Summary
Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.
Abstract
La formazione ossea da parte degli osteoblasti è un processo essenziale per una corretta acquisizione ossea e il turnover osseo per mantenere l'omeostasi scheletrica e, in definitiva, prevenire la frattura. Nell'interesse sia di ottimizzare la massa ossea di picco che di combattere varie malattie muscoloscheletriche (ad esempio, osteoporosi post-menopausale, anoressia nervosa, diabete mellito di tipo 1 e 2), sono stati fatti sforzi incredibili nel campo della biologia ossea per caratterizzare completamente gli osteoblasti durante tutto il loro processo di differenziazione. Dato il ruolo primario degli osteoblasti maturi per secernere proteine della matrice e vescicole di mineralizzazione, è stato notato che questi processi richiedono un'incredibile quantità di energia cellulare, o adenosina trifosfato (ATP). Lo stato energetico cellulare complessivo è spesso indicato come bioenergetica cellulare e include una serie di reazioni metaboliche che rilevano la disponibilità del substrato a derivare ATP per soddisfare le esigenze cellulari. Pertanto, l'attuale metodo descrive in dettaglio il processo di isolamento delle cellule stromali primarie del midollo osseo murino (BMSC) e il monitoraggio del loro stato bioenergetico utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale in varie fasi della differenziazione degli osteoblasti. È importante sottolineare che questi dati hanno dimostrato che il profilo metabolico cambia drasticamente durante la differenziazione degli osteoblasti. Pertanto, è necessario utilizzare questo tipo di cellula fisiologicamente rilevante per apprezzare appieno come lo stato bioenergetico di una cellula possa regolare la funzione complessiva.
Introduction
La formazione dell'osso da parte dell'osteoblasto è accompagnata da distruzione coordinata o riassorbimento delle ossa da parte degli osteoclasti. L'equilibrio tra formazione ossea osteoblastica e riassorbimento osteoclasto è un processo accoppiato che descrive il turnover osseo o il rimodellamento, che è essenziale per l'omeostasi scheletrica. La disfunzione degli osteoblasti porta a una compromissione della formazione ossea e provoca varie malattie, tra cui l'osteoporosi 1,2,3. La differenziazione ex vivo/in vitro delle cellule staminali stromali del midollo osseo (BMSC) in precursori di osteoblasti e osteoblasti maturi provoca la formazione e la deposizione della matrice ossea mineralizzata nel vaso di coltura nel tempo 4,5,6. Questa formazione ossea da parte dell'osteoblasto richiede una quantità significativa di energia cellulare. In particolare, la sintesi e la secrezione di collagene hanno dimostrato di fare molto affidamento sull'ATP cellulare: i rapporti ADP e, presumibilmente, il traffico e la secrezione di vescicole mineralizzate richiedono ulteriore ATP 7,8,9,10,11. Molti ricercatori hanno dimostrato che il processo di osteoblastogenesi e la funzione degli osteoblasti richiede un adeguato apporto di energia per soddisfare la domanda metabolica di formazione ossea 12,13,14,15,16. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare lo stato bioenergetico delle cellule stromali murine primarie attraverso la differenziazione degli osteoblasti utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale. Queste tecniche aiutano a sviluppare una migliore comprensione dell'omeostasi scheletrica, che può alla fine portare allo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche in grado di migliorare i disturbi scheletrici.
L'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale può essere utilizzato per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) degli osteoblasti vivi, che corrisponde rispettivamente alla produzione di ATP mitocondriale e glicolitico. Fondamentale per questa metodologia è il fatto che uno ione H + per lattato viene rilasciato durante la glicolisi nella conversione del glucosio in lattato, che altera il pH del mezzo riflesso nei valori ECAR. Al contrario, durante il ciclo TCA (acido tricarbossilico), la fosforilazione ossidativa attraverso i mitocondri produce CO2 utilizzando o consumando ossigeno, e quindi il monitoraggio dell'OCR riflette questo processo metabolico. L'analizzatore misura sia l'OCR che l'ECAR nel microambiente extracellulare contemporaneamente e in tempo reale, il che consente un enorme potenziale quando si studia la bioenergetica cellulare 6,17. Inoltre, l'esecuzione di questi test è relativamente semplice e facilmente personalizzabile a seconda dell'obiettivo sperimentale. Tecniche simili sono state impiegate per comprendere ulteriormente la regolazione metabolica delle cellule T del sistema immunitario18,19, l'inizio del cancro e la progressione20, insieme a più altri tipi di cellule che contribuiscono alle sindromi metaboliche21,22.
I vantaggi dell'analizzatore di flusso metabolico in tempo reale rispetto alle tecniche alternative includono (1) la capacità di misurare la bioenergetica cellulare delle cellule vive in tempo reale, (2) la capacità di eseguire test con un numero relativamente piccolo di cellule (richiede un minimo di 5.000 cellule), (3) porte di iniezione per manipolare parallelamente più trattamenti in un sistema ad alto rendimento a 96 pozzetti, (4) l'uso di imager di cellule automatizzate prive di etichette radioattive per la normalizzazione18, 23,24. I seguenti metodi mirano a fornire una descrizione generalizzata ma dettagliata del monitoraggio della bioenergetica cellulare nelle BMSC murine durante la differenziazione degli osteoblasti utilizzando l'analizzatore. Includerà saggi eseguiti di routine; tuttavia, come per molte tecniche e metodi, è altamente incoraggiato che i singoli laboratori determinino dettagli specifici per i loro esperimenti.
Selezione di saggi e diversi tipi di saggi disponibili: È disponibile un'ampia varietà di kit di analisi e reagenti per studiare la bioenergetica delle cellule, garantendo al contempo l'affidabilità e la coerenza dei risultati sperimentali. Inoltre, il software desktop offre anche modelli di analisi che possono essere facilmente personalizzati. Il test può essere definito in base alle esigenze dell'utente di misurare diversi parametri metabolici. Questi saggi possono essere modificati in vari modi in base all'obiettivo sperimentale e/o alla domanda scientifica. Ad esempio, con quattro porte di iniezione, è possibile iniettare più composti nel mezzo di analisi per analizzare la risposta cellulare specifica per ciascuna via metabolica.
Test del fenotipo dell'energia cellulare: Questo test misura il fenotipo metabolico e il potenziale metabolico delle cellule vive. Questo test è anche raccomandato come primo passo per avere un'idea generalizzata del metabolismo specifico del percorso. Una miscela di oligomicina A-an inibitore di ATP sintasi e Carbonil cianuro 4-(trifluorometoossi) fenilidrazone (FCCP) - un agente di disaccoppiamento mitocondriale viene iniettato per comprendere il potenziale energetico cellulare. L'iniezione di oligomicina A inibisce la sintesi di ATP, con conseguente aumento del tasso di glicolisi (ECAR) per consentire alle cellule di soddisfare le loro richieste energetiche; d'altra parte, l'iniezione di FCCP si traduce in un OCR più elevato a causa della depolarizzazione della membrana mitocondriale. Essenzialmente, questo test raffigura la respirazione metabolica basale e, a seguito delle doppie iniezioni, spinte o stress, la risposta metabolica. Sulla base di questi parametri, il software traccia quindi OCR ed ECAR delle cellule classificando le cellule come stato aerobico, quiescente, glicolitico o energetico nel tempo25,26.
Saggio del tasso di produzione in tempo reale ATP: Questo misura la produzione cellulare di ATP contemporaneamente dalla glicolisi e dalla respirazione mitocondriale. Questo test misura quantitativamente i cambiamenti metabolici dalle due vie energetiche e fornisce dati sui tassi di produzione di ATP mitocondriale e glicolitico nel tempo. Il test ottiene dati basali OCR ed ECAR seguiti dal calcolo del tasso di produzione di ATP mitocondriale attraverso l'iniezione di oligomicina A e il tasso di produzione di ATP glicolitico attraverso l'iniezione di rotenone + antimicina A miscela (inibizione totale della funzione mitocondriale), con conseguente acidificazione mitocondriale17,27.
Test da sforzo dei mitocondri cellulari (o test da sforzo mito cellulare): Questo misura la funzione mitocondriale attraverso la respirazione legata all'ATP, quantifica la bioenergetica cellulare, identifica la disfunzione mitocondriale e misura la risposta delle cellule allo stress. Vari parametri, tra cui la capacità respiratoria basale e di riserva, la respirazione legata all'ATP, la respirazione massima e il consumo di ossigeno non mitocondriale, possono essere ottenuti in un unico test. Questo test prevede iniezioni sequenziali di oligomicina A, FCCP (agente di disaccoppiamento mitocondriale), una miscela di inibitori del rotenone/antimicina A per analizzare in modo efficiente l'effetto di questi sulla funzione mitocondriale28.
Flessibilità mito fuel flex test: Questo misura il tasso di respirazione mitocondriale dall'ossidazione dei tre combustibili mitocondriali primari dalla presenza e dall'assenza dei loro inibitori. L'inibizione sequenziale di glucosio, glutammina e acidi grassi aiuta a misurare la dipendenza, la capacità e la flessibilità delle cellule e la dipendenza delle cellule in vari percorsi cellulari per soddisfare la domanda di energia. Quando i mitocondri non possono soddisfare le richieste del percorso bloccato di interesse ossidando altri combustibili, le cellule entrano in uno stato di dipendenza. La capacità delle cellule è calcolata dall'inibizione delle altre due vie alternative seguite dall'inibizione della via di interesse. La flessibilità delle cellule aiuta a comprendere la capacità dei mitocondri di compensare e soddisfare il fabbisogno di carburante della via inibita. Viene calcolato sottraendo la dipendenza delle cellule dalla capacità delle celle. Tre diversi inibitori vengono utilizzati indipendentemente o come miscela di due per calcolare efficacemente i parametri del saggio. L'acido 2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico (UK5099) inibisce l'ossidazione del glucosio bloccando il vettore piruvato nella glicolisi. Bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES) solfuro di etile inibisce la via di ossidazione della glutammina ed etomoxir inibisce l'ossidazione degli acidi grassi a catena lunga29.
Figura 1: Rappresentazione schematica della metodologia per la coltivazione e la preparazione degli osteoblasti per l'analisi. I BMSC murini sono isolati dalle ossa lunghe, coltivati e seminati in piastre a 96 pozzetti a 25.000 cellule / densità del pozzo. La coltura di queste cellule in mezzi specifici per osteoblasti viene avviata quando raggiungono l'80% -100% di confluenza per iniziare la loro differenziazione. I saggi vengono eseguiti in diverse fasi di differenziazione. Le piastre della cartuccia vengono idratate un giorno prima del test. Il giorno del test, diversi inibitori vengono iniettati nelle porte delle cartucce del sensore in base ai requisiti del test e un buffer di calibrazione viene aggiunto alla piastra di calibrazione a 96 pozzetti. Dopo la calibrazione, viene eseguito il test del flusso metabolico cellulare in tempo reale, seguito dall'imaging della micropiastra di coltura cellulare utilizzando l'imager a micropiastre per normalizzare i dati dell'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale con il conteggio cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutte le procedure si basavano sulle linee guida e sull'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il centro medico della Vanderbilt University.
1. Preparazione dei reagenti e impostazione del saggio
- Isolamento e coltivazione di cellule stromali del midollo osseo (vedi anche il precedente articolo30).
- Preparare terreni di coltura cellulare alfa minimi essenziali (αMEM) completi integrando i mezzi essenziali minimi con alfa modifica con il 10% di FBS (siero bovino fetale), 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina.
- Preparare il tubo di raccolta del midollo osseo tagliando l'estremità di un tubo microcentrifuga da 0,6 mL in modo che le cellule possano passare attraverso e inserendolo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 100 μL di αMEM completo.
- Eutanasia dei topi utilizzando il trattamento con CO2 come segue. Posizionare l'animale nella camera CO2 per 2-3 minuti o fino a quando la respirazione cessa. Attendere almeno 1 minuto dopo che l'animale diventa incosciente per rimuovere i topi dalla camera e dislocare cervicalmente.
- Usando una pinza sterile e un paio di forbici, apri l'addome inferiore dei topi eutanasizzati per fare una piccola incisione. Isolare le ossa lunghe (femore, tibia e cresta iliaca) dei topi.
- Tagliare le ossa lunghe per rimuovere tutti i tessuti molli. Una volta pulito l'osso, tagliare ~ 1-2 mm dalle estremità distale e prossimale per creare un'apertura per il midollo da lavare.
NOTA: questa apertura deve essere conservativa per evitare di perdere il midollo mentre gli consente di scovare. - Posizionare le ossa in un tubo di raccolta contenente 100 μL di 1x PBS sterile (soluzione salina tamponata con fosfato) per isolare il midollo osseo totale.
- Lavare il midollo mediante centrifugazione a 10.000 x g per 15-20 s a temperatura ambiente. Le cellule del midollo pellet nella parte inferiore del tubo.
- Ripetere la centrifugazione fino a quando la cavità ossea appare bianca e priva della maggior parte degli elementi del midollo. Risospesciare la popolazione mista di midollo osseo tubando delicatamente su e giù.
- Coltivare le cellule di un animale (sia femore che tibia) in un matraccio di coltura cellulare da 75 cm2 in 10 ml di terreno di coltura cellulare e incubare a 37 °C in un incubatore di colture cellulari con il 5% di CO2. Se si raggruppano cellule di 2-3 animali, utilizzare un pallone da coltura a2 cellule da 150 cm (consigliato).
- Dopo 24-48 ore di incubazione della popolazione mista, aspirare la popolazione cellulare ematopoietica non aderente contenuta all'interno del terreno di coltura e lavare le cellule aderenti con 1x PBS.
- Semina cellulare da BMSC e differenziamento degli osteoblasti
- Tripsinizzare le cellule aderenti aggiungendo abbastanza 0,25% di tripsina-EDTA (circa 3-4 ml) per coprire leggermente la superficie del pallone, seguita da un'incubazione di 3 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 6-7 mL di αMEM completo al matraccio/tripsina per risospescere i BMSC aderenti mediante pipettaggio accurato su e giù. Trasferire la sospensione BMSC in un tubo centrifugo conico.
- Rimuovere un'aliquota di 50 μL della sospensione BMSC e aggiungere 50 μL di tripano blu (diluizione 1:1). Contare il numero totale di cellule vitali che escludono il colorante pipettando 10 μL di questa miscela su un emocitometro e osservandolo al microscopio. Non contare le cellule morte o malsane che appaiono di colore blu (<10% delle cellule).
- In base al conteggio cellulare, calcolare il volume di sospensione cellulare in αMEM completo necessario per una concentrazione finale di 2,4 x 106 celle/ml per un volume totale di almeno 10 ml per piastra.
Figura 2: La micropiastra di coltura cellulare, specificamente progettata per l'analizzatore. (A) I quattro pozzetti di correzione dello sfondo, A1, A12, H1, H12, sono evidenziati. Questi pozzetti contengono solo mezzi di analisi senza cellule. (B) Il codice a barre sul lato della piastra per scansionare la piastra utilizzando il lettore di immagini e l'analizzatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Centrifugare le cellule nel tubo conico a 1.000 x g per 5 minuti e risospese le cellule alla concentrazione finale desiderata di 2,4 x 106 celle / mL.
- Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio e, utilizzando un pipetto multicanale, risospese accuratamente le celle per garantire una miscela omogenea di cellule.
- Semina 2,5 x 104 cellule per pozzetto nella micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti con 80 μL di αMEM completo. Non seminare cellule nei pozzetti di correzione dello sfondo (A1, A12, H1, H12); invece, basta aggiungere il mezzo in questi quattro pozzi.
NOTA: i BMSC per i saggi sono placcati in micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti progettata per l'analizzatore in combinazione con le cartucce del sensore. La superficie di queste piastre è diversa da una normale piastra a 96 pozzetti. La superficie di ciascun pozzetto nella piastra è di 0,106 cm2, che è circa il 40% della tipica area della piastra a 96 pozzetti. La densità di semina cellulare ottimale viene scelta in base al tipo di cellula. In genere, l'analizzatore è in grado di rilevare tra 0,5-4 x 104 celle per pozzetto. Gli osteoblasti devono essere in contatto per differenziarsi efficacemente; a tale scopo è stata selezionata una placcatura compresa tra 2,0 x 10 4-3,0 x 104 BMSC/pozzetto in 80 μL di αMEM completo. - Agitare delicatamente la piastra per garantire la distribuzione uniforme delle cellule nei pozzetti e incubare a 37 °C, 5% CO2. Controllare la crescita delle cellule e la confluenza cellulare al microscopio dopo 48 ore. Modificare il supporto di coltura cellulare, se necessario.
- A seconda dell'obiettivo del test, quando le BMSC sono confluenti al 60%-80% (in genere 48-72 h), iniziare la differenziazione degli osteoblasti cambiando il terreno di coltura cellulare in mezzo di differenziazione degli osteoblasti (αMEM completo integrato con 5 mM di β-glicerolo fosfato e 50 μg / mL di acido L-ascorbico).
- Se le cellule stromali indifferenziate (Giorno 0) devono essere analizzate, mantenere le cellule sotto αMEM completo.
- Cambia i mezzi di differenziazione degli osteoblasti a giorni alterni e visualizza le cellule al microscopio per assicurarti che siano sane fino al giorno del test. Preferibilmente, 24 ore prima del test programmato, cambiare il supporto e mantenere un programma di cambio del mezzo coerente (raccomandato).
NOTA: cambiare con attenzione il supporto inclinando leggermente le piastre ad angolo; questo evita il contatto accidentale delle punte delle pipette alle piastre di coltura cellulare e l'interruzione del monostrato delle cellule.
2. Preparazione della cartuccia del sensore per la calibrazione del flusso extracellulare
- Idratare le cartucce del sensore dal kit di analisi extracellulare prima del giorno del test. Rimuovere le cartucce del sensore (piastra verde) e posizionare i sensori a testa in giù.
- Utilizzando un pipetto multicanale, aggiungere 200 μL di H2O a ciascun pozzetto della piastra di utilità. Riposizionare con attenzione le cartucce del sensore sulla piastra di servizio e incubare la piastra durante la notte a temperatura ambiente.
NOTA: il produttore consiglia di incubare le cartucce del sensore in un incubatore non CO2 a 37 °C durante la notte. Tuttavia, può verificarsi un'evaporazione significativa delle cartucce del sensore. In questo caso, le cartucce del sensore possono essere incubate a temperatura ambiente. Queste piastre devono essere incubate per un minimo di 4 ore e un massimo di 72 ore. - Il giorno del test, scartare l'H2O dalla piastra di utilità e aggiungere 200 μL di calibrante. Incubare la piastra di servizio per almeno 1 ora prima del test.
3. Preparazione del fluido dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale
- Utilizzare il supporto DMEM privo di fenolo rosso con un pH pre-regolato di 7,4 (consigliato) per eseguire il test con BMSC.
- Preparare 80 mL di mezzi di saggio integrando i mezzi DMEM con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di glutammina, 10 mM di glucosio, 200 nM di insulina, 50-200 μM di acido oleico BSA.
- Incubare il mezzo di saggio completo a 37 °C a bagnomaria.
4. Preparazione dei composti per le cartucce del sensore
- Scongelare oligomicina A, rotenone e antimicina A sul ghiaccio. Pipettare su e giù per solubilizzare i composti prima dell'uso.
- Aggiungere 3 mL di mezzo di saggio preparato a ciascun tubo, seguito dall'aggiunta del rispettivo tubo composto A: 26,4 μL di 2,5 mM di oligomicina A; tubo B: 3,1 μL di 12,67 mM rotenone + 4,1 μL di 9,4 mM antimicina A + 30 μL di colorazione Hoechst.
- Caricare una concentrazione 10x di questi inibitori nella porta corrispondente. La concentrazione finale di soluzioni iniettabili necessarie è di 2 μM di oligomicina A, 1 μM di rotenone e 4,1 μM di antimicina A.
NOTA: Hoechst viene aggiunto alla porta di iniezione finale per la colorazione fluorescente dei nuclei per scopi di imaging e normalizzazione. Queste concentrazioni possono essere ottimizzate in base al tipo di cellula. - Caricare 20 μL di questi composti nelle cellule in 180 μL di mezzi di saggio.
5. Preparare la micropiastra di coltura cellulare per il test
- Rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'incubatore a 37 °C e osservare le cellule al microscopio.
- Rimuovere il mezzo di analisi dal bagno d'acqua.
- Lavare delicatamente le cellule con 200 μL di mezzo di saggio due volte e aggiungere 200 μL di mezzo di saggio per pozzetto.
NOTA: Una volta aggiunto il mezzo di analisi finale alle celle, il tempo fino a quando le piastre non entrano nell'analizzatore è cruciale. Pertanto, non iniziare a sostituire il supporto fino a quando i seguenti passaggi non vengono eseguiti entro 1 ora. - Controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che le cellule rimangano aderenti ai pozzetti.
- Assicurarsi che le celle in D5 ed E8 siano aderenti con un monostrato coerente e non siano state lavate via durante la fase di lavaggio. Il software di imaging cellulare utilizza questi due pozzetti per impostare l'autofocus e l'autoesposizione.
NOTA: il produttore consiglia di incubare la piastra in un incubatore non CO2 a 37 °C per 1 ora; questo passaggio può essere saltato se si preferisce l'imaging automatico. Ad esempio, l'imager a micropiastra mantiene le stesse condizioni in una camera chiusa e le celle possono essere riprese sotto un campo luminoso.
6. Impostazione del test e dell'imaging
Figura 3: Il software del controller. Il software verifica che l'apparecchiatura sia collegata e sia impostata su 37 °C. I file modello per diversi saggi che possono essere eseguiti con l'analizzatore di flusso extracellulare possono essere selezionati per personalizzare ulteriormente il test in base agli obiettivi sperimentali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Aprire il software desktop nel computer accanto all'apparecchiatura.
- Controllare lo stato della connessione nell'angolo inferiore sinistro del software del controller.
- Vai a Modelli e seleziona il file modello XF ATP Rate Assay o il modello di test appropriato.
- Selezionare Definizioni di gruppo nella parte superiore dello schermo e definire i gruppi.
- Selezionare il layout della mappa delle piastre e assegnare i pozzetti in base ai gruppi definiti.
- Verificare il protocollo dello strumento, assicurarsi che i composti aggiunti siano elencati correttamente e includere le informazioni sul progetto per i riferimenti futuri.
- Fare clic su Esegui test; questo richiederà la selezione del percorso di archiviazione del file dei risultati.
- Selezionare il percorso in cui salvare il file dei risultati.
- Salvare il file con la data del test e fare clic su Avvia esecuzione.
- Posizionare la cartuccia del sensore e la piastra di utilità sul vassoio e fare clic su Sono pronto per avviare la calibrazione.
- Prima di iniziare la calibrazione, assicurarsi che il coperchio della cartuccia sia rimosso e che la cartuccia del sensore sia posizionata nell'orientamento corretto sulla piastra di utilità. Questo passaggio richiederà 10-20 minuti e, una volta completato, il software visualizzerà la finestra di dialogo Load Cell Plate .
7. Ottieni immagini in campo luminoso
NOTA: questo passaggio è facoltativo. Se non è disponibile alcuna apparecchiatura di imaging, andare al passaggio 8.
Figura 4: Il software di imaging cellulare comunica con il lettore di immagini attraverso il computer. Le cellule nella micropiastra possono essere fotografate prima e dopo il test e il conteggio / pozzo cellulare viene ottenuto dopo il test per normalizzare i dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Aprire il software di imaging cellulare sul computer.
- Assicurarsi che l'imager micropiastra sia acceso e che le porte siano collegate al computer.
- Controllare la barra di stato in basso a sinistra dello schermo per assicurarsi che la temperatura sia impostata su 37 °C e che lo stato della connessione sia evidenziato in verde come pronto.
- Eseguire la scansione del codice a barre della piastra per avviare il processo di imaging.
- Fornisci un nome alla piastra cellulare e premi Salva (questo è il nome in cui verranno salvate sia le immagini a campo luminoso che quelle fluorescenti). Fare clic su Esegui scansione Brightfield.
- La schermata successiva, la piastra e il menu di scansione mostrano le opzioni per l'imaging. Prima del test, selezionare Avvia scansione Brightfield.
- Posizionare la micropiastra di coltura cellulare insieme al coperchio/coperchio della piastra sul supporto del vassoio e allineare bene A1 con il marchio A1. Fare clic su Chiudi vassoio.
- Viene visualizzata la schermata successiva, l'acquisizione di immagini in campo luminoso, con una mappa delle lastre. Fare clic su Scan All Wells, che avvia il processo di inizializzazione del sistema seguito da 30-35 minuti di scansione.
- Dopo la scansione a campo luminoso, rimuovere la micropiastra di coltura cellulare e posizionarla nell'analizzatore per eseguire il test.
8. Esecuzione del test
- Una volta completata la calibrazione, il software visualizza la finestra di dialogo Piastra cella di carico .
- Fare clic su Apri vassoio per sostituire il vassoio di utilità con una micropiastra di coltura cellulare. Assicurarsi che il coperchio venga rimosso e che l'A1 della piastra si adatti all'orientamento corretto.
- Quindi, fare clic su Load Cell Plate per avviare il test. La cartuccia del sensore rimarrà all'interno dell'analizzatore per le iniezioni del saggio.
- Attendere l'inizio del test e visualizzare il tempo stimato di completamento.
- Al termine del test, il software visualizza la finestra di dialogo Scarica cartuccia sensore . Fare clic su Espellere e rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'analizzatore.
- Rimuovere con attenzione la cartuccia del sensore e sostituire il coperchio della piastra cellulare. Le cellule sono pronte per l'imaging fluorescente e il conteggio delle cellule.
- Dopo aver rimosso la piastra cellulare e la cartuccia del sensore, viene visualizzata la finestra di dialogo Analisi completa .
- Fare clic su Visualizza risultati per aprire il file dei risultati del test e normalizzare immediatamente i dati o fare clic su Home.
9. Ottenere immagini di fluorescenza e normalizzare
NOTA: Questo passaggio è un metodo opzionale ma preferito per la normalizzazione di BMSC e osteoblasti. Se non sono disponibili apparecchiature di imaging, è necessario eseguire un altro metodo di normalizzazione, come l'isolamento e la quantificazione di proteine o DNA.
Figura 5: Immagini rappresentative del software di imaging utilizzato per la normalizzazione dei dati dal test. (A) Immagine a campo luminoso cucito che mostra la confluenza cellulare in tutto il pozzo. (B) Immagine di fluorescenza cucita che mostra nuclei di osteoblasti colorati di Hoechst utilizzati per contare i numeri di cellule per normalizzare i risultati del test. Questi sono osteoblasti dopo 7 giorni di differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Dopo il completamento del test, eseguire la scansione del codice a barre della piastra con il lettore di codici a barre portatile. Se la targa è già stata fotografata, non richiederà un nuovo nome.
- Selezionare Fluorescenza e conteggio celle, posizionare la piastra cellulare sul supporto del vassoio e fare clic su Chiudi vassoio.
- Nella finestra di acquisizione delle immagini, selezionare Scansiona tutti i pozzetti per iniziare l'imaging. L'imaging a fluorescenza richiede circa 15-20 minuti per scansionare l'intera piastra. Osservare il segno di spunta verde che indica che la scansione è stata completata.
- Esamina le immagini fluorescenti e i conteggi cellulari nell'applicazione di imaging e imaging cellulare facendo clic in modo casuale su un paio di pozzetti.
NOTA: è disponibile un'opzione per visualizzare le celle contate in basso a destra dello schermo. Questa opzione mostra un'immagine mascherata, evidenziando gli oggetti che sono stati contati. - Una volta completata l'imaging a fluorescenza, esportare le immagini per ulteriori riferimenti.
- Una volta completata l'imaging e il conteggio delle celle, apri il file dei risultati e fai clic su Normalizza. La schermata di normalizzazione fornirà il layout della piastra e un'opzione per importare il conteggio delle celle.
- Fare clic su Importa e selezionare Applica per il software desktop per normalizzare automaticamente il test con il conteggio delle celle.
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Representative Results
Figura 6: Grafici rappresentativi per i saggi eseguiti di routine per comprendere il profilo bioenergetico cellulare del gruppo di controllo rispetto al gruppo di trattamento con i rispettivi errori standard. (A) Il test del fenotipo dell'energia cellulare. Il grafico rappresenta la glicolisi (ECAR) vs. respirazione mitocondriale (OCR) del controllo rispetto a due gruppi di trattamento (n = 3). L'iniezione di oligomicina A e fattori di stress FCCP eleva l'attività basale, indicata da simboli aperti, mentre i simboli chiusi indicano la risposta delle cellule a diversi fattori di stress. (B) Il test della velocità ATP in tempo reale. Il test della velocità di ATP indica che sia i gruppi di controllo che quelli di trattamento (n = 2) producono più ATP attraverso la glicolisi rispetto alla fosforilazione ossidativa. C) La prova da sforzo mito. Il test da sforzo mito fornisce il tasso di controllo della respirazione mitocondriale rispetto alle cellule di trattamento (n = 2) nel tempo e l'effetto degli inibitori sulle cellule dopo le rispettive iniezioni. (D) La prova di flessione del combustibile mito. Il test di flessione del combustibile mito misura la percentuale di ossidazione dei gruppi di controllo e trattamento (n = 2) rispetto alle vie del glucosio, della glutammina e degli acidi grassi e la dipendenza e la flessibilità delle cellule da questi combustibili mitocondriali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il protocollo descrive una descrizione generalizzata di come i saggi di flusso extracellulare aiutano a comprendere la bioenergetica cellulare degli osteoblasti derivati da BMSC murine. Abbiamo dettagliato questi test eseguiti di routine e note importanti da considerare prima, durante e dopo il test. Le due principali vie di produzione di ATP, la glicolisi e la fosforilazione ossidativa mitocondriale, sono ampiamente discusse per comprendere meglio la capacità delle cellule di scambiarsi tra le vie, soddisfacendo così le richieste energetiche delle cellule. Una volta completato il test, i risultati del test vengono normalizzati in base al conteggio delle cellule ed esportati nel rispettivo file del generatore del rapporto di analisi. Il generatore di report calcola automaticamente i parametri del test e fornisce un rapporto di riepilogo del test. La Figura 6 illustra i risultati rappresentativi dei test eseguiti di routine per comprendere meglio come reagiscono il controllo degli osteoblasti maturi rispetto ai gruppi di trattamento quando vengono iniettati diversi inibitori.
Immagini generiche e rappresentative dei possibili risultati attesi sono mostrate nella Figura 6. Ad esempio, nella Figura 6A, il fenotipo dell'energia cellulare monitora l'OCR rispetto all'ECAR calcolando il fenotipo basale delle cellule, il fenotipo stressato e il potenziale metabolico. L'iniezione del mix di fattori di stress oligomicina A e FCCP aumenta l'attività basale del gruppo di controllo (simboli aperti) aumentando l'utilizzo di entrambe le vie. In risposta ai fattori di stress, si nota un livello di energia significativamente elevato nel gruppo di controllo e trattamento 1 (simboli chiusi). D'altra parte, il trattamento 2 aveva un'attività basale relativamente più bassa e le cellule diventavano più aerobiche. Questo test aiuta a comprendere la bioenergetica delle cellule in risposta a diversi fattori di stress.
Il test della velocità di ATP in tempo reale calcola il tasso di produzione totale di ATP cellulare in base alla somma dei tassi di produzione di ATP glicolitico e mitocondriale.
Tasso di produzione di ATP (pmol ATP/min) = tasso di produzione glicoATP (pmol ATP/min) + tasso di produzione mitoATP (pmol ATP/min).
La Figura 6B indica che sia il gruppo di controllo che quello di trattamento producono più ATP attraverso la glicolisi rispetto a quella della fosforilazione ossidativa. Mentre il gruppo di trattamento mostra una produzione totale di ATP significativamente più elevata, le cellule sono costantemente passate dal metabolismo glicolitico a quello ossidativo. Questo confronto tra il gruppo di controllo e il gruppo di trattamento indica che questo specifico trattamento presenta un profilo bioenergetico diverso rispetto al gruppo di controllo.
La Figura 6C è un esempio del tasso di respirazione mitocondriale nel tempo, che è dettagliato. La frequenza respiratoria basale nel gruppo di trattamento è relativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo. I tassi di produzione di respirazione e ATP in entrambi i gruppi sono diminuiti insieme alla perdita di protoni seguita da un'iniezione di oligomicina A. I tassi di respirazione delle cellule risalgono di nuovo alla loro respirazione massima dopo l'iniezione di FCCP. L'iniezione finale di rotenone/antimicina A diminuisce nuovamente l'OCR, con conseguente respirazione di riserva, che viene misurata dalle differenze nella respirazione massima e basale. Dopo la terza iniezione, la respirazione mitocondriale viene interrotta dalla combinazione di rotenone/antimicina A, che prende di mira e inibisce il complesso I e III della catena di trasporto degli elettroni (ETC), permettendoci così di calcolare la respirazione non mitocondriale. Rispetto al gruppo di controllo, sia la respirazione basale che quella massima nei gruppi di trattamento sono relativamente più basse; questo suggerisce che il trattamento potrebbe influenzare la respirazione mitocondriale degli osteoblasti.
Il test di flessione del carburante mito misura il potenziale dei mitocondri di ossidare i tre diversi combustibili mitocondriali, glucosio, glutammina e acidi grassi. La dipendenza, la flessibilità e la capacità della cellula da diversi percorsi che alimentano la respirazione mitocondriale sono calcolate in base all'ossidazione del rispettivo combustibile mitocondriale. La Figura 6D mostra che il gruppo di controllo è altamente dipendente dalla via del glucosio. Allo stesso tempo, il trattamento ha migliorato la capacità di ossidazione del glucosio delle cellule di soddisfare attivamente il fabbisogno di carburante della via inibita. D'altra parte, l'ossidazione della glutammina era efficiente nel gruppo di controllo, con conseguente dipendenza relativamente più elevata delle cellule da quella del gruppo di trattamento, aumentando così la capacità complessiva del gruppo di controllo. La via degli acidi grassi mostra che il trattamento ha aumentato la capacità complessiva delle cellule a causa della maggiore dipendenza dal combustibile mitocondriale mentre compensa il fabbisogno di carburante.
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Discussion
L'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale può essere utilizzato per esplorare l'energetica cellulare in diverse condizioni. Il protocollo illustra l'isolamento efficiente delle BMSC, la coltura delle cellule in piastre di coltura cellulare appropriate e la loro differenziazione in osteoblasti maturi, che possono essere utilizzati per vari saggi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Inoltre, vengono spiegate in dettaglio anche le fasi critiche del test del flusso metabolico cellulare in tempo reale, tra cui l'idratazione delle cartucce del sensore, il caricamento delle porte di iniezione, l'esecuzione del test, la normalizzazione dei dati e le analisi dei dati. Questo test valuta la risposta degli osteoblasti a diversi inibitori mitocondriali e glicolitici per comprendere la bioenergetica delle cellule. Questo protocollo è ottimizzato specificamente per gli osteoblasti in base al tipo di cellula e questo metodo offre una guida più robusta e precisa rispetto al protocollo standard del produttore. Diversi parametri in questo protocollo, tra cui la densità di semina cellulare, la concentrazione dei composti, l'aggiunta di substrato esogeno al mezzo, la capacità tampone, devono essere ottimizzati in base al tipo di cellula specifico e al suo background.
L'analizzatore di flusso extracellulare fornisce misure rapide e affidabili delle funzioni metaboliche cellulari in cellule coltivate ex vivo . Rispetto ad altri saggi biologici, il tempo totale del test è in genere compreso tra 60 e 120 minuti. L'apparecchiatura mantiene le normali condizioni cellulari e fisiologiche mantenendo la temperatura preimpostata di 37 °C, facilitando risultati di analisi efficienti e riproducibili con complessità ridotte. In genere, l'OCR e l'ECAR al basale vengono registrati da tre a quattro volte prima di aggiungere inibitori. Gli inibitori e i trattamenti vengono anche iniettati sequenzialmente, facilitando la misurazione della risposta metabolica della cellula nel tempo. L'analizzatore consente ai ricercatori di ottenere risultati standardizzati in condizioni ottimizzate. L'analizzatore offre anche la possibilità di iniettare diversi composti durante il test per osservare i cambiamenti in tempo reale nella respirazione delle cellule. Ad esempio, per il test della velocità dell'ATP, utilizzare una miscela di oligomicina A da 2 μM e rotenone/1 μM di antimicina A come composto predefinito iniettato-Porta A: 2 μM Oligomicina A; Porta B: 1 μM Rotenone/1 μM Antimicina A.
Il mezzo di analisi è diverso dai tipici mezzi di crescita per alcuni fattori, tra cui l'assenza di bicarbonato per rilevare meglio i cambiamenti nel pH, l'assenza di integratori di glucosio, glutammina e piruvato consente allo sperimentatore di personalizzare i substrati esogeni aggiunti e il mezzo non contiene rosso fenolo per calcolare con precisione i valori di pH.
Glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio sono i substrati esogeni più utilizzati. L'uso di questi substrati è specifico per il tipo di cellula e le domande sperimentali. In questo contesto, si riconosce che questi saggi, sebbene preziosi, vengono eseguiti utilizzando un sistema artificiale. Ad esempio, si consiglia di utilizzare 10 mM di glucosio; tuttavia, si tratta di livelli soprafisiologici e i ricercatori dovrebbero considerare se altre concentrazioni di glucosio sarebbero più appropriate. A questo punto, è anche essenziale considerare se l'assorbimento di glucosio nelle BMSC e negli osteoblasti dipende dall'insulina e, in tal caso, dovrebbe essere aggiunta anche l'insulina. Poiché questo rimane un argomento di dibattito all'interno del campo31,32, è preferibile l'inclusione dell'insulina. Sulla stessa linea, se l'utilizzo di acidi grassi è relativo alla domanda sperimentale, i mezzi di saggio dovrebbero essere ulteriormente integrati con acidi grassi. L'importanza di questi substrati esogeni gioca un ruolo fondamentale nei saggi e nell'interpretazione dei dati; pertanto, le concentrazioni di questi substrati dovrebbero essere ottimizzate in base al tipo di cellula e alla domanda di ricerca.
Uno dei principali vantaggi dell'analizzatore di flusso extracellulare è che richiede un numero minimo di cellule per eseguire i test, con un alto n dato il formato a 96 pozzetti. Le cartucce del sensore consentono inoltre di iniettare diversi inibitori e composti attraverso le quattro porte di iniezione. La flessibilità di modificare il test, di eseguire iniezioni acute con inibitori aggiuntivi e trattamenti di interesse è un ulteriore vantaggio di questa tecnica. Queste caratteristiche rendono l'analizzatore in grado di eseguire saggi in tempo reale ad alta produttività su un numero minimo di celle e quindi preferibile rispetto al classico metodo dell'elettrodo di ossigeno clark. Sebbene il metodo dell'elettrodo sia economico e semplice per misurare la respirazione mitocondriale, fornisce un rumore di fondo molto più elevato e ha una risoluzione inferiore rispetto all'analizzatore24,33.
Inoltre, nel flusso di lavoro descritto, il profilo bioenergetico cellulare ottenuto dall'analizzatore può essere normalizzato in modo efficiente utilizzando l'imager a micropiastre contando le cellule nelle micropiastre dopo il test34. Il numero di cellule vitali può variare da bene a pozzo dopo il test; l'uso della conta cellulare è preferibile rispetto ad altri metodi, tra cui la normalizzazione delle proteine o del DNA poiché il contenuto proteico o di DNA delle cellule non rimane costante in diverse condizioni o trattamenti per i quali vengono confrontati gli energetici cellulari. Il contenuto di proteine o DNA può variare sotto l'influenza di diversi trattamenti ed è un grave svantaggio della normalizzazione utilizzando questo metodo, ad esempio, il contenuto proteico degli osteoblasti cambia durante la differenziazione. Man mano che le cellule maturano durante l'osteoblastogenesi, iniziano a secernere proteine della matrice extracellulare aumentando il contenuto totale di proteine cellulari. Questo può essere problematico quando si confrontano i risultati del test delle cellule in diverse fasi di crescita o punti temporali dell'osteoblastogenesi.
Data la moltitudine di vantaggi, l'analizzatore per monitorare la bioenergetica cellulare è stato un'enorme aggiunta all'avanzamento del campo. Tuttavia, esistono limitazioni. Ad esempio, uno dei principali limiti di questi saggi è che possono essere eseguiti solo a livello cellulare o organoide e i dati non sono sufficienti per fornirci un'idea completa di ciò che accadrebbe in vivo in diverse condizioni fisiologiche. Come accennato in precedenza, l'ambiente cellulare creato durante i test è anche lontano dalla nicchia fisiologica originale. Il microambiente artificiale creato integrando diversi nutrienti come glucosio, piruvato, glutammina e acido oleico o palmitico sono spesso superiori ai normali livelli fisiologici degli osteoblasti. L'aggiunta di acido grasso come uno dei nutrienti per il test è limitata, poiché la maggior parte degli acidi grassi di lunghezza della catena di carbonio più elevata presenti nel nostro corpo sono molto idrofobici e altamente insolubili. Ciò si traduce in difficoltà tecniche nell'aggiungerli ai supporti di analisi. La risposta metabolica delle cellule a un singolo acido grasso come l'acido oleico o palmitico è diversa in altre condizioni fisiologiche, in cui le cellule sperimentano un cocktail di vari acidi grassi e proteine leganti. Infine, la misurazione dell'ATP utilizzando questo metodo, sebbene probabilmente superiore ai saggi luminescenti statici, rimane indiretta in quanto questa tecnica misura solo l'ossigeno. Sebbene non sia una misurazione diretta, è vero che l'aggiunta dell'inibitore dell'ATP sintasi, oligomicina A, seguita da inibitori della catena di trasporto degli elettroni durante la misurazione dell'OCR fornisce una forte evidenza dei cambiamenti che si verificano nell'ATP. Pertanto, tecniche come la spettroscopia di massa possono essere utilizzate per supportare questi dati. Tuttavia, mentre queste limitazioni dovrebbero essere attentamente considerate, questo strumento fornisce informazioni preziose sulla bioenergetica cellulare.
Infine, si nota che per comprendere come le suddette alterazioni in bioenergetica influenzino la funzionalità cellulare, in particolare delle BMSC e degli osteoblasti, sono necessari esperimenti complementari da coltivazione in vitro seguita da colorazione alcalina fosfatasi (ALIP), Von Kossa o Alizarina.
In conclusione, i metodi sopra descritti forniscono la base per il monitoraggio di varie vie metaboliche negli osteoblasti utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale. L'esecuzione di tali esperimenti porterà a una comprensione più profonda di come la bioenergetica cellulare nelle BMSC primarie murine durante la differenziazione degli osteoblasti possa essere modulata per migliorare i risultati correlati allo scheletro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 e National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (a ERR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid | Sigma - Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
| Antimycin A | Sigma - Aldrich | A8674 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
| Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide | Sigma - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 imaging reader | BioTek | N/A | Microplate imager |
| Etomoxir sodium salt hydrate | Sigma - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| Insulin | Sigma - Aldrich | I6634 | |
| Oleic Acid-Albumin from bovine serum | Sigma - Aldrich | O3008 | |
| Oligomycin A - 5 mg | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Rotenone | Sigma - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM Glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM media | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent Technologies | S7800B | Real- Time Metabolic flux analyzer |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution |
| The Cell imaging 1.1.0.11 software | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave software 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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