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Biology

ओस्टियोब्लास्ट बायोएनर्जेटिक्स की निगरानी करने के लिए रियल-टाइम सेल मेटाबोलिक फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करना

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63142
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Vanderbilt Center for Bone Biology, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Summary

वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स परख ऑक्सीजन की खपत दर और बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर, जो माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट उत्पादन से मेल खाती है, पीएच और ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग करके उपाय करती है। पांडुलिपि ओस्टियोब्लास्ट्स की ऊर्जा स्थिति और सेलुलर बायोएनर्जेटिक स्थिति के लक्षण वर्णन और व्याख्या को समझने के लिए एक विधि की व्याख्या करती है।

Abstract

ओस्टियोब्लास्ट्स द्वारा हड्डी का गठन कंकाल होमोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए उचित हड्डी अधिग्रहण और हड्डी के कारोबार के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है, और अंततः, फ्रैक्चर को रोकने के लिए। चोटी की हड्डी के द्रव्यमान को अनुकूलित करने और विभिन्न मस्कुलोस्केलेटल बीमारियों (यानी, रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस, एनोरेक्सिया नर्वोसा, टाइप 1 और 2 मधुमेह मेलिटस) का मुकाबला करने के लिए ब्याज में, हड्डी जीव विज्ञान के क्षेत्र में अविश्वसनीय प्रयास किए गए हैं ताकि उनकी भेदभाव प्रक्रिया के दौरान ओस्टियोब्लास्ट को पूरी तरह से चिह्नित किया जा सके। मैट्रिक्स प्रोटीन और खनिज पुटिकाओं को स्रावित करने के लिए परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट की प्राथमिक भूमिका को देखते हुए, यह ध्यान दिया गया है कि ये प्रक्रियाएं सेलुलर ऊर्जा, या एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की अविश्वसनीय मात्रा लेती हैं। समग्र सेलुलर ऊर्जा की स्थिति को अक्सर सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स के रूप में जाना जाता है, और इसमें चयापचय प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला शामिल होती है जो सेलुलर आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एटीपी प्राप्त करने के लिए सब्सट्रेट उपलब्धता को समझती है। इसलिए, वर्तमान विधि प्राथमिक, मुरीन अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं (बीएमएससी) को अलग करने और ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव में विभिन्न चरणों में वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके उनकी बायोएनर्जेटिक स्थिति की निगरानी करने की प्रक्रिया का विवरण देती है। महत्वपूर्ण रूप से, इन आंकड़ों ने प्रदर्शित किया है कि ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दौरान चयापचय प्रोफ़ाइल नाटकीय रूप से बदलजाती है। इस प्रकार, इस शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार का उपयोग पूरी तरह से सराहना करने के लिए आवश्यक है कि सेल की बायोएनर्जेटिक स्थिति समग्र कार्य को कैसे विनियमित कर सकती है।

Introduction

ओस्टियोब्लास्ट द्वारा हड्डी का गठन ओस्टियोक्लास्ट द्वारा समन्वित विनाश या हड्डियों के अवशोषण के साथ होता है। ओस्टियोब्लास्टिक हड्डी के गठन और ओस्टियोक्लास्ट अवशोषण के बीच संतुलन हड्डी के कारोबार या रीमॉडलिंग का वर्णन करने वाली एक युग्मित प्रक्रिया है, जो कंकाल होमियोस्टैसिस के लिए आवश्यक है। ओस्टियोब्लास्ट शिथिलता बिगड़ा हुआ हड्डी के गठन की ओर जाता है और ऑस्टियोपोरोसिस 1,2,3 सहित विभिन्न बीमारियों में परिणाम होता है। अस्थि मज्जा स्ट्रोमल स्टेम कोशिकाओं (बीएमएससी) के पूर्व विवो / इन विट्रो भेदभाव ओस्टियोब्लास्ट अग्रदूतों और परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट के परिणामस्वरूप समय 4,5,6 के साथ संस्कृति पोत में खनिजीकृत हड्डी मैट्रिक्स का गठन और जमाव होता है। ओस्टियोब्लास्ट द्वारा इस हड्डी के गठन के लिए सेलुलर ऊर्जा की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, कोलेजन संश्लेषण और स्राव को सेलुलर एटीपी पर भारी भरोसा करने के लिए दिखाया गया है: एडीपी अनुपात, और संभवतः, खनिजीकृत पुटिका तस्करी और स्राव के लिए अतिरिक्त एटीपी 7,8,9,10,11 की आवश्यकता होती है। कई शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया है कि ओस्टियोब्लास्टोजेनेसिस और ओस्टियोब्लास्ट फ़ंक्शन की प्रक्रिया को हड्डी के गठन की चयापचय मांग को पूरा करने के लिए ऊर्जा की पर्याप्त आपूर्ति की आवश्यकता होती है 12,13,14,15,16। इसलिए, इस विधि का लक्ष्य वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दौरान प्राथमिक, मुरीन स्ट्रोमल कोशिकाओं की बायोएनर्जेटिक स्थिति को चिह्नित करना है। ये तकनीकें कंकाल होमियोस्टैसिस की बेहतर समझ विकसित करने में सहायता करती हैं, जो अंततः कंकाल विकारों में सुधार करने में सक्षम उपन्यास चिकित्सीय विकल्पों के विकास का कारण बन सकती हैं।

वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और लाइव ओस्टियोब्लास्ट्स की बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दर (ईसीएआर) को मापने के लिए किया जा सकता है, जो क्रमशः माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक एटीपी उत्पादन से मेल खाता है। इस पद्धति के लिए मौलिक तथ्य यह है कि प्रति लैक्टेट एक एच + आयन लैक्टेट में ग्लूकोज के रूपांतरण में ग्लाइकोलाइसिस के दौरान जारी किया जाता है, जो ईसीएआर मूल्यों में परिलक्षित मीडिया पीएच को बदल देता है। इसके विपरीत, टीसीए (ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड) चक्र के दौरान, माइटोकॉन्ड्रिया के माध्यम से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन ऑक्सीजन का उपयोग या उपभोग करके सीओ2 का उत्पादन करता है, और इसलिए ओसीआर की निगरानी इस चयापचय प्रक्रिया का प्रतिबिंबित करती है। विश्लेषक एक साथ और वास्तविक समय में बाह्य कोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट में ओसीआर और ईसीएआर दोनों को मापता है, जो सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स 6,17 का अध्ययन करते समय जबरदस्त क्षमता की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इन assays प्रदर्शन अपेक्षाकृत सीधा है और आसानी से प्रयोगात्मक लक्ष्य के आधार पर अनुकूलन योग्य है. इसी तरह की तकनीकों को प्रतिरक्षा प्रणाली18,19, कैंसर दीक्षा और प्रगति 20 के टी-सेल चयापचय विनियमन को समझने के लिए नियोजित किया गया है, साथ ही चयापचय सिंड्रोम21,22 में योगदान देने वाले कई अन्य सेल प्रकारों के साथ।

वैकल्पिक तकनीकों पर वास्तविक समय चयापचय फ्लक्स विश्लेषक के फायदों में शामिल हैं (1) वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं के सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को मापने की क्षमता, (2) अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओं के साथ परख करने की क्षमता (5,000 कोशिकाओं के रूप में कम की आवश्यकता होती है), (3) इंजेक्शन पोर्ट समानांतर रूप से एक उच्च-थ्रूपुट 96-वेल सिस्टम में कई उपचारों में हेरफेर करने के लिए, (4) सामान्यीकरण के लिए रेडियोधर्मी लेबल-मुक्त स्वचालित सेल इमेजर का उपयोग18, 23,24. निम्नलिखित विधियों का उद्देश्य विश्लेषक का उपयोग करके ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दौरान मुरीन बीएमएससी में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स की निगरानी का एक सामान्यीकृत लेकिन विस्तृत विवरण प्रदान करना है। इसमें नियमित रूप से किए गए assays शामिल होंगे; हालांकि, कई तकनीकों और तरीकों के साथ, यह अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है कि व्यक्तिगत प्रयोगशालाएं अपने प्रयोगों के लिए विशिष्ट विवरण निर्धारित करती हैं।

परख और assays के विभिन्न प्रकार के उपलब्ध का चयन: परख किट और अभिकर्मकों की एक विस्तृत विविधता कोशिकाओं के bioenergetics का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं, जबकि विश्वसनीयता और प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए. इसके अतिरिक्त, डेस्कटॉप सॉफ़्टवेयर भी परख टेम्पलेट्स प्रदान करता है जिसे आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। परख विभिन्न चयापचय मापदंडों को मापने के लिए उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर परिभाषित किया जा सकता है। इन assays प्रयोगात्मक लक्ष्य और / या वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर विभिन्न तरीकों से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चार इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ, कई यौगिकों को प्रत्येक चयापचय मार्ग के लिए विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए परख मीडिया में इंजेक्ट किया जा सकता है।

सेल ऊर्जा फेनोटाइप परीक्षण: इस परख 'जीवित कोशिकाओं चयापचय phenotype और चयापचय क्षमता उपायों. इस परख भी पहले कदम के रूप में अनुशंसित करने के लिए मार्ग विशिष्ट चयापचय का एक सामान्यीकृत विचार प्राप्त करने के लिए है. एटीपी सिंथेज़ और कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) के ओलिगोमाइसिन ए-एन अवरोधक का मिश्रण- सेल ऊर्जा क्षमता को समझने के लिए एक माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग एजेंट इंजेक्ट किया जाता है। ओलिगोमाइसिन ए का इंजेक्शन एटीपी के संश्लेषण को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को अपनी ऊर्जा मांगों को पूरा करने में सक्षम बनाने के लिए ग्लाइकोलाइसिस (ईसीएआर) की दर में वृद्धि होती है; दूसरी ओर, FCCP के इंजेक्शन माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के विध्रुवीकरण के कारण उच्च OCR में परिणाम। अनिवार्य रूप से, यह परख बेसल चयापचय श्वसन को दर्शाता है, और दोहरे इंजेक्शन, धक्का, या तनाव, चयापचय प्रतिक्रिया के बाद। इन मापदंडों के आधार पर, सॉफ़्टवेयर तब कोशिकाओं को एरोबिक, क्विसेंट, ग्लाइकोलाइटिक, या ऊर्जावान राज्य के रूप में वर्गीकृत करके कोशिकाओं के ओसीआर और ईसीएआर को25,26 समय के साथ प्लॉट करता है।

एटीपी वास्तविक समय उत्पादन दर परख: यह ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन से एक साथ सेलुलर एटीपी उत्पादन को मापता है। यह परख मात्रात्मक रूप से दो ऊर्जा मार्गों से चयापचय बदलाव को मापता है और समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक एटीपी उत्पादन दरों पर डेटा प्रदान करता है। परख बेसल OCR और ECAR डेटा प्राप्त करता है, जिसके बाद ओलिगोमाइसिन ए के इंजेक्शन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन दर की गणना की जाती है और रोटेनोन + एंटीमाइसिन ए मिश्रण (माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का कुल निषेध) के इंजेक्शन के माध्यम से ग्लाइकोलाइटिक एटीपी उत्पादन दर की गणना की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल अम्लीकरण17,27 होता है।

सेल माइटोकॉन्ड्रिया तनाव परीक्षण (या सेल माइटो तनाव परीक्षण): यह एटीपी से जुड़े श्वसन के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापता है, सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को मापता है, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की पहचान करता है, और तनाव के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को मापता है। बेसल और अतिरिक्त श्वसन क्षमता, एटीपी से जुड़े श्वसन, अधिकतम श्वसन, और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत सहित विभिन्न मापदंडों को एक परख में प्राप्त किया जा सकता है। इस परख oligomycin ए, FCCP (माइटोकॉन्ड्रियल uncoupling एजेंट), rotenone / antimycin एक अवरोधक का मिश्रण के अनुक्रमिक इंजेक्शन शामिल हैं कुशलतापूर्वक माइटोकॉन्ड्रियल समारोह28 पर इन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए.

लचीलापन mito ईंधन फ्लेक्स परीक्षण: यह उनके अवरोधकों की उपस्थिति और अनुपस्थिति द्वारा तीन प्राथमिक माइटोकॉन्ड्रियल ईंधन के ऑक्सीकरण द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापता है। ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और फैटी एसिड का अनुक्रमिक निषेध कोशिकाओं की निर्भरता, क्षमता और लचीलेपन और ऊर्जा की मांग को पूरा करने के लिए विभिन्न सेलुलर मार्गों में कोशिकाओं की निर्भरता को मापने में सहायता करता है। जब माइटोकॉन्ड्रिया अन्य ईंधनों को ऑक्सीकरण करके ब्याज के अवरुद्ध मार्ग की मांगों को पूरा नहीं कर सकता है, तो कोशिकाएं एक निर्भरता स्थिति में प्रवेश करती हैं। कोशिकाओं की क्षमता की गणना अन्य दो वैकल्पिक मार्गों के निषेध द्वारा की जाती है, जिसके बाद ब्याज के मार्ग के निषेध का पालन किया जाता है। कोशिकाओं का लचीलापन माइटोकॉन्ड्रिया की क्षमता को समझने में मदद करता है ताकि वे बाधित मार्ग की ईंधन जरूरतों की भरपाई और पूरा कर सकें। इसकी गणना कोशिकाओं की क्षमता से कोशिकाओं की निर्भरता को घटाकर की जाती है। तीन अलग-अलग अवरोधकों का उपयोग स्वतंत्र रूप से या दो के मिश्रण के रूप में प्रभावी ढंग से परख मापदंडों की गणना करने के लिए किया जाता है। 2-सायनो-3-(1-फिनाइल-1एच-इंडोल-3-yl)-2-प्रोपेनिक एसिड (UK5099) ग्लाइकोलाइसिस में पाइरूवेट वाहक को अवरुद्ध करके ग्लूकोज के ऑक्सीकरण को रोकता है। Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES) एथिल सल्फाइड ग्लूटामाइन ऑक्सीकरण मार्ग को रोकता है, और etomoxir लंबी श्रृंखला फैटी एसिड29 के ऑक्सीकरण को रोकता है।

Figure 1
चित्रा 1: विश्लेषण के लिए ओस्टियोब्लास्ट्स को संवर्धित करने और तैयार करने के लिए पद्धति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। मुरीन बीएमएससी को लंबी हड्डियों से अलग किया जाता है, सुसंस्कृत किया जाता है, और 25,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से घनत्व पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों में बीज दिया जाता है। ओस्टियोब्लास्ट विशिष्ट मीडिया में इन कोशिकाओं को संवर्धित करना तब शुरू होता है जब वे अपने भेदभाव को शुरू करने के लिए 80% -100% confluency तक पहुंचते हैं। assays भेदभाव के विभिन्न चरणों में प्रदर्शन कर रहे हैं. कारतूस प्लेटों परख से एक दिन पहले हाइड्रेटेड कर रहे हैं. परख के दिन, विभिन्न inhibitors परख आवश्यकताओं के आधार पर सेंसर कारतूस के बंदरगाहों में इंजेक्ट किया जाता है, और एक अंशांकन बफर 96 अच्छी तरह से अंशांकन प्लेट के लिए जोड़ा जाता है। अंशांकन के बाद, वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स परख किया जाता है, इसके बाद सेल गणना के साथ वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक डेटा को सामान्य करने के लिए माइक्रोप्लेट इमेजर का उपयोग करके सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट को इमेजिंग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

सभी प्रक्रियाएं वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों और अनुमोदन पर आधारित थीं।

1. अभिकर्मकों और परख सेटअप की तैयारी

  1. अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं का अलगाव और संवर्धन (पिछले लेख30 को भी देखें)।
    1. 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम), पेनिसिलिन के 100 U / mL, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL के साथ अल्फा संशोधन के साथ न्यूनतम आवश्यक मीडिया के पूरक द्वारा पूर्ण अल्फा न्यूनतम आवश्यक मीडिया (αMEM) सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें।
    2. एक 0.6 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंत को ट्रिम करके अस्थि मज्जा संग्रह ट्यूब तैयार करें ताकि कोशिकाएं 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इसे पारित कर सकें और इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में डाल सकें जिसमें पूर्ण αMEM का 100 μL होता है।
    3. निम्नानुसार CO2 उपचार का उपयोग कर चूहों Euthanize. जानवर को2-3 मिनट के लिए या श्वसन बंद होने तक सीओ 2 कक्ष में रखें। कक्ष से चूहों को हटाने और गर्भाशय ग्रीवा को विस्थापित करने के लिए जानवर बेहोश होने के बाद कम से कम 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    4. बाँझ संदंश और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, एक छोटा चीरा बनाने के लिए euthanized चूहों के निचले पेट को खोलें। चूहों की लंबी हड्डियों (फीमर, टिबिया और इलियाक शिखा) को अलग करें।
    5. सभी नरम ऊतकों को हटाने के लिए लंबी हड्डियों को ट्रिम करें। एक बार हड्डी को साफ करने के बाद, मज्जा के माध्यम से फ्लश करने के लिए एक उद्घाटन बनाने के लिए डिस्टल और समीपस्थ सिरों से ~ 1-2 मिमी काटें।
      नोट: यह उद्घाटन मज्जा को खोने से बचने के लिए रूढ़िवादी होना चाहिए, जबकि इसे बाहर निकालने की अनुमति देता है।
    6. कुल अस्थि मज्जा को अलग करने के लिए हड्डियों को 1x बाँझ पीबीएस (फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा) के 100 μL युक्त एक संग्रह ट्यूब में रखें।
    7. कमरे के तापमान पर 15-20 सेकंड के लिए 10,000 x g पर centrifugation द्वारा मज्जा फ्लश। मज्जा कोशिकाएं ट्यूब के नीचे गोली मारती हैं।
    8. जब तक अस्थि गुहा सफेद और अधिकांश मज्जा तत्वों से रहित दिखाई नहीं देती तब तक सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं। अस्थि मज्जा की मिश्रित आबादी को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करके पुन: निलंबित करें।
    9. सेल संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर में 75 सेमी2 सेल संस्कृति फ्लास्क में एक जानवर (फीमर और टिबिया दोनों) से कोशिकाओं को संस्कृति दें और 5% सीओ2 के साथ सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि 2-3 जानवरों से कोशिकाओं को पूल करना, तो 150 सेमी2 सेल संस्कृति फ्लास्क (अनुशंसित) का उपयोग करें।
    10. मिश्रित आबादी के इनक्यूबेशन के 24-48 घंटे के बाद, संस्कृति मीडिया के भीतर निहित गैर-अनुयायी हेमटोपोइएटिक सेल आबादी को एस्पिरेट करें और 1x पीबीएस के साथ अनुयायी कोशिकाओं को धोएं।
  2. BMSCs और ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव से सेल सीडिंग
    1. फ्लास्क सतह को थोड़ा कवर करने के लिए पर्याप्त 0.25% ट्रिप्सिन- ईडीटीए (लगभग 3-4 एमएल) जोड़कर अनुवर्ती कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट का इनक्यूबेशन।
    2. फ्लास्क / ट्रिप्सिन के लिए पूर्ण αMEM के 6-7 mL जोड़ें ताकि ध्यान से ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके अनुयायी BMSCs को फिर से निलंबित किया जा सके। एक शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए BMSC निलंबन स्थानांतरण.
    3. BMSC निलंबन के एक 50 μL ऐलीकोट निकालें और यह करने के लिए trypan नीले (1: 1 कमजोर पड़ने) के 50 μL जोड़ें। व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें जो इस मिश्रण के 10 μL को हेमोसाइटोमीटर पर पिपेट करके और माइक्रोस्कोप के तहत इसे देखकर डाई को बाहर करते हैं। नीले रंग की (<10% कोशिकाओं) दिखाई देने वाली किसी भी मृत या अस्वास्थ्यकर कोशिकाओं की गिनती न करें।
    4. सेल गिनती के आधार पर, प्रति प्लेट कम से कम 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 2.4 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए आवश्यक पूर्ण αMEM में सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें।

Figure 2
चित्र 2: सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट, विशेष रूप से विश्लेषक के लिए डिज़ाइन किया गया है। (A) चार पृष्ठभूमि सुधार कुओं, A1, A12, H1, H12, पर प्रकाश डाला गया है। इन कुओं में केवल किसी भी कोशिकाओं के बिना परख मीडिया होते हैं। (बी) इमेजिंग रीडर और विश्लेषक का उपयोग करके प्लेट को स्कैन करने के लिए प्लेट के किनारे पर बारकोड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और कोशिकाओं को 2.4 x 106 कोशिकाओं / एमएल की वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें।
  2. सेल निलंबन को एक जलाशय में स्थानांतरित करें और, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं के एक समरूप मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  3. बीज 2.5 x 104 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट में पूर्ण αMEM के 80 μL के साथ. पृष्ठभूमि सुधार कुओं (A1, A12, H1, H12) में कोशिकाओं को बीज न करें; इसके बजाय, बस इन चार कुओं में माध्यम जोड़ें।
    नोट: assays के लिए BMSCs सेंसर कारतूस के साथ संयोजन के रूप में विश्लेषक के लिए डिज़ाइन किए गए 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति microplate में मढ़वाया जाता है। इन प्लेटों का सतह क्षेत्र एक नियमित 96-अच्छी तरह से प्लेट से अलग है। प्लेट में प्रत्येक कुएं का सतह क्षेत्र 0.106 सेमी2 है, जो विशिष्ट 96-अच्छी तरह से प्लेट क्षेत्र का लगभग 40% है। इष्टतम सेल सीडिंग घनत्व सेल प्रकार के आधार पर चुना जाता है। आमतौर पर, विश्लेषक 0.5-4 x 104 कोशिकाओं के बीच अच्छी तरह से पता लगा सकता है। ओस्टियोब्लास्ट्स को प्रभावी ढंग से अंतर करने के लिए संपर्क में होना चाहिए; इस उद्देश्य के लिए, 2.0 x 10 4-3.0 x 104 BMSCs / अच्छी तरह से पूर्ण αMEM के 80 μL में के बीच चढ़ाना चुना गया है।
  4. कुओं में कोशिकाओं के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे से उत्तेजित करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। 48 घंटे के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं और सेल confluency के विकास की जाँच करें। यदि आवश्यक हो तो सेल संस्कृति मीडिया परिवर्तित करें.
  5. परख के लक्ष्य के आधार पर, जब BMSCs 60% -80% confluent (आमतौर पर 48-72 ज) होते हैं, तो ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव मीडिया में सेल संस्कृति मीडिया को बदलकर ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव शुरू करते हैं (पूर्ण αMEM 5 mM β-ग्लिसरॉल फॉस्फेट और 50 μg / mL एल-एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक)।
  6. यदि अविभाजित स्ट्रोमल कोशिकाओं (दिन 0) का विश्लेषण किया जाना है, तो पूर्ण αMEM के तहत कोशिकाओं को बनाए रखें।
  7. ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव मीडिया को हर दूसरे दिन बदलें और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की कल्पना करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे परख के दिन तक स्वस्थ हैं। अधिमानतः, अनुसूचित परख से पहले 24 ज, मीडिया को बदलने और एक सुसंगत मध्यम परिवर्तन अनुसूची (अनुशंसित) बनाए रखने के लिए।
    नोट: ध्यान से एक कोण पर प्लेटों को थोड़ा झुकाव द्वारा मीडिया को बदलें; यह सेल संस्कृति प्लेटों और कोशिकाओं के monolayer के व्यवधान के लिए पिपेट युक्तियों के आकस्मिक संपर्क से बचा जाता है।

2. बाह्य कोशिकीय फ्लक्स अंशांकन के लिए सेंसर कारतूस की तैयारी

  1. परख के दिन से पहले बाह्य कोशिकीय परख किट से सेंसर कारतूस हाइड्रेट. सेंसर कारतूस (हरी प्लेट) निकालें और सेंसर को उल्टा रखें।
  2. एक multichannel pipet का उपयोग करते हुए, उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए H 2 O के200μL जोड़ें। ध्यान से सेंसर कारतूस वापस उपयोगिता प्लेट पर जगह और कमरे के तापमान पर रात भर प्लेट incubate.
    नोट:: निर्माता एक गैर-CO2 37 °C इनक्यूबेटर में रात भर सेंसर कारतूस incubating की सिफारिश करता है। हालांकि, सेंसर कारतूस का महत्वपूर्ण वाष्पीकरण हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो सेंसर कारतूस को कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया जा सकता है। इन प्लेटों को कम से कम 4 घंटे और अधिकतम 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाना चाहिए।
  3. परख के दिन पर, उपयोगिता प्लेट से एच2ओ छोड़ दें और कैलिब्रेंट के 200 μL जोड़ें। परख से पहले कम से कम 1 ज के लिए उपयोगिता प्लेट इनक्यूबेट.

3. वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक मीडिया तैयारी

  1. BMSCs के साथ परख चलाने के लिए 7.4 (अनुशंसित) के पूर्व-समायोजित पीएच के साथ फिनोल लाल मुक्त DMEM मीडिया का उपयोग करें।
  2. 1 mM सोडियम पाइरूवेट, 2 mM glutamine, 10 mM ग्लूकोज, 200 nM इंसुलिन, 50-200 μM ओलिक एसिड BSA के साथ DMEM मीडिया के पूरक द्वारा परख मीडिया के 80 mL तैयार करें।
  3. एक पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा परख मीडिया इनक्यूबेट.

4. सेंसर कारतूस के लिए यौगिकों की तैयारी

  1. बर्फ पर ओलिगोमाइसिन ए, रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए को पिघलाएं। उपयोग करने से पहले यौगिकों को घुलनशील बनाने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे।
  2. प्रत्येक ट्यूब के लिए तैयार परख माध्यम के 3 mL जोड़ें, संबंधित यौगिक-ट्यूब एक के अलावा के बाद: 2.5 mM oligomycin ए के 26.4 μL; ट्यूब बी: 3.1 μL 12.67 mM rotenone + 9.4 mM एंटीमाइसिन A + 30 μL Hoechst दाग के 4.1 μL.
  3. संबंधित पोर्ट में इन अवरोधकों की 10x एकाग्रता लोड करें। आवश्यक इंजेक्शन समाधानों की अंतिम एकाग्रता ओलिगोमाइसिन ए के 2 μM, रोटेनोन के 1 μM, और एंटीमाइसिन ए के 4.1 μM है।
    नोट: Hoechst इमेजिंग और सामान्यीकरण प्रयोजनों के लिए नाभिक को फ्लोरोसेंट रूप से धुंधला करने के लिए अंतिम इंजेक्शन पोर्ट में जोड़ा जाता है। इन सांद्रता को सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है।
  4. परख मीडिया के 180 μL में कोशिकाओं में इन यौगिकों के 20 μL लोड.

5. परख के लिए सेल संस्कृति microplate तैयार

  1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से सेल कल्चर माइक्रोप्लेट को हटा दें और माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  2. पानी के स्नान से परख माध्यम निकालें.
  3. धीरे परख माध्यम के 200 μL के साथ कोशिकाओं को दो बार धोना और अच्छी तरह से प्रति परख मीडिया के 200 μL जोड़ें.
    नोट: एक बार अंतिम परख मीडिया कोशिकाओं के लिए जोड़ा जाता है, समय जब तक प्लेटों विश्लेषक में मिलता है महत्वपूर्ण है. इसलिए, जब तक निम्न चरणों को 1 घंटे के भीतर निष्पादित नहीं किया जाता है, तब तक मीडिया को बदलना शुरू न करें।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें कि कोशिकाएं कुओं से चिपकी रहती हैं।
  5. सुनिश्चित करें कि D5 और E8 में कोशिकाओं को एक सुसंगत मोनोलेयर के साथ पालन किया जाता है और धोने के चरण के दौरान धोया नहीं गया था। सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस और ऑटोएक्सपोजर सेट करने के लिए इन दो कुओं का उपयोग करता है।
    नोट: निर्माता 1 घंटे के लिए एक गैर-सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करने की सिफारिश करता है; स्वचालित इमेजिंग को प्राथमिकता दी जाती है, तो इस चरण को छोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, माइक्रोप्लेट इमेजर एक बंद कक्ष में समान स्थितियों को बनाए रखता है, और कोशिकाओं को एक ब्राइटफील्ड के तहत चित्रित किया जा सकता है।

6. परख और इमेजिंग की स्थापना

Figure 3
चित्रा 3: नियंत्रक सॉफ्टवेयर. सॉफ़्टवेयर सत्यापित करता है कि उपकरण जुड़ा हुआ है और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है। विभिन्न assays के लिए टेम्पलेट फ़ाइलें है कि extracellular फ्लक्स विश्लेषक के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर आगे परख अनुकूलित करने के लिए चुना जा सकता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. उपकरण के बगल में कंप्यूटर में डेस्कटॉप सॉफ़्टवेयर खोलें।
  2. नियंत्रक सॉफ़्टवेयर के निचले-बाएँ कोने में कनेक्शन स्थिति की जाँच करें.
  3. टेम्पलेट्स पर जाएं और XF एटीपी दर परख टेम्पलेट फ़ाइल या उपयुक्त परख टेम्पलेट का चयन करें।
  4. स्क्रीन के शीर्ष पर समूह परिभाषाओं का चयन करें और समूहों को परिभाषित करें।
  5. प्लेट मैप लेआउट का चयन करें और परिभाषित समूहों के आधार पर कुओं को असाइन करें।
  6. इंस्ट्रूमेंट प्रोटोकॉल सत्यापित करें, सुनिश्चित करें कि जोड़े गए यौगिक सही ढंग से सूचीबद्ध हैं, और भविष्य के संदर्भों के लिए परियोजना की जानकारी शामिल करें।
  7. रन परख पर क्लिक करें; यह परिणाम फ़ाइल संग्रहण स्थान के चयन का संकेत देगा।
  8. परिणाम फ़ाइल को सहेजने के लिए स्थान का चयन करें.
  9. परख की तारीख के साथ फ़ाइल को बचाने के लिए और स्टार्ट रन पर क्लिक करें.
  10. ट्रे पर सेंसर कारतूस और उपयोगिता प्लेट रखें और पर क्लिक करें मैं अंशांकन शुरू करने के लिए तैयार हूं ।
  11. अंशांकन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि कारतूस ढक्कन हटा दिया गया है, और सेंसर कारतूस को उपयोगिता प्लेट पर सही अभिविन्यास में रखा गया है। इस चरण में 10-20 मिनट लगेंगे, और एक बार पूरा होने के बाद, सॉफ़्टवेयर लोड सेल प्लेट संवाद बॉक्स प्रदर्शित करेगा।

7. Brightfield छवियों को प्राप्त करें

नोट:: यह चरण वैकल्पिक है। यदि कोई इमेजिंग उपकरण उपलब्ध नहीं है, तो चरण 8 पर जाएँ।

Figure 4
चित्रा 4: सेल इमेजिंग सॉफ़्टवेयर कंप्यूटर के माध्यम से इमेजिंग रीडर को संवाद करता है। माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं को परख से पहले और बाद में चित्रित किया जा सकता है, और डेटा को सामान्य करने के लिए परख के बाद सेल गिनती / अच्छी तरह से प्राप्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. कंप्यूटर पर सेल इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें।
  2. सुनिश्चित करें कि माइक्रोप्लेट इमेजर चालू है और पोर्ट कंप्यूटर से कनेक्टेड हैं।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए स्क्रीन के निचले बाईं ओर स्थिति पट्टी की जाँच करें कि तापमान 37 °C पर सेट है और कनेक्शन की स्थिति को तैयार के रूप में हरे रंग में हाइलाइट किया जाना चाहिए।
  4. इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए प्लेट बारकोड को स्कैन करें।
  5. सेल प्लेट को एक नाम प्रदान करें और सहेजें हिट करें (यह वह नाम है जहां उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों दोनों को बचाया जाएगा)। Perform Brightfield Scan पर क्लिक करें।
  6. अगली स्क्रीन, प्लेट और स्कैन मेनू, इमेजिंग के लिए विकल्प दिखाते हैं। परख से पहले, Brightfield स्कैन प्रारंभ करें का चयन करें.
  7. ट्रे धारक पर प्लेट कवर / ढक्कन के साथ सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट रखें और ए 1 मार्क के साथ अच्छी तरह से ए 1 संरेखित करें। Close Tray पर क्लिक करें।
  8. अगली स्क्रीन, ब्राइटफील्ड छवि अधिग्रहण, एक प्लेट मानचित्र के साथ प्रकट होता है। स्कैन ऑल वेल्स पर क्लिक करें, जो स्कैन के 30 से 35 मिनट के बाद सिस्टम प्रारंभ प्रक्रिया शुरू करता है।
  9. Brightfield स्कैन के बाद, सेल संस्कृति microplate को हटाने और परख प्रदर्शन करने के लिए विश्लेषक में यह जगह है.

8. परख चल रहा है

  1. अंशांकन पूरा हो जाने के बाद, सॉफ़्टवेयर लोड सेल प्लेट संवाद बॉक्स प्रदर्शित करता है।
  2. एक सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट के साथ उपयोगिता ट्रे को बदलने के लिए ओपन ट्रे पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि ढक्कन हटा दिया गया है और प्लेट का A1 सही अभिविन्यास में फिट बैठता है।
  3. फिर, परख शुरू करने के लिए लोड सेल प्लेट पर क्लिक करें। सेंसर कारतूस परख इंजेक्शन के लिए विश्लेषक के अंदर रहेगा.
  4. परख शुरू होता है और पूरा होने का अनुमानित समय प्रदर्शित करता है जब तक प्रतीक्षा करें।
  5. परख के पूरा होने पर, सॉफ्टवेयर प्रदर्शित करता है अनलोड सेंसर कारतूस संवाद बॉक्स. निकालें पर क्लिक करें और विश्लेषक से सेल संस्कृति माइक्रोप्लेट को हटा दें।
  6. ध्यान से सेंसर कारतूस निकालें और सेल प्लेट ढक्कन की जगह. कोशिकाएं फ्लोरोसेंट इमेजिंग और सेल गिनती के लिए तैयार हैं।
  7. सेल प्लेट और सेंसर कारतूस को हटाने के बाद, परख पूरा संवाद बॉक्स प्रकट होता है।
  8. परख परिणाम फ़ाइल खोलने के लिए और तुरंत डेटा सामान्य करने के लिए या घर पर क्लिक करने के लिए परिणाम देखें पर क्लिक करें पर क्लिक करें।

9. प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करें और सामान्यीकृत

नोट: यह चरण BMSCs और osteoblasts के सामान्यीकरण के लिए एक वैकल्पिक लेकिन पसंदीदा विधि है। यदि कोई इमेजिंग उपकरण उपलब्ध नहीं है, तो एक और सामान्यीकरण विधि को करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि प्रोटीन या डीएनए अलगाव और परिमाणीकरण।

Figure 5
चित्रा 5: परख से डेटा के सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया इमेजिंग सॉफ्टवेयर से प्रतिनिधि छवियों. (ए) सिले हुए उज्ज्वल क्षेत्र छवि पूरे कुएं में सेल संगम दिखा रहा है। (बी) सिले हुए प्रतिदीप्ति छवि ओस्टियोब्लास्ट के Hoechst-दाग नाभिक दिखा ओस्टियोब्लास्ट ्स परख परिणामों को सामान्य करने के लिए सेल संख्याओं की गिनती के लिए इस्तेमाल किया. ये 7 दिनों के भेदभाव के बाद ओस्टियोब्लास्ट हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. परख पूरा होने के बाद, हैंडहेल्ड बारकोड रीडर के साथ प्लेट बारकोड को स्कैन करें। यदि प्लेट को पहले से ही चित्रित किया गया है, तो इसे नए नाम की आवश्यकता नहीं होगी।
  2. प्रतिदीप्ति और सेल गणना का चयन करें, ट्रे धारक पर सेल प्लेट रखें, और ट्रे बंद करें पर क्लिक करें।
  3. छवि अधिग्रहण विंडो में, इमेजिंग शुरू करने के लिए सभी कुओं को स्कैन करें का चयन करें। प्रतिदीप्ति इमेजिंग को पूरी प्लेट को स्कैन करने में लगभग 15-20 मिनट लगते हैं। हरे रंग के टिक चिह्न का निरीक्षण करें जो यह दर्शाता है कि स्कैन पूरा हो गया है।
  4. बेतरतीब ढंग से कुओं के एक जोड़े पर क्लिक करके इमेजिंग और सेल इमेजिंग आवेदन में फ्लोरोसेंट छवियों और सेल गिनती की समीक्षा करें।
    नोट:: स्क्रीन के नीचे दाईं ओर गिने गए कक्षों को देखने के लिए एक विकल्प है। यह विकल्प एक नकाबपोश छवि दिखाता है, जो गिने गए ऑब्जेक्ट्स को हाइलाइट करता है।
  5. एक बार प्रतिदीप्ति इमेजिंग पूरा हो जाने के बाद, अतिरिक्त संदर्भों के लिए छवियों को निर्यात करें।
  6. इमेजिंग और सेल गिनती पूरी होने के बाद, परिणाम फ़ाइल खोलें और Normalize पर क्लिक करें। सामान्यीकरण स्क्रीन प्लेट लेआउट और सेल गिनती आयात करने के लिए एक विकल्प दे देंगे।
  7. आयात पर क्लिक करें और स्वचालित रूप से सेल गिनती के साथ परख को सामान्य करने के लिए डेस्कटॉप सॉफ़्टवेयर के लिए लागू करें का चयन करें।

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Representative Results

Figure 6
चित्रा 6: नियमित रूप से निष्पादित assays के लिए प्रतिनिधि रेखांकन उनके संबंधित मानक त्रुटियों के साथ नियंत्रण बनाम उपचार समूह के सेलुलर bioenergetic प्रोफ़ाइल को समझने के लिए. (ए) सेल ऊर्जा फेनोटाइप परीक्षण. प्लॉट ग्लाइकोलाइसिस (ईसीएआर) बनाम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन (ओसीआर) बनाम नियंत्रण बनाम दो उपचार समूहों (एन = 3) का प्रतिनिधित्व करता है। ओलिगोमाइसिन ए और एफसीसीपी तनावों का इंजेक्शन बेसलाइन गतिविधि को बढ़ाता है, जो खुले प्रतीकों द्वारा इंगित किया जाता है, जबकि बंद प्रतीक विभिन्न तनावों के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का संकेत देते हैं। (बी) वास्तविक समय एटीपी दर परख. एटीपी दर परख इंगित करता है कि दोनों नियंत्रण और उपचार समूहों (एन = 2) ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की तुलना में ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से अधिक एटीपी का उत्पादन करते हैं। (C) mito stress test माइटो तनाव परीक्षण समय के साथ नियंत्रण बनाम उपचार कोशिकाओं (एन = 2) की माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर और उनके संबंधित इंजेक्शन के बाद कोशिकाओं पर अवरोधकों के प्रभाव को प्रदान करता है। (d) mito ईंधन फ्लेक्स परीक्षण. माइटो ईंधन फ्लेक्स परीक्षण ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और फैटी एसिड मार्गों और इन माइटोकॉन्ड्रियल ईंधन पर कोशिकाओं की निर्भरता और लचीलेपन के संबंध में नियंत्रण और उपचार समूहों (एन = 2) के प्रतिशत ऑक्सीकरण को मापता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोटोकॉल एक सामान्यीकृत विवरण का वर्णन करता है कि कैसे बाह्य कोशिकीय फ्लक्स एसेस मुरीन बीएमएससी से व्युत्पन्न ओस्टियोब्लास्ट्स के सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को समझने में सहायता करता है। हम इन नियमित रूप से प्रदर्शन assays और महत्वपूर्ण नोट्स से पहले, के दौरान, और परख के बाद पर विचार किया जा करने के लिए विस्तृत है. दो प्रमुख एटीपी उत्पादन मार्ग, ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन, व्यापक रूप से कोशिकाओं की क्षमता को बेहतर ढंग से समझने के लिए चर्चा की जाती है ताकि मार्गों के बीच इंटरचेंज किया जा सके, जिससे कोशिकाओं की ऊर्जा मांगों को पूरा किया जा सके। एक बार परख पूरा हो गया है, परख परिणाम सेल गिनती के आधार पर सामान्यीकृत कर रहे हैं और संबंधित परख रिपोर्ट जनरेटर फ़ाइल के लिए निर्यात कर रहे हैं. रिपोर्ट जनरेटर स्वचालित रूप से परख मापदंडों की गणना करता है और परख की एक सारांश रिपोर्ट प्रदान करता है। चित्रा 6 नियमित रूप से निष्पादित assays के प्रतिनिधि परिणामों को बेहतर ढंग से समझने के लिए दिखाता है कि परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट्स नियंत्रण बनाम उपचार समूह प्रतिक्रिया करते हैं जब विभिन्न अवरोधकों को इंजेक्ट किया जाता है।

संभावित अपेक्षित परिणामों की जेनेरिक, प्रतिनिधि छवियों को चित्र 6 में दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, चित्रा 6 ए में, सेल ऊर्जा फेनोटाइप कोशिकाओं के बेसलाइन फेनोटाइप, तनावग्रस्त फेनोटाइप और चयापचय क्षमता की गणना करके ओसीआर बनाम ईसीएआर की निगरानी करता है। ऑलिगोमाइसिन ए और एफसीसीपी स्ट्रेसर मिश्रण का इंजेक्शन दोनों मार्गों के उपयोग को बढ़ाकर नियंत्रण समूह की आधारभूत गतिविधि (खुले प्रतीकों) को बढ़ाता है। तनावों के जवाब में, नियंत्रण और उपचार 1 समूह (बंद प्रतीकों) में काफी उच्च ऊर्जा स्तर देखा जाता है। दूसरी ओर, उपचार 2 में तुलनात्मक रूप से कम बेसलाइन गतिविधि थी, और कोशिकाएं अधिक एरोबिक हो गईं। इस परख विभिन्न तनावों के जवाब में कोशिकाओं के bioenergetics को समझने में एड्स.

वास्तविक समय एटीपी दर परख ग्लाइकोलाइटिक और माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन दरों के योग के आधार पर कुल सेलुलर एटीपी उत्पादन दर की गणना करता है।

एटीपी उत्पादन दर (pmol ATP/min) = glycoATP उत्पादन दर (pmol ATP/min) + mitoATP उत्पादन दर (pmol ATP/min)।

चित्रा 6 बी इंगित करता है कि दोनों नियंत्रण और उपचार समूह ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन की तुलना में ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से अधिक एटीपी का उत्पादन करते हैं। जबकि उपचार समूह काफी अधिक कुल एटीपी उत्पादन प्रदर्शित करता है, कोशिकाएं लगातार ग्लाइकोलाइटिक से ऑक्सीडेटिव चयापचय में स्थानांतरित हो गई हैं। नियंत्रण और उपचार समूह की यह तुलना इंगित करती है कि यह विशिष्ट उपचार नियंत्रण समूह की तुलना में एक अलग बायोएनर्जेटिक प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करता है।

चित्रा 6 सी समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर का एक उदाहरण है, जो विस्तृत है। उपचार समूह में बेसल श्वसन दर नियंत्रण समूह की तुलना में तुलनात्मक रूप से कम है। दोनों समूहों में श्वसन और एटीपी उत्पादन दर प्रोटॉन रिसाव के साथ-साथ कम हो जाती है, जिसके बाद ओलिगोमाइसिन ए इंजेक्शन होता है। कोशिकाओं की श्वसन दर एफसीसीपी के इंजेक्शन के बाद उनके अधिकतम श्वसन के लिए फिर से बढ़ जाती है। रोटेनोन / एंटीमाइसिन ए का अंतिम इंजेक्शन ओसीआर को फिर से कम कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप अतिरिक्त श्वसन होता है, जिसे अधिकतम और बेसल श्वसन में अंतर से मापा जाता है। तीसरे इंजेक्शन के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को रोटेनोन / एंटीमाइसिन ए के संयोजन से बंद कर दिया जाता है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) कॉम्प्लेक्स I और III को लक्षित और रोकता है, जिससे हमें गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की गणना करने में सक्षम बनाया जा सकता है। नियंत्रण समूह की तुलना में, उपचार समूहों में बेसल और अधिकतम श्वसन दोनों अपेक्षाकृत कम है; इससे पता चलता है कि उपचार ओस्टियोब्लास्ट के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को प्रभावित कर सकता है।

माइटो ईंधन फ्लेक्स परीक्षण तीन अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रियल ईंधन, ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और फैटी एसिड को ऑक्सीकरण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की क्षमता को मापता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को ईंधन देने वाले विभिन्न मार्गों पर सेल की निर्भरता, लचीलापन और क्षमता की गणना संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल ईंधन के ऑक्सीकरण के आधार पर की जाती है। चित्रा 6 डी से पता चलता है कि नियंत्रण समूह ग्लूकोज मार्ग पर अत्यधिक निर्भर है। उसी समय, उपचार ने कोशिकाओं के ग्लूकोज ऑक्सीकरण की क्षमता को सक्रिय रूप से बाधित मार्ग की ईंधन जरूरतों को पूरा करने के लिए बढ़ाया। दूसरी ओर, ग्लूटामाइन का ऑक्सीकरण नियंत्रण समूह में कुशल था, जिसके परिणामस्वरूप उपचार समूह के लिए कोशिकाओं की तुलनात्मक रूप से उच्च निर्भरता होती है, जिससे नियंत्रण समूह की समग्र क्षमता बढ़ जाती है। फैटी एसिड मार्ग से पता चलता है कि उपचार ने ईंधन की जरूरतों की भरपाई करते हुए माइटोकॉन्ड्रियल ईंधन पर उच्च निर्भरता के कारण कोशिकाओं की समग्र क्षमता में वृद्धि की है।

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Discussion

वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में सेलुलर ऊर्जावानों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल BMSCs के कुशल अलगाव को दर्शाता है, उपयुक्त सेल संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं को culturing, और परिपक्व ओस्टियोब्लास्ट्स के लिए उनके भेदभाव, जिसका उपयोग बाहरी फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके विभिन्न assays के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, सेंसर कारतूस के जलयोजन, इंजेक्शन बंदरगाहों की लोडिंग, परख प्रदर्शन, डेटा के सामान्यीकरण, और डेटा विश्लेषण सहित वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स परख के महत्वपूर्ण चरणों को भी विस्तार से समझाया गया है। यह परख कोशिकाओं के bioenergetics को समझने के लिए विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक अवरोधकों के लिए ओस्टियोब्लास्ट की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करता है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से सेल प्रकार के आधार पर ओस्टियोब्लास्ट के लिए अनुकूलित किया गया है, और यह विधि निर्माता के मानक प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक मजबूत और सटीक मार्गदर्शिका प्रदान करती है। इस प्रोटोकॉल में कई पैरामीटर, जिसमें सेल सीडिंग घनत्व, यौगिकों की एकाग्रता, मीडिया में बहिर्जात सब्सट्रेट के अलावा, बफरिंग क्षमता शामिल है, को विशिष्ट सेल प्रकार और इसकी पृष्ठभूमि के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता है।

बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक पूर्व विवो सुसंस्कृत कोशिकाओं में सेलुलर चयापचय कार्यों के त्वरित और विश्वसनीय उपाय प्रदान करता है। अन्य जैविक assays की तुलना में, कुल परख समय आमतौर पर 60 से 120 मिनट के बीच है। उपकरण 37 डिग्री सेल्सियस के पूर्व निर्धारित तापमान को बनाए रखने के द्वारा सामान्य सेलुलर और शारीरिक स्थितियों को बनाए रखता है, कम जटिलताओं के साथ कुशल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परख परिणामों की सुविधा प्रदान करता है। आमतौर पर, बेसलाइन ओसीआर और ईसीएआर को अवरोधकों को जोड़ने से पहले तीन से चार बार दर्ज किया जाता है। अवरोधकों और उपचारों को भी क्रमिक रूप से इंजेक्ट किया जाता है, जो समय के साथ सेल के चयापचय प्रतिक्रिया माप की सुविधा प्रदान करता है। विश्लेषक शोधकर्ताओं को अनुकूलित परिस्थितियों में मानकीकृत परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देता है। विश्लेषक भी परख के दौरान विभिन्न यौगिकों को इंजेक्ट करने की क्षमता प्रदान करता है कोशिकाओं के श्वसन में वास्तविक समय परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए. उदाहरण के लिए, एटीपी दर परख के लिए, एक 2 μM oligomycin एक और 1 μM rotenone / 1 μM एंटीमाइसिन डिफ़ॉल्ट यौगिक इंजेक्शन-पोर्ट ए के रूप में एक मिश्रण का उपयोग करें: 2 μM Oligomycin एक; पोर्ट बी: 1 μM Rotenone / 1 μM एंटीमाइसिन ए।

परख मीडिया कुछ कारकों द्वारा विशिष्ट विकास मीडिया से अलग है, जिसमें पीएच में परिवर्तनों का बेहतर पता लगाने के लिए बाइकार्बोनेट की अनुपस्थिति शामिल है, ग्लूकोज, ग्लूटामाइन और पाइरूवेट की खुराक की अनुपस्थिति प्रयोगकर्ता को बहिर्जात सब्सट्रेट को अनुकूलित करने की अनुमति देती है, और मीडिया में पीएच मूल्यों की सटीक गणना करने के लिए फिनोल लाल नहीं होता है।

ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन, और सोडियम पाइरूवेट सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले बहिर्जात सब्सट्रेट हैं। इन सब्सट्रेट्स का उपयोग सेल प्रकार और प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए विशिष्ट है। इस संदर्भ में, यह मान्यता प्राप्त है कि ये assays, जबकि मूल्यवान, एक कृत्रिम प्रणाली का उपयोग करके प्रदर्शन कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, 10 एमएम ग्लूकोज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है; हालांकि, यह supraphysiological स्तर है, और शोधकर्ताओं को इस बात पर विचार करना चाहिए कि क्या अन्य ग्लूकोज सांद्रता अधिक उपयुक्त होगी। इस बिंदु पर, यह विचार करना भी आवश्यक है कि क्या बीएमएससी और ओस्टियोब्लास्ट में ग्लूकोज अपटेक इंसुलिन पर निर्भर करता है, और उस स्थिति में, इंसुलिन को भी जोड़ा जाना चाहिए। चूंकि यह31,32 क्षेत्र के भीतर बहस का विषय बना हुआ है, इसलिए इंसुलिन को शामिल करना पसंद किया जाता है। एक समान लाइन के साथ, अगर फैटी एसिड का उपयोग प्रयोगात्मक प्रश्न के सापेक्ष है, परख मीडिया को आगे फैटी एसिड के साथ पूरक किया जाना चाहिए। इन बहिर्जात substrates का महत्व assays और डेटा व्याख्या में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; इसलिए, इन substrates की सांद्रता सेल प्रकार और अनुसंधान प्रश्न के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए।

बाह्य कोशिकीय फ्लक्स विश्लेषक के प्राथमिक लाभों में से एक यह है कि इसे assays को चलाने के लिए कोशिकाओं की एक न्यूनतम संख्या की आवश्यकता होती है, जिसमें 96-अच्छी तरह से प्रारूप को देखते हुए उच्च एन होता है। सेंसर कारतूस भी चार इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से विभिन्न अवरोधकों और यौगिकों को इंजेक्ट करने की क्षमता को सक्षम करते हैं। परख को संशोधित करने के लिए लचीलापन, अतिरिक्त अवरोधकों और ब्याज के उपचार के साथ तीव्र इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए इस तकनीक का एक अतिरिक्त लाभ है। ये विशेषताएं विश्लेषक को उच्च थ्रूपुट करने में सक्षम बनाती हैं, कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या पर वास्तविक समय के एसेस और इसलिए शास्त्रीय क्लार्क ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड विधि पर बेहतर होती हैं। यद्यपि इलेक्ट्रोड विधि माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए सस्ती और सरल है, यह कहीं अधिक पृष्ठभूमि शोर देता है और विश्लेषक24,33 की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन है।

इसके अतिरिक्त, वर्णित वर्कफ़्लो में, विश्लेषक से प्राप्त सेल बायोएनर्जेटिक प्रोफ़ाइल को परख34 के बाद माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं की गिनती करके माइक्रोप्लेट इमेजर का उपयोग करके कुशलतापूर्वक सामान्यीकृत किया जा सकता है। व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या परख के बाद अच्छी तरह से अच्छी तरह से भिन्न हो सकती है; कोशिका गणना का उपयोग प्रोटीन या डीएनए सामान्यीकरण सहित अन्य तरीकों की तुलना में बेहतर है, क्योंकि कोशिकाओं के प्रोटीन या डीएनए सामग्री विभिन्न परिस्थितियों या उपचारों के तहत स्थिर नहीं रहती है, जिसके लिए सेलुलर ऊर्जावानों की तुलना की जा रही है। प्रोटीन या डीएनए सामग्री विभिन्न उपचारों के प्रभाव में भिन्न हो सकती है और इस विधि का उपयोग करके सामान्यीकरण का एक प्रमुख नुकसान है, उदाहरण के लिए, भेदभाव के दौरान ओस्टियोब्लास्ट की प्रोटीन सामग्री बदल जाती है। जैसे ही कोशिकाएं ओस्टियोब्लास्टोजेनेसिस के दौरान परिपक्व होती हैं, वे कुल सेलुलर प्रोटीन सामग्री को बढ़ाते हुए एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन को स्रावित करना शुरू कर देती हैं। यह समस्याग्रस्त हो सकता है जब विभिन्न विकास चरणों या ओस्टियोब्लास्टोजेनेसिस के समय बिंदुओं के तहत कोशिकाओं के परख परिणामों की तुलना की जाती है।

फायदों की भीड़ को देखते हुए, सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स की निगरानी करने के लिए विश्लेषक क्षेत्र को आगे बढ़ाने के लिए एक जबरदस्त अतिरिक्त रहा है। हालांकि, सीमाएं मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, इन assays की प्रमुख सीमाओं में से एक यह है कि वे केवल सेलुलर या ऑर्गेनोइड स्तर पर किए जा सकते हैं, और डेटा हमें विभिन्न शारीरिक परिस्थितियों में विवो में क्या होगा, इसका पूरा विचार प्रदान करने के लिए पर्याप्त नहीं है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, assays के दौरान बनाया गया सेलुलर वातावरण भी मूल शारीरिक आला से बहुत दूर है। ग्लूकोज, पाइरूवेट, ग्लूटामाइन, और ओलिक या पामिटिक एसिड जैसे विभिन्न पोषक तत्वों के पूरक द्वारा बनाए गए कृत्रिम सूक्ष्म वातावरण अक्सर ओस्टियोब्लास्ट के सामान्य शारीरिक स्तर से अधिक होते हैं। परख के लिए पोषक तत्वों में से एक के रूप में फैटी एसिड के अलावा सीमित है, क्योंकि हमारे शरीर में मौजूद उच्च कार्बन श्रृंखला लंबाई फैटी एसिड के अधिकांश बहुत हाइड्रोफोबिक और अत्यधिक अघुलनशील हैं। यह परख मीडिया के लिए उन्हें जोड़ने में तकनीकी कठिनाइयों में परिणाम. ओलिक या पामिटिक एसिड जैसे एकल फैटी एसिड के लिए कोशिकाओं की चयापचय प्रतिक्रिया अन्य शारीरिक स्थितियों के तहत अलग-अलग होती है, जहां कोशिकाएं विभिन्न फैटी एसिड और बाध्यकारी प्रोटीन के कॉकटेल का अनुभव करती हैं। अंत में, इस विधि का उपयोग करके एटीपी का माप, जबकि यकीनन स्थैतिक ल्यूमिनेसेंट एसेस से बेहतर है, अप्रत्यक्ष रूप से बना हुआ है क्योंकि यह तकनीक केवल ऑक्सीजन को मापती है। हालांकि यह एक प्रत्यक्ष माप नहीं है, यह सच है कि एटीपी सिंथेज़ इनहिबिटर, ओलिगोमाइसिन ए के अलावा, ओसीआर को मापने के दौरान इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधकों के बाद एटीपी में होने वाले परिवर्तनों का मजबूत सबूत प्रदान करता है। इसलिए, इन डेटा का समर्थन करने के लिए मास स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसी तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। फिर भी, जबकि इन सीमाओं पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए, यह उपकरण सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स के बारे में अमूल्य जानकारी प्रदान करता है।

अंत में, यह ध्यान दिया जाता है कि यह समझने के लिए कि बायोएनर्जेटिक्स में उक्त परिवर्तन सेलुलर कार्यक्षमता को कैसे प्रभावित करते हैं, विशेष रूप से बीएमएससी और ओस्टियोब्लास्ट्स के, पूरक प्रयोगों को विट्रो कल्चरिंग में शामिल करने की आवश्यकता होती है, जिसके बाद क्षारीय फॉस्फेट (एलिप), वॉन कोसा, या अलीज़ारिन धुंधला होता है।

अंत में, ऊपर वर्णित तरीके वास्तविक समय सेल चयापचय फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके ओस्टियोब्लास्ट्स में विभिन्न चयापचय मार्गों की निगरानी के लिए आधार प्रदान करते हैं। इस तरह के प्रयोगों को करने से इस बात की गहरी समझ होगी कि कैसे प्राथमिक, ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को कंकाल से संबंधित परिणामों में सुधार करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज (एनआईएएमएस) ग्रांट एआर072123 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए) ग्रांट एजी069795 (ईआरआर) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin EDTA Sigma-Aldrich T4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid Sigma - Aldrich PZ0160 UK5099
Antimycin A Sigma - Aldrich A8674
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide Sigma - Aldrich SML0601 BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma - Aldrich C2920 FCCP
Cytation 5 imaging reader BioTek N/A Microplate imager
Etomoxir sodium salt hydrate Sigma - Aldrich E1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM) Thermo Scientific 62249
Insulin Sigma - Aldrich I6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serum Sigma - Aldrich O3008
Oligomycin A - 5 mg Sigma - Aldrich 75351
Rotenone Sigma - Aldrich R8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF DMEM media Agilent Technologies 103575-100 DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Technologies S7800B Real- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent Technologies 102416-100 Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 software Agilent Technologies - BioTek
Wave software 2.6.1 Agilent Technologies
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9422-50G

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जीव विज्ञान अंक 181
ओस्टियोब्लास्ट बायोएनर्जेटिक्स की निगरानी करने के लिए रियल-टाइम सेल मेटाबोलिक फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करना
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Jayapalan, S., Nandy, A., Rendina-Ruedy, E. Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics. J. Vis. Exp. (181), e63142, doi:10.3791/63142 (2022).

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