Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Spektrofotometriske metoder for studier av eukaryotisk glykogenmetabolisme

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Teknikker for å måle aktiviteten til viktige enzymer av glykogenmetabolisme presenteres ved hjelp av et enkelt spektrofotometer som opererer i det synlige området.

Abstract

Glykogen syntetiseres som en lagringsform av glukose av et bredt spekter av organismer, alt fra bakterier til dyr. Molekylet består av lineære kjeder av α1,4-bundne glukoserester med grener introdusert ved tilsetning av α1,6-koblinger. Å forstå hvordan syntesen og nedbrytningen av glykogen reguleres og hvordan glykogen oppnår sin karakteristiske forgrenede struktur, krever studier av enzymer for glykogenlagring. Imidlertid bruker metodene som oftest brukes til å studere disse enzymaktivitetene, reagenser eller teknikker som ikke er tilgjengelige for alle etterforskere. Her diskuterer vi et batteri av prosedyrer som er teknisk enkle, kostnadseffektive og likevel i stand til å gi verdifull innsikt i kontrollen av glykogenlagring. Teknikkene krever tilgang til et spektrofotometer, som opererer i området 330 til 800 nm, og er beskrevet under forutsetning av at brukerne vil benytte engangs plastkuvetter. Prosedyrene er imidlertid lett skalerbare og kan modifiseres for bruk i en mikroplateleser, noe som muliggjør svært parallell analyse.

Introduction

Glykogen er utbredt i naturen, med forbindelsen som finnes i bakterier, mange protister, sopp og dyr. I mikroorganismer er glykogen viktig for celleoverlevelse når næringsstoffer er begrensende, og i høyere organismer som pattedyr tjener syntese og nedbrytning av glykogen til å buffere blodsukkernivået 1,2,3. Studien av glykogenmetabolisme er derfor av betydning for så forskjellige felt som mikrobiologi og pattedyrfysiologi. Å forstå glykogenmetabolismen krever å studere de viktigste enzymene for glykogensyntese (glykogensyntase og forgreningsenzymet) og glykogennedbrytning (glykogenfosforylase og avgreningsenzym). Gullstandardanalysene av glykogensyntase, fosforylase, forgrening og debranching enzymaktiviteter benytter radioaktive isotoper. For eksempel måles glykogensyntase vanligvis i en stoppet radiokjemisk analyse ved å følge inkorporering av glukose fra UDP-[14 C] glukose (i tilfelle av dyre- og soppenzymer) eller ADP-[14C] glukose (i tilfelle av bakterielle enzymer) i glykogen 4,5. Tilsvarende måles glykogenfosforylase i retning av glykogensyntese, etter inkorporering av glukose fra [14C]glukose-1-fosfat til glykogen6. Forgreningsenzymet analyseres ved å måle dette enzymets evne til å stimulere inkorporering av [14 C] glukose fra glukose-1-fosfat i α1,4-bundne kjeder av glykogenfosforylase7, og avgreningsenzymaktivitet bestemmes ved å følge enzymets evne til å inkorporere [14C] glukose i glykogen8 . Selv om de er svært følsomme, slik at de kan brukes i råcelleekstrakter med lave nivåer av enzymaktivitet, er de radioaktive substratene dyre og underlagt forskriftskravene som følger med radioisotopbruk. Disse barrierene plasserer bruken av visse analyser utenfor rekkevidde for mange arbeidstakere. I løpet av mange år har imidlertid et imponerende utvalg av spektrofotometriske tilnærminger til måling av disse enzymene blitt beskrevet. Generelt er disse tilnærmingene til slutt avhengige av å måle produksjonen eller forbruket av NADH / NADPH, eller genereringen av fargede komplekser mellom glykogen og jod. Dermed er de enkle og kan utføres ved hjelp av enkle spektrofotometere utstyrt med bare wolfram- eller xenonblitslamper.

Spektrofotometriske analyser av glykogensyntase er avhengige av å måle nukleosiddifosfatet frigjort fra sukkernukleotiddonoren når glukose tilsettes til den voksende glykogenkjeden 9,10. Prosedyren for måling av glykogensyntaseaktivitet beskrevet i avsnitt 1 i protokollen nedenfor er en modifikasjon av den som er skissert av Wayllace et al.11, og koblingsskjemaet er vist nedenfor:

(Glukose) n + UPD-glukose → (glukose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpyruvat → pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H + → Laktat + NAD +

Glykogensyntase tilfører glukose fra UDP-glukose til glykogen. UDP generert i denne prosessen omdannes til UTP av nukleosiddifosfatkinase (NDP-kinase), i en reaksjon som genererer ADP. ADP tjener i sin tur som et substrat for pyruvatkinase, som fosforylerer ADP ved bruk av fosfoenolpyruvat som fosfatdonor. Det resulterende pyruvatet omdannes til laktat av enzymet laktatdehydrogenase i en reaksjon som forbruker NADH. Analysen kan derfor utføres kontinuerlig, og overvåker reduksjonen i absorbans ved 340 nm når NADH forbrukes. Det er lett tilpasset for bruk med enzymer som krever ADP-glukose som glukosedonor. Her er koblingstrinnene enklere siden ADP frigjort ved virkningen av glykogensyntase påvirkes direkte av pyruvatkinase.

Det finnes en rekke spektrofotometriske analyser tilgjengelig for bestemmelse av glykogenfosforylaseaktivitet. I den klassiske versjonen drives enzymet bakover, i retning av glykogensyntese, som vist nedenfor:

(Glukose) n + glukose-1-fosfat → (glukose)n+1 + Pi

Ved tidsbestemte intervaller fjernes aliquots av reaksjonsblandingen, og mengden fosfatfrigjort kvantifiseres12,13. I våre hender har denne analysen vært av begrenset bruk på grunn av tilstedeværelsen av lett målbart fritt fosfat i mange kommersielle preparater av glukose-1-fosfat, kombinert med de høye konsentrasjonene av glukose-1-fosfat som kreves for fosforylasevirkning. Snarere har vi rutinemessig brukt en alternativ analyse som måler glukose-1-fosfat frigjort som glykogen nedbrytes av fosforylase13. En koblet reaksjonsordning, illustrert nedenfor, er brukt.

(Glukose) n + Pi → (glukose)n-1 + glukose-1-fosfat

Glukose-1-fosfat → glukose-6-fosfat

Glukose-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+

Glukose-1-fosfatet omdannes til glukose-6-fosfat av fosfoglukomutase, og glukose-6-fosfatet oksyderes deretter til 6-fosfoglukonolakton, med samtidig reduksjon av NADP + til NADPH. Prosedyren beskrevet i avsnitt 2 i protokollen nedenfor er avledet fra metoder beskrevet av Mendicino et al.14 og Schreiber & Bowling 15. Analysen kan lett utføres kontinuerlig, med økning i absorbans ved 340 nm over tid, slik at reaksjonshastigheten kan bestemmes.

Spektrofotometrisk bestemmelse av avgrenende enzymaktivitet er avhengig av måling av glukosen frigjort ved enzymets virkning på fosforylasegrensedekstrin 16. Denne forbindelsen er laget ved å behandle glykogen uttømmende med glykogenfosforylase. Siden glykogenfosforylasevirkningen stopper 4 glukoserester fra et α1,6-grenpunkt, inneholder grensen dekstrin glykogen, hvis ytre kjeder er forkortet til ~ 4 glukoserester. Fremstilling av fosforylasegrense dextrin er beskrevet her, ved hjelp av en prosedyre avledet fra de som er utviklet av Taylor et al.17 og Makino &Omichi 18.

Debranching er en to-trinns prosess. 4-α-glukanotransferaseaktiviteten til det bifunksjonelle avgreningsenzymet overfører først tre glukoserester fra grenpunktet til den ikke-reduserende enden av en nærliggende α1,4-bundet glukosekjede. Den enkle, α1,6-bundne glukoseresten som er igjen ved grenpunktet, hydrolyseres deretter av α1,6-glukosidaseaktiviteten19. Analysen utføres vanligvis på en stoppet måte, glukosen frigjøres etter en gitt tid (eller serie ganger) måles i en koblet enzymanalyse som vist nedenfor:

(Glukose) n → (glukose)n-1 + glukose

Glukose + ATP → glukose-6-fosfat + ADP

Glukose-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+

Bestemmelsen av NADPH produsert gir et mål på glukoseproduksjon. Prosedyren som er skissert i avsnitt 3 i protokollen nedenfor, er basert på en som er beskrevet av Nelson et al.16. Som de andre metodene som er avhengige av forbruk eller generering av NADH / NADPH, er analysen ganske følsom. Imidlertid vil tilstedeværelsen av amylaser eller andre glukosidaser, som også kan frigjøre fri glukose fra fosforylasegrense dextrin, forårsake betydelig forstyrrelse (se diskusjon).

Den kolorimetriske bestemmelsen av forgreningsenzymaktivitet er avhengig av det faktum at α1,4-bundne kjeder av glukose vedtar spiralformede strukturer som binder seg til jod, og danner fargede komplekser20. Fargen på komplekset som dannes avhenger av lengden på α1,4-bundne kjeder. Dermed danner amylose, som består av lange, stort sett uforgrenede kjeder av α1,4-bundet glukose, et dypblått kompleks med jod. I motsetning til dette danner glykogener, hvis ytre kjeder vanligvis er i størrelsesorden bare 6 til 8 glukoserester lange, oransje-røde komplekser. Hvis en løsning av amylose inkuberes med forgreningsenzym, resulterer innføringen av grener i amylosen i generering av kortere α1,4-bundne glukosekjeder. Dermed skifter absorpsjonsmaksimumet til amylose/jodkompleksene mot kortere bølgelengder. Prosedyren diskutert her er avledet fra det som er beskrevet av Boyer & Preiss21 og forgreningsenzymaktivitet kvantifiseres som en reduksjon i absorpsjon av amylose / jodkomplekset ved 660 nm over tid.

Som det fremgår av diskusjonen ovenfor, betyr det faktum at fargene på kompleksene dannet mellom jod og α1,4-glukosekjeder varierer med kjedelengden, at absorbansspektrene til glykogen / jodkomplekser bør variere med graden av glykogenforgrening. Dette er faktisk tilfelle, og mindre forgrenede glykogener / glykogener med lengre ytre kjeder absorberer lys ved en lengre bølgelengde enn glykogener som er mer forgrenede / har kortere ytre kjeder. Jodfargingsreaksjonen kan derfor brukes til å få raske, kvalitative data om graden av glykogenforgrening22. Den oransjebrune fargen dannes når glykogenkomplekser med jod ikke er spesielt intense. Imidlertid kan fargeutviklingen forbedres ved inkludering av mettet kalsiumkloridoppløsning22. Dette øker følsomheten til metoden rundt 10 ganger og tillater klar analyse av mikrogrammengder glykogen. Analysen for bestemmelse av forgrening beskrevet i avsnitt 4 i protokollen, nedenfor, er tilpasset fra en prosedyre utviklet av Krisman22. Det utføres ganske enkelt ved å kombinere glykogenprøven med jodoppløsning og kalsiumklorid i en kyvette og samle absorpsjonsspekteret fra 330 nm til 800 nm. Absorbansmaksimumet forskyves mot lengre bølgelengder etter hvert som graden av forgrening avtar.

Samlet gir metodene beskrevet her enkle, pålitelige midler for å vurdere aktivitetene til nøkkelenzymene for glykogenmetabolisme, og for å oppnå kvalitative data om omfanget av glykogenrenering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitet

  1. Klargjør stamløsninger av nødvendige reagenser som angitt i tabell 1 (før forsøksdagen).
Komponent Veibeskrivelser
50 mM Tris pH 8,0 Løs opp 0,61 g Tris-basen i ~ 80 ml vann.  Chill til 4 ° C.   Juster pH til 8,0 med HCl og gjør volumet opp til 100 ml med vann.
20 mM HEPES-buffer Oppløs 0,477 g HEPES i ~ 80 ml vann.  Juster pH til 7,0 med NaOH og gjør opp volumet til 100 ml med vann.
132 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8 Løs opp 1,94 g Tris-base og 0,239 g KCl i ~90 ml vann.  Juster pH til 7,8 med HCl og gjør opp volumet til 100 ml med vann.
0,8% w / v østers glykogen Vei ut 80 mg østersglykogen og tilsett vann.  Gjør det endelige volumet opp til 10 ml med vann og varm forsiktig / bland for å oppløse glykogen helt.
100 mM UDP-glukose Oppløs 0,31 g UDP-glukose i vann og gjør sluttvolumet opptil 1 ml.  Oppbevares i aliquots, frosset ved -20 °C.   Stabil i flere måneder.
50 mM ATP Oppløs 0,414 g ATP i ~ 13 ml vann.  Juster pH til 7,5 med NaOH og gjør opp volumet til 15 ml med vann.  Oppbevares i aliquots frosset ved -20 °C.   Stabil i flere måneder.
100 mM glukose-6-fosfat pH 7,8 Oppløs 0,282 g glukose-6-fosfat i ~ 7 til 8 ml vann.  Juster pH til 7,8 med NaOH.  Gjør volumet opptil 10 ml med vann.  Oppbevares frosset i aliquots ved -20 °C.   Stabil i minst seks måneder.
40 mM fosfoenolpyruvat Løs opp 4 mg fosfoenolpyruvat i 0,5 ml 20 mM HEPES-buffer pH 7,0.  Oppbevares ved -20 °C.   Stabil i minst 1 uke.
0,5 m mnCl2 Løs opp 9,90 g MnCl2 i et siste volum på 100 ml vann.
NDP kinase Rekonstituer frysetørket pulver med tilstrekkelig vann til å gi 1 U/μl oppløsning.  Tilbered aliquoter, frys i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C.   Stabil i minst 1 år.

Tabell 1: Lagerløsninger som kreves for analyse av glykogensyntaseaktivitet.

  1. På dagen for analysen, lag en fersk arbeidsløsning på 4 mM NADH ved å oppløse 4,5 mg NADH i 1,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Oppbevares på is, beskyttet mot lys.
  2. Tine lagerløsninger av UDP-glukose, ATP, fosfoenolpyruvat og NDP-kinase på is.
  3. Forvarm et vannbad til 30 °C.
  4. Sett opp hver glykogensyntaseanalyse i et 1,5 ml rør ved å tilsette reaksjonsblandingsreagensene listet opp i tabell 2.
Komponent Volum (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl buffer pH 7,8 250
Vann 179
100 mM glukose-6-fosfat, pH 7,8 58
0,8 % w/v østersglykogen 67
50 mM ATP 80
4 mM NADH 80
100 mM UDP-glukose 28
40 mM fosfoenolpyruvat 20
0,5 m mnCl2 8
Endelig volum 770

Tabell 2: Sammensetningsreaksjonsblanding for analyse av glykogensyntaseaktivitet.

MERK: For å lette oppsettet kan det lages en mastermiks som inneholder nok av hver av de ovennevnte reagensene til å fullføre antall planlagte analyser.

  1. Forbered en tom reaksjon, hvor NADH i blandingen ovenfor erstattes med vann. Overfør til en engangs metakrylat kyvette og bruk denne til å sette null på spektrofotometeret på 340 nm.
  2. Ta en 770 μL av aliquot av reaksjonsblandingen i et 1,5 ml rør. Tilsett 2 μL NDP-kinase og 2 μL pyruvatkinase/laktatdehydrogenaseblanding, bland forsiktig og inkuber ved 30 °C i 3 minutter for å forvarme reaksjonsblandingen.
  3. Tilsett 30 μL av prøven som inneholder glykogensyntase i 20 mM Tris buffer, pH 7,8; bland, og overfør reaksjonsblandingen til en engangs metakrylatkyvette.
  4. Plasser kyvetten i spektrofotometeret og registrer absorbansen ved 340 nm ved tidsbestemte intervaller i 10 til 20 minutter. Plott absorbansene oppnådd mot tiden.
    MERK: En reaksjon der glykogensyntaseprøven erstattes med 20 mM Tris-buffer, bør utføres for å kontrollere for ikke-enzymatisk oksidasjon av NADH. Avhengig av prøvens renhet, kan det være nødvendig med andre kontrollreaksjoner. Se Diskusjon for detaljer.
  5. Bestem reaksjonshastigheten (se Resultater for detaljer).

2. Bestemmelse av glykogenfosforylaseaktivitet

  1. Klargjør stamløsninger som angitt i tabell 3 (før forsøksdagen).
Komponent Veibeskrivelser
125 mM RØR pH 6,8 Løs opp 3,78 g rør i vann.  Juster pH til 6,8 med NaOH og gjør opp volumet til 100 ml med vann.
8% w / v østers glykogen Vei ut 0,8 g østersglykogen og tilsett vann.  Gjør det endelige volumet opp til 10 ml med vann og varm forsiktig / bland for å oppløse glykogen.  Oppbevares frosset ved -20 °C.
200 mM Na fosfat pH 6,8 Løs opp 2,63 g Na 2 HPO4,7 H 2 O og 1,41 g NaH2PO4. H2O i vann.  Ta volumet opp til 100 ml med vann.
1 mM glukose-1,6-bisfosfat Oppløs 2 mg glukose-1,6-bisfosfat i 4 ml vann.  Aliquot og oppbevares frosset ved -20 °C.   Stabil i minst flere måneder.
10 mM NADP Løs opp 23 mg NADP i 3 ml vann.  Aliquot og oppbevares frosset ved -20 °C.   Stabil i minst flere måneder.

Tabell 3: Lagerløsninger som kreves for analyse av glykogenfosforylaseaktivitet.

  1. Forvarm et vannbad til 30 °C
  2. Sett opp hver glykogenfosforylaseanalyse i et 1,5 ml rør ved å tilsette reaksjonsblandingsreagensene listet opp nedenfor (tabell 4).
Komponent Volum (μl)
125 mM RØR buffer pH 6,8 160
Vann 70
8% w / v østers glykogen 100
200 mM Na fosfat 6,8 400
1 mM glukose-1,6-bisfosfat 20
10 mM NADP 20
Endelig volum 770

Tabell 4: Sammensetningsreaksjonsblanding for analyse av glykogenfosforylaseaktivitet.

MERK: For å lette oppsettet kan det lages en mastermiks som inneholder nok av hver av de ovennevnte reagensene til å fullføre antall planlagte analyser.

  1. Forbered en tom reaksjon som inneholder komponentene oppført i tabell 4 , men tilsett ytterligere 30 μL 25 mM PIPES-buffer, pH 6,8 (fremstilt ved å fortynne 125 mM PIPES-buffer 1/5 med vann). Overfør til en engangs metakrylat kyvette og bruk til å sette null på spektrofotometeret ved 340 nm.
  2. Ta en 770 μL aliquot reaksjonsblanding i et 1,5 ml rør. Tilsett 1 μL glukose-6-fosfat dehydrogenase og 1 μL fosfoglukomutase, bland forsiktig og inkuber ved 30 ° C i 3 minutter for å forvarme reaksjonsblandingen.
  3. Tilsett 30 μL av prøven som inneholder glykogenfosforylase i 25 mM PIPES-buffer, pH 6,8. Bland og overfør reaksjonsblandingen til en engangs metakrylatkyvette.
  4. Plasser kyvetten i spektrofotometeret og registrer absorbansen ved 340 nm ved tidsbestemte intervaller i 10 til 20 minutter. Plott absorbansene oppnådd mot tiden.
    MERK: En reaksjon der glykogenfosforylase erstattes med 25 mM PIPES buffer bør inkluderes. Avhengig av renheten av glykogenfosforylaseprøven, kan det også være nødvendig med andre kontroller (se Diskusjon for detaljer).
  5. Bestem reaksjonshastigheten (se Representative resultater for detaljer).

3. Bestemmelse av glykogenregrenerende enzymaktivitet

  1. Klargjør stamløsninger som angitt i tabell 5 (før forsøksdagen).
Komponent Veibeskrivelser
100 mM maleate buffer Løs opp 1,61 g maleinsyre i ~ 80 ml vann.  Juster pH til 6,6 med NaOH og gjør det endelige volumet opp til 100 ml med vann.
300 mM trietanolaminhydroklorid/ 3 mM MgSO4 pH 7,5 Løs opp 27,85 g trietanolaminhydroklorid og 0,370 g MgSO4. 7H2O i ~ 400 ml vann.  Juster pH til 7,5 med NaOH og lag opp til et endelig volum på 500 ml med vann.
150 mM ATP/12 mM NADP Oppløs 1,24 g ATP i ~ 10 ml vann.  Overvåk pH og tilsett NaOH for å opprettholde en pH på ~ 7,5 når ATP oppløses.  Legg til 0,138 g NADP.  Juster pH til ~ 7,5 med NaOH og lag opp til et endelig volum på 15 ml med vann. Oppbevares i aliquots ved – 20 °C. Stabil i flere måneder.
50 mM Na fosfatbuffer pH 6,8 Løs opp 32,81 g Na 2 HPO4,7 H 2 O og 17,61 g NaH2PO4. H2O i vann.  Ta volumet opp til et siste volum på 5 liter med vann.

Tabell 5: Lagerløsninger som kreves for analyse av glykogenregreningsenzymaktivitet.

  1. Forbered fosforylasegrense dextrin
    1. Løs opp 0,3 g østersglykogen i 10 ml 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 6,8.
    2. Oppløs tilstrekkelig lyofilisert fosforylase A-pulver for å gi 60 U aktivitet i 50 mM fosfatbuffer, pH 6,8.
      MERK: Avhengig av mye fosforylase A kjøpt, vil massen som trengs variere, men er vanligvis mellom 5 og 10 mg pulver.
  2. Tilsett 60 U fosforylase A i glykogenoppløsningen og overfør til en dialysepose. Dialyse ved romtemperatur mot 1 liter 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 6,8 i 8 timer. Bytt til den friske dialysebufferen og fortsett inkubasjonen over natten.
  3. Tilsett ytterligere 10 U fosforylase A og bytt til fersk dialysebuffer. Etter 8 timer, bytt igjen til fersk dialysebuffer og fortsett inkubasjonen over natten.
  4. Overfør innholdet i dialyseposen til et sentrifugerør og kok i 10 minutter. Chill på is, og sentrifuger deretter ved 10.000 x g i 15 min.
  5. Overfør supernatanten til en dialysepose og dialyse i 8 timer mot tre endringer på 2 liter destillert vann.
  6. Overfør innholdet i dialyseposen til et 50 ml sentrifugerør. Mål volumet og tilsett to volumer iskald absolutt etanol for å utfelle grensen dextrin. La røret stå på is i 30 min.
    MERK: Et hvitt bunnfall skal begynne å danne umiddelbart etter tilsetning av etanol, men hvis det ikke gjør det, tilsett en dråpe på 3 M NaCl.
  7. Sentrifuge ved 15 000 x g i 15 minutter og kast supernatanten. Skyll den hvite pelleten med grensedekstrin to ganger med 66% v / v etanol, med ~ 30 ml for hver skylling.
  8. Overfør grensen dextrin til en mørtel og la lufttørke helt. Når grensen dextrin er tørr, slip til et pulver med en pestle og overfør til et egnet fartøy for lagring; tørr ved 4 °C.
  9. For bruk som avgreningsenzymsubstrat, lag en 1% w / v-løsning i vann.
  10. Forvarm et vannbad til 30 °C.
  11. Forvarm en varmeblokk eller et vannbad til 95 °C.
  12. Forbered fire 1,5 ml rør som hver inneholder 100 μL maleatbuffer, 80 μL fosforylasegrense dekstrin og 10 μL vann. Disse rørene vil bli brukt til å utføre debranching enzymanalysen. Merk to av rørene Reaksjon og de to andre rørene Kontroll.
  13. Ved tidsbestemte intervaller tilsettes 10 μL av den avgrenende enzymprøven til reaksjonsrørene og 10 μL buffer som ble brukt til å forberede forgreningsenzymprøven til kontrollrørene. Inkuber ved 30 °C.
  14. Ved definerte tidspunkter (f.eks. 5-, 10- og 20-minutters inkubasjon), trekk ut 50 μL fra hvert reaksjons- og kontrollrør og plasser umiddelbart i varmeblokken eller vannbadet ved 95 °C. Varm i 3 min.
  15. Sentrifuge ved 15 000 x g i 2 minutter for å fjerne utfelt protein.
    MERK: På dette tidspunktet kan prosedyren stoppes om nødvendig. De oppvarmede prøvene kan oppbevares frosset ved -20 °C til målingen av frigjort glukose (trinn 17 nedenfor) går videre).
  16. Måling av frigjort glukose
    1. Overfør 40 μL av supernatanten fra de oppvarmede prøvene til engangs metakrylatkyvetter og tilsett 833 μL trietanolaminhydroklorid / magnesiumsulfatbuffer, 67 μL NADP / ATP-blanding og 60 μL vann. Bland ved å pipettere forsiktig opp og ned, vær forsiktig så du ikke introduserer luftbobler.
      MERK: For å lette oppsettet kan det lages en mastermiks som inneholder nok av hver av de ovennevnte reagensene til å fullføre antall planlagte analyser.
    2. Forbered en tom reaksjon ved å kombinere 100 μL maleatbuffer, 80 μL fosforylasegrense dekstrin og 20 μL vann. Bland godt, og overfør 40 μL til en engangs metakrylatkyvette. Tilsett 833 μL trietanolaminhydroklorid/magnesiumsulfat etc. som beskrevet i trinn 3.17.1.
    3. Sett nullen på spektrofotometeret ved 340 nm ved hjelp av den tomme reaksjonen.
    4. Tilsett 0,5 μL glukose-6-fosfat dehydrogenase til hver kyvett. Bland forsiktig ved å pipettere sakte opp og ned. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter, og registrer deretter absorbansen ved 340 nm.
      MERK: Absorpsjonsverdiene skal være lave, noe som betyr liten kontaminering av prøvene med glukose-6-fosfat.
    5. Tilsett 0,5 μL heksokinase. Bland forsiktig ved å pipettere sakte opp og ned. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter, og registrer deretter absorbansen ved 340 nm.
    6. Fortsett inkubasjonen ved romtemperatur i ytterligere 5 minutter. Ta opp absorbansen ved 340 nm igjen. Hvis absorpsjonen har økt fra det som er registrert ved 15 minutter, fortsett inkubasjonen i ytterligere 5 minutter og kontroller absorpsjonen igjen. Registrer den endelige absorpsjonen ved 340 nm oppnådd.
    7. For hver prøve trekker du absorbansen ved 340 nm registrert etter tilsetning av glukose-6-fosfatdehydrogenase fra den endelige absorbansen oppnådd etter tilsetning av heksokinase. Plot verdiene oppnådd mot hvor lang tid den tilsvarende prøven hadde blitt inkubert med debranching enzym.

4. Bestemmelse av glykogenrenforgrenende enzymaktivitet

  1. Før forsøksdagen tilberedes jod/KI-oppløsning ved først å oppløse 2,6 g KI i 10 ml vann. I en avtrekksvifte, vei ut 0,26 g jod og tilsett KI-løsningen.
    FORSIKTIG: Jod er skadelig når det kommer i kontakt med huden eller ved innånding. Bland for å løse opp jod og oppbevar ved 4 °C, beskyttet mot lyset. Klargjør også 125 mM PIPES buffer, pH 6,8 (se tabell 3).
  2. Når du begynner eksperimenter, gjør du et arbeidslager av surgjort jodreagens.
    1. Ta 45,7 ml vann i et 50 ml rør og tilsett 150 μL jod / KI-oppløsning etterfulgt av 150 μL 1 M HCl.
    2. Bland godt og oppbevar ved 4 °C, beskyttet mot lyset. Løsningen er stabil i minst 3 dager under disse forholdene.
  3. På forsøksdagen, lag en fersk 10 mg / ml løsning av amylose.
    1. Vei ut 50 mg amylose og overfør til et 15 ml rør.
    2. Tilsett 200 μL absolutt etanol og rist forsiktig.
    3. Tilsett 500 μL på 2 M KOH og rist forsiktig.
      FORSIKTIG: KOH forårsaker alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Bruk egnet personlig verneutstyr.
    4. Tilsett 0,5 ml vann mens du rister forsiktig. Hvis amylosen ikke oppløses helt, tilsett ytterligere 0,5 ml vann.
    5. Juster pH til ~ 6,5 til 7,0 med 1 M HCl.
      FORSIKTIG: HCl kan forårsake irritasjon i øye, hud og luftveier. Bruk egnet personlig verneutstyr.
    6. Tilsett vann for å nå et sluttvolum på 5 ml.
    7. Steriliser ved passasje gjennom et 0,2 μm sprøyteendefilter og oppbevar ved romtemperatur. Skal ikke avkjøles eller fryses.
  4. Forvarm et vannbad til 30 °C.
  5. Forbered tolv 1,5 ml rør, hver inneholdende 1 ml surgjort jodreagens. Sett til side på benken. Disse vil bli brukt til å stoppe forgreningsenzymreaksjonen.
  6. Forbered fire 1,5 ml rør som hver inneholder 150 μL amylose, 150 μL rørbuffer og 45 μL vann. Disse rørene vil bli brukt til å utføre forgreningsenzymanalysen. Merk to av rørene Reaksjon og de to andre rørene Kontroll.
  7. Ved tidsbestemte intervaller, tilsett 5 μL forgreningsenzymprøve til reaksjonsrørene og 5 μL buffer som ble brukt til å forberede forgreningsenzymprøven til kontrollrørene. Inkuber ved 30 °C.
  8. Ved definerte tidspunkter (f.eks. 5, 10 og 15 min inkubasjon), trekk ut 10 μL fra hvert reaksjons- og kontrollrør og tilsett 1,5 ml rør som inneholder 1 ml surgjort jodreagens. Tilsett ytterligere 140 μL vann og bland godt. Overfør til engangs kyvetter.
    MERK: Prøvene skal være blå i fargen og løsningen skal være fri for bunnfall. Fargen som dannes er stabil i minst 2 timer ved romtemperatur.
  9. Forbered en prøve som inneholder 1 ml surgjort jodreagens og 150 μL vann. Bland godt og overfør til en kyvette. Bruk denne kyvetten til å sette nullen på spektrofotometeret til 660 nm.
  10. Les absorbansen til hver av de tolv prøvene ved 660 nm. Bestem hastigheten på forgreningsenzymreaksjonen ved å trekke absorbansen oppnådd i nærvær av forgreningsenzym (reaksjon) fra absorbansen når det ikke er noe forgreningsenzym tilstede (kontroll) ved hvert tidspunkt. Se Representative resultater for mer informasjon.

5. Kvalitativ vurdering av glykogenrenering

  1. Forbered mettet kalsiumkloridoppløsning ved å tilsette 74,5 g vannfritt kalsiumklorid til ~40 ml vann og omrøring. Tilsett litt mer vann og fortsett å røre. Gjør volumet opp til 100 ml med vann og fortsett å røre til CaCl2 er helt oppløst.
  2. Forbered et arbeidslager av jod/CaCl 2 fargereagens ved å blande 50 μL KI/jodstamløsning (se trinn 4.1 ovenfor) med 13 ml mettet CaCl2-oppløsning i et 15 ml rør. Bland godt og oppbevar ved 4 °C, beskyttet mot lyset. Løsningen er stabil i minst 1 uke under disse forholdene.
  3. Bestemmelse av forgrening
    1. I et 1,5 ml rør kombinerer du 650 μL jod / CaCl2 fargereagensmasse med 100 μL vann og blandes grundig. Overfør løsningen til en engangs metakrylatkyvett.
      MERK: Løsningen i kyvetten skal være klar og svakt gul i fargen.
    2. Plasser i spektrofotometeret, og kjør i en bølgelengdeskanningsmodus, samle et bakgrunnsspektrum fra 330 nm til 800 nm.
    3. I et 1,5 ml rør kombinerer du 650 μL arbeidsjod / CaCl2 fargereagens med 50 μg østersglykogen. Ta det endelige volumet til 750 μL med vann og bland godt. Overfør løsningen til en engangs metakrylatkyvett.
      MERK: Oppløsningen i kyvetten skal være klar og ha en dyp oransje/brun farge.
    4. Plasser i spektrofotometeret og samle et absorpsjonsspektrum fra 330 nm til 800 nm.
    5. Gjenta trinn 4.4.3 til 4.4.4 med 50 μg amylopektin og 30 μg amylose.
      MERK: Amylopektinprøven skal være gul/grønn og amyloseprøven skal være grønn/blå. Begge prøvene skal være klare. De fargede kompleksene som dannes er stabile, uten endring i absorpsjonsspekteret, i minst 1 time ved romtemperatur.
    6. For å oppnå en indikasjon på den forgrenede strukturen til en ukarakterisert glykogenprøve, kombiner 25 μg til 50 μg glykogen med 650 μL arbeidsjod / CaCl2 fargereagens. Fortsett som ovenfor, bring volumet til 750 μL med vann, bland godt og overfør til en metakrylatkyvette.
      MERK: Glykogenprøven skal gi en gul / oransje til oransje / brun farge avhengig av graden av forgrening (lengden på ytre kjeder) av glykogenet som er tilstede. Igjen bør prøven være klar. Se Representative resultater for mer informasjon.
    7. Samle absorpsjonsspekteret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitet
Figur 1 viser representative resultater fra glykogensyntaseanalyser med rensede enzymer. I panel A, etter et lite etterslep, var det en lineær reduksjon i absorpsjonen ved 340 nm over tid i en periode på rundt 12 minutter. Endringshastigheten i absorpsjon i figur 1A var ~0,12 absorbansenheter/min. En endringshastighet i absorbans mellom ~0,010 og ~0,20 absorbansenheter/min er optimal, og mengden tilsatt glykogensyntase bør justeres for å gi rater innenfor dette området. I panel B vises resultatet av å legge for mye glykogensyntase til analysen. Her var reaksjonen komplett i løpet av de første 2 minuttene. Kontrollreaksjonen, som i disse tilfellene ikke inneholdt glykogensyntase, viste ingen målbar reduksjon i absorbans over tid. Som utdypet i diskusjonen, er bruk av vevshomogenater i denne analysen fullt mulig, selv om det er nødvendig med ytterligere kontrollreaksjoner.

Protokollen beskrevet her bruker østersglykogen som substrat, som fungerer godt med glykogensynteser fra mange forskjellige arter. Det skal imidlertid bemerkes at glykogensyntaser kan vise ganske variabel aktivitet avhengig av hvilken type glykogen som brukes. Derfor er det tilrådelig å kartlegge en rekke former for glykogen før du begynner en detaljert studie.

Protokollen som er gitt inkluderer glukose-6-fosfat i reaksjonsblandingen, siden mange glykogensynteser er allosterisk aktivert av denne forbindelsen 9,23,24,25,26. Gjennomføring av analyser i nærvær og fravær av glukose-6-fosfat (som utgjør reaksjonsvolumet med vann), tillater beregning av -/+ glukose-6-fosfataktivitetsforholdet, noe som er en nyttig indikasjon på fosforyleringstilstanden til pattedyr- og soppglykogensyntaser 1,27.

Bestemmelsen av glykogensyntaseaktivitet fra endringen i absorbans er ganske grei. Utryddelseskoeffisienten til NADH er tatt som 6220 M-1 cm-1, noe som gjør det mulig å beregne endringshastigheten i NADH-konsentrasjonen fra absorbansendringshastigheten som følger:

En endringshastighet i absorpsjon på 0,12 enheter/min tilsvarer 0,12/6220 = 1,93 x 10-5 mol/l/min endring i NADH-konsentrasjon. Volumet i kyvetten var 0,8 ml, noe som betyr at endringen i mengde NADH var: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol / min. Volumet av enzym tilsatt var 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5,76 x 10-7 mol NADH konsumert / min / ml enzym.

Siden det er et en-til-en-forhold mellom konsumert NADH og glukosen innlemmet i glykogen, kan reaksjonshastigheten uttrykkes som 5,76 x 10-7 mol glukose innlemmet / min / ml.

Når proteininnholdet i enzymprøven er kjent, kan den spesifikke enzymaktiviteten uttrykkes som μmol glukose inkorporert/min/mg protein eller nmol glukose inkorporert/min/mg protein, alt etter hva som er hensiktsmessig.

Som nevnt i innledningen er protokollen lett tilpasset for å måle aktiviteten til glykogensyntaser som bruker ADP-glukose som glukosedonor. Dette oppnås ved enkel substitusjon av UDP-glukose med ADP-glukose i reaksjonsblandingen. Videre utelates både NDP-kinase og ATP fra reaksjonsblandingen, siden ADP som frigjøres under glykogensyntasevirkning er et direkte substrat for pyruvatkinase.

Figure 1
Figur 1: Representative resultater fra analyser av glykogensyntaseaktivitet. Spektrofotometeret ble satt til å ta en avlesning per min i en total tid på 20 min. Panel A viser forventet kort forsinkelsesfase etterfulgt av en lineær reduksjon i absorbans med tiden (eksperimentell). Det var ingen reduksjon i absorpsjonen som ble observert i kontrollreaksjonen. Reaksjonshastigheten beregnes ut fra absorbansendringens helning i lineærfasen (fra 5 til 16 min). Panel B viser resultatet av å legge til for mye enzym. Her er NADH oppbrukt innen 2 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Bestemmelse av glykogenfosforylaseaktivitet
Figur 2 viser representative data fra en glykogenfosforylaseanalyse ved bruk av renset enzym. Med preparatet som ble brukt her, var analysen lineær i ca. 3 minutter. Innfellingen viser en regresjonslinje trukket gjennom punktene fra tid 0 til 2,5 min. Hellingen på denne linjen viser hastigheten på absorbansendringen til å være 0,022 absorbansenheter/min. En absorbansøkning på rundt 0,01 til 0,04 er optimal, siden analysen vil avvike fra linearitet ganske raskt hvis for mye enzym er tilstede. Graden av NADPH-dannelse beregnes ut fra utryddelseskoeffisienten som, som for NADH, er 6220 M-1 cm-1. For hver 1 mol NADPH dannet, hadde en mol glukose-1-fosfat blitt produsert ved virkningen av glykogenfosforylase. Enzymaktivitet kan derfor uttrykkes som mengden glukose-1-fosfat frigjort fra glykogen per tidsenhet, etter en beregning som ligner den som er skissert ovenfor.

Reaksjonsbetingelsene er lett tilpasningsdyktige for de fosforylaser som er følsomme for allosterisk modulering. De nødvendige effektorene er ganske enkelt inkludert i reaksjonsmasterblandingen, og erstatter noe av vannet. En viktig advarsel er at selve effektoren må vises å ikke påvirke aktiviteten til koblingsenzymer, fosfoglukomutase og glukose-6-fosfatdehydrogenase.

Til slutt, som med glykogensyntase beskrevet ovenfor, kan typen glykogen som brukes som substrat påvirke reaksjonshastigheten. Mens østersglykogen fungerer bra med fosforylaser fra mange arter, er det kanskje ikke alltid det optimale valget.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater fra analyser av glykogenfosforylaseaktivitet. Spektrofotometeret ble satt til å ta en avlesning hver 30. s i en total tid på 10 min. Det var en jevn økning i absorbans registrert i nærvær av glykogenfosforylase (eksperimentell), mens reaksjonen uten tilsatt fosforylase forble ved baseline (kontroll). Innfellingen viser en utvidelse av den opprinnelige reaksjonsperioden, og demonstrerer lineariteten til produktdannelsen med hensyn til tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bestemmelse av glykogenregrenerende enzymaktivitet
Dataene vist i figur 3 er representative for en glykogenregrenerende enzymanalyse ved bruk av renset avgreningsenzym. På hvert tidspunkt ble endringen i absorpsjon som skjedde i fravær av tilsatt forgreningsenzym (Kontroll) trukket fra endringen i absorpsjon som skjedde i nærvær av forgreningsenzym (Reaksjon). De resulterende absorbansverdiene ble deretter plottet. Som ovenfor beregnes en endringshastighet for NADPH-konsentrasjon fra kurvens innledende helling ved regresjonsanalyse. I dette eksemplet var økningen i NADPH per tidsenhet lineær i 10 minutter, med en helning på 0,0079 absorbansenheter/min. Selv om disse dataene er perfekt brukbare, ville tilsetningen av litt mindre enzym ha gitt en grunnere skråning og tillatt en lengre lineær fase. Alternativt kan ytterligere avlesninger tas ved å fjerne aliquots for måling ved 2 min og 7 min inkubasjon. Bestemmelse av debranching enzymaktivitet er veldig grei, siden 1 mol NADPH dannes for hver 1 mol glukose frigjort av α1,6-glukosidaseaktiviteten til debranching enzym. Dermed kan reaksjonshastigheten uttrykkes som mengden glukose frigjort fra fosforylasegrense dekstrin per tidsenhet, etter samme type beregning som ble brukt for glykogensyntase- og fosforylaseanalysene ovenfor.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater fra analyser av glykogenregrenerende enzymaktivitet. Prøver av fosforylase grense dextrin ble behandlet med debranching enzym i 5, 10, 20 eller 40 min. Økningen i absorbans ved 340 nm, produsert som NADP ble redusert til NADPH i en koblet enzymanalyse, ble målt i prøver tatt på hvert av disse tidspunktene. Reaksjonen viste en lineær fase, som vedvarte i minst 10 minutter.

Bestemmelse av glykogenrenforgrenende enzymaktivitet
Figur 4 viser data fra glykogenforgreningsenzymanalyser. Ved hvert av de angitte tidspunktene ble absorbansen av kontroll- og reaksjonsprøvene målt. Absorbansen av reaksjonsprøven ved 660 nm ble trukket fra den tilsvarende kontrollprøven, og absorbansforskjellen ble plottet mot tid. Deretter ble det trukket en regresjonslinje gjennom punktene (panel A). Reaksjonshastigheten kan uttrykkes ganske enkelt som endringen i absorbans ved 660 nm per tidsenhet. Den maksimale endringen i absorbans som kan forekomme i denne analysen er bare ~ 0,4 absorbansenheter, som representerer maksimal forgrening av den tilsatte amylosen av forgreningsenzymet (panel B). Videre, når absorbansen til reaksjonsrørene faller mer enn ~ 0,2 absorbansenheter under kontrollens, er analysen ikke lenger innenfor det lineære området, og ingen estimering av reaksjonshastighet kan gjøres (panel B).

Amylosen som brukes som substrat i denne prosedyren, vil begynne å forlate løsningen ganske lett hvis den er kjølt eller frosset og deretter tint. Derfor er det viktig å gjøre amylosesubstratløsningen frisk og for å sikre at det ikke har dannet seg bunnfall før bruk.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater fra analyser av glykogenforgreningsenzymaktivitet. Prøver av amylose ble behandlet med forgreningsenzym. Aliquots ble fjernet ved de viste tidspunktene og tilsatt et surgjort jodreagens. Absorbansen av amylose/jodkompleks dannet ble deretter målt til 660 nm. Dataene som vises representerer forskjellen i absorbans mellom kontrollinkubasjoner som manglet forgreningsenzym og reaksjoner som inneholdt forgreningsenzym. Panel A viser en reduksjon i absorbans ved 660 nm på grunn av avgrenende enzymaktivitet, som var lineær i ~ 20 min. Panel B illustrerer det smale dynamiske området til analysen, hvor den maksimale endringen i absorbans som kan produseres er ~ 0,4 absorbansenheter og linearitet går tapt når endringen i absorpsjon er ~ 0,2 absorbansenheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Kvalitativ vurdering av omfanget av glykogenforgrening
Amylose, amylopektin, fosforylasegrense dekstrin, glykogen isolert fra gjær ble kombinert med jod/mettet kalsiumkloridoppløsning og absorpsjonsspektra av de resulterende kompleksene ble samlet inn (figur 5). Ved å bruke massene av glykogen, amylopektin og amylose gitt i protokollen beskrevet ovenfor, bør maksimal absorpsjonsavlesning oppnådd være rundt 0,7 til 0,8, som vist her (paneler A og B). Absorbansmaksima for amylose og amylopektin er henholdsvis rundt 660 nm og 500 nm og 385 nm. Fosforylasegrense dekstrin ble inkludert her, siden innsamling av absorbansspekteret av fosforylasegrense dekstrin / jodkomplekser gir en rask kontroll av omfanget av fosforylasefordøyelse oppnådd under fremstillingen av dette avgrenende enzymsubstratet. Glykogen fra de fleste kilder produserer to topper, en ved ca. 400 nm og en andre topp ved 460 nm (figur 5B). Venstreforskyvninger i absorbansspektrene til glykogen indikerer økt forgrening/redusert ytre kjedelengde. Motsatt indikerer høyreforskyvninger redusert forgrening/økt ytre kjedelengde.

Den mettede kalsiumkloridoppløsningen er tett og de tilsatte glykogenprøvene vil danne et lag over toppen når de tilsettes. Derfor er det nødvendig med forsiktig blanding for å oppnå en homogen løsning. I tillegg, hvis karbohydratprøvene som brukes ikke er fullstendig oppløst før blanding med kalsiumkloridoppløsningen, vil det dannes mørkfargingsaggregater i kyvetten. Disse aggregatene vil åpenbart hindre innsamling av et absorpsjonsspekter, og det er viktig å sikre at løsningen i kyvetten er klar før du fortsetter med noen målinger.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater fra kvalitativ vurdering av glykogenforgrening. Prøver av renset fosforylasegrense dextrin, amylopektin, amylose (Panel A) eller glykogen (Panel B) ble kombinert med jod / mettet kalsiumkloridoppløsning og absorpsjonsspektra av de resulterende kompleksene ble målt fra 330 nm til 800 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generelt er de viktigste fordelene ved alle metodene som presenteres deres lave kostnader, letthet, hastighet og mangel på avhengighet av spesialutstyr. Den største ulempen som de alle deler er følsomhet sammenlignet med andre tilgjengelige metoder. Sensitiviteten til prosedyrene som involverer produksjon eller forbruk av NADH / NADPH er enkle å estimere. Gitt at utryddelseskoeffisienten til NADH / NADPH er 6,22 M-1 cm-1 , indikerer enkel aritmetikk at ~ 10-20 μM endringer i konsentrasjon lett kan oppdages. Med analysevolumene beskrevet i den nåværende artikkelen, tilsvarer dette evnen til å måle mengder i området ~ 10-20 nmol. Uten tvil er dette ganske følsomt. Det er imidlertid mulig å justere den spesifikke aktiviteten til radiomerkede substrater slik at følsomheten kan økes utover grensen for de spektrofotometriske analysene ganske enkelt. Selv om forgreningsenzymanalysen og den kvalitative vurderingen av glykogenrenering begge er avhengige av dannelsen av komplekser mellom jod og α1,4-bundne glukosepolymerer, er utgangen fra hver analyse forskjellig og deres følsomhet er også forskjellig. Spesifikke hensyn for hver av analysene som er beskrevet, diskuteres nedenfor.

Bestemmelse av glykogensyntaseaktivitet
Den koblede enzymanalysen beskrevet her tillater kontinuerlig analyse av glykogensyntaseaktivitet, noe som er nyttig ved bestemmelse av kinetiske parametere. Det er også lett skalerbart, og en veldig lignende prosedyre er beskrevet for bruk i mikrotiterplater, noe som gjør det mulig å foreta svært parallelle målinger av enzymaktivitet28. Vi bruker rutinemessig denne analysen med rensede, rekombinante glykogensyntaser29. Imidlertid ble de beskrevne prosedyrene opprinnelig utviklet for bruk i vevshomogenater (for eksempler, se Danforth10 og Leloir et al.9). En advarsel her er at vevshomogenatet må fortynnes riktig før bruk. Fortynningen er nødvendig for å redusere homogenatets turbiditet og interferens fra konkurrerende enzymer/substrater i homogenatet. Videre, for å ta hensyn til NADH-forbruk som ikke er avhengig av glykogensyntaseaktivitet, bør blanke reaksjoner som inneholder alle reaksjonskomponenter unntatt UDP-glukose inkluderes. Glykogensyntaseaktiviteten bestemmes deretter ved å trekke endringshastigheten i NADH-absorbans i fravær av UDP-glukose fra det som oppnås i nærvær av denne forbindelsen.

Bestemmelse av glykogenfosforylaseaktivitet
I likhet med glykogensyntaseanalysen kan den spektrofotometriske målingen av fosforylaseaktivitet utføres på en kontinuerlig måte, mens andre fosforylaseanalyser stoppes analyser13. Den er også lett tilpasningsdyktig for bruk i mikrotiterplater eller andre applikasjoner med høy gjennomstrømning15. Igjen krever bruk med vevshomogenater passende fortynning for å redusere turbiditet / forstyrrende reaksjoner. For eksempel er glukose-6-fosfat en ganske rikelig metabolitt, og dets tilstedeværelse i et vevshomogenat vil resultere i NADPH-produksjon via glukose-6-fosfatdehydrogenasekoblingsenzymet uavhengig av fosforylaseaktivitet. Ved arbeid med vevshomogenater bør kontrollreaksjoner som inneholder passende fortynnet vevshomogenat og alle andre analysekomponenter unntatt fosfat og glykogen inkluderes. Fosforylaseaktivitet beregnes deretter ved å trekke NADPH-produksjonen i fravær av glykogen / fosfat fra det som oppstår i nærvær av disse forbindelsene. Spesifikke anbefalinger knyttet til riktig grad av fortynning av ulike typer pattedyrvevekstrakt finnes i Mezl et al.13.

Bestemmelse av glykogenregrenerende enzymaktivitet
Selv om det her beskrives som en stoppet analyse, kan denne prosedyren lett tilpasses og utføres på en kontinuerlig måte16. Siden analysen er avhengig av produksjon av glukose, må bruken i råvevekstrakter vurdere frigjøring av glukose fra fosforylase begrense dextrin av andre enzymer enn debranching enzym, og generering av glukose ved virkningen av slike enzymer på endogent glykogen tilstede i vevekstraktet. Spørsmålet om endogent glykogen behandles lett med en kontrollreaksjon som ingen fosforylasegrense dextrin tilsettes. Tilstedeværelsen av andre α-glukosidaseaktiviteter kan estimeres i parallelle reaksjoner hvor maltose, i stedet for fosforylasegrensedektrin, er tilstede som substrat.

Bestemmelse av glykogenrenforgrenende enzymaktivitet
Av de forskjellige kvantitative analysene som diskuteres, er den kolorimetriske forgreningsenzymanalysen den desidert minst følsomme. Faktisk har det blitt anslått at følsomheten er rundt 50-100 ganger mindre enn den som oppnås med den radiokjemiske metoden, hvor stimulering av glykogenfosforylasereaksjonen ved tilsetning av forgreningsenzym måles21. I likhet med den avgrenende enzymanalysen er forgreningsenzymanalysen også følsom for tilstedeværelsen av forurensende glukosidaseaktiviteter, siden fordøyelsen av amylosen vil påvirke jodbindingen. Noen løsninger har blitt foreslått for å tillate bruk av analyser som ligner på det som er beskrevet her i nærvær av forurensende glukosidaseaktiviteter30. Etter vårt syn er imidlertid denne analysen best egnet til studier av rensede eller delvis rensede glykogenforgreningsenzymer, der slike forstyrrende aktiviteter er minimale eller fraværende.

Kvalitativ vurdering av omfanget av glykogenforgrening
Den detaljerte analysen av glykogenrenering er ganske arbeidskrevende, og involverer vanligvis en kombinasjon av enzymatisk fordøyelse, kjemisk modifikasjon og en rekke separasjonsteknikker for å analysere produktene som genereres31. Mens den kolorimetriske analysen som er beskrevet her, tydeligvis ikke kan gi sammenlignbar informasjon om den fine strukturen av glykogen, gir den et enkelt og raskt mål på mer eller mindre forgrening. Videre inneholder de oppnådde spektrene noen tilleggsinformasjon. For eksempel, som diskutert under Representative resultater, er prøver av glykogen vanligvis tilstede med absorbanstopper ved ~ 400 nm og ~ 460 nm. Toppen ved ~ 400 nm representerer tilsynelatende korte ytre kjeder i glykogenpartikler, siden den er forbedret i glykogen isolert fra gjærmutanter som mangler forgreningsenzym i forhold til villtype gjær32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingen kjente interessekonflikter knyttet til dette arbeidet, og det har ikke vært noen økonomisk støtte til dette arbeidet som kunne ha påvirket utfallet.

Acknowledgments

Forfatteren vil gjerne takke Karoline Dittmer og Andrew Brittingham for deres innsikt og mange nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 og 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

Biokjemi utgave 174
Spektrofotometriske metoder for studier av eukaryotisk glykogenmetabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter