Summary
Dit is een protocol voor de chirurgische implantatie en werking van een draadloos aangedreven interface voor perifere zenuwen. We demonstreren het nut van deze aanpak met voorbeelden van zenuwstimulatoren die op de heupzenuw of de middenrifzenuw van de rat worden geplaatst.
Abstract
Perifere zenuwinterfaces worden vaak gebruikt in de experimentele neurowetenschappen en regeneratieve geneeskunde voor een breed scala aan toepassingen. Dergelijke interfaces kunnen sensoren, actuatoren of beide zijn. Traditionele methoden voor perifere zenuwinterfacing moeten ofwel worden vastgemaakt aan een extern systeem of vertrouwen op batterijvoeding die het tijdsbestek voor gebruik beperkt. Met recente ontwikkelingen van draadloze, batterijloze en volledig implanteerbare perifere zenuwinterfaces, kan een nieuwe klasse apparaten mogelijkheden bieden die overeenkomen met of groter zijn dan die van hun bedrade of batterijgevoede voorlopers. Dit artikel beschrijft methoden om (i) dit systeem bij volwassen ratten (i) chirurgisch te implanteren en (ii) draadloos van stroom te voorzien en te besturen. De ischias- en middenrifzenuwmodellen werden als voorbeeld geselecteerd om de veelzijdigheid van deze aanpak te benadrukken. Het artikel laat zien hoe de perifere zenuwinterface samengestelde spieractiepotentialen (CMAP's) kan oproepen, een therapeutisch elektrisch stimulatieprotocol kan leveren en een kanaal kan bevatten voor het herstel van perifere zenuwbeschadiging. Dergelijke apparaten bieden uitgebreide behandelingsopties voor therapeutische stimulatie met een enkele dosis of herhaalde dosis en kunnen worden aangepast aan verschillende zenuwlocaties.
Introduction
Traumatische perifere zenuwletsels (PNI's) komen voor in de VS met een jaarlijkse incidentie van ongeveer 200.000 per jaar1. De meeste patiënten die aan PNI's lijden, houden blijvende functionele beperkingen over. In het ergste geval kan dit leiden tot spierverlamming en behandelingsrefractaire neuropathische pijn veroorzaken die zo ernstig is dat patiënten bereid zijn een amputatie van ledematen als behandeling te ondergaan2. Het grootste obstakel om de PNI-resultaten te verbeteren, is dat de regeneratie van axonen te traag is in verhouding tot de afstanden die ze opnieuw moeten aangroeien. Een volwassen menselijk axon groeit bijvoorbeeld met 1 mm/dag, maar moet mogelijk regenereren over afstanden >1000 mm in het geval van een laesie in een proximale ledemaat.
In de huidige klinische praktijk vereist ~50% van de PNI's chirurgisch herstel3. Voor succesvolle zenuwregeneratie moeten axonen (i) over de plaats van de laesie groeien (d.w.z. spleet kruisen) en vervolgens (ii) regenereren langs de zenuwbaan om een eindpunt te bereiken (d.w.z. distale hergroei) (Figuur 1). Er zijn geen door de FDA goedgekeurde medicijnen waarvan bewezen is dat ze de zenuwregeneratie versnellen. De status-quo van de klinische behandeling van PNI is de afgelopen decennia slechts stapsgewijs veranderd en is beperkt tot technische verfijningen van chirurgische methoden zoals distale motorische zenuwoverdrachten om de afstand te verkleinen die regenererende axonen moeten afleggen4, of "kant-en-klare" synthetische zenuwleidingen voor gevallen waarin de proximale zenuw zich terugtrekt en niet direct weer aan elkaar kan worden gehecht5. Er zijn echter vier gerandomiseerde klinische onderzoeken geweest naar therapeutische elektrische stimulatie die postoperatief op zenuwen werd toegepast, dit waren single-center onderzoeken onder leiding van Dr. K. Ming Chan aan de Universiteit van Alberta die een significant verbeterde reïnnervatie van spier 6,7,8 of huid9 laten zien. Het fundamentele werk voor dit elektrische stimulatieprotocol werd uitgevoerd bij knaagdieren10,11, waar is aangetoond dat elektrische stimulatie specifiek werkt door het oversteken van de spleet te verbeteren (Figuur 1), maar niet door distale hergroei 12,13,14,15.
De chirurgische plaatsing van transcutane draadelektroden die in alle vier de gerandomiseerde klinische onderzoeken met elektrische stimulatie werden gebruikt, was noodzakelijk omdat de effecten ervan afhangen van de afgifte van voldoende stroom om het neuroncellichaam te depolariseren bij 20 Hz continu gedurende 1 uur11. In de klinische praktijk is dit elektrische stimulatieprotocol voor de meeste patiënten niet te tolereren bij de intensiteiten die nodig zijn via oppervlaktestimulerende elektroden op de huid vanwege pijn. Er zijn niet-triviale risico's verbonden aan het postoperatief gebruiken van transcutane elektroden, zoals diepe wondinfectie of onbedoelde verplaatsing van draden van de zenuwen tijdens het vervoer van patiënten vanuit de operatiekamer (OK). Bovendien zijn de hoge kosten van OK-tijd zelf een ontmoediging om het in die setting te proberen in plaats van tijdens acuut postoperatief herstel. Er is een nieuwe klasse van draadloze, batterijloze en volledig implanteerbare perifere zenuwinterfaces in opkomst om deze tekortkoming van bestaande perifere zenuwinterfaces aan te pakken.
Deze nieuwe klasse van draadloze implanteerbare elektronische systemen is klaar om het gemak en de flexibiliteit voor het doseren van elektrische stimulatie te vergroten en de barrières te slechten die een bredere klinische implementatie in de weg staan. Dit artikel beschrijft methoden om (i) dit systeem chirurgisch te implanteren en (ii) draadloos van stroom te voorzien en te besturen in volwassen ischias- en middenrifzenuwmodellen bij ratten. Het laat zien hoe de perifere zenuwinterface CMAP's kan oproepen, een therapeutisch elektrisch stimulatieprotocol kan leveren en zelfs kan fungeren als een kanaal voor het herstel van perifere zenuwen. De protocollen hier kunnen worden aangepast voor andere varianten van deze technologie die lichtpulsen kunnen afgeven voor optogenetisch gemedieerde neuromodulatie16, gecontroleerde medicijnafgifte17 of herhaalde aanvallen van elektrische stimulatie in de loop van de tijd18,19.
Protocol
Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, worden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Northwestern University. Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van het Center for Comparative Medicine en IACUC van de Northwestern University. Het is noodzakelijk om IACUC te raadplegen bij het aanpassen van de protocollen.
1. Fabricage van draadloze elektronische stimulatoren (Figuur 2)
- Gebruik koper/polyimide/koper (18 μm dik koper aan de boven- en onderkant, polyimide met een dikte van 75 μm) als substraat voor de radiofrequentie-power harvester-spoel (d.w.z. antenne voor draadloze ontvangers).
- Gebruik directe laserablatie om gaten voor de elektroden op de bovenste en onderste koperlagen te vormen en het apparaat vorm te geven. Verbind de bovenste en onderste lagen elektrisch met zilverpasta door de gaten.
- Bevestig de elektronische componenten met commerciële verpakkingen, zoals diode en condensator, via solderen.
- Gebruik het bioresorbeerbare dynamische covalente polyurethaan (b-DCPU; 200 μm dik) ingekapseld molybdeen (Mo; 15 μm dik; serpentijnstructuur) als rekbare verlengelektroden19.
- Vorm de manchetelektrode voor de interface tussen het apparaat en de zenuw met behulp van poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) film (300 μm dik).
- Na het aansluiten van de antenne van de draadloze ontvanger en de rekbare verlengelektrode, kapselt u de antenne van de draadloze ontvanger en de verbinding in met gecommercialiseerde waterdichte epoxy of polydimethysiloxaan (PDMS). Zie afbeelding 2 (rechts) voor het volledig gemonteerde apparaat.
- Bevestig de draadloze werking van het apparaat met behulp van een golfvormgenerator om monofasische elektrische impulsen te genereren via de primaire spoel (dwz transmissiespoel).
OPMERKING: Bij het onderzoeken van de rekrutering van perifere axonen en de inductie van axonale regeneratie door monofasische en bifasische stimuli, rapporteerden eerdere studies een verwaarloosbaar effect als gevolg van de verschillen in golfvormkarakteristiek20, en deze groep is in staat geweest om therapeutische elektrische stimulatieverbetering te bereiken met dezelfde monofasische stroomparameters bij muizen21 en ratten18. Bovendien werd in eerdere studies de biocompatibiliteit in vivo en in vitro onderzocht en werden geen aanwijzingen gevonden voor weefselbeschadiging door verhittingseffecten of de materialen zelf. Vanwege deze bevindingen en de beperkte duur van therapeutische elektrische stimulatie in de huidige studie, werden monofasische in plaats van bifasische stimuli gebruikt in dit protocol. - Meet de resulterende gelijkstroomuitgangsspanning met een oscilloscoop die is aangesloten op de manchetelektrode.
2. Voorbereiding van het apparaat voor implantatie
- Plaats de implantaten in een steriele petrischaal en sluit deze af met parafilm.
- Bestraal de apparaten met UV-licht gedurende 30 minuten per kant.
3. Chirurgische ingreep van de rechter heupzenuwimplantatie bij ratten van draadloze, batterijloze perifere zenuwinterface voor elektrische stimulatie (Figuur 3)
NOTITIE: Handhaaf steriele omstandigheden. Voer operaties uit binnen het aangewezen operatiegebied van een behandelkamer voor dieren. De chirurg zal tijdens de operatie een gezichtsmasker, jas, pet en steriele handschoenen aantrekken. Als er meer dan één operatie wordt uitgevoerd, verwissel dan steriele handschoenen tussen de dieren en gebruik voor elke operatie schone, steriele chirurgische instrumenten. Steriliseer gereedschappen tussen operaties door door middel van warmtesterilisatie (autoclaaf of glasparelsterilisator). Gebruik volwassen Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 200-250 g.
- Induceer anesthesie met behulp van isofluraangasanesthesie (3% inductie, 1-3% onderhoud) in zuurstof (2 l/min), met subcutane toediening van meloxicam (1-2 mg/kg). Bedek de ogen van de ratten met de daarvoor bestemde oogzalf om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de ratten in buikligging op gedesinfecteerde operatietafels voor volgende procedures. Beoordeel voor de resterende duur van de operatie de ademhalingsfrequentie (moet ~2/s zijn), weefselkleur en diepte van de anesthesie niet minder dan elke 15 minuten, en handhaaf de isofluraanspiegels dienovereenkomstig. Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door de pedaalreflex te controleren (gebrek aan reactie op een stevige teenknijp). Houd de slijmvliezen in de gaten, die roze en vochtig moeten blijven.
- Scheer het operatiegebied, inclusief het rechterbeen en de onderste helft van de rug. Scrub het geschoren operatiegebied met een betadinepad, gevolgd door een 70% medisch ethanolwattenstaafje, en herhaal dit scrubproces drie keer voor huiddesinfectie.
- Maak een incisie van 1,5 – 2 cm in de huid evenwijdig aan het rechter dijbeen met behulp van een weefselschaar, gevolgd door een stompe scheiding van onderhuids bindweefsel op de rug (direct mediaal van de incisie) om een onderhuidse zak vrij te maken voor de ontvangerspoel (Figuur 4A). Maak vervolgens een incisie (1,2-1,5 cm) op de rechter bilspier evenwijdig aan de incisie in de huid.
- Isoleer de heupzenuw voorzichtig met metalen dissectiesondes met stompe uiteinden (Figuur 4B).
OPMERKING: De heupzenuw bevindt zich diep bij de biceps femoris en loopt evenwijdig aan het dijbeen. Er wordt een ontleedbereik voorgesteld. - Implanteer het draadloze, batterijloze apparaat op de heupzenuw (Figuur 4C) door de manchet om de geïsoleerde rechter heupzenuw te wikkelen, zonder de zenuw onder spanning te zetten of zijn pad te vervormen 18,19,20. Markeer op de huid waar de ontvangerspoel is geplaatst voor verdere elektrische stimulatie.
- Hecht de incisie in de bilspier met resorbeerbare hechtingen (Figuur 4D).
NOTITIE: De bovenste helft van de ontvangerspoel bevindt zich boven de bilspier en de manchetinterface eronder. - Sluit de huidincisie met wondclips (of begraven hechtdraad; Figuur 4E). Pas de randen van de huid aan.
- Lever 1 uur continue postoperatieve 20 Hz elektrische stimulatie met een pulsbreedte van 200 μs onder narcose (Figuur 4F). Breng dieren terug naar hun thuiskooien nadat ze volledig zijn hersteld van de anesthesie.
OPMERKING: Het gedetailleerde protocol wordt hieronder beschreven. De ontvangstspoel wordt boven de huid weergegeven in figuur 4F. - Postoperatieve behandeling
- Plaats de rat in een herstelkooi zonder bodembedekking, bekleed met keukenpapier, met de helft van de kooi op een geschikte temperatuurgereguleerde warmtebron (goedgekeurd verwarmingskussen).
- Houd de rat goed in de gaten totdat hij ambulant is. Eenmaal ambulant en stabiel bevonden, breng je de rat terug naar de thuiskooi en kijk je uit naar sociale re-integratie.
- Controleer de ratten na acuut herstel op infectie op de incisieplaats en op symptomen van neurogene pijn, inclusief maar niet beperkt tot bewaken, kronkelen, krabben en zelfverminking. Controleer de ratten dagelijks gedurende de postoperatieve herstelperiode van 5 dagen, en daarna ten minste eens in de drie dagen als de ratten op dag 5 niet worden geofferd.
- Dien meloxicam (1-2 mg/kg) eenmaal daags subcutaan toe gedurende twee tot drie dagen na de operatie, afhankelijk van de mate van pijn/ongemak van het dier. Als aanhoudende pijn wordt vermoed, ga dan postoperatief door met meloxicam na deze periode en als het refractair blijkt te zijn, euthanaseer de rat dan vroegtijdig in overleg met het veterinaire team.
- Verwijder de huidhechtingen of wondklemmen 10-12 dagen na de operatie.
4. Chirurgische ingreep van implantatie van de linker middenrifzenuw van ratten in draadloze stimulatoren (Figuur 5A)
OPMERKING: Zorg voor steriele omstandigheden, zoals in rubriek 3. Gebruik volwassen Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 200-250 g. Steriliseer alle chirurgische instrumenten voor gebruik.
- Induceer anesthesie met behulp van isofluraangasanesthesie (3% inductie, 1-3% onderhoud) in zuurstof (2 l/min), met subcutane toediening van meloxicam (1-2 mg/kg). Bedek de ogen van de rat met de daarvoor bestemde oogzalf om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de ratten in rugligging op gedesinfecteerde operatietafels voor volgende procedures. Beoordeel gedurende de resterende duur van de operatie de ademhalingsfrequentie, weefselkleur en diepte van de anesthesie niet minder dan elke 15 minuten en handhaaf de isofluraanspiegels dienovereenkomstig. Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door de pedaalreflex te controleren (gebrek aan reactie op een stevige teenknijp). Houd de slijmvliezen in de gaten, die roze en vochtig moeten blijven.
- Scheer het operatiegebied op het ventrale aspect van de nek. Scrub het geschoren operatiegebied met een betadinepad, gevolgd door een 70% medisch ethanolwattenstaafje, en herhaal dit scrubproces drie keer voor huiddesinfectie.
- Dien bupivacaïne (2 mg/kg, verdund in zoutoplossing met een totaal volume van maximaal 0,5 ml) subcutaan toe op de middellijn van de nek, gericht op de meest oppervlakkige laag. Maak een incisie van 3 cm in de middellijn door de huid en de oppervlakkige cervicale fascia om de sternohyoïde en sternocleidomastoïde spieren bloot te leggen (Figuur 5B).
OPMERKING: Er wordt een ontleedbereik voorgesteld. - Til de sternocleidomastoïde op met behulp van zachte stompe dissectie met een sonde en trek deze zijdelings terug met behulp van een vaatlus (Figuur 5C). Maak de omohyoid voorzichtig los en trek hem terug. Maak vervolgens de nervus vagus en de halsslagaderbundel onder de omohyoïde spier voorzichtig los en trek deze mediaal terug.
OPMERKING: Het belangrijkste onderscheid hier is tussen de nervus vagus en de nervus phrenicus. Snijd de omohyoid door als het nodig is om de onderliggende structuren bloot te leggen. - Isoleer de middenrifzenuw (Figuur 5D).
OPMERKING: De middenrifzenuw loopt langs het oppervlak van de voorste scalene-spier en loopt als een opmerkelijk kleine longitudinale zenuw die loodrecht op de plexus brachialis kruist. In tegenstelling tot de heupzenuw is de anatomie rond de middenrifzenuw in de nek complexer. Voer een elektrofysiologische bevestiging uit (stap 4.7) vóór de implantatie voor het beste resultaat. - Plaats de opname-elektrode subcutaan, net caudaal ten opzichte van de ribbenkast, ipsilateraal ten opzichte van de geïsoleerde middenrifzenuw (Figuur 5E). Plaats de stimulatoren op de middenrifzenuw en bevestig via synchrone signalering (Figuur 6).
OPMERKING: Het oproepen van een maximale respons met een stimulusintensiteit van ~3-6 mA en een stimulusduur van 0,02 ms is typisch. - Controleer de volledige doorsnede van de middenrifzenuw door aan te tonen dat de opgewekte respons volledig is opgeheven wanneer een elektrische stimulus wordt uitgeoefend op het proximale zenuwuiteinde ten opzichte van de doorsnijdingsplaats (figuur 6).
- Implanteer een draadloos, batterijloos apparaat op de middenrifzenuw (Figuur 5F) door de ontvangstspoel van het implanteerbare apparaat op het sternohyoïde te plaatsen, diep ten opzichte van de bilaterale sternocleidomastoïde spieren, met de manchet rond de middenrifzenuw en de contactelektroden loodrecht op de zenuw geplaatst.
- Sluit de oppervlakkige cervicale fascia met eenvoudige resorbeerbare hechtingen (Figuur 5G). Sluit de huid met onderbroken omgekeerde resorbeerbare hechtingen in de diepe dermis. Breng de dieren pas terug naar hun thuiskooien nadat ze volledig zijn hersteld van de anesthesie.
- Volg stap 3.10 voor een postoperatieve behandeling.
5. Draadloze toediening van therapeutische elektrische stimulatie
- Pas gedurende 1 uur elektrische stimulatie toe op de ratten onder algemene anesthesie. Plaats voor de draadloze stimulatie een golfvorm-/functiegenerator (spanning: 1-15 Vpp) en optionele versterker boven het dier om elektrische stroom te leveren aan een externe inductieve spoel (d.w.z. transmissiespoel) (tweedimensionale spiraalspoel met 5 windingen; diameter: 2 cm) om een goede inductieve koppeling met de geïmplanteerde ontvangerspoel te garanderen. Lever monofasische pulsen van 200 μs bij 20 Hz gedurende 1 uur.
- Om de afgifte van elektrische stimulatie te verifiëren en te kwantificeren, registreert u CMAP's van de voorste tibiale spier en past u de stimulatiespanning aan om supramaximale activering van de heupzenuw te leveren. Gebruik concentrische naaldelektroden voor alle opnames.
NOTITIE: Als de door de functie gegenereerde maximale spanning onvoldoende is om een maximale respons op te roepen, gebruik dan een versterker.
6. Euthanasie
- Primaire methode
- Plaats de kooi onder een CO2 -toevoerkamer, ingesteld op een snelheid van 8-12 LPM (of een geschikt debiet op basis van de kamergrootte). Controleer de ratten op bewusteloosheid en vervolgens gedurende ten minste 1 minuut stoppen met ademen.
- Secundaire methode
- Voer cervicale dislocatie of bilaterale thoracotomie uit.
Representative Results
In het heupzenuwletselmodel wordt het implantaat rond de rechter heupzenuw geplaatst voorafgaand aan end-to-end herstel van de scheenbeenzenuwtak (Figuur 3, Figuur 4A en Figuur 7A). Een concentrische naaldelektrode van 30 G wordt in de rechter voorste musculus tibialis geplaatst om de stimulusparameters te definiëren die nodig zijn voor elektrische stimulatie met maximale intensiteit. Deze experimenten omvatten het verhogen van de stimulatie-intensiteit totdat de responsomvang maximaal is afgevlakt. Omdat de tibialis anterior wordt geïnnerveerd door de fibulaire tak van de heupzenuw, wordt deze gespaard bij de tibiale zenuwtranssectie. Registratie van tibialis anterior maakt dus continue monitoring van de elektrostimulatiebehandeling mogelijk.
Voor een enkelvoudige stimuluspuls die door een draadelektrode aan de rechter heupzenuw wordt afgegeven (5 mA, 0,02 ms), wordt een maximale CMAP-respons opgewekt met een negatieve piekamplitude van 5,4 mV geregistreerd op ipsilaterale tibialis anterior (Figuur 7B; zwart spoor). Voor een vergelijkbare stimuluspuls die wordt afgegeven door het draadloze, batterijloze implantaat, wordt een vergelijkbare CMAP-respons opgewekt met een negatieve piekamplitude van 4,6 mV (Figuur 7B; oranje spoor). Dit komt overeen met een recent rapport dat draadloze zenuwstimulatie gemiddeld 88% van de CMAP haalt uit draadgebaseerde zenuwstimulatie21, ruim boven de drempel die vereist is voor therapeutische effecten in klinische onderzoeken 6,7,8,9. In het getoonde voorbeeld was de langere latentie van de draadloze stimulator versus de bedrade stimulator te wijten aan de grotere afstand tot de geregistreerde spier.
In het middenrifzenuwmodel wordt het implantaat vóór de doorsnede rond de rechter middenmiddenmotief geplaatst (Figuur 5). Om de stimulusparameters te definiëren die nodig zijn voor elektrische stimulatie met maximale intensiteit, wordt een concentrische naaldelektrode van 30 G subcutaan op de rechter (ipsilaterale) voorste ribbenrand geplaatst om vanaf het rechter hemmidiafragma op te nemen. De experimenten omvatten het verhogen van de stimulatiespanning totdat de responsgrootte maximaal is. Omdat het een uitdaging kan zijn om de middenrifzenuw te isoleren van de omliggende neurovasculaire structuren, kan de identiteit ervan worden bevestigd door een spiertrekkingsreactie op te roepen (Figuur 6; oranje spoor). De specificiteit van de stimulatie kan verder worden geverifieerd door doorsnede van de middenrifzenuw distaal van de zenuwelektrodemanchet met daaropvolgende opheffing van de spiertrekkingsrespons (figuur 6; zwart spoor).
Repetitieve, laagfrequente elektrische stimulatietherapie kan gedurende 1 uur aan de heupzenuw worden toegediend met behulp van een vastgesteld protocol dat de axonregeneratie verbetert (6,7,8,9,10,11; Figuur 8). De manchetinterface van het draadloze implantaat werd op de rechter heupzenuw geplaatst en de concentrische naaldelektrode van 30 G werd op de rechter voorste spier tibialis geplaatst om de behandeling te controleren. Figuur 8A toont vier opeenvolgende pieken in de opgenomen elektromyografie aan het begin (0 min) van de 1 uur 20 Hz elektrische stimulatie. Figuur 8B toont vier andere pieken geregistreerd tijdens de 40 minuten van de 1 uur durende elektrische stimulatie met een lichte afname van de piekamplitude, wat consistent is met het vermoeidheidspatroon dat wordt waargenomen bij draadgebaseerde elektrostimulatietherapie15,21.
De mate van regeneratie van de perifere zenuw kan worden beoordeeld met behulp van retrograde tracers die distaal op de plaats van de zenuwlaesie worden aangebracht. Omdat perifere axonen meerdere collaterale spruiten ontkiemen, maken retrograde tracering en tellingen van het motorneuron soma in het ruggenmerg een nauwkeurigere beoordeling van het aantal regenererende neuronen mogelijk dan het tellen van regenererende axonen in de zenuw zelf. Om dit aan te tonen, werd de heupzenuwstam doorsneden door een verbrijzelingsletsel. Na 3 weken herstel werden twee verschillende fluorescerende retrograde kleurstoffen toegediend op twee takken van de heupzenuw: respectievelijk de fibulaire zenuw (groen) en de tibiale zenuw (rood) (figuur 9A). Figuur 9B-D toont verlichte subgroepen van lagere motorneuronen in de voorhoorn van het lumbale ruggenmerg die ofwel de scheenbeenzenuw (Figuur 9B) of de fibulaire zenuw (Figuur 9C) vormen. De overlay-afbeelding toont twee verschillende kolommen van gelabelde neuronen in de voorhoorn van het ruggenmerg, die kunnen worden gekwantificeerd in termen van ruimtelijke verdeling en het aantal motorneuronen dat een axon distaal van de laesieplaats heeft geregenereerd (Figuur 9D).
Figuur 1: Zenuwregeneratiemodel. (A) Gap crossing vindt vroeg na zenuwherstel plaats wanneer axonen na reparatie van proximaal naar distaal zenuwuiteinde groeien. (B) De duur van distale hergroei is gerelateerd aan de afstand tot het doeleindorgaan (bijv. huid, spieren) en de snelheid van axonhergroei. De meeste therapieën voor het verbeteren van zenuwherstel richten zich op een of beide van deze processen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van een fabricage van een draadloze elektronische stimulator. Links, gedetailleerde lagen van de structuur van het apparaat, waaronder een cirkelvormige spoel voor het oogsten van radiofrequenties, een rekbare verlengelektrode en een zenuwmanchet die zich om een interessante zenuw wikkelt. Rechts, een vereenvoudigde illustratie met drie delen van het apparaat. Afkortingen: PLGA = poly(melkzuur-co-glycolzuur); b-DCPU = bioresorbeerbaar dynamisch covalent polyurethaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Implantatie van draadloze, batterijloze zenuwinterface in het heupzenuwmodel van de rat. (A) De afbeelding toont een volledig implanteerbaar systeem in de rechter heupzenuw van een rat. (B) Het bovenste paneel toont een elektrode-interface die op de heupzenuw is geplaatst, net proximaal van de end-to-end reparatie van de rechter scheenbeenzenuw. Het onderste paneel toont een elektrode-interface met een verlengde zenuwmanchet die de spleetopening overbrugt tussen het proximale uiteinde en de distale zenuwstomp. Afkorting: PLGA = poly(melkzuur-co-glycolzuur). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Procedure voor implantatie van de heupzenuw. (A) Incisie op de huid, het onderhuidse bindweefsel en de bilspier om de hamstring bloot te leggen. (B) Geïsoleerde heupzenuw (zwarte pijl). (C) Apparaat na implantatie met zenuwmanchet, draden (witte sterretjes) en implantaat zichtbaar (ster). (D) Sluiting van het bindweefsel door middel van hechtdraad. (E) Sluiting van de incisie door middel van wondklemmen. (F) Draadloze elektrische stimulatie gegenereerd door een spoel boven de huid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Procedure voor implantatie van de nervus phrenicus. (A) Ventraal aanzicht van de nek in rugligging. (B) Incisie op de huid en het onderhuidse bindweefsel om de sternohyoid-spier bloot te leggen. (C) Ontleden door de potentiële ruimte tussen de omohyoid-spier en de sternocleidomastoïde spier. (D) Nervus phrenicus (pijl), geïsoleerd uit de plexus brachialis. (E) Diafragmatische elektromyografische bevestiging van de middenrifzenuw. Zwarte pijl, opname-elektrode. Rode pijl, stimulatoren. (F) Implantatie. (G) Sluiting van de huid met diepe dermale hechtingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Bevestiging van volledige transsectie van de middenrifzenuw door opgewekte samengestelde spieractiepotentialen uit het middenrif. Vóór de transsectie van de phrenicuszenuw (ORANGE) wekte elektrische stimulatie van de phrenicuszenuw samengestelde spieractiepotentialen op het ipsilaterale diafragma op, die werden opgeheven door transsectie van de middenrifzenuw (BLACK). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve zenuwgeleidingsstudies waarin draadloze en bedrade elektrische stimulatie worden vergeleken. (A) Illustratie van draadloze (ZWARTE) en bedrade (ORANJE) apparaten die op de heupzenuw zijn geplaatst. De opname-elektrode werd in de tibialis anterior geplaatst. (B) Samengestelde spieractiepotentialen die worden opgeroepen door een bedraad implantaat (ORANJE) versus een draadloos implantaat (ZWART). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: EMG-opname van TA-spier met 20 Hz repetitieve elektrische stimulatie gedurende 1 uur vanaf implantaten. (A) Spoor van EMG op min 1 van e-stim. (B) Spoor van EMG bij minimaal 40 van e-stim. Afkortingen: EMG = elektromyografie; TA = tibialis anterior; e-stim = elektrische stimulatie; min = minuut. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Representatieve beelden van de regeneratie van de heupzenuw. (A) Illustratie van heupzenuwbeschadiging en fluorescerende retrograde etikettering. De axonen van de heupzenuw werden doorsneden door verbrijzeling. Na 3 weken herstel werden de distale takken - de fibulaire zenuw (in groen) en de scheenbeenzenuw (in rood) - retrograde gelabeld. (B-D) Afbeeldingen van een lumbaal ruggenmerg met neuronale soma in de ipsilesionale voorste hoorn. Schaalbalken = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit artikel beschrijft de stappen in de chirurgische implantatie en werking van een draadloze, batterijloze en volledig implanteerbare perifere zenuwinterfaces in het ischias- en middenrifzenuwmodel van ratten. We demonstreren hoe deze nieuwe klasse van biomedische implantaten kan worden gebruikt om een therapeutisch paradigma voor elektrische stimulatie te leveren waarvan is aangetoond dat het de regeneratie van axonen verbetert in preklinische en klinische studies (voor een overzicht, zie22). Dit protocol is ongecompliceerd en kan worden geëxtrapoleerd naar kleinere diermodellen, zoals muizen21, evenals andere draadloze, batterijloze en volledig implanteerbare apparaten met functionaliteit die opto-elektronische en microfluïdische perifere zenuwinterfaces omvat 18,23,24,25,26,27,28,29,30. Ook gedemonstreerd is de aanpak met behulp van de heupzenuw van knaagdieren, het meest voorkomende experimentele model31.
De veelzijdigheid van deze benadering is aangetoond wanneer deze wordt aangepast om te communiceren met de middenrifzenuw, die zelden wordt gebruikt als een model van perifere zenuwbeschadiging32, misschien omdat het een enorm ondergewaardeerd klinisch probleem is 33,34,35. De diagnose en revalidatie van de middenrifzenuw zijn een belangrijk onderwerp geworden tijdens de COVID-19-pandemie 36,37,38. Het is momenteel niet bekend of de regeneratie van phrenicusaxonen en het herstel van middenrifverlamming kunnen worden versterkt door dit korte, laagfrequente elektrische stimulatieparadigma. Elektrische stimulatie van de middenrifzenuw voor diafragmaspierstimulatie is echter een gevestigde optie voor respiratoire insufficiëntie bij patiënten met tetraplegie door een hoge cervicale dwarslaesie 39,40,41,42,43. Andere indicaties worden onderzocht, waaronder het spenen van beademingsapparatuur na kritieke ziekte44.
Verschillende kritieke stappen moeten worden benadrukt om een goede werking van het geïmplanteerde systeem te garanderen. Ten eerste is het belangrijk om niet te veel kracht uit te oefenen op de dunne elektronische componenten van de apparaten bij het hanteren ervan om de-isolatie van lood, knikken of breuk te voorkomen. Vervolgens is het belangrijk om de locatie van de spoel van de radiofrequentie-power harvester nauwkeurig op de bovenliggende huid te markeren. Ten derde zorgt een zorgvuldige uitlijning van de transmissiespoel van de externe radiofrequentievoeding over de power harvester-spoel van het geïmplanteerde apparaat met een zwanenhalsklem voor een stabiele werking. Ten slotte wordt, om elektrische stimulatie te bevestigen naast visuele observatie van spiertrekkingen, periodieke neurofysiologische monitoring aanbevolen. In het geval van de complexere anatomie van de middenrifzenuw in de nek helpt elektrofysiologische bevestiging aan te tonen dat de juiste zenuw is geïsoleerd (figuur 6).
Naast de draadloze, batterijloze elektrische stimulatoren die in dit artikel 18,19,21 worden getoond, hebben veel andere apparaten mogelijk dezelfde procedures. Omdat elektroden die zijn ontworpen om te implanteren in de glossopharyngeale en vaguszenuwen om chronisch signalen van sympathische en parasympathische zenuwstelsels op te nemen 30,45,46 bijvoorbeeld een vergelijkbaar operatiegebied delen met de middenrifzenuw, kan dit protocol worden aangepast voor hun implantatie. Draadloze biocompatibele stimulatoren voor de lange termijn voor perifere zenuwen, zoals ReStore, zijn geweldige hulpmiddelen om op hun plaats te blijven en zenuwen te stimuleren als dat nodig is 25,47,48,49,50. Er zijn ook relevante meerkanaals draadloze opname-implantaten gemeld51. Over het algemeen zijn we van mening dat deze chirurgische en elektrische stimulatieprotocollen als standaard kunnen worden aangepast voor alle draadloze perifere zenuwinterfacing met betrekking tot elektrische stimulatie of opname.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk maakte gebruik van de NUFAB-faciliteit van het NUANCE Center van de Northwestern University, dat steun heeft gekregen van de SHyNE Resource (NSF ECCS-1542205), het IIN en het MRSEC-programma van Northwestern (NSF DMR-1720139). Dit werk maakte gebruik van de MatCI-faciliteit die werd ondersteund door het MRSEC-programma van de National Science Foundation (DMR-1720139) van het Materials Research Center van de Northwestern University. C.K.F erkent de steun van het Eunice Kennedy Shriver Institute of Child Health and Human Development van de NIH (subsidie nr. R03HD101090) en de American Neuromuscular Foundation (Development Grant). Y.H. erkent steun van NSF (subsidienr. CMMI1635443). Dit werk werd ondersteund door het Querrey Simpson Institute for Bioelectronics aan de Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | Electronics & Innovation | 201L | |
| Arbitrary Waveform Generator | RIGOL | DG1032Z | 30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts |
| Bupivacaine | Pfizer | 655317 | Marcaine, 0.5% |
| Copper/polyimide/copper | Pyralux | AP8535R | 18 µm thick top and bottom copper, 75 µm thick polyimide |
| EMG recording device | Natus | Nicolet VikingQuest | |
| EPOXY MARINE | Loctite | ||
| Isoflurane, USP | Butler Schein Animal Health | 1040603 | ISOTHESIA |
| Meloxicam | covetrus | 5mg/ml | |
| Needle electrodes | Technomed USA Inc. | TE/B50600- 001 | |
| PDMS (Silicone Elastomer Kit) | DOW | SYLGARD™ 184 | |
| ProtoLaser U4 | LPKF | U4 | |
| Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant | Puralube | 83592 | |
| Waveform generator | Agilent Technologies | Agilent 33250A |
References
- Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: an international survey of current treatments and future perspectives. Journal of Reconstructive Microsurgery. 25 (6), 339-344 (2009).
- Ayyaswamy, B., et al. Quality of life after amputation in patients with advanced complex regional pain syndrome: a systematic review. EFORT Open Reviews. 4 (9), 533-540 (2019).
- Kim, D. H., et al. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Mackinnon, S. E. Donor distal, recipient proximal and other personal perspectives on nerve transfers. Hand Clinics. 32 (2), 141-151 (2016).
- Safa, B., Buncke, G. Autograft substitutes: conduits and processed nerve allografts. Hand Clinics. 32 (2), 127-140 (2016).
- Barber, B., et al. Intraoperative Brief Electrical Stimulation of the Spinal Accessory Nerve (BEST SPIN) for prevention of shoulder dysfunction after oncologic neck dissection: a double-blinded, randomized controlled trial. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 47 (1), 7 (2018).
- Power, H. A., et al. Postsurgical electrical stimulation enhances recovery following surgery for severe cubital tunnel syndrome: a double-blind randomized controlled trial. Neurosurgery. 86 (6), 769-777 (2020).
- Gordon, T., et al. Brief post-surgical electrical stimulation accelerates axon regeneration and muscle reinnervation without affecting the functional measures in carpal tunnel syndrome patients. Experimental Neurology. 223 (1), 192-202 (2010).
- Wong, J. N., et al. Electrical stimulation enhances sensory recovery: a randomized controlled trial. Annals of Neurology. 77 (6), 996-1006 (2015).
- Nix, W. A., Hopf, H. C. Electrical stimulation of regenerating nerve and its effect on motor recovery. Brain Research. 272 (1), 21-25 (1983).
- Al-Majed, A. A., et al. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 20 (7), 2602-2608 (2000).
- Witzel, C., et al. Electrical nerve stimulation enhances perilesional branching after nerve grafting but fails to increase regeneration speed in a murine model. Journal of Reconstructive Microsurgery. 32 (6), 491-497 (2016).
- Witzel, C., Rohde, C., Brushart, T. M. Pathway sampling by regenerating peripheral axons. Journal of Comparative Neurology. 485 (3), 183-190 (2005).
- Brushart, T. M., et al. Electrical stimulation promotes motoneuron regeneration without increasing its speed or conditioning the neuron. Journal of Neuroscience. 22 (15), 6631-6638 (2002).
- Franz, C. K., Rutishauser, U., Rafuse, V. F. Intrinsic neuronal properties control selective targeting of regenerating motoneurons. Brain. 131, Pt 6 1492-1505 (2008).
- Park, S. I., et al. stretchable, fully implantable miniaturized optoelectronic systems for wireless optogenetics. Nature Biotechnology. 33 (12), 1280-1286 (2015).
- Koo, J., et al. Wirelessly controlled, bioresorbable drug delivery device with active valves that exploit electrochemically triggered crevice corrosion. Science Advances. 6 (35), (2020).
- Koo, J., et al. Wireless bioresorbable electronic system enables sustained nonpharmacological neuroregenerative therapy. Nature Medicine. 24 (12), 1830-1836 (2018).
- Choi, Y. S., et al. Stretchable, dynamic covalent polymers for soft, long-lived bioresorbable electronic stimulators designed to facilitate neuromuscular regeneration. Nature Communications. 11 (1), 5990 (2020).
- Hingne, P. M., Sluka, K. A. Differences in waveform characteristics have no effect on the antihyperalgesia produced by transcutaneous electrical nerve stimulation (TENS) in rats with joint inflammation. Journal of Pain. 8, 251-255 (2007).
- Guo, H., et al. Advanced materials in wireless, implantable electrical stimulators that offer rapid rates of bioresorption for peripheral axon regeneration. Advanced Functional Materials. 31 (29), 2102724 (2021).
- Zuo, K. J., et al. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Experimental Neurology. 332, 113397 (2020).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, fully implantable optofluidic cuff system for wireless optogenetic and pharmacological neuromodulation of peripheral nerves. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Montgomery, K. L., et al. Wirelessly powered, fully internal optogenetics for brain, spinal and peripheral circuits in mice. Nature Methods. 12 (10), 969-974 (2015).
- Seo, D., et al. Wireless recording in the peripheral nervous system with ultrasonic neural dust. Neuron. 91 (3), 529-539 (2016).
- Neely, R. M., et al. Recent advances in neural dust: towards a neural interface platform. Current Opinion in Neurobiology. 50, 64-71 (2018).
- Mickle, A. D., et al. A wireless closed-loop system for optogenetic peripheral neuromodulation. Nature. 565 (7739), 361-365 (2019).
- Khalifa, A., et al. The microbead: a 0.009 mm(3) implantable wireless neural stimulator. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 13 (3), 971-985 (2019).
- Jeong, J. W., et al. Wireless optofluidic systems for programmable in vivo pharmacology and optogenetics. Cell. 162 (3), 662-674 (2015).
- Yao, G., et al. Effective weight control via an implanted self-powered vagus nerve stimulation device. Nature Communications. 9 (1), 5349 (2018).
- Repair Brushart, M. Nerve Repair. , Oxford University Press. (2012).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographically selective reinnervation of adult mammalian skeletal muscles. Journal of Neuroscience. 8 (8), 3094-3099 (1988).
- Boon, A. J., et al. Sensitivity and specificity of diagnostic ultrasound in the diagnosis of phrenic neuropathy. Neurology. 83 (14), 1264-1270 (2014).
- Farr, E., D'Andrea, D., Franz, C. K. Phrenic nerve involvement in neuralgic amyotrophy (Parsonage-Turner syndrome). Sleep Medicine Clinics. 15 (4), 539-543 (2020).
- Mandoorah, S., Mead, T.
- Patel, Z., et al. Diaphragm and phrenic nerve ultrasound in COVID-19 patients and beyond: imaging technique, findings, and clinical applications. Journal of Ultrasound in Medicine. , (2021).
- Farr, E., et al. Short of breath for the long haul: diaphragm muscle dysfunction in survivors of severe COVID-19 as determined by neuromuscular ultrasound. medRxiv. , (2020).
- Fernandez, C. E., et al. Imaging review of peripheral nerve injuries in patients with COVID-19. Radiology. 298 (3), 117-130 (2021).
- Elefteriades, J. A., et al. Long-term follow-up of bilateral pacing of the diaphragm in quadriplegia. New England Journal of Medicine. 326 (21), 1433-1444 (1992).
- Elefteriades, J. A., et al. Long-term follow-up of pacing of the conditioned diaphragm in quadriplegia. Pacing and Clinical Electrophysiology: PACE 2002. 25 (6), 897-906 (2002).
- Glenn, W. W., et al. Ventilatory support by pacing of the conditioned diaphragm in quadriplegia. New England Journal of Medicine. 310 (18), 1150-1155 (1984).
- Garrido-Garcia, H., et al. Treatment of chronic ventilatory failure using a diaphragmatic pacemaker. Spinal Cord. 36 (5), 310-314 (1998).
- Romero, F. J., et al. Long-term evaluation of phrenic nerve pacing for respiratory failure due to high cervical spinal cord injury. Spinal Cord. 50 (12), 895-898 (2012).
- Vashisht, R., Chowdhury, Y. S.
- McCallum, G. A., et al. Chronic interfacing with the autonomic nervous system using carbon nanotube (CNT) yarn electrodes. Scientific Reports. 7 (1), 11723 (2017).
- Zhang, Y., et al. Climbing-inspired twining electrodes using shape memory for peripheral nerve stimulation and recording. Science Advances. 5 (4), 1066 (2019).
- Sivaji, V., et al. ReStore: A wireless peripheral nerve stimulation system. Journal of Neuroscience Methods. 320, 26-36 (2019).
- Tanabe, Y., et al. High-performance wireless powering for peripheral nerve neuromodulation systems. PLoS One. 12 (10), 0186698 (2017).
- MacEwan, M. R., et al. Therapeutic electrical stimulation of injured peripheral nerve tissue using implantable thin-film wireless nerve stimulators. Journal of Neurosurgery. 130 (2), 486-495 (2019).
- Lee, B., et al. An implantable peripheral nerve recording and stimulation system for experiments on freely moving animal subjects. Scientific Reports. 8 (1), 6115 (2018).
- Deshmukh, A., et al. Fully implantable neural recording and stimulation interfaces: Peripheral nerve interface applications. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108562 (2020).
