Summary
Dette er en protokol til kirurgisk implantation og drift af en trådløst drevet grænseflade til perifere nerver. Vi demonstrerer nytten af denne tilgang med eksempler fra nervestimulatorer placeret på enten rottens iskiasnerve eller phrenic nerve.
Abstract
Perifere nervegrænseflader bruges ofte i eksperimentel neurovidenskab og regenerativ medicin til en lang række applikationer. Sådanne grænseflader kan være sensorer, aktuatorer eller begge dele. Traditionelle metoder til perifer nervegrænseflade skal enten binde til et eksternt system eller stole på batteristrøm, der begrænser tidsrammen for drift. Med den seneste udvikling af trådløse, batterifrie og fuldt implanterbare perifere nervegrænseflader kan en ny klasse af enheder tilbyde funktioner, der matcher eller overstiger deres kablede eller batteridrevne forløbere. Dette papir beskriver metoder til (i) kirurgisk implantering og (ii) trådløs strøm og kontrol af dette system hos voksne rotter. De iskias- og phrenic nervemodeller blev valgt som eksempler for at fremhæve alsidigheden af denne tilgang. Papiret viser, hvordan den perifere nervegrænseflade kan fremkalde sammensatte muskelaktionspotentialer (CMAP'er), levere en terapeutisk elektrisk stimuleringsprotokol og inkorporere en kanal til reparation af perifer nerveskade. Sådanne indretninger tilbyder udvidede behandlingsmuligheder for terapeutisk stimulering af enkeltdosis eller gentagen dosis og kan tilpasses en række forskellige nerveplaceringer.
Introduction
Traumatiske perifere nerveskader (PNI'er) forekommer i USA med en årlig forekomst på ca. 200.000 pr.År 1. De fleste patienter, der lider af PNI'er, efterlades med permanente funktionsnedsættelser. I værste fald kan dette resultere i muskellammelse og udløse behandlingsildfaste neuropatiske smerter så alvorlige, at patienter er villige til at gennemgå en lemamputation som behandling2. Den største hindring for at forbedre PNI-resultaterne er, at axonregenerering er for langsom i forhold til de afstande, de skal vokse igen. For eksempel vokser en voksen human axon ved 1 mm / dag, men skal muligvis regenerere over afstande > 1000 mm i tilfælde af en læsion i et proksimalt lem.
I nuværende klinisk praksis kræver ~ 50% af PNI'erne kirurgisk reparation3. For vellykket nerveregenerering skal axoner (i) vokse over læsionsstedet (dvs. mellemrumskrydsning) og derefter (ii) regenerere ned ad nervevejen for at nå et slutorganmål (dvs. distal genvækst) (figur 1). Der er ingen FDA-godkendte lægemidler, der har vist sig at fremskynde nerveregenerering. Status quo for PNI klinisk ledelse har kun ændret sig trinvist i løbet af de sidste årtier og er begrænset til tekniske forbedringer af kirurgiske metoder såsom distale motoriske nerveoverførsler for at reducere afstanden regenererende axoner skal rejse4 eller "off the shelf" syntetiske nerveledninger i tilfælde, hvor den proksimale nerve trækker sig tilbage og ikke direkte kan sutureres sammen igen5. Der har imidlertid været fire randomiserede kliniske forsøg med terapeutisk elektrisk stimulering anvendt på nerver postoperativt, som var enkeltcenterundersøgelser ledet af Dr. K. Ming Chan ved University of Alberta, der viser signifikant forbedret reinnervering af muskel 6,7,8 eller hud9. Det grundlæggende arbejde for denne elektriske stimuleringsprotokol blev udført hos gnavere10,11, hvor det har vist sig, at elektrisk stimulering virker specifikt ved at forbedre mellemrumskrydsning (figur 1), men ikke distal genvækst12,13,14,15.
Den kirurgiske placering af transkutane trådelektroder, der blev anvendt i alle fire randomiserede kliniske forsøg med elektrisk stimulering, var nødvendig, fordi dens virkninger afhænger af levering af tilstrækkelig strøm til at depolarisere neuroncellelegemet ved 20 Hz kontinuerligt i 1 h11. I klinisk praksis er denne elektriske stimuleringsprotokol ikke acceptabel for de fleste patienter ved de intensiteter, der kræves via overfladestimulerende elektroder på huden på grund af smerte. Der er ikke-trivielle risici forbundet med at køre transkutane elektroder postoperativt, såsom dyb sårinfektion eller utilsigtet forskydning af ledninger fra nerverne under patienttransport fra operationsstuen (OR). Derudover er de høje omkostninger ved OR-tid i sig selv et afskrækkende incitament mod at forsøge det i denne indstilling snarere end under akut postoperativ genopretning. En ny klasse af trådløse, batterifrie og fuldt implanterbare perifere nervegrænseflader dukker op for at løse denne mangel ved eksisterende perifere nervegrænseflader.
Denne nye klasse af trådløse implanterbare elektroniske systemer er klar til at øge letheden og fleksibiliteten til dosering af elektrisk stimulering og nedbryde de barrierer, der forhindrer dens bredere kliniske implementering. Dette papir beskriver metoder til (i) kirurgisk implantering og (ii) trådløs strøm og kontrol af dette system i voksne rotte-, iskias- og phrenic nervemodeller. Det viser, hvordan den perifere nervegrænseflade kan fremkalde CMAP'er, levere en terapeutisk elektrisk stimuleringsprotokol og endda fungere som en kanal til reparation af perifere nerver. Protokollerne her kan tilpasses til andre varianter af denne teknologi, der kan levere lysimpulser til optogenetisk medieret neuromodulation16, kontrolleret lægemiddelfrigivelse17 eller gentagne anfald af elektrisk stimulering over tid18,19.
Protocol
Alle procedurer beskrevet i denne protokol udføres i overensstemmelse med NIH Guide for pleje og brug af laboratoriedyr og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Northwestern University. Denne protokol følger retningslinjerne for dyrepleje fra Northwestern University's Center for Comparative Medicine og IACUC. Det er nødvendigt at rådføre sig med IACUC ved tilpasning af protokollerne.
1. Fremstilling af trådløs elektronisk stimulator (figur 2)
- Brug kobber / polyimid / kobber (18 μm tykt top og bund kobber, 75 μm tykt polyimid) som substrat for radiofrekvens strømhøster spole (dvs. trådløs modtagerantenne).
- Brug direkte laserablation til at mønstre huller til elektroderne på de øverste og nederste kobberlag og form enheden. Tilslut de øverste og nederste lag elektrisk ved hjælp af sølvpasta gennem hullerne.
- Fastgør de elektroniske komponenter med kommerciel emballage, såsom diode og kondensator, via lodning.
- Brug den bioresorberbare dynamiske kovalente polyurethan (b-DCPU; 200 μm tyk) indkapslede molybdæn (Mo; 15 μm tyk; serpentinstruktur) som strækbare forlængelseselektroder19.
- Dann manchetelektroden til grænsefladen mellem enheden og nerven ved hjælp af poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) film (300 μm tyk).
- Efter tilslutning af den trådløse modtagerantenne og strækbar forlængerelektrode indkapsles den trådløse modtagerantenne og forbindelsen med kommercialiseret vandtæt epoxy eller polydimethysiloxan (PDMS). Se figur 2 (højre) for den fuldt monterede enhed.
- Bekræft enhedens trådløse funktion ved hjælp af en bølgeformgenerator til at generere monofasiske elektriske impulser via den primære spole (dvs. transmissionsspolen).
BEMÆRK: Ved at undersøge rekrutteringen af perifere axoner og induktion af aksonal regenerering ved monofasiske og bifasiske stimuli rapporterede tidligere undersøgelser en ubetydelig effekt på grund af forskellene i bølgeformkarakteristik20, og denne gruppe har været i stand til at opnå terapeutisk elektrisk stimuleringsforbedring med de samme monofasiske strømparametre hos mus21 og rotter18. Desuden undersøgte tidligere undersøgelser biokompatibilitet in vivo og in vitro og fandt ingen tegn på vævsskader fra opvarmningseffekter eller selve materialerne. På grund af disse fund og den begrænsede varighed af terapeutisk elektrisk stimulering i denne undersøgelse blev monofasiske, snarere end bifasiske, stimuli anvendt i denne protokol. - Mål den resulterende jævnstrømsudgangsspænding med et oscilloskop forbundet til manchetelektroden.
2. Klargøring af udstyr til implantation
- Anbring implantatanordningerne i en steril petriskål og forsegl den med parafilm.
- Bestråle enhederne med UV-lys i 30 minutter pr. side.
3. Kirurgisk procedure af rotte højre iskiasnerveimplantation af trådløs, batterifri perifer nervegrænseflade til elektrisk stimulering (figur 3)
BEMÆRK: Oprethold sterile forhold. Udfør operationer inden for det udpegede kirurgiske område i et dyreforsøgsrum. Kirurgen vil donere en ansigtsmaske, frakke, hætte og sterile handsker under operationen. Hvis der udføres mere end én operation, skal du skifte sterile handsker mellem dyr og bruge rene, sterile kirurgiske instrumenter til hver operation. Steriliser værktøjer mellem operationer ved varmesterilisering (autoklave eller glasperlesterilisator). Brug voksne Sprague-Dawley rotter, der vejer 200-250 g.
- Inducer anæstesi ved hjælp af isoflurangasbedøvelse (3% induktion, 1-3% vedligeholdelse) i ilt (2 l / min) med subkutan administration af meloxicam (1-2 mg / kg). Dæk rotternes øjne med udpeget oftalmisk salve for at forhindre tørring.
- Placer rotterne i en udsat position på desinficerede kirurgiske borde til efterfølgende procedurer. I den resterende kirurgiske varighed skal du vurdere vejrtrækningshastigheden (skal være ~ 2 / s), vævsfarve og dybde af anæstesi ikke mindre end hvert 15. minut og opretholde isofluranniveauerne i overensstemmelse hermed. Bekræft den passende dybde af anæstesi ved at kontrollere pedalrefleks (manglende reaktion på en fast tåklemme). Overvåg slimhinderne, som skal forblive lyserøde og fugtige.
- Barber det kirurgiske område, herunder højre ben og nederste halvdel af ryggen. Skrub det barberede kirurgiske område med en betadinpude efterfulgt af en 70% medicinsk ethanolpind, og gentag denne skrubbeproces tre gange for huddesinfektion.
- Lav et snit på 1,5 - 2 cm i huden parallelt med højre lårbensknogle ved hjælp af vævssaks efterfulgt af stump adskillelse af subkutant bindevæv på bagsiden (direkte medial til snittet) for at rydde en subkutan lomme til modtagerspolen (figur 4A). Lav et efterfølgende snit (1,2-1,5 cm) på højre gluteal muskel parallelt med hudsnittet.
- Isoler forsigtigt iskiasnerven med metaldissektionssonder med stumpe ender (figur 4B).
BEMÆRK: Iskiasnerven er placeret dybt til biceps femoris og løber parallelt med lårbenet. Der foreslås et dissekerende omfang. - Implanter den trådløse, batterifri enhed på iskiasnerven (figur 4C) ved at vikle manchetten rundt om den isolerede højre iskiasnerve uden at sætte nerven under spænding eller forvrænge dens vej 18,19,20. Marker på huden, hvor modtagerspolen er placeret for yderligere elektrisk stimulering.
- Sutur gluteal muskelsnit ved hjælp af absorberbare suturer (figur 4D).
BEMÆRK: Den øverste halvdel af modtagerspolen sidder over glutealmusklen og manchetgrænsefladen under den. - Luk hudsnittet med sårklip (eller begravet sutur; Figur 4E). Match hudkanterne.
- Leverer 1 times kontinuerlig postkirurgisk 20 Hz elektrisk stimulering med 200 μs pulsbredde under anæstesi (figur 4F). Returner dyr til deres hjemmebure, når de er fuldt ud genoprettet fra anæstesi.
BEMÆRK: Den detaljerede protokol er beskrevet nedenfor. Modtagerspolen er vist over huden i figur 4F. - Postkirurgisk behandling
- Anbring rotten i et genopretningsbur uden strøelse, foret med køkkenrulle, hvor halvdelen af buret placeres på en passende temperaturreguleret varmekilde (godkendt varmepude).
- Overvåg rotten omhyggeligt, indtil den er ambulant. Når rotten er ambulant og vurderet til at være stabil, skal du returnere den til hjemmeburet og se efter social reintegration.
- Efter akut bedring skal rotterne overvåges for infektion på snitstedet og for symptomer på neurogen smerte, herunder, men ikke begrænset til, bevogtning, vridning, ridser og selvlemlæstelse. Overvåg rotterne dagligt i den 5-dages postkirurgiske restitutionsperiode og mindst en gang hver tredje dag derefter, hvis rotterne ikke ofres på dag 5.
- Meloxicam (1-2 mg/kg) administreres subkutant én gang dagligt i to til tre dage efter operationen, afhængigt af dyrets udviste smerte/ubehag. Hvis der er mistanke om vedvarende smerter, skal du fortsætte med meloxicam ud over denne periode postoperativt, og hvis det viser sig ildfast, skal du aflive rotten tidligt i samråd med veterinærteamet.
- Fjern hudsuturerne eller sårklemmerne 10-12 dage efter operationen.
4. Kirurgisk procedure af rotte venstre phrenic nerve implantation af trådløse stimulatorer (figur 5A)
BEMÆRK: Oprethold sterile forhold, som i punkt 3. Brug voksne Sprague-Dawley rotter, der vejer 200-250 g. Steriliser alle kirurgiske værktøjer før brug.
- Inducer anæstesi ved hjælp af isoflurangasbedøvelse (3% induktion, 1-3% vedligeholdelse) i ilt (2 l / min) med subkutan administration af meloxicam (1-2 mg / kg). Dæk rottens øjne med udpeget oftalmisk salve for at forhindre udtørring.
- Placer rotterne i liggende stilling på desinficerede kirurgiske borde til efterfølgende procedurer. I den resterende kirurgiske varighed skal du vurdere vejrtrækningshastighed, vævsfarve og dybde af anæstesi ikke mindre end hvert 15. minut og opretholde isofluranniveauerne i overensstemmelse hermed. Bekræft den passende dybde af anæstesi ved at kontrollere pedalrefleks (manglende reaktion på en fast tåklemme). Overvåg slimhinderne, som skal forblive lyserøde og fugtige.
- Barber det kirurgiske område på det ventrale aspekt af nakken. Skrub det barberede kirurgiske område med en betadinpude efterfulgt af en 70% medicinsk ethanolpind, og gentag denne skrubbeproces tre gange for huddesinfektion.
- Administrer bupivacain (2 mg/kg, fortyndet i saltvand, der ikke overstiger totalvolumen 0,5 ml) subkutant ved midterlinjen på halsen, målrettet mod det mest overfladiske lag. Lav et 3 cm midterlinjesnit gennem huden og overfladisk cervikal fascia for at udsætte sternohyoid- og sternocleidomastoidmusklerne (figur 5B).
BEMÆRK: Der foreslås et dissekeringsomfang. - Løft sternocleidomastoid ved hjælp af blid stump dissektion med en sonde og træk den sideværts tilbage ved hjælp af en karsløjfe (figur 5C). Frigør forsigtigt og træk omohyoidet tilbage. Derefter forsigtigt fri og medialt trække vagusnerven og halsbundtet under omohyoid muskel.
BEMÆRK: Den største forskel her er mellem vagusnerven og phrenic nerven. Skær omohyoidet, hvis det er nødvendigt at udsætte de underliggende strukturer. - Isoler phrenic nerve (figur 5D).
BEMÆRK: Den phrenic nerve løber langs overfladen af den forreste scalene muskel, der løber som en særlig lille langsgående nervekrydsning vinkelret på brachial plexus. I modsætning til iskiasnerven er anatomien omkring phrenic nerven i nakken mere kompleks. Udfør elektrofysiologisk bekræftelse (trin 4.7) før implantation for at opnå de bedste resultater. - Placer optageelektroden subkutant, lige kausalt til brystkassen, ipsilateral til den isolerede phrenic nerve (figur 5E). Placer stimulatorerne på phrenic nerven og bekræft via synkron signalering (figur 6).
BEMÆRK: Det er typisk at fremkalde et maksimalt respons med en stimulusintensitet på ~ 3-6 mA og stimulusvarighed på 0,02 ms. - Kontroller fuldstændig transsektion af phrenic nerven ved at vise fuldstændig afskaffelse af det fremkaldte respons, når en elektrisk stimulus påføres den proksimale nerveende i forhold til transsektionsstedet (figur 6).
- Implanter en trådløs, batterifri enhed på phrenic nerven (figur 5F) ved at placere modtagerspolen på den implanterbare enhed på sternohyoid, dybt i forhold til de bilaterale sternocleidomastoid muskler, med manchetten omkring phrenic nerven og kontaktelektroderne placeret vinkelret på nerven.
- Luk den overfladiske cervikale fascia med enkle løbende absorberbare suturer (figur 5G). Luk huden med afbrudte inverterede absorberbare suturer i den dybe dermis. Returner dyrene til deres hjemmebure først, når de er fuldt ud genoprettet fra anæstesi.
- For postkirurgisk behandling skal du følge trin 3.10.
5. Trådløs levering af terapeutisk elektrisk stimulering
- Påfør elektrisk stimulering i 1 time til rotterne under generel anæstesi. Til trådløs stimulering placeres en bølgeform/funktionsgenerator (spænding: 1-15 Vpp) og valgfri forstærker over dyret for at levere elektrisk strøm til en ekstern induktiv spole (dvs. transmissionsspole) (todimensionel spiralspole med 5 omdrejninger; diameter: 2 cm) for at sikre god induktiv kobling med den implanterede modtagerspole. Lever monofasiske 200 μs impulser ved 20 Hz i 1 times varighed.
- For at verificere og kvantificere elektrisk stimuleringslevering skal du registrere CMAP'er fra den tibiale forreste muskel og justere stimuleringsspændingen for at levere supramaksimal aktivering af iskiasnerven. Brug koncentriske nåleelektroder til alle optagelser.
BEMÆRK: Hvis funktionsgenereret maksimal spænding er utilstrækkelig til at fremkalde en maksimal respons, skal du bruge en forstærker.
6. Aktiv dødshjælp
- Primær metode
- Anbring buret under et CO2 -leveringskammer, indstillet til en hastighed på 8-12 LPM (eller passende strømningshastighed baseret på kammerstørrelsen). Overvåg rotterne for bevidstløshed og derefter i mindst 1 minut efter ophør af vejrtrækning.
- Sekundær metode
- Udfør cervikal dislokation eller bilateral thoracotomi.
Representative Results
I iskiasnerveskademodellen placeres implantatet omkring højre iskiasnerve inden ende-til-ende reparation af tibialnervegrenen (figur 3, figur 4A og figur 7A). En 30 G koncentrisk nåleelektrode placeres i højre tibialis forreste muskel for at definere de stimulusparametre, der er nødvendige for elektrisk stimulering med maksimal intensitet. Disse eksperimenter omfatter forhøjelse af stimuleringsintensiteten, indtil responsstørrelsen plateauer maksimalt. Da tibialis anterior er innerveret af den fibulære gren af iskiasnerven, skånes den i tibial nervetranssektionsskade. Således muliggør optagelse fra tibialis anterior kontinuerlig overvågning af den elektriske stimuleringsbehandling.
For en enkeltstimuluspuls leveret af en trådelektrode til højre iskiasnerve (5 mA, 0,02 ms) fremkaldes et maksimalt CMAP-respons med en 5,4 mV negativ topamplitude registreret på ipsilateral tibialis anterior (figur 7B; sort spor). For en sammenlignelig stimuluspuls leveret af det trådløse, batterifrie implantat fremkaldes et sammenligneligt CMAP-respons med en 4,6 mV negativ topamplitude (figur 7B; orange spor). Dette er i overensstemmelse med en nylig rapport, at trådløs nervestimulering opnår i gennemsnit 88% af CMAP fra trådbaseret nervestimulering21, langt over den tærskel, der kræves for terapeutiske virkninger i kliniske undersøgelser 6,7,8,9. I det viste eksempel skyldtes den længere latenstid for den trådløse stimulator vs. kablet stimulator dens større afstand fra den registrerede muskel.
I phrenic nerve model er implantatet placeret omkring højre phrenic nerve før transsektion (figur 5). For at definere de stimulusparametre, der er nødvendige for elektrisk stimulering med maksimal intensitet, placeres en 30 G koncentrisk nåleelektrode subkutant til højre (ipsilateral) forreste costalmargen for at optage fra højre halvmembran. Eksperimenterne involverer at hæve stimuleringsspændingen, indtil responsstørrelsen plateauer maksimalt. Da phrenic nerven kan være udfordrende at isolere fra omgivende neurovaskulære strukturer, kan dens identitet bekræftes ved at fremkalde et rykrespons (figur 6; orange spor). Stimuleringens specificitet kan yderligere verificeres ved transsektion af phrenic nerve distal til nerveelektrodemanchetten med efterfølgende afskaffelse af trækresponsen (figur 6; sort spor).
Gentagne, lavfrekvente elektriske stimuleringsterapi kan leveres til iskiasnerven i 1 time ved hjælp af en etableret protokol, der forbedrer axonregenerering (6,7,8,9,10,11; Figur 8). Manchetgrænsefladen på det trådløse implantat blev placeret på højre iskiasnerve, og den 30 G koncentriske nåleelektrode blev placeret på højre tibialis forreste muskel for at overvåge behandlingen. Figur 8A viser fire sekventielle spidser i den registrerede elektromyografi i begyndelsen (0 min) af den elektriske stimulering på 1 time og 20 Hz. Figur 8B viser fire andre pigge registreret ved 40 minutter af den elektriske stimulering på 1 time med et lille fald i topamplitude, hvilket er i overensstemmelse med træthedsmønsteret noteret med trådbaseret elektrisk stimuleringsterapi15,21.
Graden af perifer nerveregenerering kan vurderes ved hjælp af retrograd sporstoffer, der påføres distalt på nervelæsionsstedet. Fordi perifere axoner spirer flere sikkerhedsspirer, tillader retrograd sporing og tællinger af motorneuronsoma i rygmarven en mere nøjagtig vurdering af antallet af regenererende neuroner end at tælle regenererende axoner i selve nerven31. For at demonstrere dette blev iskiasnervestammen transekteret af en knusningsskade. Efter 3 ugers genopretning blev to forskellige fluorescerende retrograd farvestoffer administreret på to grene af iskiasnerven: henholdsvis fibulær nerve (grøn) og tibial nerve (rød) (figur 9A). Figur 9B-D viser oplyste undergrupper af lavere motoneuroner i lændehvirvelsøjlen forreste horn, der danner enten tibialnerven (figur 9B) eller fibulær nerve (figur 9C). Overlejringsbilledet viser to forskellige kolonner af mærkede neuroner i rygmarvens forreste horn, som kan kvantificeres med hensyn til rumlig fordeling og antallet af motorneuroner, der har regenereret en axondistal til læsionsstedet (figur 9D).
Figur 1: Model for nerveregenerering. (A) Gap krydsning sker tidligt efter nervereparation, når axoner vokser fra proksimal til distal nerveende efter reparation. (B) Varigheden af distal genvækst er relateret til afstanden til målendeorganet (f.eks. hud, muskler) og hastigheden af axongenvækst. De fleste terapier til forbedring af nervereparation målrette en eller begge af disse processer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Illustration af en trådløs elektronisk stimulatorfabrikation. Venstre, detaljerede lag af enhedens struktur, herunder en cirkulær radiofrekvensstrømhøsterspole, en strækbar forlængerelektrode og en nervemanchet, der vikles rundt om en nerve af interesse. Til højre, en forenklet illustration, der viser tre dele af enheden. Forkortelser: PLGA = poly (mælkesyre-co-glycolsyre); b-DCPU = bioresorberbar dynamisk kovalent polyurethan. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Implantation af trådløs, batterifri nervegrænseflade i rottens iskiasnervemodel. (A) Illustrationen viser et fuldt implanterbart system i højre iskiasnerve hos en rotte. (B) Toppanelet viser en elektrodegrænseflade placeret på iskiasnerven lige proksimal til ende-til-ende reparation af højre tibialnerve. Bundpanelet viser en elektrodegrænseflade med en udvidet nervemanchet, der bygger bro mellem den proksimale ende og den distale nervestub. Forkortelse: PLGA = poly(mælkesyre-co-glycolsyre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Procedure for implantation af iskiasnerven. (A) Indsnit på huden, subkutant bindevæv og glutealmusklen for at udsætte hamstring. (B) Isoleret iskiasnerve (sort pil). (C) Enhed efter implantation med nervemanchet, ledninger (hvid stjerne) og implantat synlig (stjerne). (D) Lukning af bindevævet ved sutur. E) Lukning af snittet med sårklemmer. (F) Trådløs elektrisk stimulering genereret af en spole over huden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Phrenic nerve implantation procedure. (A) Ventral visning af halsen i liggende stilling. (B) Indsnit på huden og subkutant bindevæv for at eksponere sternohyoid muskel. (C) Dissekering gennem det potentielle rum mellem omohyoidmusklen og sternocleidomastoidmusklen. (D) Phrenic nerve (pil), isoleret fra brachial plexus. E) Membranelektromyografisk bekræftelse af phrenic nerve. Sort pil, optageelektrode. Rød pil, stimulatorer. f) Beplantning. (G) Lukning af huden med dybe hudsting. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Bekræftelse af fuldstændig phrenic nerve transsektionsskade ved fremkaldte sammensatte muskelaktionspotentialer fra membranen. Før phrenic nerve transection (ORANGE) fremkaldte elektrisk stimulering af phrenic nerven sammensatte muskelaktionspotentialer på den ipsilaterale membran, som blev afskaffet ved phrenic nerve transection (BLACK). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Repræsentative nerveledningsundersøgelser, der sammenligner trådløs med trådbaseret elektrisk stimulering. (A) Illustration af trådløse (SORTE) og kablede (ORANGE) enheder placeret på iskiasnerven. Optageelektroden blev anbragt i tibialis anterior. (B) Sammensatte muskelaktionspotentialer fremkaldt af kablet implantat (ORANGE) vs. trådløst implantat (SORT). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: EMG-optagelse fra TA-muskel med 20 Hz gentagen elektrisk stimulering i 1 time fra implantater. (A) Spor af EMG ved min. 1 af e-stim. (B) Spor af EMG ved min. 40 af e-stim. Forkortelser: EMG = elektromyografi; TA = tibialis anterior; e-stim = elektrisk stimulering; min = minut. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Repræsentative billeder af iskiasnerveregenerering. (A) Illustration af iskiasnerveskade og fluorescerende retrograd mærkning. De iskiasnerveaxoner blev transekteret af knusningsskade. Efter 3 ugers genopretning blev dens distale grene - fibulær nerve (i grøn) og tibial nerve (i rød) - retrograd mærket. (B-D) Billeder af en lændehvirvelsøjle, der viser neuronal soma i det ipsilesionale forreste horn. Skalastænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Dette papir beskriver trinene i kirurgisk implantation og drift af en trådløs, batterifri og fuldt implanterbar perifer nervegrænseflade i rottens iskias- og phrenic nervemodel. Vi demonstrerer, hvordan denne nye klasse af biomedicinske implantater kan bruges til at levere et terapeutisk elektrisk stimuleringsparadigme, der har vist sig at forbedre axonregenerering i prækliniske og kliniske undersøgelser (til gennemgang, se22). Denne protokol er ukompliceret og kan ekstrapoleres til mindre dyremodeller, såsom mus21, samt andre trådløse, batterifrie og fuldt implanterbare enheder med funktionalitet, der inkluderer optoelektroniske og mikrofluidiske perifere nervegrænseflader 18,23,24,25,26,27,28,29,30. Også demonstreret er tilgangen ved hjælp af gnaveriskiasnerven, som er den mest almindelige eksperimentelle model31.
Alsidigheden af denne tilgang er blevet vist, når den er tilpasset grænsefladen med phrenic nerven, som sjældent anvendes som en model for perifer nerveskade32, måske fordi det er et meget underkendt klinisk problem 33,34,35. Phrenic nerveskade diagnose og rehabilitering er blevet et vigtigt spørgsmål under COVID-19-pandemien 36,37,38. Det er i øjeblikket ukendt, om regenerering af phrenic axoner og genopretning fra membranlammelse kan forstærkes af dette korte, lavfrekvente elektriske stimuleringsparadigme. Imidlertid er phrenic nerve elektrisk stimulering til membranmuskelpacing en etableret mulighed for respirationssvigt hos patienter med tetraplegi fra høj cervikal rygmarvsskade 39,40,41,42,43. Andre indikationer undersøges, herunder fravænning af respiratorer efter kritisk sygdom44.
Flere kritiske trin skal understreges for at sikre god drift af det implanterede system. For det første er det vigtigt at undgå at anvende for meget kraft på de tynde elektroniske komponenter i enhederne, når du håndterer dem for at forhindre blyisolering, knæk eller brud. Dernæst er det vigtigt nøjagtigt at markere placeringen af radiofrekvensstrømhøsterspolen på den overliggende hud. For det tredje muliggør omhyggelig justering af transmissionsspolen på den eksterne radiofrekvensstrømforsyning over den implanterede enheds strømhøsterspole med en svanehalsklemme stabil drift. Endelig anbefales periodisk neurofysiologisk overvågning for at bekræfte elektrisk stimulering ud over visuel observation af muskeltrækninger. I tilfælde af den mere komplekse anatomi af phrenic nerven i nakken hjælper elektrofysiologisk bekræftelse med at demonstrere, at den korrekte nerve er blevet isoleret (figur 6).
Udover de trådløse, batterifrie elektriske stimulatorer, der er vist i dette papir 18,19,21, deler mange andre enheder potentielt de samme procedurer. For eksempel, fordi elektroder designet til at implantere til glossopharyngeal og vagusnerver for kronisk at registrere signaler fra sympatiske og parasympatiske nervesystemer 30,45,46 deler et lignende kirurgisk område med phrenic nerven, kan denne protokol tilpasses til deres implantation. Trådløse langsigtede biokompatible stimulatorer til perifere nerver, såsom ReStore, er gode værktøjer til at forblive på plads og stimulere nerver efter behov 25,47,48,49,50. Der er også rapporteret om relevante multikanals trådløse optagelsesimplantater51. Samlet set mener vi, at disse kirurgiske og elektriske stimuleringsprotokoller kan tilpasses som standard for alle trådløse perifere nervegrænseflader relateret til elektrisk stimulering eller optagelse.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde brugte NUFAB-faciliteten fra Northwestern University's NUANCE Center, som har modtaget støtte fra SHyNE Resource (NSF ECCS-1542205), IIN og Northwesterns MRSEC-program (NSF DMR-1720139). Dette arbejde gjorde brug af MatCI-faciliteten støttet af MRSEC-programmet fra National Science Foundation (DMR-1720139) ved Materials Research Center of Northwestern University. C.K.F anerkender støtte fra Eunice Kennedy Shriver Institute of Child Health and Human Development of the NIH (bevilling nr. R03HD101090) og American Neuromuscular Foundation (Development Grant). Y.H. anerkender støtte fra NSF (bevillingsnr. CMMI1635443). Dette arbejde blev støttet af Querrey Simpson Institute for Bioelectronics ved Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | Electronics & Innovation | 201L | |
| Arbitrary Waveform Generator | RIGOL | DG1032Z | 30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts |
| Bupivacaine | Pfizer | 655317 | Marcaine, 0.5% |
| Copper/polyimide/copper | Pyralux | AP8535R | 18 µm thick top and bottom copper, 75 µm thick polyimide |
| EMG recording device | Natus | Nicolet VikingQuest | |
| EPOXY MARINE | Loctite | ||
| Isoflurane, USP | Butler Schein Animal Health | 1040603 | ISOTHESIA |
| Meloxicam | covetrus | 5mg/ml | |
| Needle electrodes | Technomed USA Inc. | TE/B50600- 001 | |
| PDMS (Silicone Elastomer Kit) | DOW | SYLGARD™ 184 | |
| ProtoLaser U4 | LPKF | U4 | |
| Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant | Puralube | 83592 | |
| Waveform generator | Agilent Technologies | Agilent 33250A |
References
- Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: an international survey of current treatments and future perspectives. Journal of Reconstructive Microsurgery. 25 (6), 339-344 (2009).
- Ayyaswamy, B., et al. Quality of life after amputation in patients with advanced complex regional pain syndrome: a systematic review. EFORT Open Reviews. 4 (9), 533-540 (2019).
- Kim, D. H., et al. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Mackinnon, S. E. Donor distal, recipient proximal and other personal perspectives on nerve transfers. Hand Clinics. 32 (2), 141-151 (2016).
- Safa, B., Buncke, G. Autograft substitutes: conduits and processed nerve allografts. Hand Clinics. 32 (2), 127-140 (2016).
- Barber, B., et al. Intraoperative Brief Electrical Stimulation of the Spinal Accessory Nerve (BEST SPIN) for prevention of shoulder dysfunction after oncologic neck dissection: a double-blinded, randomized controlled trial. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 47 (1), 7 (2018).
- Power, H. A., et al. Postsurgical electrical stimulation enhances recovery following surgery for severe cubital tunnel syndrome: a double-blind randomized controlled trial. Neurosurgery. 86 (6), 769-777 (2020).
- Gordon, T., et al. Brief post-surgical electrical stimulation accelerates axon regeneration and muscle reinnervation without affecting the functional measures in carpal tunnel syndrome patients. Experimental Neurology. 223 (1), 192-202 (2010).
- Wong, J. N., et al. Electrical stimulation enhances sensory recovery: a randomized controlled trial. Annals of Neurology. 77 (6), 996-1006 (2015).
- Nix, W. A., Hopf, H. C. Electrical stimulation of regenerating nerve and its effect on motor recovery. Brain Research. 272 (1), 21-25 (1983).
- Al-Majed, A. A., et al. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 20 (7), 2602-2608 (2000).
- Witzel, C., et al. Electrical nerve stimulation enhances perilesional branching after nerve grafting but fails to increase regeneration speed in a murine model. Journal of Reconstructive Microsurgery. 32 (6), 491-497 (2016).
- Witzel, C., Rohde, C., Brushart, T. M. Pathway sampling by regenerating peripheral axons. Journal of Comparative Neurology. 485 (3), 183-190 (2005).
- Brushart, T. M., et al. Electrical stimulation promotes motoneuron regeneration without increasing its speed or conditioning the neuron. Journal of Neuroscience. 22 (15), 6631-6638 (2002).
- Franz, C. K., Rutishauser, U., Rafuse, V. F. Intrinsic neuronal properties control selective targeting of regenerating motoneurons. Brain. 131, Pt 6 1492-1505 (2008).
- Park, S. I., et al. stretchable, fully implantable miniaturized optoelectronic systems for wireless optogenetics. Nature Biotechnology. 33 (12), 1280-1286 (2015).
- Koo, J., et al. Wirelessly controlled, bioresorbable drug delivery device with active valves that exploit electrochemically triggered crevice corrosion. Science Advances. 6 (35), (2020).
- Koo, J., et al. Wireless bioresorbable electronic system enables sustained nonpharmacological neuroregenerative therapy. Nature Medicine. 24 (12), 1830-1836 (2018).
- Choi, Y. S., et al. Stretchable, dynamic covalent polymers for soft, long-lived bioresorbable electronic stimulators designed to facilitate neuromuscular regeneration. Nature Communications. 11 (1), 5990 (2020).
- Hingne, P. M., Sluka, K. A. Differences in waveform characteristics have no effect on the antihyperalgesia produced by transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) in rats with joint inflammation. Journal of Pain. 8, 251-255 (2007).
- Guo, H., et al. Advanced materials in wireless, implantable electrical stimulators that offer rapid rates of bioresorption for peripheral axon regeneration. Advanced Functional Materials. 31 (29), 2102724 (2021).
- Zuo, K. J., et al. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Experimental Neurology. 332, 113397 (2020).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, fully implantable optofluidic cuff system for wireless optogenetic and pharmacological neuromodulation of peripheral nerves. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Montgomery, K. L., et al. Wirelessly powered, fully internal optogenetics for brain, spinal and peripheral circuits in mice. Nature Methods. 12 (10), 969-974 (2015).
- Seo, D., et al. Wireless recording in the peripheral nervous system with ultrasonic neural dust. Neuron. 91 (3), 529-539 (2016).
- Neely, R. M., et al. Recent advances in neural dust: towards a neural interface platform. Current Opinion in Neurobiology. 50, 64-71 (2018).
- Mickle, A. D., et al. A wireless closed-loop system for optogenetic peripheral neuromodulation. Nature. 565 (7739), 361-365 (2019).
- Khalifa, A., et al. The microbead: a 0.009 mm(3) implantable wireless neural stimulator. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 13 (3), 971-985 (2019).
- Jeong, J. W., et al. Wireless optofluidic systems for programmable in vivo pharmacology and optogenetics. Cell. 162 (3), 662-674 (2015).
- Yao, G., et al. Effective weight control via an implanted self-powered vagus nerve stimulation device. Nature Communications. 9 (1), 5349 (2018).
- Repair Brushart, M. Nerve Repair. , Oxford University Press. (2012).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographically selective reinnervation of adult mammalian skeletal muscles. Journal of Neuroscience. 8 (8), 3094-3099 (1988).
- Boon, A. J., et al. Sensitivity and specificity of diagnostic ultrasound in the diagnosis of phrenic neuropathy. Neurology. 83 (14), 1264-1270 (2014).
- Farr, E., D'Andrea, D., Franz, C. K. Phrenic nerve involvement in neuralgic amyotrophy (Parsonage-Turner syndrome). Sleep Medicine Clinics. 15 (4), 539-543 (2020).
- Mandoorah, S., Mead, T.
- Patel, Z., et al. Diaphragm and phrenic nerve ultrasound in COVID-19 patients and beyond: imaging technique, findings, and clinical applications. Journal of Ultrasound in Medicine. , (2021).
- Farr, E., et al. Short of breath for the long haul: diaphragm muscle dysfunction in survivors of severe COVID-19 as determined by neuromuscular ultrasound. medRxiv. , (2020).
- Fernandez, C. E., et al. Imaging review of peripheral nerve injuries in patients with COVID-19. Radiology. 298 (3), 117-130 (2021).
- Elefteriades, J. A., et al. Long-term follow-up of bilateral pacing of the diaphragm in quadriplegia. New England Journal of Medicine. 326 (21), 1433-1444 (1992).
- Elefteriades, J. A., et al. Long-term follow-up of pacing of the conditioned diaphragm in quadriplegia. Pacing and Clinical Electrophysiology: PACE 2002. 25 (6), 897-906 (2002).
- Glenn, W. W., et al. Ventilatory support by pacing of the conditioned diaphragm in quadriplegia. New England Journal of Medicine. 310 (18), 1150-1155 (1984).
- Garrido-Garcia, H., et al. Treatment of chronic ventilatory failure using a diaphragmatic pacemaker. Spinal Cord. 36 (5), 310-314 (1998).
- Romero, F. J., et al. Long-term evaluation of phrenic nerve pacing for respiratory failure due to high cervical spinal cord injury. Spinal Cord. 50 (12), 895-898 (2012).
- Vashisht, R., Chowdhury, Y. S.
- McCallum, G. A., et al. Chronic interfacing with the autonomic nervous system using carbon nanotube (CNT) yarn electrodes. Scientific Reports. 7 (1), 11723 (2017).
- Zhang, Y., et al. Climbing-inspired twining electrodes using shape memory for peripheral nerve stimulation and recording. Science Advances. 5 (4), 1066 (2019).
- Sivaji, V., et al. ReStore: A wireless peripheral nerve stimulation system. Journal of Neuroscience Methods. 320, 26-36 (2019).
- Tanabe, Y., et al. High-performance wireless powering for peripheral nerve neuromodulation systems. PLoS One. 12 (10), 0186698 (2017).
- MacEwan, M. R., et al. Therapeutic electrical stimulation of injured peripheral nerve tissue using implantable thin-film wireless nerve stimulators. Journal of Neurosurgery. 130 (2), 486-495 (2019).
- Lee, B., et al. An implantable peripheral nerve recording and stimulation system for experiments on freely moving animal subjects. Scientific Reports. 8 (1), 6115 (2018).
- Deshmukh, A., et al. Fully implantable neural recording and stimulation interfaces: Peripheral nerve interface applications. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108562 (2020).
