
- Geben Sie 10 μl 1 M Glutamat, 10 μl 200 mM Malat und 10 μl 200 mM Pyruvat in die Kammer mit den einzelnen Spritzen und warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat. Geben Sie in der Software an, dass Substrate hinzugefügt wurden.
HINWEIS: Diese Substrate werden in der Regel verwendet, um die kohlenhydratgesteuerte Atmung zu messen. Für andere Kombinationen von Substraten, die zur Messung der fettgetriebenen Atmung verwendet werden sollen, siehe21. - Geben Sie 5 μl ADP mit einer separaten Spritze hinzu und beobachten Sie den schnellen Sauerstoffverbrauch (Zustand 3). Geben Sie in der Software an, dass ADP hinzugefügt wurde.
HINWEIS: Nach der Phosphorylierung des zugesetzten ADP wird sich die Sauerstoffverbrauchsrate auf Zustand 4 einpendeln. - Beenden Sie die Aufzeichnung nach 4 Minuten der Datenerfassung im Zustand 4. Speichern Sie die Datendatei.
- Komplexe II-Substrate
- Geben Sie 963 μl des Atempuffers in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührer dreht und die Puffertemperatur bei 37 °C gehalten wird. Starten Sie die Aufzeichnung der Datenerfassung.
- Nachdem sich die Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, fügen Sie 20 μl Mitochondrien hinzu und legen Sie den Deckel auf die Kammer. Geben Sie in der Software an, dass der Lösung Mitochondrien hinzugefügt wurden.
- Geben Sie 2 μl 4 μg/μl Rotenon gefolgt von 10 μl 500 mM Succinat mit separaten Spritzen in die Kammer und warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat. Geben Sie in der Software an, dass Substrate hinzugefügt wurden.
- Geben Sie 5 μl ADP mit einer separaten Spritze hinzu und beobachten Sie den schnellen Sauerstoffverbrauch (Zustand 3). Geben Sie in der Software an, dass ADP hinzugefügt wurde.
HINWEIS: Nach der Phosphorylierung des zugesetzten ADP wird sich die Sauerstoffverbrauchsrate auf Zustand 4 einpendeln. - Beenden Sie die Aufzeichnung nach 4 Minuten der Datenerfassung im Zustand 4. Speichern Sie die Datendatei.
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Representative Results
Das vorliegende Manuskript untersuchte die mitochondriale Atmung von wild gewonnenem Mus musculus (n = 7, männlich = 5, weiblich = 2; Alter = 1,30 ± 0,2 Jahre) in einem mobilen Labor für mitochondriale Physiologie (Abbildung 1). Um die mitochondriale Atmung der Skelettmuskulatur zu messen, wurde die gesamte Hintergliedmaße, also der aerobe und anaerobe Muskel, zur mitochondrialen Isolierung verwendet (Abbildung 2). Beispiele für rohe Daten zur mitochondrialen Atmung sind in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3A und Abbildung 3B stellen die komplexe I-gesteuerte mitochondriale Atmung dar. Der in Abbildung 3A beobachtete steile Hang stellt die hohe maximale Atemfrequenz dar. Dies ist der Wert, der für die weitere Datenanalyse verwendet wird. Die erfolgreiche Isolierung der Mitochondrien aus dem Skelettmuskel der Hintergliedmaßen wird durch die scharfe Kurve und die Stabilisierung einer neuen Neigung beobachtet, die den Zustand 4 bestimmt (Abbildung 3B).
Diese Daten können auch so interpretiert werden, dass die Mitochondrien aufgrund der scharfen Drehung zum Zustand 4 hochfunktional sind. Ein ähnliches Muster kann für die komplexe II-gesteuerte mitochondriale Atmung beobachtet werden (Abbildung 3C und Abbildung 3D). Abbildung 3E,F zeigen schlecht funktionierende Mitochondrien, entweder aufgrund der mitochondrialen Physiologie oder einer erfolglosen mitochondrialen Atmung. Abbildung 3E zeigt die Kopplung der Mitochondrien für die komplexe I-gesteuerte mitochondriale Atmung, wie sie durch die Wende in Zustand 4 zu sehen ist. Abbildung 3F zeigt jedoch eine entkoppelte mitochondriale Komplex-II-Atmung, die durch eine flache Linie nach der Zugabe von ADP demonstriert wird, und keine "Drehung" zur Erzeugung von Zustand-4-Daten. Diese Daten deuten auf mögliche Probleme während der mitochondrialen Isolierung hin, die im Folgenden diskutiert werden.
Die numerischen Werte von Zustand 3, Zustand 4 und RCR sowohl für Komplex I als auch für Komplex II dieser Tiere sind in Abbildung 4 zu finden. Diese Daten wurden ermittelt, indem 30 s der steilsten Steigung nach der Zugabe von ADP gemessen wurde, um den Zustand 3 zu bestimmen (Abbildung 3A, C) und die Steigung nach der "Wende" für 1 Minute gemessen wurde, um Zustand 4 zu messen (Abbildung 3B, D). Sobald diese Werte erhalten waren, wurden die Daten auf den Proteingehalt normalisiert (über Bradford-Assay22). Unter Verwendung der normalisierten Werte wurde die RCR berechnet, indem der normalisierte Wert für den Zustand 3 durch den normalisierten Wert für den Zustand 4 dividiert wurde.
Abbildung 1: Das AU MitoMobile, ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie. (A) Die Außenseite des AU MitoMobils. (B) Das Innere des Fahrzeugs nach vorne, wo keine Änderungen vorgenommen wurden. (C) Das Heck des Fahrzeugs, auf dem der Einbau der Sitzbänke, der Staufächer und der Zentrifuge zu sehen ist. (D) Die Einrichtung des Geräts während der Datenerfassung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mitochondriale Isolierung und Atmungsmessverfahren in der Skelettmuskulatur. (1) Gewebe wird vom Tier präpariert und in einen Puffer gelegt, wo es (2) zerkleinert, homogenisiert, mit Protease behandelt und einer Zentrifugation unterzogen wird, bis das mitochondriale Pellet erhalten wird. (3) Das Mitochondrien-Pellet wird resuspendiert und es werden Atmungsdaten gewonnen. (4) Sauerstoffverbrauchsdaten können zur Berechnung von Zustand 3, Zustand 4 und RCR verwendet werden. Abkürzung: RCR = Respiratory Control Ratio. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messungen der mitochondrialen Atmung mit Komplex-I- und Komplex-II-Substraten. Sauerstoffverbrauch mit komplexen I-Substraten, wobei die Steigungsanalyse von Zustand 3 (A) und Zustand 4 (B) hervorgehoben wird. Sauerstoffverbrauch mit komplexen II-Substraten unter Hervorhebung der Steigungsanalyse von Zustand 3 (C) und Zustand 4 (D). Eine suboptimale mitochondriale Atmung zeigt sich bei der komplexen I-gesteuerten Atmung (E) und der komplexen II-gesteuerten Atmung (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Daten, die an Hausmäusen (Mus musculus) im AU MitoMobile gesammelt wurden. Die mitochondriale Isolierung und die Atmung wurden mit dem hier beschriebenen Verfahren durchgeführt. Pyruvat, Malat und Glutamat wurden verwendet, um komplexe I-Atemraten zu bestimmen. Succinat und Rotenon wurden verwendet, um die Komplex-II-Atemfrequenz zu messen. (A) Komplex-I-Zustand-3-Messungen, (B) Komplex-I-Zustand-4-Messungen, (C) Komplex-I-RCR-Messungen, (D) Komplex-II-Zustand-3-Messungen, (E) Komplex-II-Zustand-4-Messungen und (F) Komplex-II-RCR-Messungen. Abkürzung: RCR = Respiratory Control Ratio. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Mitochondrien-Isolationspuffer für die Skelettmuskulatur | ||
| Reagenz | mit BSA, Konzentration (mM) | ohne BSA, Konzentration (mM) |
| Kcl | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| Tris-Base | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| Fettsäurefreies BSA | 0.15% | - |
| Isolierter Mitochondrien-Resuspensionspuffer für die Skelettmuskulatur | ||
| Reagenz | Konzentration (mM) | |
| Mannit | 220 | |
| Saccharose | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA | 1 | |
Tabelle 1: Mitochondrien-Isolationspuffer (mit und ohne BSA) und isolierter Mitochondrien-Resuspensionspuffer für die Skelettmuskulatur.
| Puffer für die Atmung | |
| Reagenz | Konzentration (mM) |
| Kcl | 100 |
| MOPS | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Traubenzucker | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA | 1 |
| Fettsäurefreies BSA | 0.20% |
| Substrate für die Atmung | |
| Reagenz | Konzentration (mM) |
| Pyruvat | 200 |
| Malat | 200 |
| Succinat | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamat | 1000 |
Tabelle 2: Atmungspuffer und Substrate.
| Zustand 3 | Zustand 4 | RCR | Studieren | Substrate |
| 368,3±80,4 | 68,9±25,0 | 5,8±1,6 | 12 | 2 mM Pyruvat, 2 mM Malat |
| 241,8±22,5 | 28,9±3,2 | 8,3±1,9 | 23 | 5 mM Pyruvat, 2 mM Malat |
| 285,7±36,5 | 81,9±2,9 | 3,5±1,0 | 23 | 10 mM Succinat, 4 μM Rotenon |
| 493,4±105,4 | 61,3±9,6 | 8.2±2.2 | Aktuelle Studie | 2 mM Pyruvat, 2 mM Malat, 10 mM Glutamat |
| 559,5±74,9 | 165,2±18,5 | 3,4±0,2 | Aktuelle Studie | 5 mM Succinat, 4 μg/μL Rotenon |
Tabelle 3: Vergleichswerte von Zustand 3, Zustand 4 und RCR. Abkürzung: RCR = Respiratory Control Ratio. Zustand 3 und Zustand 4 Werte in nmol O2/mg Protein/min.
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Discussion
Das mobile Labor für mitochondriale Physiologie ermöglicht es Forschern, Mitochondrien zu isolieren und die mitochondriale Atmungsrate innerhalb von 2 Stunden nach der Gewebeentnahme an entfernten Feldstandorten zu messen. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Messungen der mitochondrialen Atmung, die im AU MitoMobile durchgeführt wurden, mit Messungen in einem universitären Forschungslabor vergleichbar sind. Insbesondere sind die hier vorgestellten Werte für Zustand 3, Zustand 4 und RCR für wild gewonnenen Mus musculus vergleichbar mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen aus demselben Labor und anderen (Tabelle 3)12,23. Es ist jedoch zu beachten, dass aufgrund unterschiedlicher Mäusestämme und verwendeter Methoden ein direkter Vergleich dieser Studien nicht möglich ist. Diese Ergebnisse zeigen den Machbarkeitsnachweis für die Messung der mitochondrialen Atmung in diesem mobilen Labor für mitochondriale Physiologie.
Alle Chemikalien und Materialien, die für die Isolierung und Atmung der Mitochondrien benötigt werden, können innerhalb des mobilen Labors transportiert und gelagert werden, was einen einfachen Zugang beim Aufbau und der Durchführung von Experimenten ermöglicht. Darüber hinaus bieten isolierte Mitochondrien, die in einem mobilen mitochondrialen Labor gesammelt wurden, eine einzigartige Probe für die Durchführung anderer biochemischer Messungen, wie z. B. die Emission reaktiver Sauerstoffspezies. Wichtig ist, dass gefrorene Mitochondrien für zusätzliche biochemische Messungen (z. B. Enzymaktivitäten einzelner Elektronentransportketten) in ein stationäres Labor transportiert werden können. Bemerkenswert ist, dass die Isolierung von Mitochondrien durch Zentrifugationsdifferenzierung nicht die einzige Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung ist. Andere Labore haben erfolgreiche Messungen der mitochondrialen Atmung mit permeabilisierten Fasern durchgeführt. Obwohl das aktuelle Manuskript diese Methode nicht beschreibt (für weitere Details zu permeabilisierten Fasern siehe 24,25,26,27,28), ist es für die Leser wichtig zu beachten, dass ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie auch die für dieses Verfahren benötigten Materialien beherbergen könnte. Bitte beachten Sie andere Bewertungen zu den Stärken und Schwächen jeder dieser Methoden25,29,30.
Mehrere Laboratorien, die mitochondriale Bioenergetikforschung betreiben, haben Empfehlungen zur Fehlerbehebung veröffentlicht, die für die Leser hilfreich sein könnten15,17. Für jedes einzelne experimentelle Projekt sollte ein einziger Stapel von Puffern erstellt werden, um alle Daten zu sammeln. Die Verwendung von Puffern, die an verschiedenen Tagen hergestellt werden, bietet die Möglichkeit, die Lösungen zu variieren, um die Messungen der mitochondrialen Atmung zu beeinflussen. Während des Isolationsprozesses kommt es zu einer Schädigung der äußeren Mitochondrienmembran; Die ordnungsgemäße Durchführung des Isolationsverfahrens durch Labortraining kann jedoch den Schaden minimieren, der bei diesem Verfahren auf natürliche Weise auftritt29,31. Während des Isolierungsprozesses werden nicht funktionsfähige oder übermäßig beschädigte Mitochondrien durch ein weißes, flauschiges mitochondriales Pellet anstelle eines kompakten braunen Pellets angezeigt. Nicht funktionsfähige oder beschädigte Mitochondrien können durch eine übermäßige Drehzahl während der Blatthomogenisierung, eine zu lange Homogenisierung, die Zugabe von zu viel Protease oder eine zu lange Verdauung oder zu viele Schläge während der endgültigen Resuspension der Mitochondrien verursacht werden.
Darüber hinaus wirkt sich die Entscheidung, welcher Muskel isoliert werden soll und wie viel Muskel verwendet wird, auf die mitochondriale Ausbeute aus. Zum Beispiel werden bei einem Tier mit einer höheren mitochondrialen Dichte, wie z. B. einem Vogel21, mehr Mitochondrien ausgefällt als bei einer Mischung von Skelettmuskelfasertypen aus einer Hintergliedmaße einer Ratte. Dadurch ändert sich auch die Menge an Gewebe, die für eine erfolgreiche Isolierung benötigt wird. Je größer die mitochondriale Dichte in einem Gewebe ist, desto geringer ist die Menge an Gewebe, die für eine erfolgreiche Isolierung benötigt wird. Forscher sollten auch das Volumen der Mannitol-Saccharose-Lösung berücksichtigen, die den endgültigen isolierten Mitochondrien hinzugefügt wird. Ein dichter gepacktes mitochondriales Pellet benötigt eine höhere Verdünnung, während ein weniger dicht gepacktes mitochondriales Pellet eine geringere Verdünnung benötigt. Das Ausmaß der Verdünnung hängt vom Tier ab, von der oxidativen Natur des zu isolierenden Skelettmuskels und davon, wie dicht das mitochondriale Pellet gepackt ist.
Es kann eine Herausforderung sein, genügend elektrische Energie zu haben, um alle Geräte zu unterstützen, die für die Datenerfassung in einem mobilen Labor benötigt werden. Bemerkenswert ist, dass die gekühlte Zentrifuge während des Betriebs (insbesondere in den ersten Phasen der Abkühlung) einen hohen Strom verbraucht. Daher sollten besondere Überlegungen angestellt werden, um sicherzustellen, dass die elektrische Leistung des Fahrzeugs dem elektrischen Bedarf der Geräte entspricht, die für den gleichzeitigen Betrieb erforderlich sind. Eine Empfehlung, die diese Einschränkung beheben könnte, ist das Hinzufügen weiterer Stromquellen (z. B. zusätzliche Batterien, zusätzliche Generatoren). Bemerkenswert ist, dass die Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung mit permeabilisierten Fasern nicht den Einsatz einer gekühlten Zentrifuge erfordert und auch eine Lösung für die begrenzte Energiequelle liefern könnte. Auch die Umweltbedingungen und die Straßenqualität sollten beim Einsatz eines mobilen Labors berücksichtigt werden. Das hier besprochene mobile Labor für mitochondriale Physiologie wurde erfolgreich auf Autobahnen bei klarem Wetter gefahren. Unbefestigte Straßen mit rauem Wetter stellen größere Schwierigkeiten dar, das Fahrzeug zum gewünschten Ort zu fahren. Obwohl die mitochondriale Isolierung keine neue Methode ist, bietet ihr Einsatz in einem mobilen Labor eine einzigartige Möglichkeit, die mitochondriale Energetik bei freilebenden Tieren zu quantifizieren. Dies kann entscheidend sein, um die Unterschiede zwischen Labor- und Wildtieren aufzuklären32,33,34. Darüber hinaus ermöglicht das mobile Labor für mitochondriale Physiologie den Forschern, energetische Einschränkungen und energetische Extreme zu untersuchen, die bei Tieren in der Natur zu finden sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Mark Nelms und John Tennant von der Abteilung für Elektro- und Computertechnik des Samuel Ginn College of Engineering an der Auburn University für ihre Hilfe bei der strukturellen und elektrischen Ausstattung des AU MitoMobile. Darüber hinaus würdigen die Autoren die Finanzierung für die Ausstattung des AU MitoMobile und die Forschung aus einem Stipendium des Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
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