Summary
Real-time cell metabolic flux assay måler iltforbrugshastigheden og ekstracellulær forsuringshastighed, hvilket svarer til mitokondriel og glykolytisk adenosintrifosfatproduktion ved hjælp af pH- og iltsensorer. Manuskriptet forklarer en metode til at forstå osteoblasternes energistatus og karakteriseringen og fortolkningen af den cellulære bioenergetiske status.
Abstract
Knogledannelse ved osteoblaster er en væsentlig proces for korrekt knogleopkøb og knogleomsætning for at opretholde skelethomeostase og i sidste ende forhindre brud. For både at optimere den maksimale knoglemasse og bekæmpe forskellige muskuloskeletale sygdomme (dvs. postmenopausal osteoporose, anorexia nervosa, type 1 og 2 diabetes mellitus) er der gjort en utrolig indsats inden for knoglebiologi for fuldt ud at karakterisere osteoblaster gennem hele deres differentieringsproces. I betragtning af den primære rolle, som modne osteoblaster spiller for at udskille matrixproteiner og mineraliseringsvetikler, er det blevet bemærket, at disse processer tager en utrolig mængde cellulær energi eller adenosintrifosfat (ATP). Den overordnede cellulære energistatus kaldes ofte cellulær bioenergetik, og den omfatter en række metaboliske reaktioner, der fornemmer substratets tilgængelighed for at udlede ATP for at imødekomme cellulære behov. Derfor beskriver den nuværende metode processen med at isolere primære, murine knoglemarvstromale celler (BMSC'er) og overvåge deres bioenergetiske status ved hjælp af real-time cell metabolic flux analyzer på forskellige stadier i osteoblastdifferentiering. Det er vigtigt, at disse data har vist, at den metaboliske profil ændres dramatisk gennem osteoblastdifferentiering. Brug af denne fysiologisk relevante celletype er således nødvendig for fuldt ud at forstå, hvordan en celles bioenergetiske status kan regulere den samlede funktion.
Introduction
Dannelsen af knogle ved osteoblast ledsages af koordineret ødelæggelse eller resorption af knogler af osteoklaster. Balancen mellem osteoblastisk knogledannelse og osteoklastresorption er en koblet proces, der beskriver knogleomsætning eller ombygning, hvilket er afgørende for skelethomeostase. Osteoblastdysfunktion fører til nedsat knogledannelse og resulterer i forskellige sygdomme, herunder osteoporose 1,2,3. Ex vivo/in vitro-differentiering af knoglemarvsstromale stamceller (BMSC'er) til osteoblastprækursorer og modne osteoblaster resulterer i dannelse og aflejring af den mineraliserede knoglematrix i dyrkningsbeholderen over tid 4,5,6. Denne knogledannelse ved osteoblast kræver en betydelig mængde cellulær energi. Specifikt har kollagensyntese og sekretion vist sig at være stærkt afhængig af cellulær ATP: ADP-forhold, og formodentlig kræver mineraliseret vesikelhandel og sekretion yderligere ATP 7,8,9,10,11. Mange forskere har vist, at processen med osteoblastogenese og osteoblastfunktion kræver en tilstrækkelig tilførsel af energi til at imødekomme det metaboliske behov for knogledannelse 12,13,14,15,16. Derfor er målet med denne metode at karakterisere den bioenergetiske status for primære, murine stromale celler gennem osteoblastdifferentiering ved hjælp af realtidscellemetabolisk fluxanalysator. Disse teknikker hjælper med at udvikle en bedre forståelse af skelethomeostase, hvilket i sidste ende kan føre til udvikling af nye terapeutiske muligheder, der er i stand til at forbedre skeletforstyrrelser.
Realtidscellemetabolisk fluxanalysator kan bruges til at måle iltforbrugshastigheden (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) af levende osteoblaster, hvilket svarer til henholdsvis mitokondriel og glykolytisk ATP-produktion. Grundlæggende for denne metode er det faktum, at en H + ion pr. Lactat frigives under glykolyse i omdannelsen af glucose til lactat, hvilket ændrer mediets pH afspejlet i ECAR-værdierne. Omvendt producerer oxidativ fosforylering via mitokondrierne under TCA-cyklussen (tricarboxylsyre) CO2 ved at udnytte eller forbruge ilt, og derfor afspejler overvågning af OCR denne metaboliske proces. Analysatoren måler både OCR og ECAR i det ekstracellulære mikromiljø samtidigt og i realtid, hvilket giver mulighed for et enormt potentiale, når man studerer cellulær bioenergetik 6,17. Derudover er udførelsen af disse assays relativt ligetil og let tilpasselig afhængigt af det eksperimentelle mål. Lignende teknikker er blevet anvendt til yderligere at forstå T-celle metabolisk regulering af immunsystemet18,19, kræftinitiering og progression20 sammen med flere andre celletyper, der bidrager til metaboliske syndromer21,22.
Fordelene ved metabolisk fluxanalysator i realtid i forhold til alternative teknikker omfatter (1) evnen til at måle cellulær bioenergetik af levende celler i realtid, (2) evne til at udføre assay med et relativt lille antal celler (kræver så lavt som 5.000 celler), (3) injektionsporte til parallelt at manipulere flere behandlinger i et system med høj gennemstrømning af 96 brønde, (4) brug af radioaktivt etiketfrit automatiseret cellebillede til normalisering18, 23,24. Følgende metoder sigter mod at give en generaliseret, men detaljeret beskrivelse af overvågning af cellulær bioenergetik i murine BMSC'er gennem osteoblastdifferentiering ved hjælp af analysatoren. Det vil omfatte rutinemæssigt udførte assays; Men som med mange teknikker og metoder opfordres det stærkt til, at de enkelte laboratorier bestemmer specifikke detaljer for deres eksperimenter.
Udvælgelse af assay og forskellige typer assays til rådighed: En bred vifte af assay kits og reagenser er tilgængelige for at studere bioenergetikken af celler, samtidig med at pålideligheden og konsistensen af de eksperimentelle resultater sikres. Derudover tilbyder desktop-softwaren også analyseskabeloner, der let kan tilpasses. Assayet kan defineres ud fra brugerens behov for at måle forskellige metaboliske parametre. Disse assays kan ændres på forskellige måder baseret på det eksperimentelle mål og / eller videnskabelige spørgsmål. For eksempel kan flere forbindelser med fire injektionsporte injiceres i assaymediet for at analysere det cellulære respons, der er specifikt for hver metabolisk vej.
Celle energi fænotype test: Dette assay måler de levende cellers metaboliske fænotype og metaboliske potentiale. Dette assay anbefales også som det første skridt til at få en generaliseret ide om pathway-specifik metabolisme. En blanding af oligomycin A-en hæmmer af ATP-syntase og carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP)-et mitokondrielt afkoblingsmiddel injiceres for at forstå celleenergipotentialet. Injektionen af oligomycin A hæmmer syntesen af ATP, hvilket resulterer i en stigning i glykolysehastigheden (ECAR) for at gøre det muligt for cellerne at opfylde deres energibehov; på den anden side resulterer injektionen af FCCP i højere OCR på grund af depolarisering af mitokondriemembranen. I det væsentlige skildrer dette assay basal metabolisk åndedræt, og efter de dobbelte injektioner, skubber eller understreger det metaboliske respons. Baseret på disse parametre plotter softwaren derefter OCR og ECAR af cellerne ved at klassificere cellerne som aerob, quiescent, glykolytisk eller energisk tilstand over tid25,26.
ATP produktionshastighedsanalyse i realtid: Dette måler den cellulære ATP-produktion samtidigt fra glykolyse og mitokondriel respiration. Dette assay måler kvantitativt de metaboliske skift fra de to energiveje og giver data om mitokondrie- og glykolytiske ATP-produktionshastigheder over tid. Assayet opnår basale OCR- og ECAR-data efterfulgt af beregning af mitokondriel ATP-produktionshastighed gennem injektion af oligomycin A og glykolytisk ATP-produktionshastighed gennem injektion af rotenon + antimycin A-blanding (total hæmning af mitokondriefunktion), hvilket resulterer i mitokondriel forsuring17,27.
Cellemitokondrier stresstest (eller celle mito stress test): Dette måler mitokondriefunktionen gennem ATP-bundet åndedræt, kvantificerer cellulær bioenergetik, identificerer mitokondriel dysfunktion og måler cellernes reaktion på stress. Forskellige parametre, herunder basal og ekstra åndedrætskapacitet, ATP-bundet åndedræt, maksimal åndedræt og ikke-mitokondrielt iltforbrug, kan opnås i et assay. Dette assay involverer sekventielle injektioner af oligomycin A, FCCP (mitokondrielt afkoblingsmiddel), en blanding af rotenon/antimycin A-hæmmere for effektivt at analysere virkningen af disse på mitokondriefunktionen28.
Fleksibilitet mito fuel flex test: Dette måler mitokondrie-respirationshastigheden ved oxidation af de tre primære mitokondrielle brændstoffer ved tilstedeværelsen og fraværet af deres hæmmere. Den sekventielle hæmning af glucose, glutamin og fedtsyrer hjælper med at måle afhængigheden, kapaciteten og fleksibiliteten af celler og afhængigheden af cellerne i forskellige cellulære veje for at imødekomme energibehovet. Når mitokondrierne ikke kan opfylde kravene fra den blokerede vej af interesse ved at oxidere andre brændstoffer, går cellerne ind i en afhængighedstilstand. Cellernes kapacitet beregnes ved hæmning af de to andre alternative veje efterfulgt af hæmning af interessevejen. Cellernes fleksibilitet hjælper med at forstå mitokondriernes evne til at kompensere og imødekomme brændstofbehovene i den hæmmede vej. Det beregnes ved at trække afhængigheden af celler fra cellernes kapacitet. Tre forskellige hæmmere anvendes uafhængigt eller som en blanding af to til effektivt at beregne assayparametrene. 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensyre (UK5099) hæmmer oxidationen af glucose ved at blokere pyruvatbæreren i glykolyse. Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) ethylsulfid hæmmer glutaminoxidationsvejen, og etomoxir hæmmer oxidationen af langkædede fedtsyrer29.
Figur 1: Skematisk gengivelse af metoden til dyrkning og fremstilling af osteoblaster til analyse. Murine BMSC'er isoleres fra lange knogler, dyrkes og podes i 96-brønds plader ved 25.000 celler / brøndtæthed. Dyrkning af disse celler i osteoblastspecifikke medier startes, når de når 80% -100% sammenflydning for at starte deres differentiering. Assays udføres på forskellige stadier af differentiering. Patronpladerne hydreres en dag før analysen. På analysedagen injiceres forskellige hæmmere i sensorpatronernes porte baseret på assaykravene, og der tilsættes en kalibreringsbuffer til kalibreringspladen med 96 brønde. Efter kalibrering udføres cellemetabolisk fluxassay i realtid efterfulgt af billeddannelse af cellekulturmikropladen ved hjælp af mikropladekameraet til normalisering af cellemetaboliske fluxanalysatordata i realtid med celleantal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurerne var baseret på retningslinjerne og godkendelsen fra Institutional Animal Care and Use Committee på Vanderbilt University Medical Center.
1. Fremstilling af reagenser og assayopsætning
- Isolering og dyrkning af knoglemarvsstromale celler (se også den foregående artikel30).
- Forbered komplette alfa-minimum essentielle medier (αMEM) cellekulturmedier ved at supplere minimum essentielle medier med alfa-modifikation med 10% FBS (føtalt kvægserum), 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin.
- Forbered knoglemarvsopsamlingsrøret ved at trimme enden af et 0,6 ml mikrocentrifugerør, så cellerne kan passere igennem og indsætte det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 100 μL komplet αMEM.
- Afliv musene ved hjælp af CO2 -behandling som følger. Anbring dyret i CO2 - kammeret i 2-3 minutter, eller indtil åndedrættet ophører. Vent i mindst 1 minut efter, at dyret bliver bevidstløst for at fjerne musene fra kammeret og cervikalt forskyde.
- Brug steril tang og en saks til at skære underlivet af de aflivede mus op for at lave et lille snit. Isoler musenes lange knogler (lårben, skinneben og iliac crest).
- Trim de lange knogler for at fjerne alt blødt væv. Når knoglen er renset, skæres ~ 1-2 mm fra de distale og proksimale ender for at skabe en åbning, som marven kan skylle igennem.
BEMÆRK: Denne åbning skal være konservativ for at undgå at miste marven, samtidig med at den kan skylle ud. - Læg knoglerne i et opsamlingsrør indeholdende 100 μL 1x steril PBS (fosfatbufret saltvand) for at isolere det samlede knoglemarv.
- Skyl marven ved centrifugering ved 10.000 x g i 15-20 s ved stuetemperatur. Marvceller pellet i bunden af røret.
- Gentag centrifugering, indtil knoglehulrummet fremstår hvidt og blottet for de fleste marvelementer. Resuspend den blandede population af knoglemarv ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Cellerne fra ét dyr (både lårben og skinneben) dyrkes i en 75 cm2 cellekulturkolbe i 10 ml cellekulturmedier og inkuberes ved 37 °C i en cellekulturinkubator med 5 % CO2. Hvis du samler celler fra 2-3 dyr, skal du bruge en 150 cm2 cellekulturkolbe (anbefales).
- Efter 24-48 timers inkubation af den blandede population aspirerer den ikke-klæbende hæmatopoietiske cellepopulation indeholdt i kulturmediet og vasker de klæbende celler med 1x PBS.
- Cellesåning fra BMSC'er og osteoblastdifferentiering
- Trypsiniser de klæbende celler ved at tilsætte nok 0,25 % trypsin-EDTA (ca. 3-4 ml) til let at dække kolbeoverfladen, efterfulgt af en inkubation på 3 minutter ved 37 °C.
- Der tilsættes 6-7 ml komplet αMEM til kolben/trypsin for at suspendere de klæbende BMSC'er igen ved forsigtigt at pipere op og ned. Overfør BMSC-suspension til et konisk centrifugerør.
- Fjern en 50 μL alikvote af BMSC-suspensionen, og tilsæt 50 μL trypanblå (1:1 fortynding) til den. Tæl det samlede antal levedygtige celler, der udelukker farvestoffet, ved at pipettere 10 μL af denne blanding på et hæmocytometer og observere det under mikroskopet. Tæl ikke døde eller usunde celler, der ser blåfarvede ud (<10% celler).
- På grundlag af celletallet beregnes det volumen af cellesuspension i komplet αMEM, der er nødvendigt for en endelig koncentration på 2,4 x 106 celler/ml for et samlet volumen på mindst 10 ml pr. plade.
Figur 2: Cellekulturmikropladen, specielt designet til analysatoren. (A) De fire baggrundskorrektionsbrønde, A1, A12, H1, H12, fremhæves. Disse brønde indeholder kun analysemedier uden celler. (B) Stregkoden på siden af pladen til scanning af pladen ved hjælp af billedbehandlingslæseren og analysatoren. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Centrifugering af cellerne i det koniske rør ved 1.000 x g i 5 min og resuspendér cellerne til den ønskede endelige koncentration på 2,4 x 106 celler/ml.
- Overfør cellesuspensionen til et reservoir, og brug en flerkanals pipet forsigtigt cellerne til at sikre en homogen blanding af celler.
- Frø 2,5 x 104 celler pr. brønd i mikropladen med 96 brønde cellekultur med 80 μL komplet αMEM. Frøceller i baggrundskorrektionsbrøndene (A1, A12, H1, H12); i stedet skal du blot tilføje mediet i disse fire brønde.
BEMÆRK: BMSC'er til assays er belagt med 96-brønds cellekulturmikroplade designet til analysatoren i forbindelse med sensorpatronerne. Overfladearealet af disse plader er forskelligt fra en almindelig 96-brønds plade. Overfladearealet af hver brønd i pladen er 0,106 cm2, hvilket er ca. 40% af det typiske pladeareal på 96 brønde. Optimal cellesåningstæthed vælges ud fra celletypen. Analysatoren kan typisk detektere mellem 0,5-4 x 104 celler pr. Brønd. Osteoblaster skal være i kontakt for at differentiere effektivt; Til dette formål er der valgt plettering mellem 2,0 x 10 4-3,0 x 104 BMSC'er/brønd i 80 μL komplet αMEM. - Omrør forsigtigt pladen for at sikre en jævn fordeling af celler i brøndene og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2. Kontroller væksten af cellerne og cellesammenløbet under mikroskopet efter 48 timer. Skift cellekulturmediet, hvis det er nødvendigt.
- Afhængigt af målet med assayet, når BMSC'er er 60% -80% sammenflydende (typisk 48-72 timer), initieres osteoblastdifferentiering ved at ændre cellekulturmediet til osteoblastdifferentieringsmedier (komplet αMEM suppleret med 5 mM β-glycerolphosphat og 50 μg / ml L-ascorbinsyre).
- Hvis udifferentierede stromalceller (dag 0) skal analyseres, skal cellerne opretholdes under komplet αMEM.
- Skift osteoblastdifferentieringsmediet hver anden dag og visualiser cellerne under mikroskopet for at sikre, at de er sunde indtil assayets dag. Fortrinsvis 24 timer før det planlagte assay, skift medier og oprethold en konsekvent medium ændringsplan (anbefales).
BEMÆRK: Skift forsigtigt mediet ved let at vippe pladerne i en vinkel; dette undgår utilsigtet kontakt mellem pipettespidser og cellekulturpladerne og forstyrrelse af monolaget af celler.
2. Klargøring af sensorpatron til ekstracellulær fluxkalibrering
- Fugt sensorpatronerne fra det ekstracellulære analysesæt inden assaydagen. Fjern sensorpatronerne (grøn plade), og placer sensorerne på hovedet.
- Brug en flerkanalspipet til at tilsætte 200 μLH20til hver brønd på hjælpepladen. Anbring forsigtigt sensorpatronerne tilbage på værktøjspladen, og inkuber pladen natten over ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Producenten anbefaler at inkubere sensorpatronerne i en inkubator uden CO2 37 °C natten over. Imidlertid kan der forekomme betydelig fordampning af sensorpatronerne. Hvis dette sker, kan sensorpatroner inkuberes ved stuetemperatur. Disse plader skal inkuberes i mindst 4 timer og højst 72 timer. - På assaydagen kasseresH20fra brugspladen og tilsættes 200 μL calibrrant. Inkuber brugspladen i mindst 1 time før analysen.
3. Forberedelse af cellemetaboliske fluxanalysatorer i realtid
- Brug phenolrødfri DMEM-medier med en forudjusteret pH på 7,4 (anbefales) til at køre assayet med BMSC'er.
- Forbered 80 ml assaymedier ved at supplere DMEM-medier med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM glutamin, 10 mM glucose, 200 nM insulin, 50-200 μM oliesyre BSA.
- Inkubere det komplette analysemedie ved 37 °C i et vandbad.
4. Fremstilling af forbindelser til sensorpatronerne
- Optø oligomycin A, rotenon og antimycin A på is. Pipette op og ned for at opløse forbindelserne inden brug.
- Der tilsættes 3 ml fremstillet analysemedium til hvert rør efterfulgt af tilsætning af det respektive forbindelsesrør A: 26,4 μL 2,5 mM oligomycin A; rør B: 3,1 μL 12,67 mM rotenon + 4,1 μL af 9,4 mM antimycin A + 30 μL Hoechst plet.
- Læg en 10x koncentration af disse hæmmere i den tilsvarende port. Den endelige koncentration af nødvendige injektionsopløsninger er 2 μM oligomycin A, 1 μM rotenon og 4,1 μM antimycin A.
BEMÆRK: Hoechst tilsættes til den endelige injektionsport til fluorescerende farvning af kernerne til billeddannelses- og normaliseringsformål. Disse koncentrationer kan optimeres ud fra celletypen. - 20 μL af disse forbindelser indlæses i cellerne i 180 μL assaymedier.
5. Forbered cellekulturmikroplade til assay
- Fjern cellekulturmikropladen fra 37 °C-inkubatoren, og observer cellerne under mikroskopet.
- Fjern analysemediet fra vandbadet.
- Vask forsigtigt cellerne med 200 μL assaymedium to gange, og tilsæt 200 μL analysemedier pr. Brønd.
BEMÆRK: Når det endelige analysemedie er tilføjet til cellerne, er tiden, indtil pladerne kommer ind i analysatoren, afgørende. Begynd derfor ikke at udskifte mediet, før følgende trin udføres inden for 1 time. - Kontroller cellerne under mikroskopet for at sikre, at cellerne forbliver klæbet til brøndene.
- Sørg for, at celler i D5 og E8 klæbes med et konsistent monolag og ikke vaskes væk under vasketrinnet. Cellebilleddannelsessoftware bruger disse to brønde til indstilling af autofokus og autoeksponering.
BEMÆRK: Fabrikanten anbefaler at inkubere pladen i en ikke-CO2 37 °C inkubator i 1 time; dette trin kan springes over, hvis automatiseret billeddannelse foretrækkes. For eksempel opretholder mikropladebilledet de samme betingelser i et lukket kammer, og celler kan afbildes under et lysfelt.
6. Opsætning af assay og billeddannelse
Figur 3: Controllersoftwaren. Softwaren verificerer, at udstyret er tilsluttet, og er indstillet til 37 °C. Skabelonfilerne til forskellige assays, der kan udføres med den ekstracellulære fluxanalysator, kan vælges for at tilpasse analysen yderligere baseret på de eksperimentelle mål. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Åbn desktop-softwaren på computeren ved siden af udstyret.
- Kontroller forbindelsesstatus i nederste venstre hjørne af controllersoftwaren.
- Gå til Skabeloner, og vælg skabelonfilen XF ATP Rate Assay eller den relevante analyseskabelon.
- Vælg Gruppedefinitioner øverst på skærmen, og definer grupperne.
- Vælg pladekortlayoutet, og tildel brøndene afhængigt af de definerede grupper.
- Kontroller instrumentprotokollen, sørg for, at de tilsatte forbindelser er korrekt angivet, og inkluder projektoplysningerne til fremtidige referencer.
- Klik på Kør assay; dette vil bede om valget af resultatfillagringsplaceringen.
- Vælg den placering, hvor resultatfilen skal gemmes.
- Gem filen med datoen for assay, og klik på Start kør.
- Placer sensorpatronen og værktøjspladen på bakken, og klik på Jeg er klar til at starte kalibreringen.
- Før kalibreringen påbegyndes, skal du sørge for, at patronlåget fjernes, og at sensorpatronen er placeret i den korrekte retning på værktøjspladen. Dette trin tager 10-20 minutter, og når det er fuldført, viser softwaren dialogboksen Vejecelleplade .
7. Hent brightfield-billeder
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Hvis der ikke er noget billedbehandlingsudstyr tilgængeligt, skal du gå videre til trin 8.
Figur 4: Cellebilleddannelsessoftwaren kommunikerer til billedlæseren via computeren. Cellerne i mikropladen kan afbildes før og efter analysen, og celletællingen / brønden opnås efter analysen for at normalisere dataene. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Åbn cellebilleddannelsessoftwaren på computeren.
- Sørg for, at mikropladebilledet er tændt, og at portene er sluttet til computeren.
- Kontroller statuslinjen nederst til venstre på skærmen for at sikre, at temperaturen er indstillet til 37 °C, og at forbindelsesstatus skal fremhæves med grønt som klar.
- Scan pladestregkoden for at starte billeddannelsesprocessen.
- Giv et navn til cellepladen, og tryk på Gem (Dette er navnet, hvor både lyse felt og fluorescerende billeder gemmes). Klik på Udfør Brightfield Scan.
- Den næste skærm-, plade- og scanningsmenu viser indstillingerne for billeddannelse. Før analysen skal du vælge Start Brightfield Scan.
- Anbring cellekulturmikropladen sammen med pladedækslet/låget på bakkeholderen, og juster godt A1 med A1-mærket. Klik på Luk bakke.
- Det næste skærmbillede, brightfield image acquisition, med et pladekort vises. Klik på Scan alle brønde, som starter systemintitialiseringsprocessen efterfulgt af 30 til 35 minutter af en scanning.
- Efter lysfeltscanningen skal du fjerne cellekulturmikropladen og placere den i analysatoren for at udføre analysen.
8. Kørsel af assay
- Når kalibreringen er fuldført, viser softwaren dialogboksen Vejecelleplade .
- Klik på Åbn bakke for at udskifte værktøjsbakken med en cellekulturmikroplade. Sørg for, at låget er fjernet, og at pladens A1 passer i den rigtige retning.
- Klik derefter på Vejecelleplade for at starte analysen. Sensorpatronen forbliver inde i analysatoren til analyseinjektionerne.
- Vent, indtil analysen starter, og viser det estimerede færdiggørelsestidspunkt.
- Når analysen er afsluttet, viser softwaren dialogboksen Aflæs sensorpatron . Klik på Skub ud, og fjern cellekulturmikropladen fra analysatoren.
- Fjern forsigtigt sensorpatronen, og udskift låget til cellepladen. Cellerne er klar til fluorescerende billeddannelse og celletælling.
- Når cellepladen og sensorpatronen er fjernet, vises dialogboksen Analyse fuldført .
- Klik på Vis resultater for at åbne analyseresultatfilen og normalisere dataene med det samme, eller klik på Hjem.
9. Få fluorescensbilleder og normalisere
BEMÆRK: Dette trin er en valgfri, men foretrukken metode til normalisering af BMSC'er og osteoblaster. Hvis der ikke er noget billeddannelsesudstyr til rådighed, skal der udføres en anden normaliseringsmetode, såsom protein- eller DNA-isolering og kvantificering.
Figur 5: Repræsentative billeder fra billeddannelsessoftwaren, der anvendes til normalisering af data fra analysen. (A) Syet lyst feltbillede, der viser cellesammenløbet gennem hele brønden. (B) Syet fluorescensbillede, der viser Hoechst-farvede kerner af osteoblaster, der anvendes til at tælle celletal for at normalisere analyseresultaterne. Disse er osteoblaster efter 7 dages differentiering. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Når analysen er afsluttet, skal du scanne pladestregkoden med den håndholdte stregkodelæser. Hvis pladen allerede er afbildet, kræver den ikke et nyt navn.
- Vælg Fluorescens og celleantal, placer cellepladen på bakkeholderen, og klik på Luk bakke.
- I billedoptagelsesvinduet skal du vælge Scan alle brønde for at starte billeddannelsen. Fluorescensbilleddannelse tager ca. 15-20 minutter at scanne hele pladen. Overhold det grønne flueben, der angiver, at scanningen er afsluttet.
- Gennemgå de fluorescerende billeder og celletællinger i billedbehandlings- og cellebilleddannelsesprogrammet ved tilfældigt at klikke på et par af brøndene.
BEMÆRK: Der er mulighed for at se tællede celler nederst til højre på skærmen. Denne indstilling viser et maskeret billede, der fremhæver de objekter, der blev talt. - Når fluorescensbilleddannelsen er afsluttet, skal du eksportere billederne for yderligere referencer.
- Når billeddannelsen og celletællingen er afsluttet, skal du åbne filen Resultater og klikke på Normaliser. Normaliseringsskærmen giver pladelayoutet og en mulighed for at importere celletællingen.
- Klik på Importer , og vælg Anvend på desktop-softwaren for automatisk at normalisere analysen med celletælling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6: Repræsentative grafer for rutinemæssigt udførte assays for at forstå den cellulære bioenergetiske profil af kontrol vs. behandlingsgruppe med deres respektive standardfejl. (A) Celleenergifænotypetesten. Plottet repræsenterer glykolysen (ECAR) vs. mitokondriel respiration (OCR) af kontrollen vs. to behandlingsgrupper (n = 3). Injektionen af oligomycin A- og FCCP-stressorer hæver basisaktiviteten, angivet med åbne symboler, mens lukkede symboler angiver cellernes reaktion på forskellige stressorer. (B) ATP-satsanalysen i realtid. ATP-hastighedsassayet indikerer, at både kontrol- og behandlingsgrupperne (n = 2) producerer mere ATP gennem glykolyse sammenlignet med oxidativ phosphorylering. C) Mito-stresstesten. Mito-stresstesten giver mitokondrie-respirationshastigheden for kontrol vs. behandlingsceller (n = 2) over tid og effekten af hæmmere på cellerne efter deres respektive injektioner. D) Flex-prøvningen af mito fuel flex. Mito fuel flex-testen måler den procentvise oxidation af kontrol- og behandlingsgrupper (n = 2) med hensyn til glucose-, glutamin- og fedtsyreveje og cellernes afhængighed og fleksibilitet af disse mitokondrielle brændstoffer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protokollen beskriver en generaliseret beskrivelse af, hvordan de ekstracellulære fluxassays hjælper med at forstå den cellulære bioenergetik af osteoblaster afledt af murine BMSC'er. Vi har detaljeret beskrevet disse rutinemæssigt udførte assays og vigtige noter, der skal overvejes før, under og efter analysen. De to store ATP-produktionsveje, glykolyse og mitokondriel oxidativ fosforylering, diskuteres bredt for bedre at forstå cellernes evne til at udveksle mellem veje og derved opfylde cellernes energibehov. Når analysen er afsluttet, normaliseres analyseresultaterne baseret på celletællingen og eksporteres til den respektive analyserapportgeneratorfil. Rapportgeneratoren beregner automatisk analyseparametrene og giver en sammenfattende rapport over analysen. Figur 6 illustrerer de repræsentative resultater af rutinemæssigt udførte assays for bedre at forstå, hvordan modne osteoblaster styrer versus behandlingsgrupper reagerer, når forskellige hæmmere injiceres.
Generiske, repræsentative billeder af mulige forventede resultater er vist i figur 6. For eksempel overvåger celleenergifænotypen i figur 6A OCR vs. ECAR ved at beregne cellernes baseline fænotype, stressede fænotype og metaboliske potentiale. Injektionen af oligomycin A- og FCCP-stressorblandingen øger kontrolgruppens baseline-aktivitet (åbne symboler) ved at øge udnyttelsen af begge veje. Som reaktion på stressorerne bemærkes et signifikant højt energiniveau i kontrol- og behandlingsgruppen 1 (lukkede symboler). På den anden side havde behandling 2 en forholdsvis lavere baselineaktivitet, og cellerne blev mere aerobe. Dette assay hjælper med at forstå cellernes bioenergetik som reaktion på forskellige stressorer.
ATP-hastighedsassay i realtid beregner den samlede cellulære ATP-produktionshastighed baseret på summen af glykolytiske og mitokondrielle ATP-produktionshastigheder.
ATP-produktionshastighed (pmol ATP / min) = glycoATP-produktionshastighed (pmol ATP / min) + mitoATP-produktionshastighed (pmol ATP / min).
Figur 6B indikerer, at både kontrol- og behandlingsgrupperne producerer mere ATP gennem glykolyse sammenlignet med oxidativ phosphorylering. Mens behandlingsgruppen udviser signifikant højere total ATP-produktion, har cellerne konsekvent skiftet fra glykolytisk til oxidativ metabolisme. Denne sammenligning af kontrol- og behandlingsgruppen indikerer, at denne specifikke behandling udviser en anden bioenergetisk profil sammenlignet med kontrolgruppen.
Figur 6C er et eksempel på mitokondrie-respirationshastigheden over tid, som er detaljeret. Den basale respirationshastighed i behandlingsgruppen er forholdsvis mindre end i kontrolgruppen. Respirations- og ATP-produktionshastighederne i begge grupper reduceres sammen med protonlækagen efterfulgt af en oligomycin A-injektion. Cellernes respirationshastigheder stiger tilbage igen til deres maksimale åndedræt efter injektionen af FCCP. Den endelige injektion af rotenon/antimycin A reducerer OCR igen, hvilket resulterer i ekstra åndedræt, som måles ved forskellene i maksimal og basal respiration. Efter den tredje injektion lukkes mitokondrieåndedræt af kombinationen af rotenon/antimycin A, som retter sig mod og hæmmer elektrontransportkæden (ETC) kompleks I og III, hvorved vi kan beregne den ikke-mitokondrielle respiration. Sammenlignet med kontrolgruppen er både den basale og maksimale respiration i behandlingsgrupperne relativt lavere; dette tyder på, at behandlingen kan påvirke mitokondrieåndedræt af osteoblaster.
Mito fuel flex testen måler mitokondriernes potentiale til at oxidere de tre forskellige mitokondrielle brændstoffer, glucose, glutamin og fedtsyrer. Cellens afhængighed, fleksibilitet og kapacitet på forskellige veje, der brænder mitokondrieåndedræt, beregnes ud fra oxidationen af det respektive mitokondrielle brændstof. Figur 6D viser, at kontrolgruppen er meget afhængig af glukosevejen. Samtidig forbedrede behandlingen kapaciteten af glukoseoxidation af cellerne til aktivt at imødekomme brændstofbehovene i den hæmmede vej. På den anden side var oxidationen af glutamin effektiv i kontrolgruppen, hvilket resulterede i forholdsvis højere afhængighed af celler end behandlingsgruppens, hvilket øgede kontrolgruppens samlede kapacitet. Fedtsyrevejen viser, at behandlingen har øget cellernes samlede kapacitet på grund af den højere afhængighed af mitokondriebrændstof, samtidig med at brændstofbehovet kompenseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den realtidscelle metaboliske fluxanalysator kan bruges til at udforske cellulære energier under forskellige forhold. Protokollen illustrerer den effektive isolering af BMSC'er, dyrkning af celler i passende cellekulturplader og deres differentiering til modne osteoblaster, som kan bruges til forskellige assays ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator. Desuden forklares de kritiske trin i realtids cellemetabolisk fluxassay, herunder hydrering af sensorpatroner, indlæsning af injektionsportene, udførelse af assay, normalisering af dataene og dataanalyser, også detaljeret. Dette assay evaluerer osteoblasternes reaktion på forskellige mitokondrielle og glykolytiske hæmmere for at forstå cellernes bioenergetik. Denne protokol er optimeret specifikt til osteoblaster baseret på celletypen, og denne metode giver en mere robust og præcis vejledning sammenlignet med producentens standardprotokol. Flere parametre i denne protokol, herunder cellesåningstætheden, koncentrationen af forbindelserne, tilsætning af eksogent substrat til mediet, bufferkapacitet, skal optimeres baseret på den specifikke celletype og dens baggrund.
Den ekstracellulære fluxanalysator giver hurtige og pålidelige målinger af cellulære metaboliske funktioner i ex vivo-dyrkede celler. Sammenlignet med andre biologiske analyser er den samlede analysetid typisk mellem 60 og 120 min. Udstyret opretholder normale cellulære og fysiologiske forhold ved at opretholde den forudindstillede temperatur på 37 °C, hvilket letter effektive og reproducerbare analyseresultater med reduceret kompleksitet. Typisk registreres baseline OCR og ECAR tre til fire gange, før der tilsættes hæmmere. Hæmmerne og behandlingerne injiceres også sekventielt, hvilket letter cellens metaboliske responsmåling over tid. Analysatoren giver forskere mulighed for at opnå standardiserede resultater under optimerede forhold. Analysatoren giver også mulighed for at injicere forskellige forbindelser under analysen for at observere ændringer i realtid i cellernes åndedræt. For eksempel til ATP-hastighedsassay skal du anvende en 2 μM oligomycin A og 1 μM rotenon/1 μM antimycin A-blanding som standardforbindelse injiceret-Port A: 2 μM Oligomycin A; Port B: 1 μM Rotenon/1 μM Antimycin A.
Analysemediet adskiller sig fra de typiske vækstmedier ved nogle få faktorer, herunder fraværet af bicarbonat for bedre at detektere ændringer i pH, fraværet af glucose,glutamin og pyruvattilskud gør det muligt for eksperimentatoren at tilpasse de tilsatte eksogene substrater, og mediet indeholder ikke phenolrødt til præcist at beregne pH-værdierne.
Glucose, L-glutamin og natriumpyruvat er de mest anvendte eksogene substrater. Anvendelsen af disse substrater er specifik for celletype og eksperimentelle spørgsmål. I denne sammenhæng erkendes det, at disse assays, selvom de er værdifulde, udføres ved hjælp af et kunstigt system. For eksempel anbefales det at bruge 10 mM glucose; Dette er dog suprafysiologiske niveauer, og forskere bør overveje, om andre glukosekoncentrationer ville være mere passende. Til dette punkt er det også vigtigt at overveje, om glukoseoptagelsen i BMSC'er og osteoblaster afhænger af insulin, og i så fald bør insulin også tilsættes. Da dette fortsat er et debatemne inden for området31,32, foretrækkes inkluderingen af insulin. På samme måde, hvis fedtsyreudnyttelsen er i forhold til det eksperimentelle spørgsmål, bør assaymediet suppleres yderligere med fedtsyrer. Betydningen af disse eksogene substrater spiller en kritisk rolle i assays og datafortolkning; derfor bør koncentrationerne af disse substrater optimeres baseret på celletype og forskningsspørgsmål.
En af de primære fordele ved den ekstracellulære fluxanalysator er, at det kræver et minimalt antal celler at køre assays, med et højt n givet 96-brøndformatet. Sensorpatronerne gør det også muligt at injicere forskellige hæmmere og forbindelser gennem de fire injektionsporte. Fleksibiliteten til at ændre assayet, til at udføre akutte injektioner med yderligere hæmmere og behandlinger af interesse er en ekstra fordel ved denne teknik. Disse funktioner gør analysatoren i stand til at udføre analyser i realtid med høj gennemstrømning på et minimalt antal celler og dermed foretrække frem for den klassiske Clark-iltelektrodemetode. Selvom elektrodemetoden er billig og enkel til måling af mitokondriel respiration, giver den langt højere baggrundsstøj og har en lavere opløsning end analysatoren24,33.
Derudover kan den cellebioenergetiske profil opnået fra analysatoren i den beskrevne arbejdsgang effektivt normaliseres ved hjælp af mikropladebilledet ved at tælle cellerne i mikropladerne efter analysen34. Antallet af levedygtige celler kan variere fra brønd til godt efter analysen; anvendelse af celletal foretrækkes frem for andre metoder, herunder protein- eller DNA-normalisering, da protein- eller DNA-indholdet i celler ikke forbliver konstant under forskellige betingelser eller behandlinger, som de cellulære energier sammenlignes for. Protein- eller DNA-indholdet kan variere under påvirkning af forskellige behandlinger og er en stor ulempe ved normalisering ved hjælp af denne metode, for eksempel ændres proteinindholdet i osteoblast under differentiering. Efterhånden som cellerne modnes under osteoblastogenese, begynder de at udskille ekstracellulært matrixprotein, hvilket øger det samlede cellulære proteinindhold. Dette kan være problematisk, når man sammenligner analyseresultaterne af celler under forskellige vækstfaser eller tidspunkter for osteoblastogenese.
I betragtning af de mange fordele har analysatoren til overvågning af cellulær bioenergetik været en enorm tilføjelse til at fremme feltet. Der findes dog begrænsninger. For eksempel er en af de største begrænsninger ved disse assays, at de kun kan udføres på cellulært eller organoidniveau, og dataene er ikke tilstrækkelige til at give os en komplet idé om, hvad der ville ske in vivo under forskellige fysiologiske forhold. Som tidligere nævnt er det cellulære miljø, der skabes under assays, også langt fra den oprindelige fysiologiske niche. Det kunstige mikromiljø skabt ved at supplere forskellige næringsstoffer som glucose, pyruvat, glutamin og oliesyre eller palmitinsyre er ofte højere end de normale fysiologiske niveauer af osteoblasterne. Tilsætningen af fedtsyre som et af næringsstofferne til analysen er begrænset, da de fleste af de højere kulstofkædelængde fedtsyrer, der findes i vores krop, er meget hydrofobe og meget uopløselige. Dette resulterer i tekniske vanskeligheder med at tilføje dem til analysemedierne. Cellernes metaboliske reaktion på en enkelt fedtsyre som oliesyre eller palmitinsyre er forskellig under andre fysiologiske forhold, hvor cellerne oplever en cocktail af forskellige fedtsyrer og bindende proteiner. Endelig forbliver målingen af ATP ved hjælp af denne metode, selvom den uden tvivl er bedre end statiske selvlysende assays, indirekte, da denne teknik kun måler ilt. Selvom det ikke er en direkte måling, er det rigtigt, at tilsætningen af ATP-syntasehæmmeren, oligomycin A, efterfulgt af elektrontransportkædehæmmere under måling af OCR giver stærke tegn på ændringer, der forekommer i ATP. Derfor kan teknikker som massespektroskopi bruges til at understøtte disse data. Ikke desto mindre, mens disse begrænsninger bør overvejes nøje, giver dette værktøj uvurderlig information om cellulær bioenergetik.
Endelig bemærkes det, at for at forstå, hvordan de nævnte ændringer i bioenergetik påvirker cellulær funktionalitet, specifikt af BMSC'erne og osteoblasterne, er der behov for komplementære eksperimenter, der skal medtages i vitro-dyrkning efterfulgt af alkalisk fosfatase (ALIP), Von Kossa eller Alizarin-farvning.
Afslutningsvis giver de ovenfor beskrevne metoder grundlag for overvågning af forskellige metaboliske veje i osteoblaster ved anvendelse af realtidscellemetabolisk fluxanalysator. Udførelse af sådanne eksperimenter vil føre til en dybere forståelse af, hvordan cellulær bioenergetik i primære, murine BMSC'er gennem osteoblastdifferentiering kan moduleres for at forbedre skeletrelaterede resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 og National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (til ERR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid | Sigma - Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
| Antimycin A | Sigma - Aldrich | A8674 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
| Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide | Sigma - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 imaging reader | BioTek | N/A | Microplate imager |
| Etomoxir sodium salt hydrate | Sigma - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| Insulin | Sigma - Aldrich | I6634 | |
| Oleic Acid-Albumin from bovine serum | Sigma - Aldrich | O3008 | |
| Oligomycin A - 5 mg | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Rotenone | Sigma - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM Glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM media | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent Technologies | S7800B | Real- Time Metabolic flux analyzer |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution |
| The Cell imaging 1.1.0.11 software | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave software 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
References
- Rodan, G. A.
- Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), 2073 (2020).
- Gao, J., et al. SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress. Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).
- Baron, R. Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast. The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).
- Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells. Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).
- Zanotelli, M. R., et al. Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture. Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).
- Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells. Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).
- Kruse, N. J., Bornstein, P. The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen. Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).
- Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. Intracellular lipid droplets support osteoblast function. Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).
- Sinnott-Armstrong, N., et al. A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density. Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone. Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).
- Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption. Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).
- Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences. The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).
- Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
- Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).
- vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).
- Noel, P., et al. Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).
- Nicholls, D., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research. GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).
- What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech (2018).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- XF cell energy phenotype test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884 (2021).
- Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system. Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
- XF ATP rate assay. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889 (2021).
- XF cell mito stress test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885 (2021).
- XF cell mito fuel flex test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888 (2021).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).
- Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
- Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone. Bone Research. 4, 16004 (2016).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).
