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Immunology and Infection

使用报告基因表达重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠的病毒感染进行实时成像和定量

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

该协议描述了在K18 hACE2转基因小鼠中使用荧光素酶和荧光表达重组（r）SARS-CoV-2和 体内 成像系统（IVIS）的病毒感染动力学，以克服研究 体内SARS-CoV-2感染所需的次要方法的需求。

Abstract

2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的。迄今为止，SARS-CoV-2已造成全球超过2.42亿例感染和490多万人死亡。与其他病毒类似，研究SARS-CoV-2需要使用实验方法来检测受感染细胞和/或动物模型中病毒的存在。为了克服这一限制，我们产生了复制能力强的重组（r）SARS-CoV-2，其表达生物发光（纳米脱硫酶，Nluc）或荧光（Venus）蛋白。这些报告基因表达rSARS-CoV-2允许基于Nluc和Venus报告基因的表达在 体外 和 体内 跟踪病毒感染。在这里，该研究描述了使用rSARS-CoV-2 / Nluc和rSARS-CoV-2 / Venus来检测和跟踪先前描述的K18人血管紧张素转换酶2（hACE2）转基因小鼠感染模型中的SARS-CoV-2感染，使用 体内 成像系统（IVIS）。这种rSARS-CoV-2 / Nluc和rSARS-CoV-2 / Venus在 体内显示出rSARS-CoV-2 / WT样致病性和病毒复制。重要的是，Nluc和Venus的表达使我们能够直接跟踪受感染小鼠 体内和离体的病毒感染。这些rSARS-CoV-2 / Nluc和rSARS-CoV-2 / Venus代表了研究SARS-CoV-2 体内生物学，了解病毒感染和相关COVID-19疾病以及确定有效的预防和/或治疗治疗以对抗SARS-CoV-2感染的绝佳选择。

Introduction

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种包膜，阳性，单链RNA病毒，属于冠状病毒科1中的β冠状病毒谱系。这种病毒家族分为α-，β-，Gamma-和Delta-coronavirus1。α-和β-冠状病毒主要感染哺乳动物，而γ-和δ-冠状病毒几乎只感染鸟类2。迄今为止，已有七种冠状病毒（CoV）跨越了物种屏障，成为人类冠状病毒（HCoV）：两种α冠状病毒（HCoV-229E和HCoV-NL63）和五种β-CoV（HCoV-OC43，HCoV-HKU1，SARS-CoV，中东呼吸综合征冠状病毒[MERS-CoV]和SARS-CoV-2）3，4，5，6。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2具有高致病性，可引起严重的下呼吸道感染7。在SARS-CoV-2出现之前，有两次由CoV引起的流行病爆发：2002-2003年在中国广东普罗维登斯的SARS-CoV，病死率（CFR）约为9.7%;2012年至今中东中东呼吸综合征冠状病毒，病死率约为34%7，8。SARS-CoV-2的总体CFR在3.4%-49%之间，基础疾病导致更高的CFR8，9。自2019年12月在中国武汉发现SARS-CoV-2以来，已造成全球超过2.42亿人感染和超过490万人死亡7，10，11，12。值得注意的是，自2020年底以来，新的SARS-CoV-2关注变体（VoC）和感兴趣的变体（VoI）影响了病毒特征，包括传播和抗原性9，13，以及COVID-19大流行的总体方向。对于SARS-CoV-2感染的治疗，目前只有一个美国（美国）美国食品和药物管理局（FDA）治疗性抗病毒药物（瑞德西韦）和一种紧急使用授权（EUA）药物（巴瑞替尼，与瑞德西韦联合给药）14。还有6种批准的EUA单克隆抗体：REGEN-COV（卡西维单抗和依德维单抗，一起给药），索曲维单抗，托珠单抗，巴姆拉尼昔单抗和雌虫昔单抗一起给药15，16，17，18，19。目前只有一种FDA批准的预防性疫苗辉瑞-BioNTech，另外两种预防性疫苗（Moderna和Janssen）已获得EUA批准的20，21，22，23，24。然而，随着感染率不受控制以及VoC和VoI的出现，SARS-CoV-2仍然对人类健康构成威胁。因此，迫切需要新的方法来确定有效的预防和治疗方法，以控制SARS-CoV-2感染和仍在进行的COVID-19大流行。

研究SARS-CoV-2需要费力的技术和次要方法来识别感染细胞和/或经过验证的感染动物模型中病毒的存在。反向遗传学的使用允许重组病毒的产生来回答病毒感染生物学中的重要问题。例如，反向遗传学技术提供了揭示和理解病毒感染，发病机制和疾病的方法。同样，反向遗传学方法为设计缺乏病毒蛋白的重组病毒铺平了道路，以了解它们在病毒发病机制中的贡献。此外，反向遗传学技术已被用于生成表达报告基因的重组病毒，用于 体外 和 体内 应用，包括确定用于治疗病毒感染的预防和/或治疗方法。荧光和生物发光蛋白是最常用的报告基因，因为它们具有灵敏度，稳定性和基于新技术改进的易于检测25，26。 在体外，荧光蛋白已被证明是病毒在受感染细胞中定位的更好选择，而荧光素酶更便于定量研究27，28，29。 在体内，荧光素酶优于荧光蛋白用于整个动物成像，而荧光蛋白优选用于鉴定感染细胞或 离体 成像30，31，32。使用报告基因表达重组病毒已成为研究许多家族病毒的有力工具，其中包括黄病毒，肠道病毒，甲型病毒，慢病毒，沙粒病毒和流感病毒28，33，34，35，36。

为了克服对研究SARS-CoV-2的次要方法的需求并表征 体内实时SARS-CoV-2感染，我们产生了复制能力强的重组（r）SARS-CoV-2，该重组体表达生物发光（纳米酰化酶，Nluc）或荧光（金星）蛋白，使用我们之前描述的基于细菌人造染色体（BAC）的反向遗传学，这些基因在 大肠杆菌 中作为单个拷贝保存 为了尽量减少病毒序列在细菌中繁殖过程中的毒性37，38。值得注意的是，rSARS-CoV-2 / Nluc和rSARS-CoV-2 / Venus 在体内显示出rSARS-CoV-2 / WT样致病性。来自rSARS-CoV-2 / Venus的高水平金星表达允许使用 体内 成像系统（IVIS）检测受感染的K18 hACE2转基因小鼠肺部的病毒感染39。Venus表达水平与肺部检测到的病毒滴度密切相关，证明了使用Venus表达作为SARS-CoV-2感染的有效替代物的可行性。使用rSARS-CoV-2 / Nluc，我们能够实时跟踪病毒感染的动态，并使用相同的IVIS方法在K18 hACE2转基因小鼠中纵向评估 体内 SARS-CoV-2感染。

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Protocol

涉及K18 hACE2转基因小鼠的方案由德克萨斯生物医学研究所（TBRI）机构生物安全委员会（IBC）和机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有实验都遵循国家研究委员会40号实验动物护理和使用指南中的建议。与小鼠一起工作时，需要适当的个人防护设备（PPE）。

1. K18 hACE2转基因小鼠的使用

  1. 在特定无病原体条件下，在生物安全水平（BSL）-2动物护理设施中购买并维持4-6周龄雌性 B6.Cg-Tg（K18-ACE2）2Prlmn / J小鼠（K18 hACE2转基因小鼠）。
    1. 到达BSL2设施后，让动物适应7天，并将其转移到BSL-3动物设施进行感染和其他实验程序。
    2. 按照IACUC协议，每个笼子放置4只小鼠。为了确保动物死亡，在小鼠感染rSARS-CoV-2和 体内 成像后，用致命剂量的Fatal-Plus（>100mg / kg）对动物实施安乐死。

2. 生物安全

注意：在本手稿中，rSARS-CoV-2是使用基于BAC的反向遗传系统为SARS-CoV-2 USA-WA1 / 2020菌株生成的，如前所述37。所有涉及rSARS-CoV-2 / Nluc或rSARS-CoV-2 / Venus感染的 体内 程序必须在BSL-3条件下在生物安全柜中进行。

  1. 在执行本文所述的所有实验程序之前和之后，用2%灭湿剂和70%乙醇消毒剂按顺序清洁生物安全柜。
  2. 每次使用前后对所有解剖材料（剪刀、解剖镊子等）和均质机进行灭菌。
  3. 根据制造商的说明，在每次使用之前和之后使用MB10片剂清洁隔离室并进行消毒。
  4. 丢弃按照IBC和IACUC指南在程序中产生的所有生物材料。

3. rSARS-CoV-2的 体内 表征

  1. 小鼠感染
    1. 将雌性4-6周龄的K18 hACE2转基因小鼠置于标记的笼子中，使用打耳代码识别每个笼子中的小鼠，并每个笼子放置4只小鼠。使用一组小鼠进行体重和存活，并使用另一组动物进行病毒滴定和成像。
    2. 感染前，将小鼠胸部从胸腹侧剃须至腹股沟区域，以促进生物发光信号。
    3. 使用无菌的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）在无菌条件下用10个5 斑形成单元（PFU）/小鼠制备rSARS-CoV-2接种物，总体积为50μL。
      注意：计算用于病毒稀释的rSARS-CoV-2的量，公式为：所需病毒= （每只小鼠105 PFU / 50μL）x最终体积）/储备病毒滴度。
    4. 将病毒接种物冷藏在冰上。
    5. 使用模拟感染（1x PBS）和rSARS-CoV-2 / WT感染的小鼠作为内部对照。将模拟感染的小鼠放在比rSARS-CoV-2感染的小鼠不同的笼子中。
    6. 在麻醉室中使用5%异氟醚气态镇静剂麻醉小鼠，并用3%异氟醚维持。
    7. 一旦确认姿势反应和矫正反射，将小鼠置于背卧位。
    8. 在食指和拇指之间搅动老鼠的脖子，用小指将尾巴靠在手掌上，以将动物保持在背部位置。
    9. 将含有50μL病毒接种物的移液器尖端置于鼻孔中，然后缓慢弹出溶液。通过观察接种物滴落消失，确保吸入病毒接种物并且没有反流。
  2. 生物发光监测感染rSARS-CoV-2 / Nluc的K18 hACE2转基因小鼠（图1 和 图2）
    注意：此实验遵循示意图表示，并使用 图1中所示的病毒。 体内 成像系统（IVIS）需要异氟醚麻醉附件。请参阅 材料表， 了解所需仪器和系统的详细信息。
    1. 启动成像软件并设置参数，单击图像模式到 生物发光，打开滤镜，并将曝光时间设置为自动。
    2. 初始化IVIS机器后，将小鼠放在隔离室中，同时仍在生物安全柜内。用5%浓度的异氟醚诱导小鼠。一旦确认体位反应和矫正反射的丧失，用3%异氟醚维持。
    3. 一旦小鼠被麻醉，将它们从分离室中取出，并用25G针头逆向轨道施用1：10稀释的荧光素酶底物在1x PBS（最终体积100μL /小鼠）中。
    4. 给予荧光素酶底物后，将小鼠放回隔离室中，其胸部朝上，鼻腔在歧管锥体内，以在成像过程中保持动物麻醉。
    5. 将隔离室转移到IVIS机器上，关闭IVIS成像仪门后，立即在软件程序中选择 采集 进行初始化（图2A）。
    6. 要分析采集的生物发光图像，请使用软件中的 ROI （感兴趣区域）工具指定精确信号并测量通量（图2B）。
    7. 单击 “测量” 并允许系统开始评估光子中的生物发光，以提供与各种参数提供的输出测量值相当的绝对光子发射。
    8. 在感染后1，2，4和6天对小鼠进行成像。
    9. 成像后将小鼠放回笼子中。
  3. 感染rSARS-CoV-2 / Venus的K18 hACE2转基因小鼠的荧光分析（图3 和 图4）
    注意：本实验遵循 图3所示的示意图和rSARS-CoV-2。请参阅 材料表， 了解所需仪器和系统的详细信息。
    1. 启动成像软件并设置参数，设置激发（500 nm）和发射滤光片（530 nm），单击图像模式到 荧光 并将曝光时间设置为自动。
    2. 腹腔内使用致命剂量的Fatal-Plus（>100mg / kg）对小鼠实施安乐死。安乐死后，用70%乙醇对切口部位进行消毒。
    3. 使用镊子，拉动皮肤，从胸骨到腹部做一个切口，用剪刀从侧面切开切口。切开肝静脉以尽量减少肺部的血液量，并避免成像过程中的高背景信号。
    4. 用剪刀切开胸骨，打开胸腔。接下来，用剪刀剪断气管的末端，用镊子切除肺部。
    5. 将切除的肺放入含有2 mL 1x PBS的6孔板中，冲洗以除去多余的血液。通过使用70%乙醇在样品之间消毒和清洁手术工具，最大限度地减少样品之间污染的可能性。
    6. 初始化IVIS机器后，将肺部放在黑色托盘中，并将组织彼此分开。
    7. 将托盘放在生物安全柜内的隔离室内，然后将隔离室转移到IVIS。关闭盖板并单击“ 采集 ”以启动成像系统（图4A）。
    8. 要分析荧光，请使用 ROI 工具并在每个单独的肺周围绘制ROI。手动测量每个ROI，然后使用给定的平均辐射效率值，并从模拟感染小鼠的ROI中减去（图4B）。
    9. 成像完成后，将组织放在冰上进行当天分析，或放在冷冻管中进行干冰冷冻，以储存在-80°C下以供以后处理。
  4. 感染rSARS-CoV-2 / Nluc（图2A-C）和rSARS-CoV-2 / Venus的K18 hACE2转基因小鼠的肺明场成像和病理学评分（图4A-C）
    1. 在对感染了rSARS-CoV-2 / Nluc，rSARS-CoV-2 / WT和模拟感染的小鼠进行生物发光成像后，将小鼠送回笼子。继续进行安乐死和小鼠肺部的 离体 明场成像（图2A）。
    2. 在对感染小鼠的肺部进行 体外 荧光成像后，拍摄肺部的明场图像（图4A）。
    3. 使用ImageJ分析肺表面的大病变（图2C 和 4C）。
    4. 打开要在图像J中分析的肺图像。
    5. 计算像素与厘米的比率，使用 直线 工具并测量图像的实际长度。
    6. 选择后，单击“ 分析>度量” 以计算长度的像素长度。
    7. 单击“ 分析”>“设置比例” ，然后输入从上一步计算的数字。
    8. 使用“ 徒手选择” 工具并选择整个肺表面。单击 “分析>测量” 以测量总肺面积。
    9. 单击 “编辑>选择”>“反转 ”以选择肺部区域的其余部分，然后按删除或退格键以删除背景。
    10. 删除所选区域，然后单击图像 >调整>颜色阈值。
    11. 要选择病理病变区域，请根据充血和出血的程度，将 亮度 调整为最小值（1 至 50 至 500 之间）和最大值（50 至 200 之间）。
    12. 选择病理病变后，单击阈值颜色面板底部的 “选择 ”，然后单击“ 分析>测量” 以测量病理区域。
    13. 使用以下公式计算大病变的百分比：病理面积百分比 = （病理面积/总肺表面的测量）x 100。
  5. 病毒滴定（图2D 和 图4D）
    1. 成像后，完成小鼠安乐死并收集肺，脑和鼻粘膜。
    2. 将肺、脑和鼻粘膜放入单独的无菌组织均质器中，并加入 1 mL 冷 1x PBS。
    3. 通过将样品以21，500× g 离心10分钟以沉淀细胞碎片来均质化样品。收集并将上清液转移到新的无菌管中并丢弃沉淀。
    4. 如果在同一天进行病毒滴定，则将上清液储存在4°C。 或者，在-80°C下冷冻均质样品的上清液，直到稍后进行评估。
    5. 利用从组织匀浆中获得的上清液进行10倍连续稀释，并用1mL每个稀释的上清液（6孔板格式，1.2×10 6个细胞/孔，一式三份）感染VeroE6 细胞的融合单层。
    6. 让病毒在37°C下在加湿的5%CO 2培养箱中吸附1 小时。
    7. 病毒吸附后，用1mL的1x PBS洗涤细胞，并在37°C下在加湿的5%CO 2培养箱中孵育含有1%琼脂的2mL 感染后培养基中孵育72小时。
    8. 孵育后，在4°C下将板在10%中性缓冲福尔马林中灭活24小时，确保整个板浸没。
    9. 从BSL3中取出板，用1mL的1x PBS洗涤细胞三次，并在室温（RT）下用1mL的0.5%Triton X-100渗透10分钟。
    10. 用1mL的2.5%牛血清白蛋白（BSA）在1x PBS中在37°C下阻断细胞1小时，然后在1mL的1μg/ mL的SARS-CoV核衣壳（N）蛋白交叉反应性单克隆抗体（1C7C7）中孵育，在2.5%BSA中在37°C下稀释1小时。
    11. 用1 mL 1x PBS洗涤细胞三次，并根据制造商的说明使用ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒显现斑块。
    12. 将病毒滴度计算为 PFU/mL。
      注意：用公式PFU / mL计算= 稀释因子x斑块数x（1 mL /接种量）。
  6. 感染rSARS-CoV-2 / Nluc的K18 hACE2转基因小鼠组织中的Nluc活性（图2E）
    1. 根据制造商的说明，使用荧光素酶测定法，量化来自模拟，rSARS-CoV-2 / WT和rSARS-CoV-2 / Nluc感染的K18 hACE2转基因小鼠的器官匀浆物中Nluc的存在。
  7. 发病率和死亡率评估（图2F，G 和 图4E，F）
    1. 鼻内感染4-6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠与105 PFU的rSARS-CoV-2 / WT，rSARS-CoV-2 / Venus，rSARS-CoV-2 / Nluc，或如第3.1节所述的模拟感染。
    2. 同时监测和称量小鼠12天，以尽量减少由于食物摄入引起的体重变化。对自达到人道终点以来体重减轻25%的小鼠实施安乐死，并指出这些小鼠屈服于病毒感染。
    3. 12天后，对病毒感染存活的小鼠实施安乐死，并计算体重变化和存活率的百分比。

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Representative Results

k18 hACE2转基因小鼠的rSARS-CoV-2 / Nluc感染（图1 和2）
图1A显示了用于评估体内感染的rSARS-CoV-2 / WT（顶部）和rSARS-CoV-2 / Nluc（底部）的示意图。图1B显示了用于评估K18 hACE2转基因小鼠中rSARS-CoV-2 / Nluc感染动态的示意图流程图。4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠（N = 4）在鼻内模拟感染1x PBS或感染105 PFU的rSARS-COV-2 / WT或rSARS-CoV-2 / Nluc。在感染后1，2，4和6天，使用分离室镇静小鼠，然后在眶后注射Nluc底物。将隔离室立即置于IVIS中，并使用成像软件在体内评估Nluc信号。在感染了rSARS-CoV-2 / Nluc的小鼠中很容易检测到Nluc表达，但在感染了rSARS-CoV-2 / WT或模拟感染的小鼠中却没有检测到Nluc表达（图2A）。定量分析显示感染后不同日子的Nluc强度（图2B）。感染rSARS-CoV-2 / Nluc的小鼠肺表面的严重病变与rSARS-CoV-2 / WT感染组的严重病变相当（图2C）。最后，将小鼠器官（肺，鼻甲和脑）均质化，并通过斑块测定（PFU / mL）测定病毒滴度，并按照制造商的说明使用荧光素酶测定测定Nluc活性。通过使用交叉反应性SARS-CoV N单克隆抗体1C7C7通过免疫染色来评估斑块。在感染后不同日子，在rSARS-CoV-2 / Nluc感染小鼠中检测到的病毒滴度与感染所有器官中感染的rSARS-CoV-2 / WT的病毒滴度相当（图2D）。Nluc活性仅在rSARS-CoV-2 / Nluc感染小鼠的器官中检测到（图2E）。另一组模拟感染和病毒感染的小鼠被监测12天体重（图2F）和存活率（图2G）的变化。感染rSARS-CoV-2 / Nluc和rSARS-CoV-2 / WT的小鼠损失高达体重的25%，并且在感染后7-8天之间全部死于病毒感染（图2F-G）。

k18 hACE2转基因小鼠的rSARS-CoV-2 / Venus感染（图3 和4）
图3A显示了用于评估体外感染的rSARS-CoV-2 / WT（顶部）和rSARS-CoV-2 / Nluc（底部）的示意图。图3B显示了用于评估K18 hACE2转基因小鼠中rSARS-CoV-2 / Venus动力学的示意图流程图。4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠（N = 4 /组）要么在鼻内模拟感染1x PBS或感染105 PFU的rSARS-COV-2 / WT或rSARS-CoV-2 / Venus鼻内。在感染后1天，2天，4天和6天，对小鼠实施安乐死，并使用IVIS切除它们的肺并进行体外成像。在所有肺部，从感染了rSARS-CoV-2 / Venus的小鼠中很容易检测到Venus表达，但那些感染了rSARS-CoV-2 / WT或模拟感染的小鼠却没有检测到Venus表达（图4A）。定量分析表明，Venus强度在感染后2天达到峰值，并在感染小鼠肺部的感染过程中降低（图4B）。肺表面图像显示感染rSARS-CoV-2 / Venus的小鼠的严重病变与rSARS-CoV-2 / WT感染小鼠的严重病变相当（图4C）。最后，将小鼠器官（肺、鼻甲和脑）均质化，通过斑块测定测定病毒滴度，并使用SARS-CoV N蛋白交叉反应性单克隆抗体1C7C7进行免疫染色评估。感染rSARS-CoV-2 / Venus导致病毒滴度与在所有器官中感染rSARS-CoV-2 / WT的小鼠中观察到的病毒滴度相当（图4D）。另一组模拟感染和病毒感染的小鼠监测12天体重（图4E）和存活率（图4F）的变化。感染rSARS-CoV-2 / Venus和rSARS-CoV-2 / WT的小鼠体重减轻高达25%，并且在感染后第9天全部死于病毒感染而没有存活（图4E-4F）。

Figure 1
图1：使用K18 hACE2转基因小鼠 在体内 评估rSARS-CoV-2 / Nluc感染。 （A） rSARS-CoV-2/WT（上图）和 rSARS-CoV-2/Nluc（下图）的示意图。（B） 体内rSARS-CoV-2/Nluc评估流程示意图。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：rSARS-CoV-2Nluc在受感染的K18 hACE2转基因小鼠中的表达。 （A-B）4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠被模拟感染（N = 4）或感染rSARS-CoV-2 / WT（N = 4）或rSARS-CoV-2 / Nluc（N = 4），每只动物使用105 PFU。在感染后1，2，4和6天麻醉小鼠，在逆眶后注射Nluc底物后。（A）在体内成像系统下测定Nluc表达，并在感染后1天，2天，4天和6天切除并拍摄来自模拟感染和感染小鼠的肺部。（B）用图像分析软件定量分析Nluc强度，（C）用ImageJ定量分析肺表面的大病变（C）**P<0.01。（D）通过斑块测定法测定感染了rSARS-CoV-2 / WT和rSARS-CoV-2 / Nluc的小鼠的鼻甲（左），肺（中）和脑（右）中的病毒滴度。（E）在荧光素酶多板读数器下测量鼻甲（左），肺（中）和脑（右）中的Nluc活性。ns，不显著。监测模拟和病毒感染的小鼠12天（F）体重和（G）存活率的变化。所有数据均以每组平均± SD 表示，并由 SPSS13.0 （IBM） 进行分析。P值小于0.05（P<0.05）被认为具有统计学意义。这个数字是从Ye C.等人41修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：使用K18 hACE2转基因小鼠 在体内 评估rSARS-CoV-2 / Venus感染。 （A）rSARS-CoV-2 / WT（顶部）和rSARS-CoV-2 / Venus（底部）的示意图。（B）体内评估rSARS-CoV-2 /金星的流程示意图。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：rSARS-CoV-2 / Venus在受感染的K18 hACE2转基因小鼠中的表达。 （A-B）4至6周龄的雌性K18 hACE2转基因小鼠模拟感染（N = 4）或感染（105 PFU /小鼠）与rSARS-CoV-2 / WT（N = 4）或rSARS-CoV-2 / Venus（N = 4）。在感染后1天，2天，4天和6天切除肺部，在感染后1，2，4和6天拍摄肺部图像。（A）在IVIS下评估金星的表达，（B）用图像分析软件定量分析荧光强度，（C）用ImageJ定量分析肺表面的严重病变。**P < 0.01。（D）通过斑块测定法测定感染了rSARS-CoV-2 / WT和rSARS-CoV-2 / Venus的小鼠的鼻鼻甲（左），肺（中）和脑（右）中的病毒滴度。ns，不显著。模拟和SARS-CoV-2感染的小鼠被监测12天（E）体重减轻和（F）存活。所有数据均以每组平均± SD 表示，并由 SPSS13.0 （IBM） 进行分析。P值小于0.05（P<0.05）被认为具有统计学意义。这个数字是从Ye C.等人41修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

该协议证明了使用这些表达报告基因的rSARS-CoV-2来监测体内病毒感染 的可行性。两种表达报告基因的重组病毒都为研究 体内SARS-CoV-2感染提供了极好的工具。所描述的 离体 （rSARS-CoV-2 / Venus）和 体内 （rSARS-CoV-2 / Nluc）成像系统代表了了解SARS-CoV-2感染动力学，病毒发病机制以及在病毒感染后不同时间识别受感染细胞/器官的绝佳选择。为了进行 离体 （rSARS-CoV-2 / Venus）和 体内 （rSARS-CoV-2 / Nluc）研究，具有准确和可重复的感染以及足够的rSARS-CoV-2 / Nluc接种是突出的。

当使用rSARS-CoV-2 / Nluc研究 体内 感染时，应剃须小鼠以促进IVIS下的Nluc可视化。还需要接种Nluc基质以可视化Nluc。这可能需要一些实验测试来确定Nluc基板的浓度和体积，以确保高Nluc信号。当使用rSARS-CoV-2 / Venus研究 离体 感染时，并且由于使用IVIS直接从整个小鼠中检测金星的限制，只有肺部的 离体 成像才能检测到金星的表达。这需要让一组小鼠在不同的时间点被安乐死。这与感染rSARS-CoV-2 / Nluc的小鼠的情况相反，因为同一组小鼠可以在感染后的不同日子成像，而无需在感染后每个时间进行安乐死。rSARS-CoV-2/ Venus与rSARS-CoV-2 / Nluc相比的一个优点是，它可以与流式细胞术一起使用，通过简单地从未感染细胞中分拣感染细胞，并结合使用特定的细胞标志物来识别SARS-CoV-2感染的细胞类型，就像我们之前在流感（REF）中描述的那样。我们的rSARS-CoV-2 / Venus和rSARS-CoV-2 / Nluc的一个重要方面是，两者 在体外 和 体内 都表现出WT-样生长特性，而不会显示出衰减的迹象，使我们能够监测 受感染小鼠 肺部的病毒感染（rSARS-CoV-2 / Venus）以及使用无创纵向 体内 成像在整个小鼠中病毒复制的动态（rSARS-CoV-2 / Nluc）。

重要的是，这些报告基因表达的 rSARS-CoV-2/Venus 和 rSARS-CoV-2/Nluc 代表了鉴定用于治疗 SARS-CoV-2 感染的铅预防和/或治疗药物的绝佳选择 41。使用报告基因表达rSARS-CoV-2表达所使用的不同荧光蛋白（例如，Venus和mCherry）使我们能够将它们结合在双荧光测定中，以确定治疗方法是否可以同时有效地抑制两种病毒的感染，体外和/或体内，并跟踪病毒感染和发病机制39。

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Disclosures

作者声明，该研究是在与所述工作没有任何商业，金融和非财务或个人利益冲突的情况下进行的。

Acknowledgments

我们要感谢我们研究所（德克萨斯生物医学研究所）的成员在COVID-19大流行期间为保持我们的设施全面运营和安全所做的努力。我们还要感谢我们的机构生物安全委员会（IBC）和spell（IACUC）以省时的方式审查我们的协议。我们感谢西奈山伊坎医学院的Thomas Moran博士提供SARS-CoV交叉反应性1C7C7核衣壳（N）蛋白单克隆抗体。马丁内斯-索布里多实验室的SARS-CoV-2研究目前得到NIAID/ NIH拨款RO1AI161363-01，RO1AI161175-01A1和R43AI165089-01的支持;国防部（DoD）拨款W81XWH2110095和W81XWH2110103;圣安东尼奥精准治疗伙伴关系;德克萨斯生物医学研究所论坛;德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心;圣安东尼奥医学基金会;并由流感发病机制和传播研究中心（CRIPT）提供，该中心是NIAID资助的流感研究和反应卓越中心（CEIRR，合同号75N93021C00014）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

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References

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使用报告基因表达重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠的病毒感染进行实时成像和定量
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