Summary
Tarla lokasyonlarında yakalanan vahşi hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için mobil bir laboratuvar tasarladık ve inşa ettik. Burada, mobil bir mitokondriyal laboratuvarın tasarımını ve donanımını ve ilgili laboratuvar protokollerini açıklıyoruz.
Abstract
Mitokondriyal enerji, hayvan biyokimyası ve fizyolojisinde merkezi bir temadır ve araştırmacılar metabolik kapasiteyi araştırmak için mitokondriyal solunumu bir metrik olarak kullanırlar. Mitokondriyal solunum önlemlerini elde etmek için taze biyolojik numuneler kullanılmalı ve tüm laboratuvar prosedürü yaklaşık 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Ayrıca, bu laboratuvar tahlillerini gerçekleştirmek için çok sayıda özel ekipman gereklidir. Bu, fizyoloji laboratuvarlarından uzakta yaşayan vahşi hayvanların dokularında mitokondriyal solunumun ölçülmesi için bir zorluk yaratır, çünkü canlı doku sahada toplandıktan sonra çok uzun süre korunamaz. Ayrıca, canlı hayvanların uzun mesafelerde taşınması, mitokondriyal enerjileri değiştirebilen strese neden olur.
Bu el yazması, sahaya götürülebilen ve vahşi hayvanlardan toplanan dokulardaki mitokondriyal metabolizmayı ölçmek için yerinde kullanılabilen mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı olan Auburn Üniversitesi (AU) MitoMobile'ı tanıtmaktadır. Mobil laboratuvarın temel özellikleri ve izole mitokondriyal solunum hızlarını ölçmek için adım adım yöntemler sunulmaktadır. Ek olarak, sunulan veriler, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarının donatılmasının ve mitokondriyal solunum ölçümlerinin yapılmasının başarısını doğrulamaktadır. Mobil laboratuvarın yeniliği, sahaya gitme ve sahada yakalanan hayvanların dokuları üzerinde mitokondriyal ölçümler yapma yeteneğinde yatmaktadır.
Introduction
Bugüne kadar, mitokondriyal enerjileri ölçmek için tasarlanan çalışmalar, bilim adamlarının göç, dalış ve kış uykusu gibi faaliyetler sırasında hayvanlardan toplanan dokularda mitokondriyal biyoenerjetik çalışmalar yapmasını engelleyen laboratuvar hayvanları veya yerleşik fizyoloji laboratuvarlarının yakınında yakalanan hayvanlarla sınırlıydı 1,2,3,4,5,6 . Birçok araştırmacı yabani hayvanların bazal ve pik metabolizma hızlarını ve günlük enerji harcamalarını başarılı bir şekilde ölçmüşolsa da 7,8, araştırmacıların mitokondri performansını ölçme kapasitesi sınırlı kalmıştır (ancak bkz. 1,4,9). Bu kısmen, mitokondriyi izole etmek için taze dokuya ve taze dokuyu elde ettikten yaklaşık 2 saat sonra izolasyonları gerçekleştirmek için bir laboratuvar tesisine ihtiyaç duyulmasından kaynaklanmaktadır. Mitokondri izole edildikten sonra, mitokondriyal solunum ölçümleri de ~ 1 saat içinde tamamlanmalıdır.
İzole mitokondriyal solunum hızları genellikle bir Clark elektroduna bağlı kapalı bir kapta oksijen konsantrasyonunun ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Bu yöntemin arkasındaki teori, oksidatif fosforilasyon sırasında oksijenin mitokondriyal solunumun son elektron alıcısı olduğu temel gözlemine dayanmaktadır. Bu nedenle, bir deney sırasında oksijen konsantrasyonu düştüğünde, adenozin trifosfat (ATP) üretiminin gerçekleştiği varsayılmaktadır10. Tüketilen oksijen, üretilen ATP için bir vekildir. Araştırmacılar, farklı substratlar kullanarak spesifik deneysel koşullar oluşturabilir ve odaya önceden belirlenmiş miktarlarda ADP ekleyerek adenozin difosfat (ADP) ile uyarılan solunumu (durum 3) başlatabilir. Eksojen ADP'nin ATP'ye fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı azalır ve durum 4'e ulaşılır ve ölçülebilir. Ayrıca, spesifik inhibitörlerin eklenmesi, kaçak solunum ve bağlanmamış solunum ile ilgili bilgilerin elde edilmesini sağlar10. Durum 3'ün durum 4'e oranı, genel mitokondriyal eşleşmenin göstergesi olan solunum kontrol oranını (RCR)belirler 10,11. Daha düşük RCR değerleri genel mitokondriyal disfonksiyonu gösterirken, daha yüksek RCR değerleri daha büyük ölçüde mitokondriyal eşleşme10 olduğunu göstermektedir.
Daha önce belirtildiği gibi, biyolojik materyalin toplanması, mitokondriyal izolasyon ve solunum hızlarının ölçümü, doku elde edildikten sonraki 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Hayvanları uzun mesafelerde kurulu laboratuvarlara taşımadan bu görevi yerine getirmek için, bu verilerin toplanabileceği saha konumlarına götürülmek üzere mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı inşa edildi. 2018 Jayco Redhawk eğlence aracı, mobil bir moleküler fizyoloji laboratuvarına dönüştürüldü ve Auburn Üniversitesi (AU) MitoMobile olarak adlandırıldı (Şekil 1A). Ankastre buzdolabı, derin dondurucu, su depolama tankı ve sıhhi tesisat, 12 voltluk pillerle çalışan elektrik, gaz jeneratörü, propan tankı ve otomatik tesviye sistemi nedeniyle bir eğlence aracı seçildi. Ayrıca, eğlence aracı, veri toplama için gece boyunca uzak sitelerde kalma yeteneği sağlar. Aracın ön kısmı değiştirilmemiştir ve sürüş ve uyku alanlarını sağlar (Şekil 1B). Aracın arkasına ve set üstü ocakta daha önce kurulmuş yatak odası olanakları (yatak, TV ve dolap) kaldırıldı.
Yatak odası malzemeleri ve set üstü ocak yerine özel yapım paslanmaz çelik raflar ve 80/20 alüminyum çerçeve ile desteklenen özel bir kuvars tezgah yerleştirildi (Şekil 1C). Laboratuvar tezgahları veri toplama için yeterli alan sağlar (Şekil 1D). Her bir ekipmanın (yani soğutmalı santrifüj, mitokondriyal solunum odaları, plaka okuyucular, bilgisayarlar, homojenizatörler, teraziler, taşınabilir ultra dondurucu ve diğer genel laboratuvar malzemeleri) güç tüketimi dikkate alınmıştır. Santrifüjün büyük voltaj ve akım taleplerini desteklemek için, elektrik sistemi uçak sınıfı ekipmanınkine yükseltildi. Aracın arkasındaki harici bir bölme, Amerika Birleşik Devletleri Ulaştırma Bakanlığı'nın sıvı nitrojen depolama ve taşıma yönergelerini karşılayan bir sıvı nitrojen depolama bölmesine dönüştürüldü. Bu depolama ünitesi paslanmaz çelikten yapılmıştır ve genişleyen nitrojen gazının aracın yolcu bölmesine sızmasını önlemek için uygun havalandırmaya sahiptir.
Mobil laboratuvarın mitokondriyal biyoenerjetik çalışmalarda kullanılabileceğini doğrulamak için mitokondri izole edildi ve yabani kaynaklı ev farelerinden (Mus musculus) arka bacak iskelet kasından mitokondriyal solunum hızları ölçüldü. Mus musculus model bir organizma olduğu için bu türün mitokondriyal solunum hızları iyi bilinmektedir12,13,14. Önceki çalışmalarda diferansiyel santrifüjleme yoluyla mitokondriyal izolasyonbelgelenmiş olsa da 15,16,17, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvar yöntemlerinde kullanılan yöntemlere kısa bir genel bakış aşağıda açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki bölümlerde mitokondriyal laboratuvar yöntemleri açıklanmaktadır. Tüm hayvan taşıma ve doku toplama prosedürleri Auburn Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#2019-3582) tarafından onaylanmıştır.
1. Veri toplama için kullanılan tamponların açıklaması
NOT: Bu tamponlar sabit bir laboratuvarda hazırlanabilir ve saha gezisinden önce mobil laboratuvara taşınabilir (aşağıda aksi belirtilmedikçe).
- İskelet kası mitokondriyal izolasyon tamponunu Tablo 1'de görüldüğü gibi sığır serum albümini (BSA) ile hazırlayın.
- Yağ asidi içermeyen BSA hariç kimyasalları deiyonize suda (~% 90 hacim) çözün. Tamponu sıcaklık 4 °C olana kadar buzdolabına koyun.
- Sıcaklığı 4 °C'de tutarken çözeltiyi 7,5 pH'a ayarlayın.
- Yağ asidi içermeyen BSA'yı ekleyin ve hacmi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- İskelet kası mitokondriyal izolasyon tamponunu Tablo 1'de görüldüğü gibi BSA olmadan hazırlayın.
- Kimyasalları deiyonize suda çözün (~% 90 hacim). Tamponu sıcaklık 4 °C olana kadar buzdolabına koyun.
- Sıcaklığı 4 °C'de tutarken çözeltiyi 7,5 pH'a ayarlayın.
- Sesi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- İskelet kası resüspansiyon tamponunu Tablo 1'de görüldüğü gibi hazırlayın.
- Kimyasalları deiyonize suda çözün (~% 90 hacim). Tamponu sıcaklık 4 °C olana kadar buzdolabına koyun.
- Sıcaklığı 4 °C'de tutarken çözeltiyi 7,4 pH'a ayarlayın.
- Sesi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- İskelet kası solunum tamponunu Tablo 2'de görüldüğü gibi hazırlayın.
- Yağ asidi içermeyen BSA hariç kimyasalları deiyonize suda (~% 90 hacim) çözün. Tamponu sıcaklık 37 °C olana kadar ısıtın.
- Sıcaklığı 37 °C'de tutarken çözeltiyi 7.0 pH'a ayarlayın.
- Yağ asidi içermeyen BSA'yı ekleyin ve hacmi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- Solunum substratlarını Tablo 2'de görüldüğü gibi hazırlayın.
- Bu substratların veri toplama gününde 100 mM Tris-HCl, pH 7.4'te taze yapıldığından emin olun. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
NOT: Sağlanan değerler, mitokondri tarafından alınacak yeterli substrat için yeterince konsantre bir çözelti yapmak içindir. Substratların nihai konsantrasyonları 2 mM piruvat, 2 mM malat, 10 mM glutamat ve 5 mM süksinattır.
- Bu substratların veri toplama gününde 100 mM Tris-HCl, pH 7.4'te taze yapıldığından emin olun. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
2. Mitokondriyal izolasyonun gerçekleştirilmesi (Şekil 2)
NOT: Mitokondriyal izolasyon ve mitokondriyal solunum ölçümleri mobil laboratuvarın laboratuvar tezgah alanında yapılmakta olup, aksi belirtilmedikçe tüm solüsyonlar 4 °C'de tutulmalıdır.
- Mobil laboratuvarı düz bir zemine park edin. Jeneratörü çalıştırın ve aracı düzleştirin. Slaydı uzatın ve ekipmanı kurun.
- İstenilen miktarda tamponu çözün.
NOT: Genel olarak, kas başına 30 mL iskelet kası izolasyon tamponu ve BSA'sız 10 mL iskelet kası izolasyon tamponu gereklidir. - Mitokondriyal solunum odalarını, üreticinin talimatlarına göre istenen deney sıcaklığına ve mevcut barometrik basınca ayarlayın ve kalibre edin. Deneylerde kullanılan belirli odalar için Malzeme Tablosuna bakın.
- Hayvanı dekapitasyon yoluyla ötenazi yapın.
NOT: Bu çalışmada ötenazi için dekapitasyon kullanılmıştır. Karbondioksit ve izofluran gibi bazı gazlar mitokondriyal fonksiyonuetkiler 18,19,20; Her çalışma için en iyi ötenazi yöntemini seçerken bu etkiler göz önünde bulundurulmalıdır. Her çalışma için hangi yöntemin uygulanması gerektiği, sorulan bilimsel soruya göre belirlenecektir. - İskelet kasını çıkarın, yağ ve bağ dokusunu hızla kesin, tartın ve kası BSA ile iskelet kası izolasyon tamponuna yerleştirin (en az 1/10 w / v) (örneğin, 1 g iskelet kası ila 10 mL tampon).
- İskelet kasını buz üzerinde makasla kıyın.
- Kıyılmış dokuyu 5 mL'lik bir pipet ucu kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 saniye boyunca %50 güçte bir bıçakla ( Malzeme Tablosuna bakın) homojenize edin. Proteaz (5 mg/g ıslak kas) ekleyin ve çözeltiyi her 30 saniyede bir karıştırarak 7 dakika sindirin. BSA ile eşit hacimde izolasyon tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
- Homojenatı 500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, kesilmiş 5 mL'lik bir pipet ucu kullanarak çift katmanlı tülbentten temiz bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın. Kahverengi bir mitokondriyal peleti çökeltmek için süpernatanı 3.500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Kalan süpernatanı dökün. Santrifüj tüpüne BSA ile aynı hacimde izolasyon tamponu ekleyin. Mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti esnek bir kazıyıcı (polis) ile yeniden süspanse edin. 3.500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Kalan süpernatanı dökün. Santrifüj tüpüne BSA'sız aynı hacimde izolasyon tamponu ekleyin. Mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından temiz bir polisle nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti yeniden süspanse edin. 3.500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı boşaltın ve mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından temiz bir polisle nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
NOT: Yeniden süspansiyon tamponunun hacmi, mitokondri peletinin boyutuna bağlı olacaktır. - Yeniden süspanse edilmiş mitokondriyi, 1 mL'lik kesilmiş pipet ucuyla bir Dounce homojenizatöre aktarın. Dounce homojenizatörü kullanarak süspansiyonu 4-5 geçişle dikkatlice homojenize edin.
- Mitokondriyal süspansiyonu, başka bir kesilmiş 2 mL pipet ucu kullanarak etiketli 1 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Mitokondriyal solunum ölçümleri (Şekil 3)
- Kompleks I substratları
- Hazneye 945 μL solunum tamponu ekleyin. Karıştırıcının döndüğünden ve tampon sıcaklığının 37 °C'de tutulduğundan emin olun. Veri toplama kaydını başlatın.
- Oksijen konsantrasyonu stabilize olduktan sonra, 20 μL mitokondri ekleyin ve kapağı hazneye yerleştirin. Yazılımda, odaya mitokondri eklendiğini belirtin.
- Ayrı şırıngalarla hazneye 10 μL 1 M glutamat, 10 μL 200 mM malat ve 10 μL 200 mM piruvat ekleyin ve sinyal stabilize olana kadar bekleyin. Yazılımda, alt tabakaların eklendiğini belirtin.
NOT: Bu substratlar tipik olarak karbonhidrat kaynaklı solunumu ölçmek için kullanılır. Yağ kaynaklı solunumu ölçmek için kullanılacak diğer substrat kombinasyonları için bkz.21. - Ayrı bir şırınga ile 5 μL ADP ekleyin ve hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin (durum 3). Yazılımda, ADP'nin eklendiğini belirtin.
NOT: Eklenen ADP'nin fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı 4 durumuna sabit kalacaktır. - 4 dakikalık durum 4 veri toplama işleminden sonra kaydı sonlandırın. Veri dosyasını kaydedin.
- Kompleks II yüzeyler
- Odaya 963 μL solunum tamponu ekleyin. Karıştırıcının döndüğünden ve tampon sıcaklığının 37 °C'de tutulduğundan emin olun. Veri toplama kaydını başlatın.
- Oksijen konsantrasyonu stabilize olduktan sonra, 20 μL mitokondri ekleyin ve kapağı hazneye yerleştirin. Yazılımda, çözeltiye mitokondri eklendiğini belirtin.
- Ayrı şırıngalar kullanarak hazneye 2 μL 4 μg/μL rotenon ve ardından 10 μL 500 mM süksinat ekleyin ve sinyal stabilize olana kadar bekleyin. Yazılımda, alt tabakaların eklendiğini belirtin.
- Ayrı bir şırınga kullanarak 5 μL ADP ekleyin ve hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin (durum 3). Yazılımda, ADP'nin eklendiğini belirtin.
NOT: Eklenen ADP'nin fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı 4 durumuna sabit kalacaktır. - 4 dakikalık durum 4 veri toplama işleminden sonra kaydı sonlandırın. Veri dosyasını kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makale, gezici bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarında yabani kaynaklı Mus musculus'un (n = 7, erkek = 5, kadın = 2; yaş = 1.30 ± 0.2 yıl) mitokondriyal solunumunu araştırdı (Şekil 1). İskelet kası mitokondriyal solunumunu ölçmek için mitokondriyal izolasyon için tüm arka bacak, dolayısıyla aerobik ve anaerobik kas kullanıldı (Şekil 2). Ham mitokondriyal solunum verilerinin örnekleri Şekil 3'te gösterilmektedir. Şekil 3A ve Şekil 3B , karmaşık I güdümlü mitokondriyal solunumu temsil eder. Şekil 3A'da gözlenen dik eğim, yüksek maksimal solunum hızını temsil eder. Bu, daha fazla veri analizi için kullanılan değerdir. Mitokondrinin arka bacak iskelet kasından başarılı bir şekilde izole edilmesi, durum 4'ü belirleyen keskin dönüş ve yeni bir eğimin stabilizasyonu ile gözlenir (Şekil 3B).
Bu veriler, durum 4'ü kurmak için keskin dönüş nedeniyle mitokondrinin yüksek işlevli olduğu şeklinde de yorumlanabilir. Kompleks II tahrikli mitokondriyal solunum için de benzer bir model gözlemlenebilir (Şekil 3C ve Şekil 3D). Şekil 3E,F, mitokondriyal fizyoloji veya başarısız mitokondriyal solunum nedeniyle zayıf işleyen mitokondriyi göstermektedir. Şekil 3E, durum 4'e dönüşte görüldüğü gibi, karmaşık I tahrikli mitokondriyal solunum için mitokondrinin bağlanmasını göstermektedir. Bununla birlikte, Şekil 3F, ADP'nin eklenmesinden sonra düz bir çizgi ile gösterildiği gibi, ayrılmamış kompleks II mitokondriyal solunumu gösterir ve durum 4 verilerini üretmek için "dönüş" yoktur. Bu veriler, aşağıda tartışılan mitokondriyal izolasyon sırasında olası sorunları önerecektir.
Bu hayvanların hem kompleks I hem de kompleks II için durum 3, durum 4 ve RCR'nin sayısal değerleri Şekil 4'te bulunabilir. Bu veriler, durum 3'ü belirlemek için ADP eklendikten sonra en dik eğimin 30 s'si ölçülerek (Şekil 3A,C) ve durum 4'ü ölçmek için 1 dakika boyunca "dönüşten" sonraki eğim ölçülerek belirlenmiştir (Şekil 3B,D). Bu değerler elde edildikten sonra, veriler protein içeriğine normalleştirildi (Bradford testi22 ile). Normalleştirilmiş değerler kullanılarak, normalleştirilmiş durum 3 değerinin normalleştirilmiş durum 4 değerine bölünmesiyle RCR hesaplandı.
Resim 1: Seyyar mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı olan AU MitoMobile. (A) AU MitoMobile'ın dışı. (B) Aracın ön tarafına bakan ve herhangi bir değişiklik yapılmayan iç kısmı. (C) Tezgahların, saklama bölmelerinin ve santrifüjün montajını gösteren aracın arkası. (D) Veri toplama sırasında ekipmanın kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İskelet kasında mitokondriyal izolasyon ve solunum ölçüm prosedürü. (1) Doku hayvandan diseke edilir ve (2) kıyılmış, homojenize edilmiş, proteaz ile muamele edilmiş ve mitokondriyal pelet elde edilene kadar santrifüjlemeye tabi tutulduğu tampona yerleştirilir. (3) Mitokondri peleti yeniden askıya alınır ve solunum verileri elde edilir. (4) Oksijen tüketimi verileri, durum 3, durum 4 ve RCR'yi hesaplamak için kullanılabilir. Kısaltma: RCR = solunum kontrol oranı. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kompleks I ve kompleks II substratları ile mitokondriyal solunum ölçümleri. Durum 3 (A) ve durum 4 (B)'nin eğim analizini vurgulayan kompleks I substratları ile oksijen tüketimi. Durum 3 (C) ve durum 4 (D)'nin eğim analizini vurgulayan kompleks II substratları ile oksijen tüketimi. Suboptimal mitokondriyal solunum, kompleks I güdümlü solunumda (E) ve kompleks II güdümlü solunumda (F) görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: AU MitoMobile'da ev fareleri (Mus musculus) üzerinde toplanan veriler. Mitokondriyal izolasyon ve solunum, burada tarif edilen prosedür kullanılarak gerçekleştirildi. Kompleks I solunum hızlarını belirlemek için piruvat, malat ve glutamat kullanıldı. Kompleks II solunum hızlarını ölçmek için süksinat ve rotenon kullanıldı. (A) Kompleks I durum 3 ölçümleri, (B) kompleks I durum 4 ölçümleri, (C) kompleks I RCR, (D) kompleks II durum 3 ölçümleri, (E) kompleks II durum 4 ölçümleri ve (F) kompleks II RCR. Kısaltma: RCR = solunum kontrol oranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| İskelet kası için mitokondri izolasyon tamponu | ||
| Reaktif | BSA ile, konsantrasyon (mM) | BSA olmadan, konsantrasyon (mM) |
| Kartal | 100 | 100 |
| Tris-HCl | 40 | 40 |
| Tris-Tabanı | 10 | 10 |
| MgCl2 | 1 | 1 |
| EGTA (EGTA) | 1 | 1 |
| ATP | 0.2 | 0.2 |
| Yağ asidi içermeyen BSA | 0.15% | - |
| İskelet kası için izole mitokondri resüspansiyon tamponu | ||
| Reaktif | Konsantrasyon (mM) | |
| Mannitol | 220 | |
| Sakaroz | 70 | |
| Tris-HCl | 10 | |
| EGTA (EGTA) | 1 | |
Tablo 1: İskelet kası için mitokondri izolasyon tamponları (BSA'lı ve BSA'sız) ve izole mitokondri resüspansiyon tamponu.
| Solunum tamponu | |
| Reaktif | Konsantrasyon (mM) |
| Kartal | 100 |
| MOPLAR | 50 |
| KH2PO4 | 10 |
| Glikoz | 20 |
| MgCl2 | 10 |
| EGTA (EGTA) | 1 |
| Yağ asidi içermeyen BSA | 0.20% |
| Solunum substratları | |
| Reaktif | Konsantrasyon (mM) |
| Piruvat | 200 |
| Malate | 200 |
| Süksinat | 500 |
| ADP | 100 |
| Glutamat | 1000 |
Tablo 2: Solunum tamponu ve substratları.
| Eyalet 3 | Durum 4 | RCR (RCR) | Okumak | Substrat |
| 368.3±80.4 | 68,9±25,0 | 5.8±1.6 | 12 | 2 mM piruvat, 2 mM malat |
| 241.8±22.5 | 28.9±3.2 | 8.3±1.9 | 23 | 5 mM piruvat, 2 mM malat |
| 285.7±36.5 | 81.9±2.9 | 3.5±1.0 | 23 | 10 mM süksinat, 4 μM rotenon |
| 493.4±105.4 | 61.3±9.6 | 8.2±2.2 | Güncel Çalışma | 2mM piruvat, 2mM malat, 10 mM glutamat |
| 559.5±74.9 | 165.2±18.5 | 3.4±0.2 | Güncel Çalışma | 5 mM süksinat, 4 μg/μL rotenon |
Tablo 3: Durum 3, durum 4 ve RCR'nin karşılaştırmalı değerleri. Kısaltma: RCR = solunum kontrol oranı. Durum 3 ve durum 4 değerleri nmol O2 / mg protein / dak olarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı, araştırmacıların mitokondriyi izole etmelerini ve uzak saha sahalarında doku toplandıktan sonraki 2 saat içinde mitokondriyal solunum hızlarını ölçmelerini sağlar. Burada sunulan sonuçlar, AU MitoMobile'da yapılan mitokondriyal solunum ölçümlerinin bir üniversite araştırma laboratuvarında yapılan ölçümlerle karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Spesifik olarak, burada sunulan yabani kaynaklı Mus musculus için durum 3, durum 4 ve RCR değerleri, aynı laboratuvardan ve diğerlerinden daha önce yayınlanmış sonuçlarla karşılaştırılabilir (Tablo 3)12,23. Bununla birlikte, farklı fare suşları ve kullanılan yöntemler nedeniyle, bu çalışmaların doğrudan bir karşılaştırmasının yapılamayacağına dikkat edilmelidir. Bu sonuçlar, bu mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarında mitokondriyal solunumun ölçümü için kavram kanıtını göstermektedir.
Mitokondri izolasyonu ve solunumu için gerekli olan tüm kimyasallar ve malzemeler mobil laboratuvarda taşınabilir ve depolanabilir, bu da deneyler kurarken ve gerçekleştirirken erişim kolaylığı sağlar. Ek olarak, mobil bir mitokondriyal laboratuvarda toplanan izole mitokondri, reaktif oksijen türlerinin emisyonu gibi diğer biyokimyasal ölçümleri gerçekleştirmek için benzersiz bir numune sağlar. Daha da önemlisi, donmuş mitokondri, ek biyokimyasal ölçümler için sabit bir laboratuvara taşınabilir (örneğin, bireysel elektron taşıma zinciri enzim aktiviteleri). Özellikle, mitokondriyi santrifüj farklılaşması yoluyla izole etmek, mitokondriyal solunumu ölçmek için tek yöntem değildir. Diğer laboratuvarlar, geçirgen liflerle mitokondriyal solunumun başarılı ölçümlerini gerçekleştirmiştir. Mevcut el yazması bu yöntemi açıklamasa da (geçirgen lifler hakkında daha fazla ayrıntı için bkz. 24,25,26,27,28), okuyucuların mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarının da bu prosedür için gerekli malzemeleri barındırabileceğini not etmeleri önemlidir. Lütfen bu yöntemlerin her birinin güçlü ve zayıf yönleri hakkındaki diğer incelemelere bakın25,29,30.
Mitokondriyal biyoenerjetik araştırmaları yapan birkaç laboratuvar, okuyucuların yararlı bulabileceği sorun giderme önerileri yayınlamıştır15,17. Herhangi bir tek deneysel proje için, tüm verileri toplamak için tek bir tampon grubu yapılmalıdır. Farklı günlerde yapılan tamponların kullanılması, mitokondriyal solunum ölçümlerini etkilemek için çözeltilerde varyasyon fırsatı yaratır. İzolasyon işlemi sırasında dış mitokondriyal zarda hasar meydana gelecektir; Bununla birlikte, laboratuvar eğitimi yoluyla izolasyon yönteminin uygun şekilde uygulanması, bu prosedürle doğal olarak oluşacak hasarı en aza indirebilir 29,31. İzolasyon işlemi sırasında, işlevsel olmayan veya aşırı hasar görmüş mitokondri, kompakt kahverengi bir pelet yerine beyaz kabarık bir mitokondriyal pelet ile gösterilir. İşlevsel olmayan veya hasarlı mitokondri, bıçak homojenizasyonu sırasında aşırı devir, çok uzun süre homojenleştirme, çok fazla proteaz ekleme veya çok uzun süre sindirme veya mitokondrinin son yeniden süspansiyonu sırasında kullanılan çok fazla vuruştan kaynaklanabilir.
Ayrıca, hangi kasın izole edileceği ve ne kadar kas kullanılacağının seçimi mitokondriyal verimi etkileyecektir. Örneğin, bir kuş21 gibi daha yüksek mitokondriyal yoğunluğa sahip bir hayvanda, bir sıçanın arka ayağından iskelet kası lifi tiplerinin bir karışımına kıyasla daha fazla mitokondri çökelecektir. Bu aynı zamanda başarılı bir izolasyon için gereken doku miktarını da değiştirecektir. Bir dokudaki mitokondriyal yoğunluk ne kadar büyükse, başarılı izolasyon için gereken doku miktarı o kadar düşük olur. Araştırmacılar ayrıca son izole mitokondriye eklenen mannitol-sükroz çözeltisinin hacmini de dikkate almalıdır. Daha yoğun paketlenmiş bir mitokondriyal pelet daha yüksek bir seyreltmeye ihtiyaç duyarken, daha az yoğun paketlenmiş bir mitokondriyal pelet daha düşük bir seyreltmeye ihtiyaç duyacaktır. Seyreltmenin kapsamı hayvana, izole edilen iskelet kasının oksidatif doğasına ve mitokondriyal peletin ne kadar yoğun bir şekilde paketlendiğine bağlı olacaktır.
Mobil bir laboratuvarda veri toplamak için gereken tüm ekipmanı desteklemek için yeterli elektrik gücüne sahip olmak zor olabilir. Özellikle, soğutmalı santrifüj çalışma sırasında (özellikle soğumanın ilk aşamalarında) yüksek akım çeker. Bu nedenle, aracın elektrik çıkışının, aynı anda çalışması için gereken ekipmanın elektrik talebiyle eşleşmesini sağlamak için özel hususlar gösterilmelidir. Bu sınırlamayı çözebilecek bir öneri, daha fazla güç kaynağının eklenmesidir (örneğin, ekstra piller, ek jeneratörler). Özellikle, geçirgen liflerle mitokondriyal solunumu ölçme yöntemi, soğutmalı bir santrifüj kullanımına ihtiyaç duymaz ve ayrıca sınırlı güç kaynağına bir çözünürlük sağlayabilir. Mobil laboratuvar kullanımında çevre koşulları ve yol kalitesi de göz önünde bulundurulmalıdır. Burada tartışılan mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı, açık havalarda eyaletler arası yollarda başarıyla sürüldü. Sert hava koşullarına sahip toprak yollar, aracı ilgilenilen yere sürmede daha fazla zorluk yaratacaktır. Mitokondriyal izolasyon yeni bir yöntem olmasa da, mobil bir laboratuvarda kullanılması, serbest yaşayan hayvanlarda mitokondriyal enerjileri ölçmek için benzersiz bir yol sağlar. Bu, laboratuvar hayvanları ve vahşi hayvanlar arasındaki farkları aydınlatmada kritik olabilir32,33,34. Ek olarak, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı, araştırmacıların doğal dünyadaki hayvanlar arasında bulunan enerjik kısıtlamaları ve enerjik aşırılıkları incelemelerine olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Auburn Üniversitesi Samuel Ginn Mühendislik Fakültesi Elektrik ve Bilgisayar Mühendisliği bölümünden Mark Nelms ve John Tennant'a AU MitoMobile'ın yapısal ve elektrik donanımına yardımcı oldukları için teşekkür ediyor. Ek olarak, yazarlar AU MitoMobile'ı donatmak için fon sağladığını ve Auburn Üniversitesi Başkanlık Disiplinlerarası Araştırma Ödülleri (PAIR) hibesinden araştırma yaptığını kabul ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
