Summary
Diseñamos y construimos un laboratorio móvil para medir las tasas de respiración en mitocondrias aisladas de animales silvestres capturados en lugares de campo. Aquí, describimos el diseño y equipamiento de un laboratorio mitocondrial móvil y los protocolos de laboratorio asociados.
Abstract
La energética mitocondrial es un tema central en la bioquímica y fisiología animal, y los investigadores utilizan la respiración mitocondrial como métrica para investigar la capacidad metabólica. Para obtener las medidas de respiración mitocondrial, se deben utilizar muestras biológicas frescas y se debe completar todo el procedimiento de laboratorio en aproximadamente 2 h. Además, se requieren múltiples equipos especializados para realizar estos ensayos de laboratorio. Esto crea un desafío para medir la respiración mitocondrial en los tejidos de animales salvajes que viven lejos de los laboratorios de fisiología, ya que el tejido vivo no se puede conservar durante mucho tiempo después de la recolección en el campo. Además, el transporte de animales vivos a largas distancias induce estrés, lo que puede alterar la energía mitocondrial.
Este manuscrito presenta el MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU), un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial que se puede llevar al campo y utilizar in situ para medir el metabolismo mitocondrial en tejidos recolectados de animales salvajes. Se presentan las características básicas del laboratorio móvil y los métodos paso a paso para medir las tasas de respiración mitocondrial aisladas. Además, los datos presentados validan el éxito de equipar el laboratorio móvil de fisiología mitocondrial y realizar mediciones de la respiración mitocondrial. La novedad del laboratorio móvil radica en la capacidad de conducir hasta el campo y realizar mediciones mitocondriales en los tejidos de los animales capturados in situ.
Introduction
Hasta la fecha, los estudios diseñados para medir la energía mitocondrial se han limitado a animales de laboratorio o animales capturados cerca de laboratorios de fisiología establecidos, lo que impidió a los científicos realizar estudios bioenergéticos mitocondriales en tejidos recolectados de animales durante actividades tales como migración, buceo e hibernación 1,2,3,4,5,6 . Si bien muchos investigadores han medido con éxito las tasas metabólicas basales y máximas y los gastos energéticos diarios de los animales salvajes7,8, la capacidad de los investigadores para medir el rendimiento de las mitocondrias ha seguido siendo limitada (pero ver 1,4,9). Esto se debe en parte a la necesidad de tejido fresco para aislar las mitocondrias y a una instalación de laboratorio para realizar los aislamientos dentro de aproximadamente 2 horas después de obtener el tejido fresco. Una vez que se han aislado las mitocondrias, las mediciones de la respiración mitocondrial también deben completarse dentro de ~ 1 h.
Las frecuencias respiratorias mitocondriales aisladas generalmente se realizan midiendo la concentración de oxígeno en un recipiente sellado conectado a un electrodo Clark. La teoría detrás de este método se basa en la observación básica de que el oxígeno es el último aceptor de electrones de la respiración mitocondrial durante la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, a medida que la concentración de oxígeno disminuye durante un experimento, se supone que se produce la producción de trifosfato de adenosina (ATP)10. El oxígeno consumido es un indicador del ATP producido. Los investigadores pueden crear condiciones experimentales específicas utilizando diferentes sustratos e iniciar la respiración estimulada por difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) mediante la adición de cantidades predeterminadas de ADP a la cámara. Después de la fosforilación del ADP exógeno a ATP, la tasa de consumo de oxígeno disminuye y se alcanza el estado 4 y se puede medir. Además, la adición de inhibidores específicos permite obtener información sobre la respiración por fuga y la respiración desacoplada10. La relación entre el estado 3 y el estado 4 determina la relación de control respiratorio (RCR), que es el indicador del acoplamiento mitocondrial global10,11. Los valores más bajos de RCR indican una disfunción mitocondrial general, mientras que los valores más altos de RCR sugieren un mayor grado de acoplamiento mitocondrial10.
Como se indicó anteriormente, la recolección de material biológico, el aislamiento mitocondrial y la medición de las tasas respiratorias deben completarse dentro de las 2 h posteriores a la obtención del tejido. Para llevar a cabo esta tarea sin transportar animales a grandes distancias a laboratorios establecidos, se construyó un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial para llevarlo a lugares de campo donde se pueden recopilar estos datos. Un vehículo recreativo Jayco Redhawk de 2018 se convirtió en un laboratorio móvil de fisiología molecular y se llamó MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU) (Figura 1A). Se seleccionó un vehículo recreativo debido al refrigerador, congelador, tanque de almacenamiento de agua y plomería incorporados, electricidad alimentada por baterías de 12 voltios, generador de gas, tanque de propano y sistema de autonivelación. Además, el vehículo recreativo ofrece la capacidad de permanecer en sitios remotos durante la noche para la recopilación de datos. La parte delantera del vehículo no fue alterada y proporciona los cuartos de conducción y dormitorio (Figura 1B). Se retiraron las amenidades del dormitorio previamente instaladas (cama, TV y gabinete) en la parte trasera del vehículo y la estufa.
Se instalaron estanterías de acero inoxidable hechas a medida y una encimera de cuarzo personalizada sostenida por un marco de aluminio 80/20 en lugar de las comodidades del dormitorio y la estufa (Figura 1C). Las mesas de laboratorio proporcionan un espacio adecuado para la recolección de datos (Figura 1D). Se tuvo en cuenta el consumo de energía de cada equipo (es decir, centrífuga refrigerada, cámaras de respiración mitocondrial, lectores de placas, computadoras, homogeneizadores, básculas, ultracongeladores portátiles y otros suministros generales de laboratorio). Para soportar las grandes demandas de voltaje y corriente de la centrífuga, el sistema eléctrico se actualizó al de un equipo de grado aeronáutico. Un compartimiento externo en la parte trasera del vehículo se convirtió en una bahía de almacenamiento de nitrógeno líquido, que cumple con las pautas del Departamento de Transporte de los Estados Unidos para el almacenamiento y transporte de nitrógeno líquido. Esta unidad de almacenamiento fue construida con acero inoxidable y tiene una ventilación adecuada para evitar que el gas nitrógeno en expansión se filtre en el compartimiento de pasajeros del vehículo.
Para confirmar que el laboratorio móvil se puede utilizar en estudios bioenergéticos mitocondriales, se aislaron mitocondrias y se midieron las tasas de respiración mitocondrial del músculo esquelético de las extremidades traseras de ratones domésticos silvestres (Mus musculus). Debido a que Mus musculus es un organismo modelo, las tasas de respiración mitocondrial de esta especie están bien establecidas12,13,14. Aunque estudios previos han documentado el aislamiento mitocondrial a través de la centrifugación diferencial15,16,17, a continuación se describe una breve descripción de los métodos utilizados en los métodos móviles de laboratorio de fisiología mitocondrial.
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Protocol
En las siguientes secciones se describen los métodos de laboratorio mitocondrial. Todos los procedimientos de manejo de animales y recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Auburn (#2019-3582).
1. Descripción de los buffers utilizados para la recogida de datos
NOTA: Estos tampones pueden prepararse en un laboratorio estacionario y trasladarse al laboratorio móvil antes de la excursión (a menos que se indique lo contrario a continuación).
- Preparar el tampón de aislamiento mitocondrial del músculo esquelético con albúmina sérica bovina (BSA), como se observa en la Tabla 1.
- Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen) excepto el BSA libre de ácidos grasos. Coloque el tampón en el refrigerador hasta que la temperatura sea de 4 °C.
- Ajuste la solución a un pH de 7,5 manteniendo la temperatura a 4 °C.
- Agregue el BSA sin ácidos grasos y suba el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
- Prepare el tampón de aislamiento mitocondrial del músculo esquelético sin BSA como se ve en la Tabla 1.
- Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen). Coloque el tampón en el refrigerador hasta que la temperatura sea de 4 °C.
- Ajuste la solución a un pH de 7,5 manteniendo la temperatura a 4 °C.
- Sube el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
- Prepare el tampón de resuspensión del músculo esquelético como se ve en la Tabla 1.
- Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen). Coloque el tampón en el refrigerador hasta que la temperatura sea de 4 °C.
- Ajuste la solución a un pH de 7,4 manteniendo la temperatura a 4 °C.
- Sube el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
- Prepare el tampón de respiración del músculo esquelético como se ve en la Tabla 2.
- Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen) excepto el BSA libre de ácidos grasos. Calentar el tampón hasta que la temperatura sea de 37 °C.
- Ajuste la solución a un pH de 7,0 manteniendo la temperatura a 37 °C.
- Agregue el BSA sin ácidos grasos y suba el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
- Prepare los sustratos de respiración como se ve en la Tabla 2.
- Asegúrese de que estos sustratos se hagan frescos el día de la recolección de datos en 100 mM de Tris-HCl, pH 7.4. Almacene en hielo hasta su uso.
NOTA: Los valores proporcionados son para hacer una solución suficientemente concentrada para que las mitocondrias absorban suficiente sustrato. Las concentraciones finales de los sustratos son 2 mM de piruvato, 2 mM de malato, 10 mM de glutamato y 5 mM de succinato.
- Asegúrese de que estos sustratos se hagan frescos el día de la recolección de datos en 100 mM de Tris-HCl, pH 7.4. Almacene en hielo hasta su uso.
2. Realización del aislamiento mitocondrial (Figura 2)
NOTA: Las mediciones de aislamiento mitocondrial y respiración mitocondrial se realizan en el área de la mesa de laboratorio del laboratorio móvil, y todas las soluciones deben mantenerse a 4 °C a menos que se indique lo contrario.
- Estacione el laboratorio móvil en un terreno plano. Encienda el generador y nivele el vehículo. Extienda el tobogán y configure el equipo.
- Descongele las cantidades deseadas de tampones.
NOTA: Generalmente, se necesitan 30 ml de tampón de aislamiento del músculo esquelético y 10 ml de tampón de aislamiento del músculo esquelético sin BSA por músculo. - Configure y calibre las cámaras de respiración mitocondrial a la temperatura deseada de los experimentos y a la presión barométrica actual según las instrucciones del fabricante. Consulte la Tabla de materiales para conocer las cámaras específicas utilizadas en los experimentos.
- Sacrificar al animal a través de la decapitación.
NOTA: El presente estudio utilizó la decapitación para la eutanasia. Algunos gases, como el dióxido de carbono y el isoflurano, afectan la función mitocondrial18,19,20; Estos efectos deben tenerse en cuenta a la hora de seleccionar el mejor método de eutanasia para cada estudio. El método que se debe realizar para cada estudio estará determinado por la pregunta científica que se haga. - Extirpar el músculo esquelético, recortar rápidamente la grasa y el tejido conectivo, pesar y colocar el músculo en un tampón de aislamiento del músculo esquelético con BSA (al menos 1/10 p/v) (p. ej., 1 g de músculo esquelético por 10 ml de tampón).
- Pica el músculo esquelético con unas tijeras sobre hielo.
- Transfiera el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 ml con una punta de pipeta cortada de 5 ml. Homogeneizar con una cuchilla (ver la Tabla de Materiales) al 50% de potencia durante 5 s. Añadir proteasa (5 mg/g de músculo húmedo) y digerir durante 7 min, mezclando la solución cada 30 s. Termine la reacción agregando un volumen igual de tampón de aislamiento con BSA.
- Centrifugar el homogeneizado a 500 × g durante 10 min. Transfiera el sobrenadante a través de una gasa de doble capa con una punta de pipeta cortada de 5 ml a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Centrifugar el sobrenadante a 3.500 × g durante 10 min para precipitar un gránulo mitocondrial marrón.
- Vierte el sobrenadante restante. Agregue el mismo volumen de tampón de aislamiento con BSA al tubo de centrífuga. Vuelva a suspender el gránulo mitocondrial con un raspador flexible (policía) trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga. Centrifugar a 3.500 × g durante 10 min.
- Vierte el sobrenadante restante. Agregue el mismo volumen de tampón de aislamiento sin BSA al tubo de centrífuga. Vuelva a suspender el gránulo mitocondrial trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga con un policía limpio. Centrifugar a 3.500 × g durante 10 min.
- Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo mitocondrial en un tampón de resuspensión trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga con un policía limpio.
NOTA: El volumen del tampón de resuspensión dependerá del tamaño del gránulo de mitocondrias. - Transfiera las mitocondrias resuspendidas a un homogeneizador Dounce con una punta de pipeta cortada de 1 ml. Con el homogeneizador Dounce, homogeneice cuidadosamente la suspensión con 4-5 pasadas.
- Coloque la suspensión mitocondrial en un tubo de microcentrífuga de 2 ml marcado con otra punta de pipeta cortada de 1 ml.
3. Mediciones de la respiración mitocondrial (Figura 3)
- Sustratos del Complejo I
- Añadir 945 μL de tampón respiratorio a la cámara. Asegúrese de que el agitador esté girando y de que la temperatura del tampón se mantenga a 37 °C. Inicie el registro de la recopilación de datos.
- Una vez que la concentración de oxígeno se haya estabilizado, agregue 20 μL de las mitocondrias y coloque la tapa en la cámara. En el software, denota que se agregaron mitocondrias a la cámara.
- Agregue 10 μL de glutamato 1 M, 10 μL de malato 200 mM y 10 μL de piruvato 200 mM a la cámara con jeringas individuales y espere hasta que la señal se estabilice. En el software, indique que se han agregado sustratos.
NOTA: Estos sustratos se utilizan normalmente para medir la respiración impulsada por los carbohidratos. Para otras combinaciones de sustratos que se utilizarán para medir la respiración impulsada por la grasa, véase21. - Añadir 5 μL de ADP con una jeringa separada y observar el rápido consumo de oxígeno (estado 3). En el software, indique que se agregó ADP.
NOTA: Después de la fosforilación del ADP agregado, la tasa de consumo de oxígeno se estabilizará hasta el estado 4. - Después de 4 minutos de la recopilación de datos del estado 4, finalice la grabación. Guarde el archivo de datos.
- Sustratos del Complejo II
- Añadir 963 μL del tampón respiratorio a la cámara. Asegúrese de que el agitador esté girando y de que la temperatura del tampón se mantenga a 37 °C. Inicie el registro de la recopilación de datos.
- Una vez que la concentración de oxígeno se haya estabilizado, agregue 20 μL de mitocondrias y coloque la tapa en la cámara. En el software, denota que se agregaron mitocondrias a la solución.
- Agregue 2 μL de 4 μg/μL de rotenona seguido de 10 μL de succinato de 500 mM a la cámara usando jeringas separadas y espere hasta que la señal se estabilice. En el software, indique que se han agregado sustratos.
- Añadir 5 μL de ADP con una jeringa separada y observar el rápido consumo de oxígeno (estado 3). En el software, indique que se agregó ADP.
NOTA: Después de la fosforilación del ADP agregado, la tasa de consumo de oxígeno se estabilizará hasta el estado 4. - Después de 4 minutos de la recopilación de datos del estado 4, finalice la grabación. Guarde el archivo de datos.
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Representative Results
El presente manuscrito investigó la respiración mitocondrial de Mus musculus silvestre (n = 7, macho = 5, hembra = 2; edad = 1,30 ± 0,2 años) en un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial (Figura 1). Para medir la respiración mitocondrial del músculo esquelético, se utilizó toda la extremidad posterior, es decir, el músculo aeróbico y anaeróbico, para el aislamiento mitocondrial (Figura 2). En la Figura 3 se muestran ejemplos de datos brutos de respiración mitocondrial. Las figuras 3A y 3B representan la respiración mitocondrial compleja impulsada por I. La pendiente pronunciada observada en la Figura 3A representa la alta tasa respiratoria máxima. Este es el valor utilizado para el análisis posterior de los datos. El aislamiento exitoso de las mitocondrias del músculo esquelético de las extremidades posteriores se observa por el giro brusco y la estabilización de una nueva pendiente, que determina el estado 4 (Figura 3B).
Estos datos también pueden interpretarse como que las mitocondrias tienen un alto funcionamiento debido al giro brusco para establecer el estado 4. Se puede observar un patrón similar para la respiración mitocondrial impulsada por el complejo II (Figura 3C y Figura 3D). La Figura 3E, F demuestra el mal funcionamiento de las mitocondrias, ya sea debido a la fisiología mitocondrial o a una respiración mitocondrial infructuosa. La figura 3E muestra el acoplamiento de las mitocondrias para la respiración mitocondrial impulsada por el complejo I, como se ve en el giro al estado 4. Sin embargo, la Figura 3F muestra la respiración mitocondrial desacoplada del complejo II, como lo demuestra una línea plana después de la adición de ADP, y ningún "giro" para producir datos del estado 4. Estos datos sugerirían posibles problemas durante el aislamiento mitocondrial, que se analizan a continuación.
Los valores numéricos del estado 3, el estado 4 y el RCR para el complejo I y el complejo II de estos animales se pueden encontrar en la Figura 4. Estos datos se determinaron midiendo 30 s de la pendiente más pronunciada después de la adición de ADP para determinar el estado 3 (Figura 3A, C) y midiendo la pendiente después del "giro" durante 1 minuto para medir el estado 4 (Figura 3B, D). Una vez obtenidos estos valores, los datos se normalizaron al contenido de proteínas (mediante el ensayo Bradford22). Utilizando los valores normalizados, el RCR se calculó dividiendo el valor del estado normalizado 3 por el valor del estado normalizado 4.
Figura 1: AU MitoMobile, un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial. (A) El exterior del MitoMobile de AU. (B) El interior del vehículo mirando hacia el frente donde no se hicieron cambios. (C) La parte trasera del vehículo que muestra la instalación de los bancos, los compartimentos de almacenamiento y la centrífuga. (D) La configuración del equipo durante la recolección de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de aislamiento mitocondrial y medición de la respiración en el músculo esquelético. (1) El tejido se disecciona del animal y se coloca en un tampón donde (2) se pica, se homogeneiza, se trata con proteasa y se somete a centrifugación hasta que se obtiene el gránulo mitocondrial. (3) Se resuspende el gránulo de mitocondrias y se obtienen datos de respiración. (4) Los datos de consumo de oxígeno se pueden utilizar para calcular el estado 3, el estado 4 y el RCR. Abreviatura: RCR = ratio de control respiratorio. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones de la respiración mitocondrial con sustratos complejos I y II. Consumo de oxígeno con sustratos complejos I, destacando el análisis de pendientes de los estados 3 (A) y 4 (B). Consumo de oxígeno con sustratos del complejo II, destacando el análisis de pendientes del estado 3 (C) y del estado 4 (D). La respiración mitocondrial subóptima se puede observar en la respiración impulsada por el complejo I (E) y la respiración impulsada por el complejo II (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Datos recopilados en ratones domésticos (Mus musculus) en el MitoMobile de la UA. El aislamiento mitocondrial y la respiración se realizaron mediante el procedimiento descrito aquí. Se utilizaron piruvato, malato y glutamato para determinar las tasas de respiración del complejo I. Se utilizaron succinato y rotenona para medir las tasas respiratorias del complejo II. (A) Mediciones del estado 3 del complejo I, (B) mediciones del estado 4 del complejo I, (C) RCR del complejo I, (D) mediciones del estado 3 del complejo II, (E) mediciones del estado 4 del complejo II y (F) RCR del complejo II. Abreviatura: RCR = ratio de control respiratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón de aislamiento de mitocondrias para músculo esquelético | ||
| Reactivo | con BSA, concentración (mM) | sin BSA, concentración (mM) |
| Kcl | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| Tris-Base | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| BSA sin ácidos grasos | 0.15% | - |
| Tampón de resuspensión mitocondrial aislado para músculo esquelético | ||
| Reactivo | Concentración (mM) | |
| Manitol | 220 | |
| Sacarosa | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA | 1 | |
Tabla 1: Tampones de aislamiento de mitocondrias (con y sin BSA) y tampón de resuspensión de mitocondrias aisladas para músculo esquelético.
| Tampón respiratorio | |
| Reactivo | Concentración (mM) |
| Kcl | 100 |
| MOPS | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Glucosa | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA | 1 |
| BSA sin ácidos grasos | 0.20% |
| Sustratos respiratorios | |
| Reactivo | Concentración (mM) |
| Piruvato | 200 |
| Malato | 200 |
| Succinato | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamato | 1000 |
Tabla 2: Tampón respiratorio y sustratos.
| Estado 3 | Estado 4 | RCR | Estudiar | Sustratos |
| 368.3±80.4 | 68,9±25,0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 mM de piruvato, 2 mM de malato |
| 241.8±22.5 | 28.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM de piruvato, 2 mM de malato |
| 285,7±36,5 | 81.9±2.9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 mM de succinato, 4 μM de rotenona |
| 493.4±105.4 | 61.3±9.6 | 8.2±2.2 | Estudio actual | 2 mM de piruvato, 2 mM de malato, 10 mM de glutamato |
| 559.5±74.9 | 165.2±18.5 | 3.4±0.2 | Estudio actual | 5 mM de succinato, 4 μg/μL de rotenona |
Tabla 3: Valores comparativos del estado 3, estado 4 y RCR. Abreviatura: RCR = ratio de control respiratorio. Los valores de estado 3 y estado 4 se muestran en nmoles O2/mg de proteína/min.
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Discussion
El laboratorio móvil de fisiología mitocondrial permite a los investigadores aislar mitocondrias y medir las tasas de respiración mitocondrial dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de tejido en sitios de campo remotos. Los resultados presentados en este documento sugieren que las mediciones de la respiración mitocondrial realizadas en el MitoMobile de la UA son comparables a las mediciones realizadas en un laboratorio de investigación universitario. Específicamente, los valores para el estado 3, el estado 4 y la RCR para Mus musculus silvestre presentados aquí son comparables con los resultados publicados previamente del mismo laboratorio y de otros (Tabla 3)12,23. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, debido a las diferentes cepas de ratones y a los métodos utilizados, no se puede realizar una comparación directa de estos estudios. Estos resultados demuestran una prueba de concepto para la medición de la respiración mitocondrial en este laboratorio móvil de fisiología mitocondrial.
Todos los productos químicos y materiales necesarios para el aislamiento y la respiración de las mitocondrias se pueden transportar y almacenar dentro del laboratorio móvil, lo que facilita el acceso a la hora de configurar y realizar experimentos. Además, las mitocondrias aisladas recogidas en un laboratorio mitocondrial móvil proporcionan una muestra única para realizar otras mediciones bioquímicas, como la emisión de especies reactivas de oxígeno. Es importante destacar que las mitocondrias congeladas se pueden transportar a un laboratorio estacionario para realizar mediciones bioquímicas adicionales (por ejemplo, actividades enzimáticas individuales de la cadena de transporte de electrones). En particular, el aislamiento de mitocondrias a través de la diferenciación por centrifugación no es el único método para medir la respiración mitocondrial. Otros laboratorios han realizado mediciones exitosas de la respiración mitocondrial con fibras permeabilizadas. Aunque el presente manuscrito no describe este método (para más detalles sobre las fibras permeabilizadas, ver 24,25,26,27,28), es importante que los lectores tengan en cuenta que un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial también podría albergar los materiales necesarios para este procedimiento. Consulte otras revisiones sobre las fortalezas y debilidades de cada uno de estos métodos25,29,30.
Varios laboratorios que realizan investigaciones bioenergéticas mitocondriales han publicado recomendaciones para la resolución de problemas que pueden ser útiles para los lectores15,17. Para cualquier proyecto experimental, se debe hacer un solo lote de tampones para recopilar todos los datos. El uso de tampones hechos en diferentes días crea la oportunidad de que la variación en las soluciones afecte las mediciones de la respiración mitocondrial. El daño a la membrana mitocondrial externa ocurrirá durante el proceso de aislamiento; Sin embargo, la correcta ejecución del método de aislamiento a través de la capacitación en laboratorio puede minimizar el daño que naturalmente ocurrirá con este procedimiento29,31. Durante el proceso de aislamiento, las mitocondrias no funcionales o demasiado dañadas se indican mediante un gránulo mitocondrial blanco esponjoso en lugar de un gránulo marrón compacto. Las mitocondrias no funcionales o dañadas pueden ser causadas por un exceso de rpm durante la homogeneización de las cuchillas, la homogeneización durante demasiado tiempo, la adición de demasiada proteasa o la digestión durante demasiado tiempo, o el uso de demasiados golpes durante la resuspensión final de las mitocondrias.
Además, la elección de qué músculo aislar y cuánto músculo se utiliza afectará al rendimiento mitocondrial. Por ejemplo, en un animal con una densidad mitocondrial más alta, como un ave21, se precipitarán más mitocondrias en comparación con una mezcla de tipos de fibras musculares esqueléticas de una extremidad posterior de una rata. Esto también cambiará la cantidad de tejido necesaria para un aislamiento exitoso. Cuanto mayor sea la densidad mitocondrial en un tejido, menor será la cantidad de tejido necesaria para un aislamiento exitoso. Los investigadores también deben considerar el volumen de solución de manitol-sacarosa añadida a las mitocondrias aisladas finales. Un gránulo mitocondrial más densamente empaquetado necesitará una dilución más alta, mientras que un gránulo mitocondrial menos densamente empaquetado necesitará una dilución más baja. El grado de dilución dependerá del animal, de la naturaleza oxidativa del músculo esquelético que se aísla y de la densidad del gránulo mitocondrial.
Disponer de suficiente energía eléctrica para soportar todo el equipo necesario para la recopilación de datos en un laboratorio móvil puede ser un reto. En particular, la centrífuga refrigerada consume una alta corriente durante el funcionamiento (especialmente durante las fases iniciales de enfriamiento). Por lo tanto, se deben tener en cuenta consideraciones especiales para garantizar que la potencia eléctrica del vehículo coincida con la demanda eléctrica del equipo necesario para funcionar simultáneamente. Una recomendación que podría resolver esta limitación es la adición de más fuentes de energía (por ejemplo, baterías adicionales, generadores adicionales). En particular, el método de medición de la respiración mitocondrial con fibras permeabilizadas no necesita el uso de una centrífuga refrigerada y también podría proporcionar una resolución a la fuente de energía limitada. Las condiciones ambientales y la calidad de las carreteras también deben tenerse en cuenta en el uso de un laboratorio móvil. El laboratorio móvil de fisiología mitocondrial del que se habla en este documento se condujo con éxito en carreteras interestatales con tiempo despejado. Los caminos de tierra con clima severo presentarán una mayor dificultad para conducir el vehículo al lugar de interés. Aunque el aislamiento mitocondrial no es un método novedoso, su uso en un laboratorio móvil proporciona una forma única de cuantificar la energía mitocondrial en animales de vida libre. Esto puede ser fundamental para dilucidar las diferencias entre los animales de laboratorio y los animales salvajes32,33,34. Además, el laboratorio móvil de fisiología mitocondrial permite a los investigadores estudiar las restricciones energéticas y los extremos energéticos que se encuentran entre los animales en el mundo natural.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Mark Nelms y John Tennant, del departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática de la Facultad de Ingeniería Samuel Ginn de la Universidad de Auburn, por ayudar con el equipamiento estructural y eléctrico del MitoMobile de la UA. Además, los autores agradecen la financiación para equipar el MitoMobile de la UA y la investigación de una beca de los Premios Presidenciales de Investigación Interdisciplinaria (PAIR) de la Universidad de Auburn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
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