Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Denne protokollen beskriver dynamikken i virusinfeksjoner ved hjelp av luciferase- og fluorescens-uttrykkende rekombinante (r)SARS-CoV-2 og et in vivo-bildebehandlingssystem (IVIS) i K18 hACE2 transgene mus for å overvinne behovet for sekundære tilnærminger som kreves for å studere SARS-CoV-2 infeksjoner in vivo.

Abstract

Koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemien har vært forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Til dags dato har SARS-CoV-2 vært ansvarlig for over 242 millioner infeksjoner og mer enn 4,9 millioner dødsfall over hele verden. I likhet med andre virus krever studier av SARS-CoV-2 bruk av eksperimentelle metoder for å oppdage tilstedeværelsen av virus i infiserte celler og / eller i dyremodeller. For å overvinne denne begrensningen genererte vi rekombinante rekombinante (r)SARS-CoV-2 som uttrykker bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner. Disse reporter-uttrykkende rSARS-CoV-2 tillater sporing av virusinfeksjoner in vitro og in vivo basert på uttrykket av Nluc og Venus reporter gener. Her beskriver studien bruk av rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus for å oppdage og spore SARS-CoV-2-infeksjon i det tidligere beskrevne K18 humane angiotensinkonverterende enzymet 2 (hACE2) transgen musemodell av infeksjon ved hjelp av in vivo avbildningssystemer (IVIS). Denne rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus viser rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenisitet og viral replikasjon in vivo. Viktigst, Nluc og Venus uttrykk tillater oss å direkte spore virusinfeksjoner in vivo og ex vivo, i infiserte mus. Disse rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus representerer et utmerket alternativ for å studere biologien til SARS-CoV-2 in vivo, for å forstå virusinfeksjon og tilhørende COVID-19 sykdom, og for å identifisere effektive profylaktiske og/ eller terapeutiske behandlinger for å bekjempe SARS-CoV-2-infeksjon.

Introduction

Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er et innhyllet, positivt sans, enkeltstrenget RNA-virus som tilhører Betacoronavirus-slekten i Coronaviridae-familien 1. Denne virale familien er delt inn i Alpha-, Beta-, Gamma- og Delta-coronavirus1. Alfa- og betacoronavirus smitter hovedsakelig pattedyr, mens Gamma- og Deltacoronavirus infiserer nesten utelukkende fugler2. Til dags dato har syv koronavirus (CoV) krysset artsbarrierer og dukket opp som menneskelige koronavirus (HCoV): to alfa-COVs (HCoV-229E og HCoV-NL63) og fem beta-coVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Midtøsten respiratorisk syndrom coronavirus [MERS-CoV], og SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV og SARS-CoV-2 er svært patogene, noe som forårsaker alvorlig nedre luftveisinfeksjon7. Før fremveksten av SARS-CoV-2 var det to epidemiske utbrudd forårsaket av COVs: SARS-CoV i Guangdong Providence, Kina, fra 2002-2003, med en dødsrate (CFR) på ca. 9,7%; og MERS-CoV i Midtøsten fra 2012 til i dag, med en CFR på ca 34%7,8. SARS-CoV-2 har en samlet CFR mellom 3,4% -49%, med underliggende forhold som bidrar til en høyere CFR 8,9. Siden oppdagelsen i desember 2019, i Wuhan, Kina, har SARS-CoV-2 vært ansvarlig for over 242 millioner menneskelige infeksjoner og mer enn 4,9 millioner menneskelige dødsfall over hele verden 7,10,11,12. Spesielt siden slutten av 2020 har nye SARS-CoV-2-varianter av bekymring (VoC) og varianter av interesse (VoI) påvirket viruskarakteristikker, inkludert overføring og antigenisitet 9,13, og den generelle retningen av COVID-19-pandemien. For behandling av SARS-CoV-2-infeksjoner er det for tiden bare ett USA (USA) Food and Drug Administration (FDA) terapeutisk antiviral (remdesivir) og en Emergency Use Authorization (EUA) legemiddel (baricitinib, som skal administreres i kombinasjon med remdesivir)14. Det er også 6 godkjente EUA monoklonale antistoffer: REGEN-COV (casirivimab og imdevimab, administrert sammen), sotrovimab, tocilizumab og bamlanivimab og etesevimab administrert sammen 15,16,17,18,19. Det er for tiden bare en FDA-godkjent profylaktisk vaksine, Pfizer-BioNTech, og to andre profylaktiske vaksiner (Moderna og Janssen) har blitt EUA godkjent 20,21,22,23,24. Men med den ukontrollerte infeksjonsraten og fremveksten av VoC og VoI utgjør SARS-CoV-2 fortsatt en trussel mot menneskers helse. Derfor er det nødvendig med nye tilnærminger for å identifisere effektiv profylaktikk og terapeutisk behandling for å kontrollere SARS-CoV-2-infeksjon og den fortsatt pågående COVID-19-pandemien.

Å studere SARS-CoV-2 krever arbeidskrevende teknikker og sekundære tilnærminger for å identifisere tilstedeværelsen av viruset i infiserte celler og / eller validerte dyremodeller av infeksjon. Bruken av omvendt genetikk har gjort det mulig for generering av rekombinante virus å svare på viktige spørsmål i biologien til virusinfeksjoner. For eksempel har omvendte genetikkteknikker gitt midler til å avdekke og forstå mekanismene for virusinfeksjon, patogenese og sykdom. På samme måte har omvendt genetikk tilnærminger banet vei for å konstruere rekombinante virus som mangler virusproteiner for å forstå deres bidrag i viral patogenese. I tillegg har omvendte genetikkteknikker blitt brukt til å generere rekombinante virus som uttrykker reportergener for in vitro- og in vivo-applikasjoner, inkludert identifisering av profylaktiske og / eller terapeutiske tilnærminger for behandling av virusinfeksjoner. Fluorescerende og bioluminescerende proteiner er de mest brukte reportergenene på grunn av deres følsomhet, stabilitet og enkle deteksjon basert på forbedring av ny teknologi 25,26. In vitro, fluorescerende proteiner har vist seg å tjene som et bedre alternativ for lokalisering av virus i infiserte celler, mens luciferaser er mer praktiske for kvantifiseringsstudier 27,28,29. In vivo, luciferaser foretrekkes fremfor fluorescerende proteiner for hele dyreavbildning, mens fluorescerende proteiner foretrekkes for identifisering av infiserte celler eller ex vivo-avbildning 30,31,32. Bruken av reporter-uttrykkende rekombinante virus har fungert som et kraftig verktøy for studiet av virus i mange familier, inkludert blant annet flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus og influensavirus 28,33,34,35,36.

For å overvinne behovet for sekundære tilnærminger for å studere SARS-CoV-2 og karakterisere sars-cov-2-infeksjon i sanntid, vi har generert rekombinante rekombinante (r)SARS-CoV-2 som uttrykker bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner ved hjelp av våre tidligere beskrevne bakterielle kunstige kromosomer (BAC)-basert omvendt genetikk, som opprettholdes som en enkelt kopi i E. coli for å minimere toksisitet av virussekvenser under forplantning i bakterier37,38. Spesielt viste rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenisitet in vivo. Det høye nivået av Venus-uttrykk fra rSARS-CoV-2/Venus tillot å oppdage virusinfeksjon i lungene til infiserte K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av et in vivo-bildesystem (IVIS)39. Nivåene av Venus-uttrykk korrelerte godt med virale titere som ble oppdaget i lungene, og demonstrerte muligheten for å bruke Venus-uttrykk som en gyldig surrogat av SARS-CoV-2-infeksjon. Ved hjelp av rSARS-CoV-2/Nluc var vi i stand til å spore dynamikken i virusinfeksjon i sanntid og i lengderetningen vurdere SARS-CoV-2 infeksjon in vivo ved hjelp av samme IVIS-tilnærming i K18 hACE2 transgene mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokoller som involverer K18 hACE2 transgene mus ble godkjent av Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) og Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle eksperimenter følger anbefalingene i Veiledning for pleie og bruk av forsøksdyr i Det nasjonale forskningsrådet40. Riktig personlig verneutstyr (PVU) er nødvendig når du arbeider med mus.

1. Bruk av K18 hACE2 transgene mus

  1. Kjøp og vedlikehold 4-6 uker gamle kvinnelige B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J mus (K18 hACE2 transgene mus) i et biosikkerhetsnivå (BSL)-2 dyrepleieanlegg under spesifikke patogenfrie forhold.
    1. Etter ankomst til BSL2-anleggene, la dyrene akklimatisere seg i 7 dager og overføre dem til BSL-3 dyreavdelingen for infeksjoner og andre eksperimentelle prosedyrer.
    2. Etter IACUC-protokoller plasserer du 4 mus per bur. For å sikre at dyret er avdød, etter musinfeksjon med rSARS-CoV-2 og in vivo-avbildning , euthanize dyrene med en dødelig dose Fatal-Plus (>100 mg / kg).

2. Biosikkerhet

MERK: I dette manuskriptet genereres rSARS-CoV-2 ved hjelp av bac-baserte omvendte genetiske systemer for SARS-CoV-2 USA-WA1/2020-stammen, som tidligere beskrevet37. Alle in vivo prosedyrer som involverer rSARS-CoV-2/Nluc eller rSARS-CoV-2/Venus infeksjoner må utføres i et biologisk sikkerhetsskap under BSL-3 forhold.

  1. Rengjør biosikkerhetsskapet med 2% Wexicide og 70% Etanol desinfeksjonsmiddel sekvensielt før og etter å ha utført alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet i denne artikkelen.
  2. Steriliser alt disseksjonsmateriale (saks, dissekerings tang, etc.) og homogenisatoren før og etter hver bruk.
  3. Rengjør isolasjonskammeret og desinfiser med MB10 tabletter før og etter hver bruk i henhold til produsentens anvisninger.
  4. Kast alt biologisk materiale som produseres under prosedyrene i følge IBC- og IACUC-retningslinjene.

3. In vivo karakterisering av rSARS-CoV-2

  1. Museinfeksjoner
    1. Plasser kvinnelige 4-6 uker gamle K18 hACE2 transgene mus i merkede bur, identifiser musene i hvert bur ved hjelp av en ørestanskode og legg 4 mus per bur. Bruk en gruppe mus for kroppsvekt og overlevelse og en annen gruppe dyr for viral titrering og avbildning.
    2. Før infeksjon, barbere mus brystet på ventral side fra brystnippelen til det inguinale brystvorteområdet for å lette bioluminescenssignalet.
    3. Forbered rSARS-CoV-2-inokulumet med 105 plakkdannende enheter (PFU)/mus under sterile forhold i et totalt volum på 50 μL ved hjelp av steril 1x fosfatbuffer saltvann (PBS).
      MERK: Beregn mengden rSARS-CoV-2 som skal brukes i viral fortynning med formelen: virus nødvendig = (105 PFU per mus / 50 μL) x endelig volum) / lager viral titer.
    4. Hold viruset inoculum kjølt på is.
    5. Bruk mock-infiserte (1x PBS) og rSARS-CoV-2/WT-infiserte mus som interne kontroller. Plasser de mock-infiserte musene i et eget bur enn rSARS-CoV-2-infiserte mus.
    6. Bedøv musene ved hjelp av 5% isofluran gassformige sedasjon i et anestesikammer og vedlikehold med 3% isofluran.
    7. Når postural reaksjon og høyre refleks er bekreftet, plasser musen i dorsal recumbency posisjon.
    8. Scruff halsen på musen mellom pekefingeren og tommelen og hold halen mot håndflaten med den rosa fingeren for å holde dyret i en dorsal posisjon.
    9. Plasser pipettespissen som inneholder 50 μL av virusets inokulum i neseboret og utløs løsningen sakte. Forsikre deg om at viruset inoculum inhales og det er ingen refluks ved å observere inoculum dråpen forsvinner.
  2. Bioluminescensovervåking K18 hACE2 transgene mus infisert med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 1 og figur 2)
    MERK: Dette eksperimentet følger den skjematiske representasjonen og bruker virusene som vises i figur 1. Et isofluranbedøvelsestilbehør er nødvendig for in vivo-bildesystemet (IVIS). Se Materialliste for detaljer om instrumenter og systemer som kreves.
    1. Start bildebehandlingsprogramvaren og konfigurer parametrene, klikk på bildemodus til Bioluminescence, åpne filteret og sett eksponeringstiden til auto.
    2. Når du initialiserer IVIS-maskinen, plasser musene i isolasjonskammeret mens du fortsatt er inne i biosikkerhetsskapet. Induser mus med isofluran ved en konsentrasjon på 5%. Når tap av postural reaksjon og høyre refleks er bekreftet, opprettholde med 3% isofluran.
    3. Når musene er bedøvet, fjern dem fra isolasjonskammeret og administrer luciferase-substratet som er fortynnet 1:10 i 1x PBS (sluttvolum 100 μL/mus) med en 25 G nål.
    4. Etter administrering av luciferase substrat, plasser musene tilbake i isolasjonskammeret med brystene vendt opp og nesehulen inne i manifoldkjeglen for å holde dyret bedøvet under avbildningsprosedyren.
    5. Overfør isolasjonskammeret til IVIS-maskinen, og umiddelbart etter at du har lukket IVIS-imager-døren, velger du Hent i programmet som skal initialiseres (figur 2A).
    6. For å analysere bioluminescensbilder som er anskaffet, bruk verktøyet ROI (region av interesse) i programvaren for å angi det nøyaktige signalet og måle fluxen (figur 2B).
    7. Klikk på Mål og la systemet begynne å vurdere bioluminescensen i fotoner for å gi det absolutte fotonutslippet som kan sammenlignes med utgangsmålingene fra de forskjellige parametrene.
    8. Bildemus ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers etterinfeksjon.
    9. Etter avbildning plasser mus tilbake i buret.
  3. Fluorescensanalyse i K18 hACE2 transgene mus infisert med rSARS-CoV-2/Venus (figur 3 og figur 4)
    MERK: Dette eksperimentet følger skjematisk representasjon og rSARS-CoV-2 som er vist i figur 3. Se Materialliste for detaljer om instrumenter og systemer som kreves.
    1. Start bildebehandlingsprogramvaren og sett opp parametrene, sett eksitasjons- (500 nm) og utslippsfiltre (530 nm), klikk på bildemodus til Fluorescence og sett eksponeringstiden til auto.
    2. Intraperitoneally euthanize musene ved hjelp av en dødelig dose Fatal-Plus (>100 mg / kg). Etter eutanasi desinfiserer snittstedet med 70% etanol.
    3. Bruk pinsett, trekk huden, gjør et snitt fra brystbenet til magen og kutt snittet fra sidene med saks. Klipp levervenen for å minimere mengden blod i lungene og unngå høye bakgrunnssignaler under avbildning.
    4. Bruk saks, kutt brystbenet og åpne ribbeina. Klipp deretter enden av luftrøret med saks og fjern lungene med pinsett.
    5. Legg de utskilte lungene i en 6-brønns plate som inneholder 2 ml 1x PBS og skyll for å fjerne overflødig blod. Minimer muligheten for kontaminering mellom prøver ved å desinfisere og rengjøre kirurgiverktøy mellom prøver som bruker 70% etanol.
    6. Etter initialisering av IVIS-maskinen, plasser lungene i en svart skuff og skille vevet fra hverandre.
    7. Plasser brettet inne i isolasjonskammeret inne i biosikkerhetsskapet, og overfør deretter isolasjonskammeret til IVIS. Lukk døren og klikk på Hent for å starte bildesystemet (figur 4A).
    8. For å analysere fluorescens, bruk ROI-verktøyet og tegn ROIer rundt hver av de enkelte lungene. Mål hver avkastning manuelt, og bruk deretter de gjennomsnittlige radianteffektivitetsverdiene som er gitt, og trekk fra verdiene til de mock-infiserte musene (figur 4B).
    9. Når avbildningen er fullført, plasser vevet på isen for analyse samme dag eller i en kryotube for tørrisfrysing for å lagre ved -80 °C for senere behandling.
  4. Lungelysfeltavbildning og patologisk skåring av K18 hACE2-transgene mus infisert med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 2A-C) og rSARS-CoV-2/Venus (figur 4A-C)
    1. Etter å ha avbildning av bioluminescens av mus infisert med rSARS-CoV-2/Nluc, returnerer rSARS-CoV-2/WT, og mock-infisert, musene til burene sine. Fortsett med eutanasi og ex vivo bright field imaging av mus lunger (figur 2A).
    2. Etter å ha avbildning av eksvivos fluorescens av lunger av infiserte mus, ta lysfeltbilder av lungene (figur 4A).
    3. Analyser bruttolesjoner på overflaten av lungen ved hjelp av ImageJ (figur 2C og 4C).
    4. Åpne lungebildet som skal analyseres i ImageJ.
    5. Beregn forholdet mellom piksel og cm, bruk rett verktøy og mål den faktiske lengden på bildet.
    6. Etter å ha valgt, klikker du på Analyser > Mål for å beregne lengden på piksler for lengden.
    7. Klikk på Analyse > Angi skala og skriv inn tallene som er beregnet fra forrige trinn.
    8. Bruk verktøyet Frihåndsvalg og merk hele lungeoverflaten. Klikk på Analyser > Mål for å måle totalt lungeområde.
    9. Klikk på Rediger > Utvalg > Gjør omvendt for å velge resten av lungeområdet, og trykk deretter på slett eller tilbake for å fjerne bakgrunnen.
    10. Fjern det merkede området, og klikk deretter på Bilde > Juster > fargeterskel.
    11. For å velge patologisk lesjonsområde, juster Lysstyrken til et minimum (mellom 1 og 50) og maksimalt (mellom 50 og 200), avhengig av nivåene av overbelastning og blødninger tilstede.
    12. Når patologiske lesjoner er valgt, klikker du på Velg nederst i terskelfargepanelet, og deretter klikker du på Analyser > Mål for å måle patologiske områder.
    13. Beregn prosentandelen av brutto lesjoner med formelen: % av patologisk areal = (måling av patologisk areal/total lungeoverflate) x 100.
  5. Virale titrasjoner (figur 2D og figur 4D)
    1. Ved avbildning, fullfør musenes eutanasi og samle lunger, hjerne og neseslimhinne.
    2. Plasser lungene, hjernen og neseslimhinnen i separate sterile vevshomogenisatorer og tilsett 1 ml kald 1x PBS.
    3. Homogeniser prøvene ved å sentrifugere ved 21.500 x g i 10 min til pelletscelleavfall. Samle og overfør supernatantene til et nytt sterilt rør og kast pelletsen.
    4. Hvis virale titrasjoner utføres samme dag, oppbevar supernatantene ved 4 °C. Alternativt kan du fryse supernatanten til de homogeniserte prøvene ved -80 °C til de evalueres senere.
    5. Ved hjelp av supernatantene som oppnås fra vevshomogenatene, gjør 10 ganger serielle fortynninger og infiserer konfluente monolayers av Vero E6-celler med 1 ml av hver fortynning av supernatanten (6-brønns plateformat, 1,2 × 106 celler / brønn, triplikater).
    6. La viruset adsorbere i 1 time ved 37 °C i en fuktet 5 % CO 2-inkubator.
    7. Etter viral adsorpsjon, vask cellene med 1 ml 1x PBS og inkuber i 2 ml postinfeksjonsmedier som inneholder 1% Agar i den fuktede 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C i 72 timer.
    8. Etter inkubasjonen, deaktiver platene i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer ved 4 °C, sørg for at hele platen er nedsenket.
    9. Ta plater ut av BSL3 og vask cellene tre ganger med 1 ml 1 ml 1x PBS og permeabiliser med 1 ml 0,5% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur (RT).
    10. Blokker cellene med 1 ml 2,5 % bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS i 1 time ved 37 °C, etterfulgt av inkubasjon i 1 ml 1 μg/ml av SARS-CoV nukleocapsid (N) protein kryssreaktivt monoklonalt antistoff (1C7C7), fortynnet i 2,5% BSA i 1 time ved 37 °C.
    11. Vask cellene tre ganger med 1 ml 1x PBS og utvikle plakkene ved hjelp av ABC-settet og DAB Peroxidase Substrate-settet i henhold til produsentens instruksjoner.
    12. Beregn virale titere som PFU/ml.
      MERK: Beregn med formelen PFU/ml = fortynningsfaktor x antall plakk x (1 ml/inokulumvolum).
  6. Nluc-aktivitet i vev av K18 hACE2 transgene mus infisert med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 2E)
    1. Kvantifisere tilstedeværelsen av Nluc i orgelet homogenater fra mock, rSARS-CoV-2/WT, og rSARS-CoV-2/Nluc infiserte K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av en luciferase analyse etter produsentens instruksjoner.
  7. Evaluering av sykelighet og dødelighet (figur 2F, G og figur 4E, F)
    1. Intranasalt infisere 4-6 uker gamle kvinnelige K18 hACE2 transgene mus med 105 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, eller mock-infisert som beskrevet i avsnitt 3.1.
    2. Overvåk og vei musene over 12 dager samtidig for å minimere vektvariasjonen på grunn av matinntak. Euthanize musene som mister 25% av sin opprinnelige kroppsvekt siden de har nådd et humant endepunkt og bemerker disse musene som bukker under for virusinfeksjon.
    3. Etter 12 dager euthanize musene som overlever virusinfeksjon og beregne % av kroppsvekt endring og overlevelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

rSARS-CoV-2/Nluc-infeksjon hos K18 hACE2 transgene mus (figur 1 og 2)
Figur 1A viser en skjematisk representasjon av rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst) som brukes til å vurdere infeksjoner in vivo. Figur 1B viser det skjematiske flytskjemaet som brukes til å vurdere rSARS-CoV-2/Nluc infeksjonsdynamikk hos K18 hACE2 transgene mus. Fire til seks uker gamle kvinnelige K18 hACE2 transgene mus (N = 4) var enten mock-infisert med 1x PBS eller infisert med 105 PFU av rSARS-COV-2/WT eller rSARS-CoV-2/Nluc intranasally. Ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers etterinfeksjon ble mus bedøvet ved hjelp av isolasjonskammeret og deretter injisert med Nluc-substrat retro-orbitalt. Isolasjonskammeret ble umiddelbart plassert i IVIS- og Nluc-signalet ble vurdert in vivo ved hjelp av bildeprogramvaren. Nluc-uttrykk ble lett påvist hos mus infisert med rSARS-CoV-2/Nluc, men ikke de som var smittet med rSARS-CoV-2/WT, eller mock-infisert (figur 2A). Kvantitative analyser viste Nluc-intensitet på ulike dager etter infeksjon (figur 2B). Grove lesjoner på lungeoverflaten til mus smittet med rSARS-CoV-2/Nluc var sammenlignbare med de i den rSARS-CoV-2/WT-infiserte gruppen (figur 2C). Til slutt ble musorganer (lunger, neseturbinat og hjerne) homogenisert, og virale titere ble bestemt av plakkanalyse (PFU / ml) og Nluc-aktivitet ble bestemt ved hjelp av luciferaseanalysen i henhold til produsentens instruksjoner. Plakk ble vurdert ved immunstaining ved hjelp av det tverrreaktive SARS-CoV N monoklonale antistoffet 1C7C7. Virale titere oppdaget i rSARS-CoV-2/Nluc infiserte mus var sammenlignbare med de som var smittet med rSARS-CoV-2/WT i alle organer på forskjellige dager etter infeksjon (figur 2D). Nluc-aktivitet ble bare påvist i organene fra rSARS-CoV-2/Nluc-infiserte mus (figur 2E). En egen gruppe mock-infiserte og virusinfiserte mus ble overvåket i 12 dager for endringer i kroppsvekt (figur 2F) og overlevelse (figur 2G). Mus smittet med rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/WT mistet opptil 25% av kroppsvekten og alle bukket under for virusinfeksjon mellom 7-8 dager etter infeksjon (figur 2F-G).

rSARS-CoV-2/Venus-infeksjon hos K18 hACE2 transgene mus (figur 3 og 4)
Figur 3A viser en skjematisk representasjon av rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst) som brukes til å vurdere infeksjoner ex vivo. Figur 3B viser det skjematiske flytskjemaet som brukes til å vurdere rSARS-CoV-2/Venus-dynamikken i K18 hACE2-transgene mus. Fire til seks uker gamle kvinnelige K18 hACE2 transgene mus (N = 4 /gruppe) var enten mock-infisert med 1x PBS eller infisert med 105 PFU av rSARS-COV-2 / WT eller rSARS-CoV-2 / Venus intranasalt. Ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers etterinfeksjon ble mus euthanized, og lungene deres ble utskilt og avbildet ex vivo ved hjelp av en IVIS. Venusuttrykk ble lett påvist i alle lunger fra mus infisert med rSARS-CoV-2/Venus, men ikke de som var smittet med rSARS-CoV-2/WT, eller mock-infisert (figur 4A). Kvantitative analyser viste at Venus intensitet topper seg på 2 dager etter infeksjon og avtar i løpet av infeksjonen i lungene til infiserte mus (figur 4B). Bilder av lungeoverflaten viste at grove lesjoner av mus smittet med rSARS-CoV-2/Venus var sammenlignbare med rSARS-CoV-2/WT-infiserte mus (figur 4C). Til slutt ble musorganer (lunger, neseturbinat og hjerne) homogenisert, og virale titere ble bestemt av plakkanalyse og vurdert ved immunstaining ved hjelp av SARS-CoV N protein kryssreaktivt monoklonalt antistoff 1C7C7. Infeksjon med rSARS-CoV-2/Venus resulterte i sammenlignbare virale titere med de som ble observert hos mus som var smittet med rSARS-CoV-2/WT i alle organer (figur 4D). En egen gruppe mock-infiserte og virusinfiserte mus ble overvåket i 12 dager for endringer i kroppsvekt (figur 4E) og overlevelse (figur 4F). Mus smittet med rSARS-CoV-2/Venus og rSARS-CoV-2/WT mistet opptil 25% av kroppsvekten og alle bukket under for virusinfeksjon ved dag 9 etter infeksjon uten overlevelse (figur 4E-4F).

Figure 1
Figur 1: Vurdering av rSARS-CoV-2/Nluc infeksjon in vivo ved bruk av K18 hACE2 transgene mus. (A) Skjematisk representasjon av rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst). (B) Skjematisk flytskjema for vurdering av rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: rSARS-CoV-2Nluc-uttrykk hos infiserte K18 hACE2-transgene mus. (A-B) Fire til seks uker gamle kvinnelige K18 hACE2 transgene mus ble mock-infisert (N = 4) eller smittet med rSARS-CoV-2/WT (N = 4) eller rSARS-CoV-2/Nluc (N = 4) ved bruk av 105 PFU per dyr. Musene ble bedøvet ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers postinfeksjon, etter å ha blitt retroorbital injisert med Nluc-substratet. (A) Nluc-uttrykk ble bestemt under et in vivo-bildesystem, og lunger fra mock-infiserte og infiserte mus ble utskilt og fotografert ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers postinfeksjon . (B) Nluc-intensiteten ble analysert av bildeanalyseprogramvaren og (C) brutto lesjoner på lungeoverflaten ble analysert av ImageJ (C) **P < 0,01. (D) Virale titere i neseturbinatet (venstre), lungene (midten) og hjernen (høyre) fra mus infisert med rSARS-CoV-2/WT og rSARS-CoV-2/Nluc ble bestemt av plakkanalyse. (E) Nluc aktivitet i nese turbinat (venstre), lunger (midten) og hjernen (høyre) ble målt under en luciferase multi-plate leser. ns, ikke signifikant. Mock- og virusinfiserte mus ble overvåket i 12 dager for endringer i (F) kroppsvekt og (G) overlevelse. Alle data presenteres som gjennomsnittlig ± SD for hver gruppe og analyseres av SPSS13.0 (IBM). En P-verdi på mindre enn 0,05 (P < 0,05) ble ansett som statistisk signifikant. Denne figuren er endret fra Ye C. et al.41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av rSARS-CoV-2/Venus infeksjon in vivo ved bruk av K18 hACE2 transgene mus. (A) Skjematisk representasjon av rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Venus (nederst). (B) Skjematisk flytskjema for vurdering av rSARS-CoV-2/Venus in vivo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: rSARS-CoV-2/Venus-uttrykk hos infiserte K18 hACE2-transgene mus. (A-B) Fire til seks uker gamle kvinnelige K18 hACE2 transgene mus var mock-infisert (N = 4) eller infisert (105 PFU/mus) med rSARS-CoV-2/WT (N = 4) eller rSARS-CoV-2/Venus (N = 4). Lungene ble utskilt ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers postinfeksjon, bilder av lunger ble fotografert ved 1-, 2-, 4- og 6-dagers etterinfeksjon. (A) Venus-uttrykket ble vurdert under en IVIS, (B) fluorescensintensitet ble analysert av bildeanalyseprogramvaren og (C) de grove lesjonene på lungeoverflatene ble analysert av ImageJ. **P < 0,01. (D) Virale titere i neseturbinatet (venstre), lungene (midten) og hjernen (høyre) fra mus infisert med rSARS-CoV-2/WT og rSARS-CoV-2/Venus ble bestemt av plakkanalyse. ns, ikke signifikant. Mock- og SARS-CoV-2-infiserte mus ble overvåket i 12 dager for (E) kroppsvekttap og (F) overlevelse. Alle data presenteres som gjennomsnittlig ± SD for hver gruppe og analyseres av SPSS13.0 (IBM). En P-verdi på mindre enn 0,05 (P < 0,05) ble ansett som statistisk signifikant. Denne figuren er endret fra Ye C. et al.41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen viser muligheten for å bruke disse rSARS-CoV-2 uttrykkende reportergenene for å overvåke virusinfeksjoner in vivo. Begge reporter-uttrykkende rekombinante virus gir et utmerket verktøy for å studere SARS-CoV-2 infeksjoner in vivo. De beskrevne ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) og in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) bildesystemer representerer et utmerket alternativ for å forstå dynamikken i SARS-CoV-2 infeksjon, viral patogenese og å identifisere infiserte celler / organer på forskjellige tidspunkter etter virusinfeksjon. For å gjennomføre ex vivo-studier (rSARS-CoV-2/Venus) og in vivo-studier (rSARS-CoV-2/Nluc), er det eminent å ha nøyaktige og reproduserbare infeksjoner samt tilstrekkelige inokulasjoner av rSARS-CoV-2/Nluc.

Når du studerer in vivo-infeksjoner ved hjelp av rSARS-CoV-2/Nluc, bør musene barberes for å lette Nluc-visualiseringen under IVIS. Det er også behov for å inokulere Nluc-substratet for visualisering av Nluc. Dette kan kreve noen eksperimentelle tester for å bestemme konsentrasjonene og volumet av Nluc-substratet for å sikre et høyt Nluc-signal. Når du studerer ex vivo-infeksjoner ved hjelp av rSARS-CoV-2/Venus, og på grunn av begrensninger ved å oppdage Venus direkte fra hele musene ved hjelp av IVIS, tillater bare ex vivo-avbildning av lungene deteksjon av Venus-uttrykk. Dette krever at en gruppe mus blir euthanized på forskjellige tidspunkter. Dette er i strid med situasjonen for mus som er smittet med rSARS-CoV-2 /Nluc siden den samme gruppen mus kan avbildes på forskjellige dager etter infeksjon, uten å kreve eutanasi på hver av tidene etter infeksjon som kreves for rSARS-CoV-2 / Venus. En fordel med rSARS-CoV-2/Venus over rSARS-CoV-2/Nluc er at den kan brukes med strømningscytometri for å identifisere hvilken type celler som er infisert av SARS-CoV-2 ved ganske enkelt å sortere smittende celler fra ikke-infiserte celler kombinert med bruk av spesifikke cellulære markører som vi tidligere har beskrevet med influensa (REF). Et viktig aspekt ved vår rSARS-CoV-2/Venus og rSARS-CoV-2/Nluc er at begge viste WT-lignende vekstegenskaper in vitro og in vivo uten å vise tegn på demping, slik at vi kan overvåke virusinfeksjon ex vivo i lungene til infiserte mus (rSARS-CoV-2/Venus) og dynamikken i viral replikasjon i hele musen (rSARS-CoV-2/Nluc) ved hjelp av ikke-invasiv langsgående in vivo-avbildning .

Det er viktig at disse reporter-uttrykkende rSARS-CoV-2/Venus og rSARS-CoV-2/Nluc representerer et utmerket alternativ for identifisering av blyprofylaktiske og/eller terapeutiske behandlinger for behandling av SARS-CoV-2 infeksjon41. Bruken av reporter-uttrykkende rSARS-CoV-2 som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner som brukes (f.eks. Venus og mCherry) tillater oss å kombinere dem i bifluorescerende analyser for å identifisere om terapeutiske stoffer effektivt kan hemme infeksjon av to virus samtidig, in vitro og eller in vivo, og for å spore virusinfeksjon, og patogenese39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle, økonomiske og ikke-økonomiske, eller personlige interessekonflikter i forhold til det beskrevne arbeidet.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke medlemmer ved instituttet vårt (Texas Biomedical Research Institute) for deres innsats for å holde anleggene våre i full drift og trygge under COVID-19-pandemien. Vi vil også takke vår Institutional Biosafety Committee (IBC) og spell (IACUC) for å gjennomgå protokollene våre på en tidseffektiv måte. Vi takker Dr. Thomas Moran ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for å ha gitt SARS-CoV tverrreaktivt 1C7C7 nukleocapsid (N) proteinmonokron antistoff. SARS-CoV-2 forskning i Martinez-Sobridos laboratorium støttes for tiden av NIAID/NIH-tilskuddene RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 og R43AI165089-01; Forsvarsdepartementet (DoD) gir W81XWH2110095 og W81XWH2110103; San Antonio-partnerskapet for presisjonsterapeutisk; Texas Biomedical Research Institute Forum; University of Texas Health Science Center i San Antonio; San Antonio Medical Foundation; og av Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), et NIAID-finansiert Senter for fremragende forskning og respons (CEIRR, kontrakt # 75N93021C00014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 177 SARS-CoV-2 coronavirus fluorescens bioluminescens replikasjons-kompetente virus reportervirus NanoLuc luciferase venus fluorescerende protein virusinfeksjon in vivo avbildning IVIS Ami HT K18 hACE2 transgene mus
Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morales Vasquez, D., Chiem, K.,… More

Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J. G., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter