Summary
Denne protokol beskriver en metode til at generere reproducerbare, småskala konstruerede lungevæv ved at genbefolke decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver med alveolære epiteltype 2-celler, fibroblaster og endotelceller.
Abstract
Der er behov for forbedrede 3-dimensionelle (3D) lungemodeller, der rekapitulerer den arkitektoniske og cellulære kompleksitet af den indfødte lungealveolus ex vivo. Nyligt udviklede organoidmodeller har lettet udvidelsen og undersøgelsen af lungeepitel-forfædre in vitro, men disse platforme er typisk afhængige af musetumorafledt matrix og / eller serum og inkorporerer kun en eller to cellulære slægter. Her beskriver vi en protokol til generering af manipulerede lungevæv (ELT'er) baseret på multi-lineage recellularisering af decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver (PCLS). ELT'er indeholder alveolære strukturer bestående af alveolær epitel, mesenchym og endotel inden for et ekstracellulært matrix (ECM) substrat, der ligner meget for den indfødte lunge. For at generere vævene oppustes rottelunger med agarose, skæres i 450 μm tykke skiver, skæres i strimler og decellulariseres. De resulterende acellulære ECM-stilladser gensås derefter med primære endotelceller, fibroblaster og alveolære epitelceller type 2-celler (AEC2'er). AEC2'er kan opretholdes i ELT-kultur i mindst 7 dage med et serumfrit, kemisk defineret vækstmedium. Gennem vævsforberedelses- og dyrkningsprocessen klippes skiverne i et kassettesystem, der letter håndtering og standardiseret cellesåning af flere ELT'er parallelt. Disse ELT'er repræsenterer en organotypisk kulturplatform, der skal lette undersøgelser af celle-celle- og cellematrixinteraktioner inden for alveolus såvel som biokemiske signaler, der regulerer AEC2'er og deres niche.
Introduction
Alveoler er de funktionelle enheder i den distale lunge, der omfatter et net af gasudvekslingsluftrum foret med alveolære epitelceller af type 1 (AEC1'er) og type 2-celler (AEC2'er). Bag epitelet er et tæt netværk af kapillærer samt understøttende mesenchym, alt understøttet af et ekstracellulært matrix (ECM) stillads, der giver både styrke og fleksibilitet til disse sarte luftsække1. Alveolerne er også skadestedet i adskillige lungepatologier, herunder idiopatisk lungefibrose2, akut respiratorisk nødsyndrom3 og alvorlig coronavirus sygdom-19 (COVID-19)4. Selvom arbejdet i løbet af det sidste årti har afdækket en bemærkelsesværdig plasticitet inden for lungeepitelet, forbliver de mekanismer, der muliggør distal lungereparation i nogle indstillinger - og som udelukker reparation i andre - et område med intens undersøgelse5. Udviklingen af forbedrede in vitro-platforme til modellering af alveolus ville lette studier af alveolær biologi, regenerering og terapi.
AEC2'er fornyer og differentierer sig til AEC1'er og betragtes således som den primære stamcelle i den distale lunge 6,7,8. Disse celler udgør imidlertid en særlig udfordring for in vitro-studier i betragtning af de vanskeligheder, der er forbundet med dyrkning af primære AEC2'er uden tab af fænotype9. I konventionel 2-dimensionel (2D) kultur flader AEC2'er ud og vedtager nogle funktioner i AEC1-lignende celler10. I modsætning hertil understøtter 3D-kulturstrategier, oftest organoider, opretholdelsen af differentierede træk i primære AEC2s 6,11,12 og tillader langvarig dyrkning af pluripotente stamceller (PSC)-afledtE AEC2s13,14. Organoider er blevet brugt til at modellere distal lungeudvikling15, virusinfektion11,15 og AEC2-relateret genetisk sygdom 13,16,17, hvilket muliggør vigtig indsigt i AEC2-biologi og regenerering. Imidlertid omfatter disse kulturmodeller typisk kun en eller to cellulære afstamninger og indlejrer cellerne i gel-type matricer, der ikke rekapitulerer enten arkitekturen eller ECM-substratet for den indfødte lungealveolus.
ECM er en kritisk regulator af cellefænotype og adfærd via molekylære, topologiske og mekaniske signaler; omfatter en nøglekomponent i vævsspecifikke nicher, der regulerer stamcelleskæbne og fungerer som et reservoir, der modulerer tilgængeligheden af lokalt udskilte vækstfaktorer 18,19,20,21. Dyrkning af celler på native ECM kan således øge in vitro-systemers prædiktive kapacitet til at modellere in vivo-vævenes biologi. Decellularisering, en proces, der fjerner cellulært materiale fra væv via vaskemidler, enzymer eller fysiske eller andre metoder, kan i vid udstrækning bevare ECM-stilladset af et indfødt organ, når det udføres omhyggeligt 22,23. Sådanne stilladser kan genbefolkes med celler til 3D biomimetisk kultur. Men mens decellulariserede stilladser i vid udstrækning anvendes til vævstekniske applikationer, har deres anvendelse til rutinemæssig cellekultur været begrænset. Flere tidligere undersøgelser har rapporteret decellularisering og recellularisering af lungeskiver eller små lungevævssegmenter. Ud over proof-of-concept-undersøgelser er 24,25,26, genbefolkede lungeskiver blevet brugt til at studere fibroblast-matrixadhæsion 27,28 og til at undersøge effekten af syge lungematricer på fibroblastfænotype27,29. Med forbedrede teknologier til rådighed til generering af præcisionsskårne vævsskiver kunne decellulariserede lungeskiver tilbyde en bekvem og lille platform til dyrkning af celler, samtidig med at alveolære, luftvejs- og vaskulære understrukturer bevares. Inkorporering af flere celletyper ville muliggøre undersøgelser af celle-celle-interaktioner inden for et fysiologisk relevant 3D-miljø. Der er imidlertid behov for forbedrede strategier for at lette håndteringen af væv gennem hele dyrkningsprocessen og for at sikre kontrolleret og reproducerbar såning af væv med et kendt antal celler.
Her præsenterer vi en protokol til at generere manipuleret lungevæv (ELT'er) ved at genbefolke decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver (PCLS) med primære endotelceller, AEC2'er og fibroblaster. I en tilpasning af vores tidligere beskrevne konstruerede hjertevævssystem30 og hele lungedecellulariseringsstrategier 22,31 beskriver vi procedurer til at skære PCLS fra rottelunger og klippe skiverne i genanvendelige vævskulturkassetter, der forenkler og standardiserer nedstrøms manipulationer. Klippede skiver decellulariseres til dannelse af acellulære ECM-stilladser, som genbefolkes i tilpassede frøbade. Lungeskivestilladser bevarer kritiske ECM-komponenter og arkitektur og understøtter væksten af AEC2'er inden for multi-lineage alveolære strukturer i mindst 7 dage. ELT'er repræsenterer et nyt alveolært cokultursystem inden for en fysiologisk relevant 3D-matrix, som skal understøtte udviklingen af lungevævstekniske strategier, samtidig med at de letter grundlæggende biologiske undersøgelser af AEC2'er og alveolus.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er beskrevet i dette papir, blev godkendt af Yale Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Oprettelse af vævskulturkassetter og frøbade
BEMÆRK: Når de er fremstillet, kan vævskulturkassetter og såbade autoklaveres og genbruges til gentagne runder af ELT-kultur.
-
Vævskulturkassetter
- Brug en laserskærer til at skære vævskulturkassetterammer og klip ud af 3/32 tommer tyk polytetrafluorethylen (PTFE) i henhold til designene i henholdsvis supplerende fil 1 og supplerende fil 2. Brug en laserskærer til at skære vævskulturkassettefaner ud af 1/16 tommer tyk PTFE i henhold til supplerende fil 3. Skær konturer 3x ved hjælp af 80% effekt og 15% hastighed (til en 30 W laserskærer).
-
Såning bade
- Brug CAD-filerne til såbadet (supplerende fil 4 og supplerende fil 5) til at 3D-printe henholdsvis bunden og ringen af frøbadformen ved hjælp af klar harpiks.
- Blødgør formene i en opløsning af 10% poloxamer 407 i destilleret vand natten over før brug for at hjælpe med PDMS-frigivelse. Lad luften tørre, monter derefter ringen over bunden af formen og pakk den ind i fleksibel plastfilm for at forhindre lækage.
- Der fremstilles mindst 60 g pr. form polydimethylsiloxan (PDMS) ved at blande PDMS-elastomer i forholdet 10:1 med hærdningsmiddel, og der hældes i den 3D-printede form. Afgas PDMS i en vakuumdissifikator i 30 minutter for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Bag såbade ved 60 °C i 8 timer.
2. Forberedelse af præcisionsskårne lungeskiver fra rottelunger
- Orgelhøst
- Forbered et delt perfusionssystem bestående af tyngdekrafts- og pumpedrevne lemmer, som vist i figur 1. Tilslut en lungearterie (PA) kanyle til enden af slangen, der består af et 1/16 tommer pigget Y-stik fastgjort til en 1/2 tommer længde af LS 14 silikonerør og et 3/32 tommer hunluerlåsstik (se figur 1). Fastgør ikke en kontraventil til kanylen på dette tidspunkt.
- Linjerne med PBS indeholdende 100 U/ml heparin og 0,01 mg/ml natriumnitroprossid (SNP) til henholdsvis antikoagulation og vasodilatation. Indstil perfusionspumpen til 30 ml/min.
BEMÆRK: Tilsæt SNP frisk til heparinopløsningen og hold beskyttet mod lys. - Dosis en voksen (8-12 uger gammel, ca. 300-350 g) Sprague-Dawley rotte med en intraperitoneal (IP) injektion på 400 U/kg heparin til antikoagulation efterfulgt af en IP-injektion af ketamin (75 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg) til anæstesi. Bekræft et kirurgisk anæstesiplan via manglende respons på skadelig stimulus (tåspids).
- Trim brystet og maven af pels ved hjælp af hårklippere. Spray derefter med 70% ethanol og tør 3x med 10% povidon-jod.
- Tag fat i huden under mellemgulvets niveau med rottetandtang. Lav derefter et 1/2 tommer tværgående snit i huden med finspids saks. Tag fat i den udsatte abdominale fascia med tangen, lav et 1/2 tommer tværgående snit i fasciaen, og udvid derefter snittet gennem huden og fasciaen over bredden af den øvre del af maven.
- Brug spidsen af den fine saks til at lave et lille snit (højst 1/8 tommer) i midten af den forreste membran, hvilket får lungerne til at trække sig tilbage i brystkassen. Forlæng snittet i membranen over brystets fulde bredde.
- Lav to lodrette snit gennem brystkassens fulde højde mod nakken, og pas på ikke at beskadige lungerne. Forlæng snittet gennem venstre ribben for at skære gennem kravebenet og langs siden af nakken til strubehovedets niveau og udsætte luftrøret.
- Dissekere luftrøret fri for omgivende bindevæv og fra spiserøret. Lav et tværgående snit over den forreste halvdel af luftrøret mellem to bruskringe tæt på strubehovedet. Tråd en 4-0 polypropylen sutur bag luftrøret, under snitniveauet, og bind løst den første halvdel af en kirurgs knude med to vendinger.
- Placer en kanyle bestående af en 1/16 tommer pigget Y-connecter forbundet til en envejs kontraventil og en 1/2 tommer længde af LS 14 silikonerør med et 3/32 tommer hunluerlåsstik (se figur 1) i luftrøret ved at indsætte en lem af Y-stikket i trakealsnittet mod lungernes retning.
- Placer den forbundne sutursløjfe omkring luftrøret på niveau med den indsatte kanyle, og stram rundt om det indsatte Y-stik for at fastgøre kanylen på plads. Tilføj to enkelt-twist kast af suturen for at fuldføre knuden.
- Fyld en 10 ml sprøjte med luft og tilslut til luer-låsen på trakealkanylen.
- Klem den ringere vena cava tæt på membranen ved hjælp af en buet hæmostat, og injicer derefter hjertet med 150 U heparin (1000 U / ml) via højre ventrikel (RV).
- Delvis åbning af stophanen for tyngdekraftslinjen for at frembringe en langsom, men konstant drypning af PBS/heparin/SNP fra PA-kanylen, der er fremstillet i trin 2.1.1.
- Træk nålen på en 4-0 polypropylen sutur bag bunden af PA'en, hvor den forlader RV. Brug den første halvdel af en kirurgs knude til at binde en løs sutursløjfe rundt om bunden af PA.
- Lav et lille snit (ikke mere end 1/8 tommer) i RV lige under og vinkelret på PA'en ved hjælp af en fin saks, og indsæt derefter en lem af PA-kanylen Y-stikket i bunden af PA. Fastgør suturen omkring PA'en og det indsatte stik, og tilføj et enkelt twist-kast for at fuldføre kirurgens knude.
BEMÆRK: Kannulering af PA under flow forhindrer tilførsel af luftbobler i vaskulaturen, der kan udelukke tilstrækkelig rydning af lungerne. - Fastgør en envejsventil til den anden ende af PA-kateterets Y-stik, og afskær derefter hjertets spids for at tillade blodgennemstrømning via venstre ventrikel.
BEMÆRK: Manglende afskæring af hjertets spids inden perfusing via pumpen kan forårsage skade på blod-gasbarrieren, hvilket fører til lækage af væske i luftrummet. - Skift perfusionsledningen til pumpesiden ved hjælp af stophanen, der forbinder de to linjer, og tænd derefter pumpen ved 30 ml / min. Mens du perfuserer lungerne via PA, skal du manuelt ventilere lungerne via 10 ml trakealsprøjten ved ca. 10-15 vejrtrækninger / min for at lette rensning af lungerne for blod. Perfuse lungerne, indtil de bliver for det meste hvide, normalt kræver 40 ml PBS / heparin / SNP eller mindre.
BEMÆRK: Utilstrækkelig rydning af lungerne af blod kan forringe nedstrøms decellularisering. - Skær det bageste luftrør lige over niveauet af trakealkanylen, og disseker derefter lungerne og hjertet fri for alt resterende bindevæv og ekstraher lungerne og hjertet en bloc.
- Fyld en 10 ml sprøjte med 2% lav smeltepunktsagarose i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) uden phenolrød, forvarmet til 42 °C.
BEMÆRK: Det nøjagtige volumen af agarose, der kræves, varierer efter lungestørrelse. Større lunger (dvs. fra rotter større end 400 g) vil kræve mere end 10 ml agarose. - Oppust manuelt de ekstraherede lunger 3x med 10 ml luft (dvs. til omtrent total lungekapacitet) via luftrørskanylen for at hjælpe med at rekruttere kollapset parenchyma.
- Oppust straks lungerne med den forberedte sprøjte med agarose ved manuelt at injicere agarosen via luftrørskanylen med en hastighed på ca. 40 ml /min, lige indtil de mest distale spidser af lungeloberne er oppustet. Hvis distale lungeområder forbliver kollapsede, injiceres yderligere 1-2 ml agarose.
- Cap luftrøret ved at fastgøre den hvide hætte fra en 4-vejs stophane til den kvindelige luerlås i trakealkanylen. Læg lungen i en 150 mm petriskål på is, så agarosen kan størkne.
BEMÆRK: Inflation af lungen kort efter ekstraktion er afgørende for at sikre ensartet fyldning af lungeparenchymen og efterfølgende vellykket vævsskæring. Hvis lungen pustes meget ujævnt op, skal du ikke fortsætte med lungeskæring, da skivekvaliteten vil være dårlig.
- Lungesnit
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at tilpasse den nøjagtige udskæringsprocedure baseret på den anvendte vibrationsmikrotom (vibratom); yderligere eksempler på PCLS-forberedelse med forskellige vævsskiver er blevet offentliggjort tidligere 32,33,34.- Forkøl metalkøleblokken ved -20 °C og hold den på is, når den ikke anvendes under hele udskæringsproceduren.
- Brug en lille dråbe cyanoacrylatlim til at fastgøre et blad til knivholderen. Fastgør forsigtigt knivholderen til vibratomen ved hjælp af en unbratnøgle, så den bare flugter med enden af et prøverør indsat i bufferbakken.
- Forbered 6-brønds plader med 3 ml pr. godt steril iskold HBSS uden phenolrød for at opsamle skiverne.
- Brug en skalpel til at skære et stykke lungevæv ca. 1-1,5 cm3.
BEMÆRK: Lungevæv fra de nedre og midterste dele af venstre lobe såvel som fra højre midterste og nederste lobes giver lettest større vævsskiver, der maksimerer alveolært område. Hvis der er uinflaterede vævsområder eller områder med bindevæv, skal du enten trimme dette væv af med en saks eller orientere sig nedad mod stemplet; sådant væv har tendens til ikke at skære rent. - Anbring en lille dråbe cyanoacrylatlim på prøverørets stempel. Dup lungevæv på en papirserviet for at fjerne overskydende fugt, og placer derefter straks lungevævet oven på stemplet ved hjælp af et par tang.
- Skub prøverørets metalrør op til niveauet for toppen af vævet og hold på plads, med stemplet trukket tilbage. Pipetter forvarmet 2% agarose i HBSS i toppen af røret for helt at omgive vævet.
- Placer den iskolde køleblok omkring vævet i ca. 1 minut for at lade agarosen størkne.
- Indsæt prøverøret i bufferbakken. Fyld bakken med iskold PBS midtvejs i vævsblokken. Drej motorbokskontakten til hurtig fremad (FF) for at fremme motorboksstemplet, så det bare rører bunden af prøverøret.
- Indstil de ønskede indstillinger for skivetykkelse, skærehastighed og svingningsfrekvens, for eksempel 450 μm tykkelse, hastighed 4 og svingningsfrekvens 5. Vælg Fortløbende tilstand, og drej derefter kontakten til Til for at begynde udskæringen.
- Når vævsskiver falder i bufferbakken, overføres de til de forberedte 6-brønds plader ved hjælp af en podningssløjfe eller spatel.
- Stop udskæringen, når der er ca. 2 mm vævstykkelse tilbage i prøverøret, for at undgå at beskadige bladet eller skærevævet indeholdende lim.
- Gentag ovenstående trin for at skære yderligere lungevæv efter ønske.
- Decellulariser skiver straks til stilladsforberedelse, eller snap-frys og opbevar ved -80 ° C i op til 2 måneder. For at fryse skal du overføre 4-6 skiver til en 35 mm petriskål og forsigtigt suge overskydende væske fra omkring skiverne. Anbring opvasken i et bad med tøris og 100% ethanol for at snap-fryse, pakk derefter i folie, forsegl i en plastikpose og overfør til -80 °C.
BEMÆRK: Anbring ikke friske skiver direkte i en -80 ° C fryser, da den relativt langsomme frysehastighed kan forårsage dannelse af iskrystaller, der kan beskadige vævet.
3. Forberedelse af lungevævsstilladser
- Fremstilling af materialer og decellulariseringsløsninger
- Autoklaverammer, klip og faner.
- Forbered decellulariseringsløsninger som beskrevet i tabel 1.
BEMÆRK: Tilsæt benzonasnuklease til forvarmet buffer umiddelbart før brug og sterilt filter. Forbered Triton X-100 og natriumdeoxycholat (SDC) opløsninger inden for 24-48 timer efter decellulariseringsproceduren. Antibiotiske/antimykotiske opløsninger og benzonasebuffer op til 30 d klargøres på forhånd og opbevares ved 4 °C.
- Skæring og klipning af lungeskiver
BEMÆRK: Mens skæring og klipning kan udføres ikke-sterilt på bordpladen, skal decellulariseringstrinnene i afsnit 3.3 og al efterfølgende håndtering af vævsstilladserne udføres i en laminær flowhætte.- Fyld et 100 mm petriskål ca. en tredjedel fyldt med PBS. Overfør kassetter (rammer, der indeholder to klip hver) og faner til skålen ved hjælp af tang.
- Hvis du bruger frosne skiver, skal du optø en skål ad gangen ved at hælde stuetemperatur PBS i skålen for at dække skiverne. Opbevar resterende retter på tøris.
- Overfør en optøet skive til en 150 mm petriskål. Fold forsigtigt skiven ud ved hjælp af fine pincet, hvis det er nødvendigt, så den ligger fladt, og opsuger derefter forsigtigt overskydende PBS fra omkring vævet.
- Brug et barberblad med en lineal som vejledning til at skære en 3 mm bred strimmel fra skiven ved at trykke bladets fulde længde fast mod fadet og vippe det let fra side til side med knivkanten holdt på plads. Alternativt kan du bruge en roterende fræser eftermonteret med 2 parallelle knive adskilt af en 3 mm specialfremstillet afstandsstykke (f.eks. lavet af acetal [polyoxymethylen]) til at skære vævsstrimler. Undgå tårer, huller, store luftveje eller kar eller tykt bindevæv.
BEMÆRK: For vellykket klipning skal strimlen være mindst 9 mm lang. - Brug pincet til at overføre vævsstrimlen til den tilberedte 100 mm petriskål.
- Klip vævsstrimlen ind i kassetten: Flyd vævet over kassetten, centrer vævet for at hænge hullerne i klemmerne i hver ende. Med fine tang skal du placere en fane delvist i hullet i den ene ende, forsigtigt rette vævet og derefter placere den anden fane. Brug pincet i hver hånd til at trykke hver fane helt ind for at sikre vævet.
BEMÆRK: Hvis du har svært ved at holde vævet på plads inden klipning, skal du suge noget PBS fra skålen for at sænke væskeniveauet. Pas på ikke at strække vævet ved placering af det andet klip, da dette kan føre til rivning. - Optønings-, skære- og klipningsproceduren gentages i trin 3.2.2-3.2.6 for så mange væv som ønsket.
- Skive decellularisering
- Når alle skiver er klippet, overføres 100 mm skålen, der indeholder kassetterne, til en laminær flowhætte.
- Begynd trin 1 i decellulariseringsprotokollen (se tabel 2): Brug en buet hæmostat til at gribe fat i de hakkede sider af hver kassette, overfør kassetter til 6-brøndplader (2 væv / brønd) fyldt med 3 ml PBS + ioner + antibiotika / antimykotika pr. Brønd (se opløsningsopskrift i tabel 1).
- Placer brøndplader på en orbitalryster ved 30 o / min i 10 minutter.
- Fortsæt med trin 2 i decellulariseringsprotokollen (se tabel 2): opsuge væsken fra hver brønd, udskift derefter med 3 ml / brønd PBS + ioner, placer pladen på orbitalryster ved 30 o / min og inkuber i 5 minutter.
- Trin 3.3.4 gentages for hver af opløsningerne og de tilsvarende varigheder som beskrevet i decellulariseringsprotokollen i tabel 2.
- Efter det sidste skylletrin med PBS + antibiotika/antimykotika (trin 20 i tabel 2) overføres væv til sterile 6-brøndsplader med friske PBS + antibiotika/antimykotika og inkuberes ved 37 °C i 48 timer.
BEMÆRK: Efter sterilisering med antibiotika/antimykotika kan lungevævsstilladser sås med det samme eller opbevares ved 4 °C i op til 30 d.
4. Skive recellularisering og kultur
BEMÆRK: Figur 2 viser en foreslået tidslinje for vævssåning og dyrkning, hvor skiver først podes med rottelungemikrovaskulære endotelceller og dyrkes i endotelmedium med lavt serum; derefter podet med rotte AEC2'er og rottelungefibroblaster med et serumfrit AEC2-vækstmedium (tilpasset fra Jacob et al.13 og You et al.35); se yderligere noter om cellekilder, der anvendes i resultater og kulturmediedetaljer i tabel 3. Denne strategi giver alveolære strukturer indeholdende AEC2 monolag.
- Forberedelse af vævsstilladser til såning (dag -4 eller -3)
- Hvis der anvendes vævsstilladser, der opbevares ved 4 °C, inkuberes stilladser natten over ved 37 °C med frisk PBS + antibiotika/antimykotika (10 % penicillin/streptomycin, 4 % amphotericin B, 0,4 % gentamicin i PBS) inden såning.
- Skyl stilladser 3x med steril PBS (5 ml/brønd), 5 min hver.
- Undersøg stilladser under et fasekontrastmikroskop ved 5x forstørrelse for at vælge væv til såning.
BEMÆRK: De bedste stilladser til såning har ingen tårer eller huller og indeholder ikke store luftveje eller skibe. Mens stilladser med funktionerne kan sås med succes, kan genpopulationsmønstre afvige fra dem, der observeres i alveolære områder.
- Endotelcellesåning (dag -3)
- Tæl endotelceller ved hjælp af et hæmocytometer, og forbered endotelcellesuspensionen i endotelmedium (se tabel 3) ved 5 x 106 celler / ml med tilstrækkelige celler til at frø 500.000 endotelceller pr. Skive (f.eks. for 12 skiver, resuspend 6 x 106 celler i 1,2 ml medium).
- Placer autoklaverede frøbade i 100 mm petriskåle. Overfør skyllede stilladser på hovedet til frøbade: Brug en fin buet hæmostat til at gribe en kassette ved de hakkede sider, brug en lige hæmostat eller tang til at gribe fat i den ene ende af kassetten (pas på ikke at røre selve vævet) og vend derefter kassetten igen med spidserne af den fine buede hæmostat via hullerne langs de hakkede sider, og læg i et frøbad godt. Gentag for resterende kassetter.
BEMÆRK: Når de er korrekt placeret, vil stilladser være centreret på hovedet i bunden af hver brønd. Tryk om nødvendigt forsigtigt ned på hjørnet af kassetten med spidsen af en hæmostat for at sikre, at kassetten sidder fladt i brønden. Forkert placering af kassetten kan føre til dårlig vævssåning. Det er acceptabelt, hvis brønden indeholder en lille mængde PBS. - Hvirvl den forberedte cellesuspension forsigtigt for at blande, og brug derefter en manuel pipette til at pipettere 100 μL celler direkte oven på hvert væv i bunden af brønden, idet du er forsigtig med ikke at beskadige vævet med pipettespidsen.
- Overfør podet væv til cellekulturinkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2.
- Efter 2 timer tilsættes 900 μL forvarmet kulturmedium til hver brønd ved hjælp af en manuel pipette, og vend derefter tilbage til inkubatoren. Hvis en kassette bliver løsnet (flyder) efter tilsætning af medium, skal du forsigtigt trykke ned på hjørnet af kassetten med pipettespidsen, så den ligger fladt i brønden.
- Skift medium på dag -2. Fjern mediet ved at vippe petriskålen og manuelt pipettere med en pipettespids let placeret i hjørnet af brønden for ikke at forstyrre kassetten. Udskift med 1 ml frisk endotelmedium pr. Brønd.
- AEC2 og fibroblast såning og vævskultur (dag 0)
- Tæl AEC2'er og fibroblaster ved hjælp af et hæmocytometer. Forbered en 1: 1 celle suspension af AEC2s og fibroblaster i AEC2 vækstmedium (epitelbase medium + AEC2 kosttilskud; se tabel 3) ved 5 x 106 samlede celler / ml, med tilstrækkelige celler til at frø 500.000 celler (250.000 AEC2s og 250.000 fibroblaster) pr. Skive (f.eks. til 12 skiver, resuspend 3 x 106 AEC2s + 3 x 106 fibroblaster sammen i 1,2 ml medium).
- Pipetter mediet ud fra hver brønd i såbadet som beskrevet i trin 4.2.6. Hvirvl den forberedte cellesuspension forsigtigt for at blande, og pipetter derefter 100 μL celler direkte oven på hvert væv i bunden af brønden.
BEMÆRK: Det er acceptabelt, hvis en lille mængde endotelmedium forbliver i brønden før AEC2 / fibroblast såning. - Overfør podet væv til cellekulturinkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2.
- Efter 2 timer tilsættes 900 μL forvarmet AEC2 vækstmedium til hver brønd og vender derefter tilbage til inkubator.
- Efter 24 timers dyrkning (dag 1) forberedes en 12-brøndplade med 1 ml forvarmet AEC2-vækstmedium pr. Brønd pr. Kassette.
- Pipetter 800 μL medium fra hver brønd i såbadet. Fjern kassetter fra såbadet: tag fat i hver med en fin buet hæmostat via hullerne langs de hakkede sider, overfør til en lige hæmostat eller tang for at gribe fat i kassetten i den ene ende og vend, brug derefter den buede hæmostat til at gribe kassetten via de hakkede sider og overfør højre side opad, en pr. Brønd, til den forberedte 12-brøndplade.
- Skift kulturmedium i 12-brøndpladen hver anden dag indtil dag 7 eller for den ønskede kulturlængde: Brug en glasPasteur-pipette til at aspirere mediet fra hver brønd, og pas på ikke at røre vævet; pipette i 1 ml frisk AEC2 vækstmedium pr. brønd.
BEMÆRK: Graden af repopulation af væv kan overvåges via fasekontrastmikroskopi ved 5x forstørrelse i hele dyrkningsperioden.
5. Vævshøst og prøveanalyse
- For at fastgøre ELT'er til histologi og immunofluorescerende farvning overføres vævskulturkassetter til 10% neutralbufferet formalin og inkuberes i 3-4 timer ved stuetemperatur på en vippe. Fjern væv fra kassetter ved at bruge spidsen af en fin spids tang til at skære vævet, hvor det møder fanerne. Behandle væv i henhold til rutinemæssige metoder til paraffinindlejring og histologi; der kræves ingen specialiserede teknikker.
- For at behandle ELT'er til qRT-PCR skylles væv i kassetter i PBS 2x, fjernes derefter væv og snap fryses eller fortsættes med lysis til RNA-ekstraktion.
BEMÆRK: Pooling af mindst 2 skiver podet med 1 x 106 celler og dyrket i 7 dage bør give rigelig RNA til downstream PCR-analyse.
Representative Results
En oversigt over processen til at generere ELT'er - bestående af lungeskæring, skiveklipning og decellularisering og stilladsrepopulation - er vist i figur 3. De ELT'er, der præsenteres her, blev dyrket ved hjælp af primære rottelungemikrovaskulære endotelceller (se materialetabel), neonatale rotte-AEC2'er og lipofibroblast-berigede neonatale rottelungefibroblaster36. AEC2'er blev frisk isoleret via magnetisk perlebaseret sortering som tidligere beskrevet37; alternative isolationsprotokoller er blevet detaljeret og diskuteret andetsteds 38,39,40. Renheden af isolerede rotte-AEC2'er kan vurderes via flowcytometri til rottespecifik AEC2-overflademarkør RTII-7041 eller via farvning af en cytocentrifuged celleprøve til RTII-70 eller pro-overfladeaktivt protein C (pSPC). Rottelungefibroblaster blev isoleret fra postnatal dag 7-9 rotteunger i henhold til en tilpasning af en offentliggjort protokol42 og anvendt ved passage 1-2; Alternative isolationsprotokoller er beskrevet andetsteds43,44. Renheden af isolerede fibroblaster kan vurderes via farvning af dyrkede eller cytocentrifuged celler til mesenkymal markør vimentin, og lipofibroblast berigelse kan vurderes via farvning for Oil Red O45.
Når lungevævet er ensartet oppustet med agarose, og vævsstykker strategisk udvalgt og orienteret til udskæring for at maksimere det samlede og parenkymale vævsområde, kan en rottelunge give væv til >100 alveolære ELT'er. Strimler af PCLS udviser tilstrækkelig mekanisk integritet til at blive klippet i vævskassetter med få (<5%) tilfælde af rivning (figur 3B).
Protokollen til decellularisering af lungeskiver er tæt baseret på vores tidligere offentliggjorte hele lungedecellulariseringsprotokol, som ved kvantitativ proteomics blev påvist at bevare mange ECM-komponenter på niveauer, der ikke adskiller sig væsentligt fra dem i native lung22. Decellulariserede skivestilladser bevarer alveolernes oprindelige arkitektur, set ved hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning (figur 4A,B) og ved fasekontrastmikroskopi (figur 4C). Vi udelukker typisk stilladser, der indeholder store luftveje eller skibe (figur 4D) eller tårer, selvom førstnævnte kan medtages, hvis de er af interesse for forskeren. Decellularisering fører til en reduktion på 96% i vævs-DNA-indhold målt ved et assay for dobbeltstrenget DNA (se Materialetabel; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg i henholdsvis native vs decellulariseret væv, middel ± SEM) (figur 5A), uden dna synligt ved hæmatoxylinfarvning (figur 4B). Histologisk og immunfluorescerende farvning af decellulariserede stilladser afslører vedligeholdelse af ECM-proteiner kollagen, elastin, kollagen IV og laminin med arkitektur og mængde svarende til den i indfødte lungeskiver (figur 5B-E). Bemærk, at kernerne i indfødte væv pletter blå / sort med trichome (til kollagen) og EVG (til elastin) pletter. Immunofluorescerende farvning blev udført som beskrevet tidligere ved anvendelse af standardmetoder til farvning af væv37. De anvendte antistoffer og deres respektive koncentrationer er anført i tabel 4.
Vellykket stilladsrepopulation fører til stærkt cellulære ELT'er efter 7 dage med et alveolært genpopulationsmønster synligt ved lysmikroskopi (figur 6A-C). I nogle tilfælde, med meget høj cellularitet, kan strukturer af organoid-typen være synlige (figur 6A, B). Mislykket vævssåning kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi under dyrkning (figur 6C). Efter dyrkning af vævsstilladser med AEC2'er, fibroblaster og endotelceller genbefolkes ELT'er tæt med alveolære strukturer, der omfatter alle tre cellelinjer (figur 6D, E). På dag 7 eller 8 opretholder AEC2'er kuboid morfologi og udtrykker overfladeaktivt protein-B (SPB) og lamellært kropsprotein ABCA3 uden tegn på signifikant differentiering til AEC1'er (figur 6E, F). AEC2'er er meget proliferative i ELT'er, som det fremgår af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering efter en 2 timers puls ved 10 μM (figur 6G).
Figur 1: Skematisk perfusionssystem til lungeekstraktion og rydning. (A) Perfusionssystemet omfatter et tyngdekraftsdrevet lem, der anvendes til indledende kannulering af lungearterien under flow; og et pumpedrevet lem, der bruges til at rydde lungerne effektivt efter indledende kannulation. Pumpeledningen indeholder en "pulsdæmper", der dæmper trykspidserne forårsaget af pumpen. Designet af trakeal- og lungearteriekanyler er detaljeret til venstre. SNP = natrium nitroprussid. (B) Oplysninger om samling af pulsdæmpere. BPT og silikone henviser til typer slanger. (C) Positioner af trakeale og lungearterielle kanyler placeret under lungeekstraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kulturtidslinje for recellularisering af tri-afstamning. Foreslået tidsplan for elt-såning og dyrkning af tre-slægter, herunder tidspunkt for tofaset såning. Cellenumre for såning og dyrkningsmedium for hver fase er angivet. Se oplysninger om kulturmedier i tabel 3. AEC2 = alveolær epitel type 2 celle. EC = endotelcelle. FB = fibroblast. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk af manipuleret lungevævsforberedelse. (A) Indfødt lungevæv skæres i skiver ved hjælp af en vibratom. (B) Præcisionsskårne lungeskiver skæres i standardiserede 3 mm brede strimler, klippes i polytetrafluorethylen (PTFE) vævskulturkassetter og vaskemiddeldecellulariseres for at give acellulære ekstracellulære matrixstilladser. (C) Stilladser gensås i specialiserede såbade, der begrænser såområdet til vævets område og dyrkes derefter i en standard brøndplade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Struktur af decellulariserede lungestilladser. H&E farvning af indfødte (A) og decellulariserede (B) lungeskiver, der viser bevarelse af alveolær arkitektur efter decellularisering. (C,D) Eksempler på decellulariserede ECM-stilladser set ved 5x forstørrelse ved fasekontrastmikroskopi, der overvejende omfatter alveolær væv (C) eller indeholder store forgrenede luftveje og kar (D, sorte og røde pilespidser). Skalastænger, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: DNA-fjernelse og matrixbevarelse i decellulariserede lungestilladser. (A) Kvantificering af DNA i indfødte og decellulariserede lungeskiver (gennemsnitlig ± SEM, n = 5). Welch's t test, **P < 0,01. Decell = decellulariseret. (B,C) Histologisk farvning af indfødte og decellulariserede lungeskiver til kollagen (B) og elastin (C). Pilespidser, elastin bevaret i alveolære indgangsringe af decellulariseret væv. (D,E) Immunofluorescerende farvning af indfødte og decellulariserede lungeskiver til kollagen IV (D) og laminin (E). Vægtstænger, 50 μm. I alle paneler skitserer stiplede felter det billedområde, der forstørres til højre i hvert respektive panel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Cellulær repopulation af manipuleret lungevæv. (A-C) Eksempler på recellulariserede ELT'er på kulturdag 7, som visualiseret under dyrkning ved fasekontrastmikroskopi. Recellulariseringsmønsteret afspejler vævets alveolære struktur. I nogle områder med høj cellularitet kan der dannes organoidlignende strukturer (pilespidser). (A) og (B) repræsenterer vellykket cellerepopulation, mens (C) repræsenterer et dårligt niveau af recellularisering efter 7 dages kultur. (D-G) Farvning af recellulariserede ELT'er på dag 7 eller 8 af kulturen. (D) H&E-farvning, der viser cellulær repopulation af den alveolære septa. (E) Immunofluorescerende farvningsetiketter indpodet proCollagenIα1+ fibroblaster, ABCA3+ AEC2'er og CD31+ endotelceller. (F) Væv indeholder rigelige SPB + AEC2'er, men få RTI-40 (podoplanin)+ AEC1'er under disse betingelser. (G) Mange AEC2'er breder sig i ELT'er, målt ved EdU-inkorporering. Vægtstænger, 500 μm (AC); 25 μm (D-G). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Decellulariseringsløsninger. Forberedelse detaljer for decellularisering løsninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Decellulariseringsprotokol. Detaljer om protokol til decellularisering af lungeskiver. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Kulturmedier. Forberedelse detaljer for endotel og AEC2 vækstmedier. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Antistoffer anvendt til immunstaining. Detaljer om antistoffer og deres koncentrationer anvendt til immunostaining. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Design til laserskæring af vævskulturkassetterammer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 2: Design til laserskæring af vævskulturkassetteclips. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 3: Design til laserskæring af vævskulturkassettefaner. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 4: CAD-fil til såning af badformbase. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 5: CAD-fil til såning af badformring. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Dette papir beskriver brugen af decellulariserede præcisionsskårne lungeskiver som en platform til at generere manipulerede lungevæv in vitro, som indeholder multi-lineage alveolære strukturer. Ved at kombinere strategier, som vi tidligere har udviklet til at genbefolke acellulære ECM-lungestilladser med høj nøjagtighed til hele lungeteknik22,31, med vores robuste system til dyrkning af småskala manipulerede hjertevæv30, muliggør denne protokol brugen af fysiologisk relevant lunge-ECM som et vævskultursubstrat på en repeterbar og moderat gennemstrømningsmåde.
De metoder, der præsenteres her, beskriver ELT-stilladsforberedelse fra rottelunger, som er let opnåelige, kan ekstraheres en bloc med direkte adgang til intakte luftveje for agaroseinflation og er af større størrelse end muselunge. Imidlertid kan lungevæv, der kan oppustes med agarose og udbytteskiver på mindst 9 mm i længden, anvendes inden for dette system. Uanset vævskilde er ensartet inflation af lungevævet med agarose det mest kritiske trin for at sikre succes med nedstrøms vævsskæring, klipning og vævshåndtering. Underinflateret lungevæv har tendens til ikke at skære rent, mens overinflateret væv kan rive under klipning. Efter agarosegelering er passende oppustede vævsområder faste, men giver lidt give, når de forsigtigt presses med tang. For intakte rottelunger fandt vi, at præ-oppustning af de ekstraherede lunger med luft flere gange efterfulgt af agaroseinflation så hurtigt som muligt efter ekstraktion resulterer i de bedste udskæringsresultater og den bedste kvalitet af resulterende vævsstilladser. Det passende volumen agarose skal optimeres empirisk; for en rottelunge er det volumen, der kræves for at puste lungen op til den samlede lungekapacitet, ca. 30 ml/kg dyremasse (f.eks. 10,5 ml agarose til lunger fra en 350 g rotte). For større resekteret lungevæv med mindre ligetil luftvejsadgang (såsom dem fra humane donorer) kan det være nødvendigt med yderligere fejlfinding for at puste vævet op via en bronchus32. Under efterfølgende lungeskæring er udvælgelsen og orienteringen af vævet på stemplet et andet vigtigt skridt til 1) sikre, at skiverne er store nok til at generere vævsstrimler, der kan klippes i vævskulturkassetter og 2) maksimere parenkymalt (alveolær) vævsområde, undtagen store luftveje eller kar.
Klipning af PCLS i vævskulturkassetter kan være et udfordrende trin i starten, men kassetterne forenkler i høj grad vævshåndtering under decellularisering og såning. To potentielle problemer, der kan opstå, er vævsrivning (enten under klipningsprocessen eller under decellularisering) eller vævspositionering i klippene, der resulterer i dårlig nedstrøms såning (f.eks. Ingen såning eller såning lige i enderne). Rivning kan være resultatet af overinflation af agarose, overstrækning af vævet under indsættelse af faner eller efterlader for lidt udhæng til at give tilstrækkeligt vævsgreb, når tapperne indsættes. Bemærk, at skiver, der rives i den ene klipende, kan podes med succes, men de er vanskelige at visualisere under mikroskopet under kultur, da vævet ikke er fladt. Dårlig vævssåning (som den i figur 6C) er sandsynligvis resultatet af, at skiven ikke ligger fladt mellem de to klip og dermed får dårlig kontakt med bunden af såbadet godt, når den vendes på hovedet. En anden mulig årsag er forkert placering af kassetten i bunden af såbadbrønden. Med hensyn til klipning skal du anvende lidt mere spænding i vævet, når du placerer det andet klip for at hjælpe det med at ligge fladt. Nogle skiver har en lille konkavitet; i disse tilfælde klips skiven med den konvekse side opad. Med øvelse oplever vi typisk mislykket såning med færre end 2% skiver.
En begrænsning af denne protokol er kravet om noget specialudstyr - en laserskærer og en 3D-printer - for at generere de indledende materialer til ELT-forberedelse. Men når vævskulturkassetterne og frøbadene er oprettet, kræves der ingen yderligere specielle materialer. Lungeskærings- og decellulariseringstrinnene i ELT-stilladsforberedelse er moderat tidskrævende; Disse trin kan dog udføres på forhånd eller i et antal, der er tilstrækkeligt til at forberede flere forsøg på samme tid. Mange PCLS (>100 hvis optimering til parenkymale regioner) kan skæres fra en enkelt lunge og snap-frosne til senere brug. Mens en enkelt fryse-optøningscyklus kan forårsage mindre ultrastrukturel skade på ECM46, har selv flere fryse-optøningscyklusser vist sig ikke at forårsage et betydeligt tab i ECM23,47. PCLS kan også klippes og decellulariseres forud for et forsøg, der skal bruges inden for en måned. (Især kan den beskrevne decellulariseringsprotokol opnås på cirka 6 timer, hvilket repræsenterer en betydelig fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder, der kræver en dag eller mere27,28.) Når stilladserne er forberedt, er cellesåningsprocessen enkel og hurtig, og kulturen af ELT'er kræver ikke specialiserede teknikker.
En advarsel ved den beskrevne ELT-metode er manglen på regionsspecifik såning, dvs. levering af AEC2'er specifikt til det alveolære rum eller endotelceller specifikt til det vaskulære rum. Ikke desto mindre, selvom celler simpelthen er podet oven på vævsstilladserne, er recellulariseringsmønsteret ikke tilfældigt, med en vis form for alveolær organisation, herunder epitelringe. Vi formoder, at celle-celle-interaktioner samt lokale forskelle i ECM-sammensætning og geometri 20,21 sandsynligvis bidrager til de observerede recellulariseringsmønstre. Til støtte for denne hypotese viste en tidligere offentliggjort undersøgelse, hvor fibroblaster blev podet ikke-specifikt på decellulariserede lungeskiver, at mønsteret af vævsrepopulation og tilknyttede cellulære fænotyper varierede signifikant efter mikroskopisk vævsregion og ECM-stilladskilde (f.eks. Sund versus syg)27. Fibroblaster blev også observeret at invadere ind i interstitium - det sted, hvor de bor i naturligt lungevæv 1,27. Den primære alternative metode, som vi kan forestille os at dyrke celler på lungeskiver på en virkelig regionsspecifik måde, ville indebære såning af intakte decellulariserede lunger via luftvejene 31,48 og vaskulære rum49,50 og derefter udskæring af det recellulariserede væv. Dette alternativ 1) er imidlertid betydeligt mere omkostnings-, tids- og ressourcekrævende; 2) er lavere gennemstrømning; 3) kræver et øget antal dyr og 4) er forbundet med en øget risiko for kontaminering på grund af udfordringerne ved hele lungekulturen og efterfølgende udskæring af den podede lunge. Selvom elt-platformen ikke rekapitulerer alle aspekter af native cellulær organisation, muliggør den lungecellekultur på et fysiologisk relevant ECM-substrat på en måde, der er tilgængelig for mange flere laboratorier.
Fleksibiliteten i ELT-systemet er en stor fordel ved denne platform og bør tillade mindre lungevævskultur med et hvilket som helst antal vævsstilladser, celler eller kulturmedier af interesse. Anvendelse af stilladser afledt af sygt væv eller fra skademodeller kan gøre det muligt at undersøge celle-celle- eller cellematrixinteraktioner i forbindelse med sygdomsændret ECM 27,29,51. Bemærk dog, at decellulariseringsprotokollen muligvis skal tilpasses for at tage højde for matrixforskelle mellem art52. Den beskrevne såningsstrategi kan bruges til enhver celletype, og kulturtidslinjen tilpasses forskerens behov. Som udgangspunkt skulle 1 x 106 celler pr. stillads give et stærkt cellulært væv inden for 7 dages dyrkning, mens 1 x 105 celler i alt resulterer i dårlig cellularitet. Ved enhver tilpasning af tidslinjen skal vævskulturkassetterne fjernes fra såbadet 24 timer efter den sidste vævssåning. Her, med det formål at modellere noget af den cellulære kompleksitet af lungealveolus, beskriver vi en tri-kultur recellulariseringsstrategi, der understøtter vedligeholdelsen af veldifferentierede neonatale AEC2'er i alveolære strukturer i mindst 7 dage. Vores resultater viser også den vellykkede indpodning af både fibroblaster og endotelceller inden for ELT'er, hvilket understreger den brede anvendelighed af kultursubstratet og dets egnethed til co-kulturstudier. Såning af voksne celler i ELT'er kan lette modelleringen af mere hvilende alveolære strukturer, mens såning af humane PSC-afledte AEC2'er, herunder dem med genetiske modifikationer, kan lette translationelle undersøgelser af human sygdom13,53. Generelt giver bottom-up-tilgangen, der muliggøres af ELT-platformen, mulighed for at undersøge bestemte celletypers bidrag til aflæsninger af interesse - såsom AEC2-spredning eller differentieringstilstand.
Sammenfattende skitserer denne protokol et robust system til generering af konstrueret lungevæv til samkulturstudier af AEC2'er, fibroblaster og endotelceller i acellulære ECM-lungeskivestilladser. ELT'er repræsenterer en ny 3D-kulturstrategi for primære AEC2'er, som til dato typisk har været afhængige af mindre fysiologiske gel-type matricer for at opretholde en veldifferentieret fænotype 6,11,12. Den nuværende platform bygger på tidligere arbejde i genpopulationen af decellulariserede lungeskiver 24,25,26,27,28,29, men tilbyder flere fordele: 1) et vævskulturkassettesystem for at lette ELT-håndtering under decellularisering, såning og kultur; 2) et tilpasset såbad til præcist at så et kendt antal celler på hvert skivestillads; og 3) en tri-kultur reseeding strategi, der muliggør alveolær væv repopulation med epitel-, mesenkymale og endotelceller. ELT'er repræsenterer således et vigtigt skridt fremad i retning af at skabe reproducerbare in vitro-modeller, der fanger den cellulære og substratkompleksitet af den oprindelige alveolus og AEC2-stamcelleniche.
Disclosures
L.E.N. er grundlægger og aktionær i Humacyte, Inc, som er en regenerativ medicinvirksomhed. Humacyte producerer konstruerede blodkar fra allogene glatte muskelceller til vaskulær kirurgi. L.E.N.'s ægtefælle har egenkapital i Humacyte, og L.E.N. sidder i Humacytes bestyrelse. L.E.N. er opfinder af patenter, der er licenseret til Humacyte, og som producerer royalties for L.E.N. L.E.N. har modtaget en ubegrænset forskningsgave til støtte for forskning i sit laboratorium på Yale. Humacyte påvirkede ikke adfærden, beskrivelsen eller fortolkningen af resultaterne i denne rapport.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Lorenzo Sewanan og Jorge Nunez for deres arbejde med at udvikle vævskulturkassettedesignet, der anvendes i denne protokol, Kaminski-laboratoriet til brug af deres vibratom, Maurizio Chioccioli og Jessica Nouws for hjælp med lungeskæring, Allie LaRocco for hjælp med indledende pilotforsøg og Hong Qian for omhyggelig læsning af protokollen. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) og U01HL145567 (L.E.N.); og ved en ubegrænset forskningsgave fra Humacyte Inc. (L.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| 8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
| Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
| Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
| Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
| CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
| Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
| Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
| Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
| Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
| Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
| Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
| Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
| KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
| Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
| Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
| Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
| MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
| Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
| NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
| Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
| PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
| Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
| Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
| Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
| PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
| PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
| Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
| Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
| Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
| Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
| Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
| Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
| Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
| Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
| Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
| Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
| Transferrin human | Sigma | T8158 | |
| Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
| Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
| Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
| Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |
References
- Burri, P. H. Morphology and respiratory function of the alveolar unit. International Archives of Allergy and Applied Immunology. 76, Suppl 1 2-12 (1985).
- Barkauskas, C. E., Noble, P. W. Cellular Mechanisms of Tissue Fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (11), 987-996 (2014).
- Taylor, M. S., et al. A Conserved Distal Lung Regenerative Pathway in Acute Lung Injury. American Journal of Pathology. 188 (5), 1149-1160 (2018).
- Carsana, L., et al. Pulmonary post-mortem findings in a series of COVID-19 cases from northern Italy: a two-centre descriptive study. Lancet Infectious Diseases. 20 (10), 1135-1140 (2020).
- Basil, M. C., et al. The Cellular and Physiological Basis for Lung Repair and Regeneration: Past, Present, and Future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Desai, T. J., Brownfield, D. G., Krasnow, M. A. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer. Nature. 507 (7491), 190-194 (2014).
- Evans, M. J., Cabral, L. J., Stephens, R. J., Freeman, G. Renewal of alveolar epithelium in the rat following exposure to NO2. The American Journal of Pathology. 70 (2), 1-24 (1973).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Borok, Z., et al. Keratinocyte growth factor modulates alveolar epithelial cell phenotype in vitro: expression of aquaporin 5. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 18 (4), 554-561 (1998).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary Type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Chen, Y. W., et al. A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 19 (5), 542-549 (2017).
- Korogi, Y., et al. In vitro disease modeling of hermansky-pudlak syndrome Type 2 using human induced pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 431-440 (2019).
- Strikoudis, A., et al. Modeling of fibrotic lung disease using 3D organoids derived from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3709-3723 (2019).
- Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
- Chapman, H. A. Epithelial responses to lung injury: Role of the extracellular matrix. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (3), 89-95 (2012).
- Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Zhou, Y., et al. Extracellular matrix in lung development, homeostasis and disease. Matrix Biology. 73, 77-104 (2018).
- Calle, E. A., et al. Targeted proteomics effectively quantifies differences between native lung and detergent-decellularized lung extracellular matrices. Acta Biomaterialia. 46, 91-100 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: Detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1055 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Burgstaller, G., et al. Distinct niches within the extracellular matrix dictate fibroblast function in (cell free) 3D lung tissue cultures. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (5), 708-723 (2018).
- Sun, H., et al. Fibroblast engraftment in the decellularized mouse lung occurs via a β1-integrin-dependent, FAK-dependent pathway that is mediated by ERK and opposed by AKT. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (6), 463-475 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Schwan, J., et al. Anisotropic engineered heart tissue made from laser-cut decellularized myocardium. Scientific Reports. 6, 32068 (2016).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Gerckens, M., et al. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
- Neuhaus, V., et al. Assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (135), e57042 (2018).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (6), 1315-1321 (2002).
- Vaccaro, C., Brody, J. S. Ultrastructure of developing alveoli. I. The role of the interstitial fibroblast. The Anatomical Record. 192 (4), 467-479 (1978).
- Calle, E. A., et al. Fate of distal lung epithelium cultured in a decellularized lung extracellular matrix. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1916-1928 (2015).
- Dobbs, L. G., Gonzalez, R., Williams, M. C. An improved method for isolating type II cells in high yield and purity. American Review of Respiratory Disease. 134 (1), 141-145 (1986).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. American Journal of Physiology. 258, 134-147 (1990).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Dobbs, L. G., Pian, M. S., Maglio, M., Dumars, S., Allen, L. Maintenance of the differentiated type II cell phenotype by culture with an apical air surface. The American Journal of Physiology. 273 (2), 347-354 (1997).
- Bruce, M. C., Honaker, C. E. Transcriptional regulation of tropoelastin expression in rat lung fibroblasts: changes with age and hyperoxia. American Journal of Physiology. 274 (6), 940-950 (1998).
- Berk, J. L., Franzblau, C., Goldstein, R. H. Recombinant interleukin-1 beta inhibits elastin formation by a neonatal rat lung fibroblast subtype. Journal of Biological Chemistry. 266 (5), 3192-3197 (1991).
- Schultz, C. J., Torres, E., Londos, C., Torday, J. S. Role of adipocyte differentiation-related protein in surfactant phospholipid synthesis by type II cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (2), 288-296 (2002).
- Maksvytis, H. J., et al. In vitro characteristics of the lipid-filled interstitial cell associated with postnatal lung growth: evidence for fibroblast heterogeneity. Journal of Cellular Physiology. 118, 113-123 (1984).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Le, A. V., et al. Efficient and Functional Endothelial Repopulation of Whole Lung Organ Scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (9), 2000-2010 (2017).
- Ren, X., et al. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nature Biotechnology. 33 (10), 1097-1102 (2015).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Alysandratos, K. D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
