Summary
リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。
Abstract
骨芽細胞による骨形成は、骨格の恒常性を維持し、最終的には骨折を防ぐために、適切な骨獲得と骨代謝回転に不可欠なプロセスです。ピーク骨量を最適化し、様々な筋骨格疾患(すなわち、閉経後骨粗鬆症、神経性食欲不振、1型および2型真性糖尿病)と戦うために、骨生物学の分野では、骨芽細胞の分化プロセス全体にわたって完全に特徴付けるための信じられないほどの努力がなされてきた。マトリックスタンパク質および石灰化小胞を分泌する成熟骨芽細胞の主な役割を考えると、これらのプロセスは信じられないほどの量の細胞エネルギー、またはアデノシン三リン酸(ATP)を必要とすることが注目されている。全体的な細胞エネルギー状態は、しばしば細胞生体エネルギー学と呼ばれ、細胞のニーズを満たすためにATPを導出するための基質の利用可能性を感知する一連の代謝反応を含む。したがって、現在の方法は、初代マウス骨髄間質細胞(BMSC)を単離し、骨芽細胞分化の様々な段階でリアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用してそれらの生体エネルギー状態を監視するプロセスを詳述する。重要なことに、これらのデータは、代謝プロファイルが骨芽細胞分化を通して劇的に変化することを実証した。したがって、この生理学的に関連する細胞型を使用することは、細胞の生体エネルギー状態が全体的な機能を調節する方法を十分に理解するために必要である。
Introduction
骨芽細胞による骨の形成は、破骨細胞による骨の協調的な破壊または再吸収を伴う。骨芽球性骨形成と破骨細胞再吸収との間のバランスは、骨格恒常性維持に不可欠な骨代謝回転またはリモデリングを記述する結合プロセスである。骨芽細胞機能障害は、骨形成の障害をもたらし、骨粗鬆症を含む様々な疾患をもたらす1,2,3。骨髄間質幹細胞(BMSC)から骨芽細胞前駆体および成熟骨芽細胞へのエクスビボ/インビトロ分化は、経時的に培養容器内の石灰化骨マトリックスの形成および沈着をもたらす4,5,6。骨芽細胞によるこの骨形成は、かなりの量の細胞エネルギーを必要とする。具体的には、コラーゲン合成および分泌は、細胞ATP:ADP比に大きく依存することが示されており、おそらく、石灰化小胞の輸送および分泌は、追加のATP7、8、9、10、11を必要とする。多くの研究者は、骨芽細胞形成および骨芽細胞機能のプロセスが、骨形成の代謝需要を満たすために十分なエネルギー供給を必要とすることを実証している12,13,14,15,16。したがって、この方法の目標は、リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を用いて骨芽細胞分化全体を通して初代マウス間質細胞の生体エネルギー状態を特徴付けることである。これらの技術は、骨格恒常性の理解を深めるのに役立ち、最終的には骨格障害を改善することができる新規な治療選択肢の開発につながる可能性がある。
リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置は、それぞれミトコンドリアおよび解糖系ATP産生に対応する生骨芽細胞の酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化速度(ECAR)を測定するために使用することができる。この方法論の基本的なことは、グルコースから乳酸への変換において解糖系中に乳酸塩あたり1つのH+イオンが放出され、ECAR値に反映された媒体pHを変化させるという事実である。逆に、TCA(トリカルボン酸)サイクルの間、ミトコンドリアを介した酸化的リン酸化は、酸素を利用または消費することによってCO2を生成するため、OCRのモニタリングはこの代謝プロセスを反映している。このアナライザは、細胞外微小環境におけるOCRとECARの両方を同時にリアルタイムで測定するため、細胞の生体エネルギーを研究する際に大きな可能性を秘めています6,17。さらに、これらのアッセイの実行は比較的簡単で、実験目標に応じて簡単にカスタマイズできます。同様の技術が、免疫系18、19、癌開始、および進行20のT細胞代謝調節を、メタボリックシンドローム21、22に寄与する複数の他の細胞型とともにさらに理解するために採用されている。
代替技術に対するリアルタイム代謝フラックス分析装置の利点には、(1)生細胞の細胞生体エネルギーをリアルタイムで測定する能力、(2)比較的少数の細胞でアッセイを行う能力(5,000細胞という低い細胞が必要)、(3)ハイスループット96ウェルシステムで複数の治療を並行して操作する注入ポート、(4)正規化のための放射性ラベルフリー自動細胞イメージャの使用18、23,24。以下の方法は、分析装置を用いた骨芽細胞分化全体を通してマウスBMSCにおける細胞生体エネルギー学のモニタリングに関する一般化されたが詳細な説明を提供することを目的としている。これには、日常的に行われるアッセイが含まれます。ただし、多くの手法や方法と同様に、個々のラボが実験の具体的な詳細を決定することを強くお勧めします。
アッセイの選択と利用可能なさまざまな種類のアッセイ:実験結果の信頼性と一貫性を確保しながら、細胞の生体エネルギー学を研究するために、多種多様なアッセイキットと試薬が利用可能です。さらに、デスクトップソフトウェアは、簡単にカスタマイズできるアッセイテンプレートも提供します。アッセイは、異なる代謝パラメータを測定するユーザのニーズに基づいて定義することができる。これらのアッセイは、実験目標および/または科学的質問に基づいて様々な方法で修正することができる。例えば、4つの注入ポートを用いて、複数の化合物をアッセイ培地に注入して、各代謝経路に特異的な細胞応答を分析することができる。
細胞エネルギー表現型試験:このアッセイは、生細胞の代謝表現型および代謝能を測定する。このアッセイは、経路特異的代謝の一般化されたアイデアを得るための第一歩としても推奨されます。ATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンA-と、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)-の混合物を注入し、細胞エネルギーポテンシャルを理解する。オリゴマイシンAの注射は、ATPの合成を阻害し、細胞がエネルギー需要を満たすことを可能にする解糖系(ECAR)の割合を増加させる。一方、FCCPの注射は、ミトコンドリア膜の脱分極のためにより高いOCRをもたらす。本質的に、このアッセイは、基礎代謝呼吸、および二重注射、プッシュ、またはストレスに続く代謝応答を描写する。これらのパラメータに基づいて、ソフトウェアは、細胞を経時的に好気的、静止状態、解糖系、またはエネルギー状態として分類することによって、細胞のOCRおよびECARをプロットする25,26。
ATPリアルタイム生産速度アッセイ: これは、解糖系およびミトコンドリア呼吸からの細胞ATP産生を同時に測定する。このアッセイは、2つのエネルギー経路からの代謝シフトを定量的に測定し、経時的なミトコンドリアおよび解糖系ATP産生速度に関するデータを提供する。アッセイは、基礎OCRおよびECARデータを取得し、続いて、オリゴマイシンAの注射によるミトコンドリアATP産生速度およびロテノン+アンチマイシンA混合物の注射による解糖系ATP産生速度(ミトコンドリア機能の総阻害)を計算し、ミトコンドリア酸性化をもたらす17、27。
細胞ミトコンドリアストレス試験(または細胞ミトストレス試験):これは、ATP結合呼吸を介してミトコンドリア機能を測定し、細胞の生体エネルギー学を定量化し、ミトコンドリア機能不全を同定し、ストレスに対する細胞の応答を測定する。基礎呼吸能力および予備呼吸能力、ATP結合呼吸、最大呼吸、および非ミトコンドリア酸素消費を含む様々なパラメータを、1つのアッセイで得ることができる。このアッセイは、オリゴマイシンA、FCCP(ミトコンドリア脱共役剤)、ロテノン/アンチマイシンA阻害剤の混合物の逐次注射を含み、ミトコンドリア機能に対するこれらの影響を効率的に分析する28。
柔軟性水戸燃料フレックステスト: これは、それらの阻害剤の有無による3つの主要なミトコンドリア燃料の酸化によるミトコンドリア呼吸数を測定する。グルコース、グルタミン、および脂肪酸の逐次阻害は、エネルギー需要を満たすために、細胞の依存性、容量、および柔軟性、ならびに様々な細胞経路における細胞の依存性を測定するのに役立つ。ミトコンドリアが他の燃料を酸化することによって目的の経路の遮断された要求を満たすことができないとき、細胞は依存状態に入る。細胞の容量は、他の2つの代替経路の阻害とそれに続く目的の経路の阻害によって計算される。細胞の柔軟性は、ミトコンドリアが阻害された経路の燃料ニーズを補償し、満たす能力を理解するのに役立ちます。これは、細胞の容量から細胞の依存性を差し引くことによって計算されます。3つの異なる阻害剤を独立して、または2つの混合物として使用して、アッセイパラメータを効果的に計算する。2-シアノ-3-(1-フェニル-1H-インドール-3-イル)-2-プロペン酸(UK5099)は、解糖系中のピルビン酸担体を遮断することによってグルコースの酸化を阻害する。ビス−2−(5−フェニルアセトアミド−1,3,4−チアジアゾール−2−イル)(BPTES)エチルスルフィドはグルタミン酸化経路を阻害し、エトモキシルは長鎖脂肪酸の酸化を阻害する29。
図1:分析のために骨芽細胞を培養および調製するための方法論の概略図。 マウスBMSCは長骨から単離され、培養され、25,000細胞/ウェル密度で96ウェルプレートに播種される。これらの細胞を骨芽細胞特異的培地中で培養することは、それらが80%〜100%コンフルエントに達したときに開始され、それらの分化を開始する。アッセイは、分化の異なる段階で行われる。カートリッジプレートをアッセイの1日前に水和させる。アッセイ当日、アッセイ要件に基づいて異なる阻害剤をセンサーカートリッジのポートに注入し、校正バッファーを96ウェル校正プレートに添加します。較正後、リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイが行われ、続いてマイクロプレートイメージャを用いて細胞培養マイクロプレートを画像化することにより、リアルタイム細胞代謝フラックス分析計データを細胞数で正規化する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
すべての手順は、ヴァンダービルト大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインと承認に基づいていました。
1. 試薬の調製とアッセイのセットアップ
- 骨髄間質細胞の単離および培養(前項30も参照)。
- 10%FBS(ウシ胎児血清)、100 U/mLのペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンでアルファ修飾で最小必須培地を補充することにより、完全なアルファ最小必須培地(αMEM)細胞培養培地を調製する。
- 細胞が通過できるように0.6 mLの微量遠心管の端をトリミングし、100 μLの完全なαMEMを含む1.5 mLの微量遠心管に挿入して骨髄採取管を準備します。
- 以下のようにCO2 処理を用いてマウスを安楽死させる。動物をCO2チャンバーに2〜 3分間、または呼吸が止まるまで置く。動物が意識不明になってから少なくとも1分間待って、マウスをチャンバーから取り出し、子宮頸部脱臼させる。
- 滅菌鉗子および一対のはさみを用いて、安楽死させたマウスの下腹部を切り開き、小さな切開を行う。マウスの長骨(大腿骨、脛骨、および腸骨頂部)を単離する。
- すべての軟部組織を除去するために長骨をトリミングします。骨がきれいになったら、遠位端と近位端から約1〜2mm切り取って、骨髄が洗い流すための開口部を作ります。
注:この開口部は、骨髄が洗い流されるのを許しながら骨髄を失うのを避けるために、控えめにする必要があります。 - 100 μLの1x滅菌PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を含む収集チューブに骨を入れて、骨髄全体を単離する。
- 室温で15〜20秒間、10,000 x g で遠心分離することによって骨髄を洗い流す。骨髄細胞ペレットをチューブの底に。
- 骨腔が白く見え、ほとんどの骨髄要素がなくなるまで遠心分離を繰り返します。骨髄の混合集団を上下に穏やかにピペッティングすることによって再懸濁する。
- 1匹の動物(大腿骨および脛骨の両方)由来の細胞を10mLの細胞培養培地中の75cm2細胞培養フラスコ中で培養し、5%CO2を有する細胞培養インキュベーター中で37°Cでインキュベートした。2〜3匹の動物由来の細胞をプールする場合は、150cm2細胞培養フラスコ(推奨)を使用する。
- 混合集団の24〜48時間のインキュベーションに続いて、培養培地内に含まれる非付着性造血細胞集団を吸引し、付着細胞を1x PBSで洗浄する。
- BMSCからの細胞播種と骨芽細胞分化
- フラスコ表面をわずかに覆うのに十分な0.25%トリプシン-EDTA(約3-4mL)を加えて付着細胞をトリプシン処理し、続いて37°Cで3分間インキュベートした。
- フラスコ/トリプシンに6~7mLの完全なαMEMを加え、注意深く上下にピペッティングすることにより、付着したBMSCを再懸濁させる。BMSC懸濁液を円錐遠心管に移す。
- BMSC懸濁液の50μLアリコートを除去し、それに50μLのトリパンブルー(1:1希釈)を加える。この混合物を血球計数器に10 μLピペッティングし、顕微鏡下で観察することによって、色素を除外した生細胞の総数をカウントする。青色に見える死んだ細胞や不健康な細胞(<10%の細胞)を数えないでください。
- 細胞数に基づいて、プレートあたり少なくとも10mLの総容量に対して、最終濃度2.4 x106 細胞/mLに必要な完全なαMEM中の細胞懸濁液の体積を計算します。
図2:分析装置用に特別に設計された細胞培養マイクロプレート 。(A)4つのバックグラウンド補正ウェルA1、A12、H1、H12が強調表示されています。これらのウェルには、細胞を含まないアッセイ培地のみが含まれています。(B)プレートの側面にあるバーコードを、イメージングリーダーおよびアナライザーを使用してプレートをスキャンする。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 円錐管内の細胞を1,000 x g で5分間遠心分離し、細胞を所望の最終濃度2.4 x106 細胞/mLに再懸濁する。
- 細胞懸濁液をリザーバに移し、マルチチャネルピペットを使用して、細胞の均一な混合物を確実にするために細胞を慎重に再懸濁する。
- 80 μLの完全αMEMを有する96ウェル細胞培養マイクロプレートに1ウェルあたり2.5 x104 個の細胞をシードする。バックグラウンド補正ウェル(A1、A12、H1、H12)に細胞を播種しないでください。代わりに、これらの4つのウェルに培地を追加するだけです。
注: アッセイ用の BMSC は、センサーカートリッジと組み合わせて分析装置用に設計された 96 ウェル細胞培養マイクロプレートにプレートされます。これらのプレートの表面積は、通常の96ウェルプレートとは異なります。プレート内の各ウェルの表面積は0.106cm2であり、これは典型的な96ウェルプレート面積の約40%である。最適な細胞播種密度は、細胞型に基づいて選択される。典型的には、分析器は、ウェル当たり0.5〜4 x104個の細胞を検出することができる。骨芽細胞は効果的に区別するために接触する必要があります。この目的のために、80 μLの完全αMEM中の2.0 x 10 4-3.0 x 104 BMSC/ウェル間のめっきが選択されています。 - プレートを穏やかに攪拌してウェル内の細胞の均一な分布を確保し、37°C、5%CO2でインキュベートする。48時間後に顕微鏡下で細胞の成長および細胞コンフルエンシーを確認する。必要に応じて細胞培養培地を交換してください。
- アッセイの目的に応じて、BMSCが60%〜80%コンフルエント(典型的には48〜72時間)である場合、細胞培養培地を骨芽細胞分化培地(5mM βグリセロールリン酸および50μg/mLのL-アスコルビン酸を添加した完全なαMEM)に変更することによって骨芽細胞分化を開始する。
- 未分化間質細胞(Day 0)を解析する場合は、細胞を完全なαMEMの下に維持します。
- 骨芽細胞分化培地を1日おきに交換し、顕微鏡下で細胞を視覚化して、アッセイの日まで細胞が健康であることを確認します。好ましくは、スケジュールされたアッセイの24時間前に、培地を変更し、一貫した培地変更スケジュール(推奨)を維持する。
メモ: プレートを斜めに少し傾けて、メディアを慎重に交換してください。これにより、ピペットチップが細胞培養プレートに誤って接触し、細胞の単層の破壊が回避されます。
2. 細胞外フラックス校正用センサカートリッジの作製
- アッセイの日の前に細胞外アッセイキットからセンサーカートリッジを水和させる。センサーカートリッジ(緑色のプレート)を取り外し、センサーを裏返して置きます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、ユーティリティプレートの各ウェルに200μLのH2Oを加える。センサーカートリッジをユーティリティプレートに慎重に置き、プレートを室温で一晩インキュベートします。
注:メーカーは、センサーカートリッジを非CO2 37°Cインキュベーターで一晩インキュベートすることをお勧めします。ただし、センサーカートリッジの著しい蒸発が発生する可能性があります。この場合、センサーカートリッジを室温でインキュベートすることができます。これらのプレートは、最小4時間、最大72時間インキュベートする必要があります。 - アッセイの日に、ユーティリティプレートからH2Oを捨て、200μLのキャリバートを加える。ユーティリティプレートをアッセイ前に少なくとも1時間インキュベートする。
3. リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置培地調製
- フェノールレッドを含まない DMEM 培地を 7.4 (推奨) の事前調整済み pH で使用し、BMSC でアッセイを実行します。
- DMEM培地に1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mMグルタミン、10 mMグルコース、200 nMインスリン、50-200 μMオレイン酸BSAを補充して、80 mLのアッセイ培地を調製します。
- 完全なアッセイ培地をウォーターバス中で37°Cでインキュベートする。
4. センサカートリッジ用コンパウンドの調製
- 氷上でオリゴマイシンA、ロテノン、およびアンチマイシンAを解凍する。使用前にピペットを上下にして化合物を可溶化します。
- 調製したアッセイ培地3 mLを各チューブに加え、続いて、それぞれの化合物チューブA:26.4 μLの2.5 mMオリゴマイシンAを添加し;チューブB:3.1 μLの12.67 mMロテノン+ 4.1 μLの9.4 mMアンチマイシンA + 30 μLのヘキスト染色。
- これらのインヒビターの 10 倍の濃度を対応するポートにロードします。必要な注射液の最終濃度は、2μMのオリゴマイシンA、1μMのロテノン、および4.1μMのアンチマイシンAである。
注:ヘキストは、イメージングおよび正規化の目的で核を蛍光染色するために最終注入口に添加される。これらの濃度は、細胞型に基づいて最適化することができる。 - これらの化合物 20 μL を 180 μL のアッセイ培地で細胞にロードします。
アッセイ用の細胞培養マイクロプレートの調製
- 細胞培養用マイクロプレートを37°Cの培養器から取り出し、顕微鏡下で細胞を観察した。
- アッセイ培地を水浴から除去する。
- 200 μL のアッセイ培地で細胞を 2 回穏やかに洗浄し、1 ウェルあたり 200 μL のアッセイ培地を加えます。
注: 最終的なアッセイ培地が細胞に添加されると、プレートが分析装置に入るまでの時間は非常に重要です。したがって、次の手順が 1 時間以内に実行されるまで、メディアの交換を開始しないでください。 - 顕微鏡下で細胞をチェックして、細胞がウェルに接着したままであることを確認します。
- D5およびE8の細胞が一貫した単分子膜で接着され、洗浄ステップ中に洗い流されなかったことを確認する。細胞イメージングソフトウェアは、オートフォーカスと自動露出を設定するためにこれら2つのウェルを使用します。
注:製造業者は、プレートを非CO2 37°Cインキュベーターで1時間インキュベートすることをお勧めします。自動イメージングが望ましい場合は、この手順をスキップできます。例えば、マイクロプレートイメージャは、密閉チャンバ内で同じ条件を維持し、細胞を明視野下で画像化することができる。
6. アッセイとイメージングのセットアップ
図3:コントローラソフトウェアソフトウェアは、機器が接続され、37°Cに設定されていることを確認します。 細胞外フラックス分析装置を用いて実施することができる異なるアッセイのためのテンプレートファイルを選択して、実験目標に基づいてアッセイをさらにカスタマイズすることができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 機器の横にあるコンピューターでデスクトップソフトウェアを開きます。
- コントローラソフトウェアの左下隅にある接続ステータスを確認します。
- テンプレートに移動し、XF ATP レートアッセイテンプレートファイルまたは適切なアッセイテンプレートを選択します。
- 画面上部の [ グループ定義 ] を選択し、グループを定義します。
- プレートマップレイアウトを選択し、定義されたグループに応じてウェルを割り当てます。
- 機器のプロトコルを確認し、添加した化合物が正しくリストされていることを確認し、将来の参照のためにプロジェクト情報を含めます。
- [アッセイの実行]をクリックします。これにより、結果ファイルの保存場所の選択が促されます。
- 結果ファイルを保存する場所を選択します。
- アッセイの日付を含むファイルを保存し、[ 実行の開始]をクリックします。
- センサーカートリッジとユーティリティプレートをトレイに置き、[ 準備完了 ]をクリックしてキャリブレーションを開始します。
- キャリブレーションを開始する前に、カートリッジの蓋が取り外され、センサーカートリッジがユーティリティプレート上の正しい向きに置かれていることを確認します。この手順には10〜20分かかり、完了すると、ソフトウェアは ロードセルプレート ダイアログボックスを表示します。
7.明視野画像を取得する
メモ: この手順はオプションです。使用可能なイメージング機器がない場合は、手順 8 に進んでください。
図4:細胞イメージングソフトウェアは、コンピュータを介してイメージングリーダーと通信します。 マイクロプレート内の細胞はアッセイの前後に画像化することができ、アッセイ後に細胞数/ウェルを取得してデータを正規化することができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- コンピュータ上の細胞イメージングソフトウェアを開きます。
- マイクロプレートイメージャの電源が入っていて、ポートがコンピュータに接続されていることを確認します。
- 画面左下のステータスバーをチェックして、温度が37°Cに設定されていること、および接続ステータスが緑色で[準備完了]として強調表示されていることを確認します。
- プレートのバーコードをスキャンして、イメージングプロセスを開始します。
- セルプレートに名前を入力し、[保存]をクリックします(これは、明視野と蛍光画像の両方が 保存 される名前です)。[ 明視野スキャンの実行]をクリックします。
- 次の画面、プレート、およびスキャン メニューには、イメージングのオプションが表示されます。アッセイの前に、[ 明視野スキャンの開始] を選択します。
- 細胞培養マイクロプレートをプレートカバー/蓋とともにトレイホルダーに置き、A1をA1マークに合わせます。 [トレイを閉じる]をクリックします。
- 次の画面には、明視野画像取得、プレートマップが表示されます。[ すべてのウェルをスキャン]をクリックすると、システムの初期化プロセスが開始され、その後に30〜35分のスキャンが開始されます。
- 明視野スキャンの後、細胞培養マイクロプレートを取り出し、分析装置に入れてアッセイを行う。
8. アッセイの実行
- キャリブレーションが完了すると、ソフトウェアは ロードセルプレート ダイアログボックスを表示します。
- [トレイ を開く ]をクリックして、ユーティリティトレイを細胞培養マイクロプレートに置き換えます。蓋が取り外され、プレートの A1 が正しい向きに収まっていることを確認します。
- 次に、 ロードセルプレート をクリックしてアッセイを開始します。センサーカートリッジは、アッセイ注射のために分析装置の内部に残ります。
- アッセイが開始され、推定完了時間が表示されるまで待ちます。
- アッセイが完了すると、ソフトウェアはセンサー カートリッジのアンロード ダイアログボックスを表示します。 「取り出し 」をクリックし、細胞培養マイクロプレートを分析装置から取り外します。
- センサーカートリッジを慎重に取り外し、セルプレートの蓋を取り付けます。細胞は蛍光イメージングと細胞計数の準備が整いました。
- セルプレートとセンサーカートリッジを取り外すと、「 アッセイ完了」 ダイアログボックスが表示されます。
- [結果 の表示 ]をクリックしてアッセイ結果ファイルを開き、データをすぐに正規化するか、[ ホーム]をクリックします。
9. 蛍光画像を取得して正規化する
注:このステップは、BMSCおよび骨芽細胞の正常化のための任意であるが推奨される方法である。利用可能なイメージング機器がない場合は、タンパク質やDNAの単離や定量など、別の正規化方法を使用する必要があります。
図5:アッセイからのデータの正規化に使用される画像化ソフトウェアからの代表的な画像。(b)アッセイ結果を正規化するために細胞数を計数するために使用した骨芽細胞のヘキスト染色核を示すステッチ蛍光画像。これらは分化の7日後の骨芽細胞である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- アッセイ終了後、ハンドヘルドバーコードリーダーでプレートバーコードをスキャンします。プレートが既にイメージ化されている場合は、新しい名前は必要ありません。
- 蛍光と細胞数を選択し、トレイホルダーにセルプレートを置き、「トレイを閉じる」をクリックします。
- 画像取得ウィンドウで、[ すべてのウェルをスキャン ]を選択してイメージングを開始します。蛍光イメージングは、プレート全体をスキャンするのに約15〜20分かかります。スキャンが完了したことを示す緑色の目盛りを確認します。
- イメージングおよび細胞イメージングアプリケーションで蛍光画像と細胞数を確認するには、いくつかのウェルをランダムにクリックします。
メモ: 画面の右下にカウントされたセルを表示するオプションがあります。このオプションは、マスクされた画像を表示し、カウントされたオブジェクトを強調表示します。 - 蛍光イメージングが完了したら、追加の参照用に画像をエクスポートします。
- イメージングと細胞数が完了したら、 結果 ファイルを開き、[ 正規化]をクリックします。正規化画面には、プレートレイアウトとセル数をインポートするオプションが表示されます。
- インポートをクリックし、デスクトップソフトウェアの適用を選択して、アッセイを細胞数で自動的に正規化します。
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Representative Results
図6:対照対処置群の細胞生体エネルギープロファイルをそれらのそれぞれの標準誤差とともに理解するために日常的に実施されるアッセイのための代表的なグラフ。プロットは、対照対2つの治療群(n = 3)の解糖系(ECAR)対ミトコンドリア呼吸(OCR)を表す。オリゴマイシンAおよびFCCPストレッサーの注射は、オープンシンボルによって示されるベースライン活性を上昇させるが、クローズドシンボルは、異なるストレッサーに対する細胞の応答を示す。(b)リアルタイムATP率アッセイ。ATP率アッセイは、対照群および処置群(n=2)の両方が、酸化的リン酸化と比較して解糖系を介してより多くのATPを産生することを示す。(C)水乙ストレステスト。ミトストレス試験は、対照細胞対治療細胞のミトコンドリア呼吸数(n = 2)を経時的に提供し、それぞれの注射後の細胞に対する阻害剤の効果を提供する。(D)水戸燃料フレックス試験。水戸燃料フレックス試験は、グルコース、グルタミン、および脂肪酸経路に対する対照群および処理群の酸化率(n = 2)、ならびにこれらのミトコンドリア燃料に対する細胞の依存性および柔軟性を測定する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
このプロトコルは、細胞外フラックスアッセイがマウスBMSCに由来する骨芽細胞の細胞生体エネルギー学の理解にどのように役立つかについての一般化された説明を記述している。我々は、これらの日常的に実施されたアッセイと、アッセイの前、最中、および後に考慮すべき重要な注意事項を詳述した。解糖系およびミトコンドリア酸化的リン酸化型の2つの主要なATP産生経路は、細胞が経路間で交換する能力をよりよく理解し、それによって細胞のエネルギー需要を満たすために広く議論されている。アッセイが完了すると、アッセイ結果は細胞数に基づいて正規化され、それぞれのアッセイレポートジェネレータファイルにエクスポートされます。レポートジェネレータは、アッセイパラメータを自動的に計算し、アッセイの要約レポートを提供します。 図6 は、異なる阻害剤が注射された場合に成熟骨芽細胞対照群対治療群がどのように反応するかをよりよく理解するために、日常的に実施されるアッセイの代表的な結果を示す。
期待される可能性のある結果の一般的な代表的な画像を 図6に示す。例えば、 図6Aでは、細胞エネルギー表現型は、細胞のベースライン表現型、ストレス表現型、および代謝電位を計算することによって、OCR対ECARを監視する。オリゴマイシンAおよびFCCPストレッサーミックスの注射は、両方の経路の利用率を増加させることによって、対照群のベースライン活性(オープンシンボル)を増加させる。ストレッサーに応答して、対照および処置1群(閉記号)において有意に高いエネルギー準位が注目される。一方、治療2はベースライン活性が比較的低く、細胞はより好気的になった。このアッセイは、異なるストレッサーに応答して細胞の生体エネルギー学を理解するのに役立ちます。
リアルタイムATP速度アッセイは、解糖系およびミトコンドリアATP産生速度の合計に基づいて全細胞ATP産生速度を計算する。
ATP 生産速度 (pmol ATP/分) = 糖 ATP 生産速度 (pmol ATP/分) + マイト ATP 生産速度 (pmol ATP/分)。
図6B は、対照群および処理群の両方が、酸化的リン酸化のそれと比較して解糖系を介してより多くのATPを産生することを示す。治療群は有意に高い総ATP産生を示すが、細胞は一貫して解糖系から酸化的代謝に移行している。対照群と処置群のこの比較は、この特定の処置が対照群と比較して異なる生体エネルギープロファイルを示すことを示す。
図6C は、経時的なミトコンドリア呼吸数の一例であり、これが詳述されている。治療群の基礎呼吸数は、対照群よりも比較的少ない。両群の呼吸およびATP産生速度は、プロトンリークに続いてオリゴマイシンA注射とともに減少する。細胞の呼吸数は、FCCPの注射後に再び最大呼吸に戻る。ロテノン/アンチマイシンAの最終注射はOCRを再び減少させ、最大呼吸と基礎呼吸の違いによって測定される予備呼吸をもたらす。3回目の注射後、電子輸送鎖(ETC)複合体IとIIIを標的とし阻害するロテノン/アンチマイシンAの組み合わせにより、ミトコンドリア呼吸が遮断され、非ミトコンドリア呼吸を計算することができます。対照群と比較して、治療群における基礎呼吸および最大呼吸の両方が比較的低い。これは、この治療が骨芽細胞のミトコンドリア呼吸に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。
水戸燃料フレックステストは、3つの異なるミトコンドリア燃料、グルコース、グルタミン、および脂肪酸を酸化するミトコンドリアの可能性を測定します。ミトコンドリア呼吸に燃料を供給する異なる経路に対する細胞の依存性、柔軟性、および容量は、それぞれのミトコンドリア燃料の酸化に基づいて計算される。 図6D は、対照群がグルコース経路に大きく依存していることを示す。同時に、この処理は、細胞のグルコース酸化の能力を高め、阻害された経路の燃料ニーズを積極的に満たす。一方、グルタミンの酸化は対照群において効率的であり、その結果、細胞の依存性が治療群のそれに対して比較的高く、それによって対照群の全体的な能力が増加した。脂肪酸経路は、燃料需要を補いながら、ミトコンドリア燃料への依存度が高いため、治療が細胞の全体的な容量を増加させたことを示している。
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Discussion
リアルタイムの細胞代謝フラックス分析装置は、さまざまな条件下で細胞エネルギーを探索するために使用できます。このプロトコルは、BMSCの効率的な単離、適切な細胞培養プレートでの細胞の培養、および成熟骨芽細胞への分化を示しており、細胞外フラックス分析装置を使用したさまざまなアッセイに使用できます。さらに、センサーカートリッジの水和、注入ポートの装填、アッセイの実行、データの正規化、およびデータ分析を含む、リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイの重要なステップも詳細に説明されています。このアッセイは、細胞の生体エネルギー学を理解するために、異なるミトコンドリアおよび解糖系阻害剤に対する骨芽細胞の応答を評価する。このプロトコルは、細胞型に基づいて骨芽細胞用に特別に最適化されており、この方法は、製造業者の標準プロトコルと比較して、より堅牢で正確なガイドを提供する。細胞播種密度、化合物の濃度、培地への外因性基質の添加、緩衝能を含むこのプロトコールにおけるいくつかのパラメータは、特定の細胞型およびその背景に基づいて最適化される必要がある。
細胞外フラックス分析計は、 エクスビボ 培養細胞における細胞代謝機能の迅速かつ信頼性の高い測定を提供します。他の生物学的アッセイと比較して、総アッセイ時間は典型的には60〜120分の間である。この装置は、37°Cの事前設定温度を維持することによって正常な細胞および生理学的条件を維持し、複雑さを軽減しながら効率的で再現性のあるアッセイ結果を容易にします。典型的には、ベースラインOCRおよびCARは、阻害剤を添加する前に3〜4回記録される。阻害剤および治療も順次注射され、経時的な細胞の代謝応答測定が容易になる。この分析装置により、研究者は最適化された条件下で標準化された結果を得ることができます。この分析装置は、アッセイ中に異なる化合物を注入して、細胞の呼吸のリアルタイム変化を観察する機能も提供します。例えば、ATPレートアッセイでは、2μMオリゴマイシンAおよび1μMロテノン/1μMアンチマイシンA混合物をデフォルトの化合物注入ポートAとして使用する:2μMオリゴマイシンA;ポートB:1μMロテノン/1μMアンチマイシンA。
アッセイ培地は、pHの変化をよりよく検出するための重炭酸塩の不在、グルコース、グルタミン、およびピルビン酸サプリメントの非存在下を含むいくつかの要因によって典型的な成長培地とは異なり、実験者は添加される外因性基質をカスタマイズすることができ、培地はpH値を正確に計算するためにフェノールレッドを含まない。
グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムは、最も使用される外因性基質である。これらの基質の使用は、細胞型および実験的質問に特異的である。この文脈において、これらのアッセイは、貴重ではあるが、人工システムを用いて行われることが認識される。例えば、10mMグルコースを使用することが推奨される。しかし、これは超生理学的レベルであり、研究者は他のグルコース濃度がより適切であるかどうかを検討する必要があります。この点までは、BMSCや骨芽細胞におけるグルコースの取り込みがインスリンに依存するかどうかを検討することも不可欠であり、その場合にはインスリンも添加すべきである。これは、分野31、32内で依然として議論のトピックであるため、インスリンの包含が好ましい。同様の線に沿って、脂肪酸利用が実験的質問に相対的である場合、アッセイ媒体は脂肪酸でさらに補充されるべきである。これらの外因性基質の重要性は、アッセイおよびデータ解釈において重要な役割を果たします。したがって、これらの基質の濃度は、細胞タイプおよび研究上の質問に基づいて最適化されるべきである。
細胞外フラックス分析装置の主な利点の1つは、アッセイを実行するのに最小限の細胞数しか必要とせず、96ウェルフォーマットでは高い n であることです。センサーカートリッジはまた、4つの注入ポートを介して異なる阻害剤および化合物を注入する能力を可能にする。アッセイを修正し、関心のある追加の阻害剤および治療を用いて急性注射を行う柔軟性は、この技術の付加的な利点である。これらの機能により、分析装置は最小限のセル数で高スループットのリアルタイムアッセイを行うことができるため、従来のクラーク酸素電極法よりも好ましいものになります。電極法は、ミトコンドリア呼吸を測定するのに安価で単純であるが、それははるかに高いバックグラウンドノイズを与え、分析器24、33よりも低い分解能を有する。
さらに、記載されたワークフローにおいて、分析器から得られた細胞生体エネルギープロファイルは、アッセイ34の後にマイクロプレート中の細胞を計数することによって、マイクロプレートイメージャを用いて効率的に正規化することができる。生細胞の数は、アッセイ後ウェルごとに変化し得る。細胞数の使用は、細胞のタンパク質またはDNA含量が、細胞エネルギーが比較されている異なる条件または治療下で一定に保たれないためのタンパク質またはDNA正規化を含む他の方法よりも好ましい。タンパク質またはDNA含量は、異なる処置の影響下で変化し得、そして、この方法を用いた正規化の主な欠点であり、例えば、骨芽細胞のタンパク質含量は分化中に変化する。骨芽細胞形成中に細胞が成熟するにつれて、それらは細胞外マトリックスタンパク質を分泌し始め、総細胞タンパク質含量を増加させる。これは、異なる増殖段階または骨芽細胞形成の時点における細胞のアッセイ結果を比較する際に問題となり得る。
多くの利点を考えると、細胞の生体エネルギー学を監視するための分析装置は、この分野を前進させる上で大きな追加となっています。ただし、制限は存在します。例えば、これらのアッセイの主な制限の1つは、それらが細胞レベルまたはオルガノイドレベルでしか実行できないことであり、データは、異なる生理学的条件下で インビボで 何が起こるかの完全なアイデアを提供するのに十分ではない。前述のように、アッセイ中に作り出される細胞環境も、元の生理学的ニッチからかけ離れています。グルコース、ピルビン酸、グルタミン、オレイン酸またはパルミチン酸などの異なる栄養素を補うことによって作成された人工微小環境は、骨芽細胞の通常の生理学的レベルよりも高いことがよくあります。私たちの体内に存在するより高い炭素鎖長の脂肪酸のほとんどは非常に疎水性で非常に不溶性であるため、アッセイのための栄養素の1つとしての脂肪酸の添加は限られています。これは、アッセイ培地にそれらを添加する際に技術的な困難をもたらす。オレイン酸やパルミチン酸のような単一の脂肪酸に対する細胞の代謝応答は、細胞が様々な脂肪酸および結合タンパク質のカクテルを経験する他の生理学的条件下では異なる。最後に、この方法を用いたATPの測定は、静的発光アッセイよりも間違いなく優れていますが、この技術は酸素のみを測定するため、間接的なままです。これは直接的な測定ではありませんが、OCRの測定中にATP合成酵素阻害剤であるオリゴマイシンAを添加し、続いて電子輸送鎖阻害剤を添加することは、ATPに起こる変化の強力な証拠を提供することは事実です。したがって、質量分析のような技術を使用して、これらのデータをサポートすることができます。それにもかかわらず、これらの制限は慎重に考慮されるべきであるが、このツールは細胞生体エネルギー学に関する非常に貴重な情報を提供する。
最後に、生体エネルギー学における上記の変化が細胞機能、特にBMSCおよび骨芽細胞にどのように影響するかを理解するためには、アルカリホスファターゼ(ALIP)、フォンコッサ、またはアリザリン染色に続く 体外培養において 相補的な実験を含める必要があることに留意されたい。
結論として、上述の方法は、リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を用いて骨芽細胞における様々な代謝経路をモニタリングするための基礎を提供する。このような実験を行うことで、骨芽細胞分化全体にわたる初代マウスBMSCにおける細胞生体エネルギー学がどのように調節され、骨格関連転帰を改善することができるかについてのより深い理解につながるであろう。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)グラントAR072123および国立加齢研究所(NIA)グラントAG069795(ERRへ)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid | Sigma - Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
| Antimycin A | Sigma - Aldrich | A8674 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
| Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide | Sigma - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 imaging reader | BioTek | N/A | Microplate imager |
| Etomoxir sodium salt hydrate | Sigma - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| Insulin | Sigma - Aldrich | I6634 | |
| Oleic Acid-Albumin from bovine serum | Sigma - Aldrich | O3008 | |
| Oligomycin A - 5 mg | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Rotenone | Sigma - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM Glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM media | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent Technologies | S7800B | Real- Time Metabolic flux analyzer |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution |
| The Cell imaging 1.1.0.11 software | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave software 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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