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Bioengineering

इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस से तैयार किया जाता है

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63151
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,4
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Yale School of Medicine, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 4Department of Anesthesiology, Yale School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल वायुकोशीय उपकला प्रकार 2 कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस को पुन: प्रस्तुत करके प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, छोटे पैमाने पर इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

बेहतर 3-आयामी (3 डी) फेफड़ों के मॉडल की आवश्यकता है जो देशी फेफड़ों के एल्वियोलस पूर्व विवो की वास्तुशिल्प और सेलुलर जटिलता को दोहराते हैं। हाल ही में विकसित ऑर्गेनोइड मॉडल ने इन विट्रो में फेफड़ों के उपकला पूर्वजों के विस्तार और अध्ययन की सुविधा प्रदान की है, लेकिन ये प्लेटफ़ॉर्म आमतौर पर माउस ट्यूमर-व्युत्पन्न मैट्रिक्स और / या सीरम पर भरोसा करते हैं, और केवल एक या दो सेलुलर वंशों को शामिल करते हैं। यहां, हम विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) के बहु-वंश पुनर्कोशिकीयकरण के आधार पर इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों (ईएलटी) को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। ईएलटी में वायुकोशीय जैसी संरचनाएं होती हैं जिनमें वायुकोशीय उपकला, मेसेनकाइम और एंडोथेलियम शामिल होते हैं, एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सब्सट्रेट के भीतर जो देशी फेफड़ों से मिलते जुलते होते हैं। ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए, चूहे के फेफड़ों को एगरोज़ के साथ फुलाया जाता है, 450 μm-मोटी स्लाइस में कटा हुआ, स्ट्रिप्स में काट दिया जाता है, और विकोशिकीय किया जाता है। परिणामस्वरूप एसेलुलर ईसीएम मचानों को प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स और वायुकोशीय उपकला प्रकार 2 कोशिकाओं (एईसी 2 एस) के साथ फिर से सीड किया जाता है। एईसी 2 एस को सीरम मुक्त, रासायनिक रूप से परिभाषित विकास माध्यम के साथ कम से कम 7 दिनों के लिए ईएलटी संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। ऊतक तैयारी और संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, स्लाइस को एक कैसेट प्रणाली में क्लिप किया जाता है जो समानांतर में कई ईएलटी के हैंडलिंग और मानकीकृत सेल सीडिंग की सुविधा प्रदान करता है। ये ईएलटी एक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एल्वियोलस के भीतर सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन की जांच के साथ-साथ एईसी 2 और उनके आला को विनियमित करने वाले जैव रासायनिक संकेतों की सुविधा प्रदान करना चाहिए।

Introduction

एल्वियोली डिस्टल फेफड़े की कार्यात्मक इकाइयाँ हैं, जिसमें वायुकोशीय उपकला प्रकार 1 कोशिकाओं (एईसी 1 एस) और टाइप 2 कोशिकाओं (एईसी 2 एस) द्वारा पंक्तिबद्ध गैस-आदान-प्रदान हवाई क्षेत्रों का एक जालवर्क शामिल है। उपकला अंतर्निहित केशिकाओं का एक घना नेटवर्क है और साथ ही मेसेनकाइम का समर्थन करता है, सभी एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) मचान द्वारा बढ़ाए जाते हैं जो इन नाजुक वायु थैलियों को ताकत और लचीलापन दोनों प्रदान करता है1. एल्वियोली कई फेफड़ों की विकृतियों में चोट की साइट भी है, जिसमें अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस2, तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम3, और गंभीर कोरोनोवायरस रोग -19 (सीओवीआईडी -19) 4 शामिल हैं। यद्यपि पिछले एक दशक में काम ने फेफड़ों के उपकला के भीतर एक उल्लेखनीय प्लास्टिसिटी को उजागर किया है, तंत्र जो कुछ सेटिंग्स में डिस्टल फेफड़ों की मरम्मत को सक्षम करते हैं - और जो दूसरों में मरम्मत को रोकते हैं - गहन जांच का एक क्षेत्र बने हुए हैं5. एल्वियोलस को मॉडल करने के लिए इन विट्रो प्लेटफार्मों में सुधार का विकास वायुकोशीय जीव विज्ञान, उत्थान और चिकित्सीय के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा।

एईसी 2 आत्म-नवीनीकरण और एईसी 1 एस में अंतर करता है, और इस प्रकार डिस्टल फेफड़े 6,7,8 का प्राथमिक स्टेम सेल माना जाता है। हालांकि, ये कोशिकाएं फेनोटाइप9 के नुकसान के बिना प्राथमिक एईसी 2 एस संवर्धन से जुड़ी कठिनाइयों को देखते हुए इन विट्रो अध्ययन के लिए एक विशेष चुनौती पेश करती हैं। पारंपरिक 2-आयामी (2 डी) संस्कृति में, एईसी 2 एस चपटा और एईसी 1 जैसी कोशिकाओं की कुछ विशेषताओं को अपनातेहैं 10. इसके विपरीत, 3 डी संस्कृति रणनीतियों, सबसे अधिक ऑर्गेनोइड, प्राथमिक एईसी 2 एस 6,11,12 में विभेदित सुविधाओं के रखरखाव का समर्थन करते हैं और प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) -व्युत्पन्न एईसी 2 एस13,14 की दीर्घकालिक संस्कृति की अनुमति देते हैं। ऑर्गेनोइड का उपयोग डिस्टल फेफड़ों के विकास15, वायरल संक्रमण11,15 और एईसी 2 से संबंधित आनुवंशिक रोग13,16,17 को मॉडल करने के लिए किया गया है, जो एईसी 2 जीव विज्ञान और उत्थान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि को सक्षम करता है। हालांकि, इन संस्कृति मॉडलों में आमतौर पर केवल एक या दो सेलुलर वंश शामिल होते हैं, और जेल-प्रकार के मैट्रिक्स में कोशिकाओं को एम्बेड करते हैं जो देशी फेफड़ों के एल्वियोलस के वास्तुकला या ईसीएम सब्सट्रेट को पुन: प्राप्त करने में विफल रहते हैं।

ईसीएम आणविक, टोपोलॉजिकल और यांत्रिक संकेतों के माध्यम से सेल फेनोटाइप और व्यवहार का एक महत्वपूर्ण नियामक है; स्टेम सेल भाग्य को विनियमित करने वाले ऊतक-विशिष्ट निचे का एक प्रमुख घटक शामिल है; और एक जलाशय के रूप में कार्य करता है जो स्थानीय रूप से स्रावित विकास कारकों 18,19,20,21 की उपलब्धता को संशोधित करता है। देशी ईसीएम पर संवर्धन कोशिकाएं इस प्रकार विवो ऊतकों के जीव विज्ञान को मॉडल करने के लिए इन विट्रो सिस्टम की भविष्य कहनेवाला क्षमता में वृद्धि कर सकती हैं। विकोशिकीयकरण, एक प्रक्रिया जो डिटर्जेंट, एंजाइम, या भौतिक या अन्य तरीकों के माध्यम से ऊतकों से सेलुलर सामग्री को हटा देती है, बड़े हिस्से में एक देशी अंग के ईसीएम मचान को संरक्षित कर सकती है, जब सावधानीपूर्वक22,23 प्रदर्शन किया जाता है। इस तरह के मचानों को 3 डी बायोमिमेटिक संस्कृति के लिए कोशिकाओं के साथ फिर से आबाद किया जा सकता है। हालांकि, जबकि ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए विकोशिकीय मचानों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, नियमित सेल संस्कृति के लिए उनका उपयोग सीमित किया गया है। पिछले कई अध्ययनों ने फेफड़ों के स्लाइस या छोटे फेफड़ों के ऊतकखंडों के विकोशिकीयकरण और पुनर्कोशिकीयकरण की सूचना दी है। प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन24,25,26 के अलावा, फाइब्रोब्लास्ट-मैट्रिक्स आसंजन 27,28 का अध्ययन करने और फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप 27,29 पर रोगग्रस्त फेफड़ों के मैट्रिक्स के प्रभाव की जांच करने के लिए पुन: आबाद फेफड़ों के स्लाइस का उपयोग किया गया है। सटीक-कट ऊतक स्लाइस उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध बेहतर प्रौद्योगिकियों के साथ, विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस वायुकोशीय, वायुमार्ग और संवहनी उपसंरचनाओं को संरक्षित करते हुए कोशिकाओं को संस्कृति के लिए एक सुविधाजनक और छोटे पैमाने पर मंच प्रदान कर सकते हैं। कई सेल प्रकारों को शामिल करने से शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी वातावरण के भीतर सेल-सेल इंटरैक्शन के अध्ययन में सक्षम होगा। हालांकि, संस्कृति प्रक्रिया के दौरान ऊतकों की हैंडलिंग की सुविधा के लिए बेहतर रणनीतियों की आवश्यकता होती है, और ज्ञात संख्या में कोशिकाओं के साथ ऊतकों के नियंत्रित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बीजारोपण सुनिश्चित करने के लिए।

यहां, हम प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं, एईसी 2 एस और फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस (पीसीएलएस) को फिर से तैयार करके इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों (ईएलटी) उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारे पहले वर्णित इंजीनियर हृदय ऊतक प्रणाली30 और पूरे फेफड़ों के विकोशिकीयकरण-पुनर्कोशिकीयकरण रणनीतियों22,31 के अनुकूलन में, हम चूहे के फेफड़ों से पीसीएलएस को काटने और स्लाइस को पुन: प्रयोज्य ऊतक संस्कृति कैसेट में क्लिप करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं जो डाउनस्ट्रीम जोड़तोड़ को सरल और मानकीकृत करते हैं। क्लिप्ड स्लाइस को एसेलुलर ईसीएम मचान बनाने के लिए विकोशिकीय बनाया जाता है, जो अनुकूलित सीडिंग स्नान में फिर से आबाद होते हैं। फेफड़े के टुकड़े मचान महत्वपूर्ण ईसीएम घटकों और वास्तुकला को संरक्षित करते हैं, और कम से कम 7 दिनों के लिए बहु-वंश वायुकोशीय जैसी संरचनाओं के भीतर एईसी 2 के विकास का समर्थन करते हैं। ईएलटी शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मैट्रिक्स के भीतर एक उपन्यास वायुकोशीय सह-संस्कृति प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे एईसी 2 एस और एल्वियोलस के बुनियादी जैविक अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हुए फेफड़ों के ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास का समर्थन करना चाहिए।

Protocol

इस पत्र में वर्णित सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को येल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. टिशू कल्चर कैसेट और सीडिंग बाथ का निर्माण

नोट: एक बार बनाया गया, ऊतक संस्कृति कैसेट और बोने वाले स्नान को ईएलटी संस्कृति के दोहराए गए दौर के लिए आटोक्लेव और पुन: उपयोग किया जा सकता है।

  1. टिशू कल्चर कैसेट
    1. क्रमशः पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 में प्रदान किए गए डिजाइनों के अनुसार 3/32 इंच मोटी पॉलीटेट्राफ्लोरोइथिलीन (पीटीएफई) से ऊतक संस्कृति कैसेट फ्रेम और क्लिप काटने के लिए लेजर कटर का उपयोग करें। पूरक फ़ाइल 3 के अनुसार 1/16 इंच मोटी पीटीएफई से ऊतक संस्कृति कैसेट टैब काटने के लिए लेजर कटर का उपयोग करें। कट 80% पावर और 15% गति (30 डब्ल्यू लेजर कटर के लिए) का उपयोग करके 3x की रूपरेखा तैयार करता है।
  2. बीजारोपण स्नान
    1. स्पष्ट राल का उपयोग करके क्रमशः सीडिंग बाथ मोल्ड के आधार और अंगूठी को 3 डी प्रिंट करने के लिए सीडिंग बाथ सीएडी फाइलों (पूरक फ़ाइल 4 और पूरक फ़ाइल 5) का उपयोग करें।
    2. पीडीएमएस रिलीज में सहायता के लिए उपयोग करने से पहले रात भर आसुत जल में 10% पोलोक्सामर 407 के समाधान में मोल्ड्स को भिगोदें। हवा को सूखने दें, फिर मोल्ड के आधार पर अंगूठी को फिट करें और लीक को रोकने में मदद करने के लिए लचीली प्लास्टिक फिल्म में लपेटें।
    3. इलाज एजेंट के साथ 10: 1 अनुपात में पीडीएमएस इलास्टोमर को मिलाकर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) के कम से कम 60 ग्राम प्रति मोल्ड तैयार करें, और 3 डी मुद्रित मोल्ड में डालें। किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए वैक्यूम डिसिकेटर में पीडीएमएस को डिगास करें।
    4. 8 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना बोने स्नान।

2. चूहे फेफड़ों से प्रेसिजन-कट फेफड़े के स्लाइस की तैयारी

  1. अंग हार्वेस्ट
    1. गुरुत्वाकर्षण- और पंप संचालित अंगों से युक्त एक विभाजन छिड़काव प्रणाली तैयार करें, जैसा कि चित्रा 1 में चित्रित किया गया है। ट्यूबिंग के अंत में एक फुफ्फुसीय धमनी (पीए) प्रवेशनी कनेक्ट करें, जिसमें एलएस 14 सिलिकॉन ट्यूबिंग की 1/2 इंच लंबाई और 3/32 इंच महिला ल्यूयर-लॉक कनेक्टर (चित्रा 1 देखें) से जुड़ी 1/16 इंच कांटेदार वाई-कनेक्टर शामिल है। इस समय प्रवेशनी के लिए एक चेक वाल्व संलग्न न करें।
    2. एमएल हेपरिन और 0.01 मिलीग्राम / एमएल सोडियम नाइट्रोप्रससाइड (एसएनपी) युक्त पीबीएस के साथ लाइनों को क्रमशः एंटीकोआग्यूलेशन और वासोडिलेशन के लिए प्राइम करें। छिड़काव पंप को 30 एमएल / मिनट पर पूर्व-सेट करें।
      नोट: हेपरिन समाधान में एसएनपी ताजा जोड़ें और प्रकाश से सुरक्षित रहें।
    3. खुराक एक वयस्क (8-12 सप्ताह पुराना, लगभग 300-350 ग्राम) स्प्रैग-डॉली चूहे को एंटी-जमावट के लिए 400 यू / किग्रा हेपरिन के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के साथ, इसके बाद संज्ञाहरण के लिए केटामाइन (75 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलाज़िन (5 मिलीग्राम / किग्रा) का आईपी इंजेक्शन। हानिकारक उत्तेजना (पैर की अंगुली चुटकी) की प्रतिक्रिया की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान की पुष्टि करें।
    4. हेयर क्लिपर्स का उपयोग करके फर की छाती और पेट को ट्रिम करें। फिर 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और 10% पोविडोन-आयोडीन के साथ 3x पोंछ लें।
    5. चूहे के दांत संदंश के साथ डायाफ्राम के स्तर के नीचे त्वचा को पकड़ो। फिर ठीक नुकीली कैंची के साथ त्वचा में 1/2 इंच अनुप्रस्थ चीरा बनाएं। संदंश के साथ उजागर पेट प्रावरणी को समझें, प्रावरणी में 1/2 इंच अनुप्रस्थ चीरा बनाएं, और फिर ऊपरी पेट की चौड़ाई में त्वचा और प्रावरणी के माध्यम से चीरा का विस्तार करें।
    6. पूर्वकाल डायाफ्राम के केंद्र में एक छोटा चीरा (1/8 इंच से अधिक नहीं) बनाने के लिए ठीक कैंची की नोक का उपयोग करें, जिससे फेफड़े वक्ष में वापस आ जाएं। छाती की पूरी चौड़ाई में डायाफ्राम में चीरा का विस्तार करें।
    7. गर्दन की ओर रिबकेज की पूरी ऊंचाई के माध्यम से दो ऊर्ध्वाधर चीरे बनाएं, सावधान रहें कि फेफड़ों को नुकसान न पहुंचे। कॉलरबोन के माध्यम से काटने के लिए बाईं पसलियों के माध्यम से चीरा का विस्तार करें और श्वासनली को उजागर करते हुए, गर्दन के किनारे स्वरयंत्र के स्तर तक।
    8. आसपास के संयोजी ऊतक से मुक्त श्वासनली और अन्नप्रणाली से विच्छेदन। स्वरयंत्र के करीब, दो उपास्थि के छल्ले के बीच श्वासनली के पूर्वकाल आधे हिस्से में एक अनुप्रस्थ चीरा बनाएं। श्वासनली के पीछे 4-0 पॉलीप्रोपाइलीन सिवनी थ्रेड करें, चीरा के स्तर से नीचे, और दो मोड़ों के साथ सर्जन की गाँठ की पहली छमाही को शिथिल रूप से पूर्व-टाई करें।
    9. एक तरफा चेक वाल्व से जुड़े 1/16 इंच कांटेदार वाई-कनेक्टर और 3/32 इंच महिला ल्यूअर-लॉक कनेक्टर (चित्रा 1 देखें) के साथ श्वासनली में एलएस 14 सिलिकॉन ट्यूबिंग की 1/2 इंच की लंबाई वाले एक प्रवेशनी को फेफड़ों की दिशा की ओर श्वासनली चीरा में रखें।
    10. सम्मिलित प्रवेशनी के स्तर पर श्वासनली के चारों ओर पूर्व-बंधे सिवनी लूप की स्थिति और जगह में प्रवेशनी को सुरक्षित करने के लिए सम्मिलित वाई-कनेक्टर के चारों ओर कस लें। गाँठ को पूरा करने के लिए सिवनी के दो सिंगल-ट्विस्ट थ्रो जोड़ें।
    11. हवा के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और श्वासनली प्रवेशनी के ल्यूर-लॉक से कनेक्ट करें।
    12. एक घुमावदार हेमोस्टैट का उपयोग करके डायाफ्राम के करीब अवर वेना कावा को क्लैंप करें, फिर दाएं वेंट्रिकल (आरवी) के माध्यम से 150 यू हेपरिन (1000 यू / एमएल) के साथ दिल को इंजेक्ट करें।
    13. चरण 2.1.1 में तैयार पीए प्रवेशनी से पीबीएस / हेपरिन / एसएनपी की धीमी लेकिन स्थिर टपकाव का उत्पादन करने के लिए गुरुत्वाकर्षण लाइन स्टॉपकॉक को आंशिक रूप से खोलें।
    14. पीए के आधार के पीछे 4-0 पॉलीप्रोपाइलीन सिवनी की सुई को थ्रेड करें जहां यह आरवी से बाहर निकलता है पीए के आधार के चारों ओर सिवनी के ढीले लूप को पूर्व-टाई करने के लिए सर्जन की गाँठ की पहली छमाही का उपयोग करें।
    15. ठीक कैंची का उपयोग करके पीए के ठीक नीचे और लंबवत आरवी में एक छोटा चीरा (1/8 इंच से अधिक नहीं) बनाएं, फिर पीए के आधार में पीए प्रवेशनी वाई-कनेक्टर का एक अंग डालें। पीए और सम्मिलित कनेक्टर के चारों ओर सिवनी को सुरक्षित करें और सर्जन की गाँठ को पूरा करने के लिए एक एकल-मोड़ फेंक जोड़ें।
      नोट: प्रवाह के तहत पीए कैन्युलेटिंग वास्कुलचर में हवा के बुलबुले की शुरूआत को रोकता है जो फेफड़ों के पर्याप्त समाशोधन को रोक सकता है।
    16. पीए कैथेटर वाई-कनेक्टर के दूसरे छोर पर एक तरफा वाल्व संलग्न करें, फिर बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से रक्त प्रवाह की अनुमति देने के लिए हृदय के शीर्ष को काट दें।
      नोट: पंप के माध्यम से छिड़काव करने से पहले हृदय के शीर्ष को काटने में विफलता रक्त-गैस बाधा को नुकसान पहुंचा सकती है, जिससे हवाई क्षेत्र में तरल पदार्थ का रिसाव हो सकता है।
    17. दो लाइनों को जोड़ने वाले स्टॉपकॉक का उपयोग करके छिड़काव लाइन को पंप की ओर स्विच करें, फिर पंप को 30 एमएल / पीए के माध्यम से फेफड़ों को सुगंधित करते समय, रक्त के फेफड़ों को साफ करने की सुविधा के लिए लगभग 10-15 सांस / मिनट पर 10 एमएल श्वासनली सिरिंज के माध्यम से फेफड़ों को मैन्युअल रूप से हवादार करें। फेफड़ों को तब तक घुमाएं जब तक कि वे ज्यादातर सफेद न हो जाएं, आमतौर पर 40 मिलीलीटर पीबीएस / हेपरिन / एसएनपी या उससे कम की आवश्यकता होती है।
      नोट: रक्त के फेफड़ों की अपर्याप्त समाशोधन डाउनस्ट्रीम विकोशिकीयकरण को खराब कर सकती है।
    18. श्वासनली प्रवेशनी के स्तर के ठीक ऊपर पीछे की श्वासनली को काटें, और फिर फेफड़ों और हृदय को सभी शेष संयोजी ऊतकों से मुक्त करें और फेफड़ों और हृदय एन ब्लॉक को निकालें।
    19. फिनोल लाल के बिना हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में 2% कम पिघलने बिंदु एगरोज़ के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें, 42 डिग्री सेल्सियस तक पूर्ववत।
      नोट: आवश्यक एगरोज़ की सटीक मात्रा फेफड़ों के आकार से भिन्न होगी। बड़े फेफड़ों (यानी, 400 ग्राम से बड़े चूहों से) को 10 एमएल से अधिक एगरोज़ की आवश्यकता होगी।
    20. मैन्युअल रूप से निकाले गए फेफड़ों को 10 मिलीलीटर हवा (यानी, लगभग कुल फेफड़ों की क्षमता के लिए) के साथ श्वासनली प्रवेशनी के माध्यम से फुलाएं ताकि ध्वस्त पैरेन्काइमा की भर्ती में मदद मिल सके।
    21. मिनट की दर से श्वासनली प्रवेशनी के माध्यम से एगरोज़ को मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करके एगरोज़ के तैयार सिरिंज के साथ फेफड़ों को तुरंत फुलाएं, बस जब तक कि फेफड़ों के लोब के सबसे डिस्टल टिप्स फुलाए नहीं जाते। यदि फेफड़ों के डिस्टल क्षेत्र ढह जाते हैं, तो अतिरिक्त 1-2 एमएल एगरोज़ इंजेक्ट करें।
    22. श्वासनली प्रवेशनी के महिला ल्यूर-लॉक के लिए 4-तरफा स्टॉपकॉक से सफेद टोपी संलग्न करके श्वासनली को कैप करें। एगरोज़ को जमने की अनुमति देने के लिए फेफड़ों को बर्फ पर 150 मिमी पेट्री डिश में रखें।
      नोट: निष्कर्षण के तुरंत बाद फेफड़ों की मुद्रास्फीति फेफड़ों के पैरेन्काइमा के समान भरने और बाद में सफल ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि फेफड़े बहुत असमान रूप से फुलाते हैं, तो फेफड़ों के टुकड़े टुकड़े के साथ आगे न बढ़ें क्योंकि टुकड़ा गुणवत्ता खराब होगी।
  2. फेफड़ों की स्लाइसिंग
    नोट: सटीक टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया का उपयोग किया जा रहा स्पंदनात्मक माइक्रोटोम (वाइब्रेटोम) के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है; विभिन्न ऊतक स्लाइसर के साथ पीसीएलएस तैयारी के अतिरिक्त उदाहरण पहले32,33,34 प्रकाशित किए गए हैं।
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर धातु द्रुतशीतन ब्लॉक को पूर्व-ठंडा करें और स्लाइसिंग प्रक्रिया में उपयोग न करते समय बर्फ पर रखें।
    2. ब्लेड धारक को ब्लेड संलग्न करने के लिए साइनोएक्रिलेट गोंद की एक छोटी बूंद का उपयोग करें। ध्यान से ब्लेड धारक को एक एलन रिंच का उपयोग करके वाइब्रेटोम में संलग्न करें ताकि यह बफर ट्रे में डाले गए नमूना ट्यूब के अंत के साथ लाइनकर सके।
    3. स्लाइस इकट्ठा करने के लिए फिनोल लाल के बिना अच्छी तरह से बाँझ बर्फ-ठंडा एचबीएसएस प्रति 3 मिलीलीटर के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें।
    4. स्केलपेल का उपयोग करके, फेफड़ों के ऊतकों का एक टुकड़ा लगभग 1-1.5 सेमी3 काट लें।
      नोट: बाएं लोब के निचले और मध्य भागों से फेफड़ों के ऊतक, साथ ही दाएं मध्य और निचले लोब से, सबसे आसानी से बड़े ऊतक स्लाइस पैदा करता है जो वायुकोशीय क्षेत्र को अधिकतम करता है। यदि अनफ्लेटेड ऊतक क्षेत्र या संयोजी ऊतक के क्षेत्र मौजूद हैं, तो या तो कैंची के साथ इस ऊतक को ट्रिम करें या सवार की ओर नीचे की ओर उन्मुख करें; इस तरह के ऊतक सफाई से कटौती नहीं करते हैं।
    5. नमूना ट्यूब के प्लंजर पर साइनोएक्रिलेट गोंद की एक छोटी बूंद रखें। अतिरिक्त नमी को हटाने के लिए एक पेपर वाइप पर फेफड़ों के ऊतकों को दबाएं, और फिर तुरंत संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके प्लंजर के शीर्ष पर फेफड़ों के ऊतकों को रखें।
    6. नमूना ट्यूब की धातु ट्यूब को ऊतक के शीर्ष के स्तर तक स्लाइड करें और प्लंजर के साथ जगह में पकड़ें। पिपेट पूरी तरह से ऊतक को घेरने के लिए ट्यूब के शीर्ष में एचबीएसएस में 2% अगरोज को पूर्व-गर्म करता है।
    7. एगरोज़ को जमने की अनुमति देने के लिए लगभग 1 मिनट के लिए ऊतक के चारों ओर बर्फ-ठंडा ठंडा ब्लॉक रखें।
    8. बफर ट्रे में नमूना ट्यूब डालें। ऊतक ब्लॉक को मध्य-मार्ग में बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ ट्रे भरें। मोटर बॉक्स प्लंजर को आगे बढ़ाने के लिए मोटर बॉक्स स्विच को फास्ट फॉरवर्ड (एफएफ) में बदल दें ताकि यह सिर्फ नमूना ट्यूब के आधार को छू रहा हो।
    9. स्लाइस मोटाई, काटने की गति और दोलन आवृत्ति के लिए वांछित सेटिंग्स सेट करें, उदाहरण के लिए, 450 μm मोटाई, गति 4 और दोलन आवृत्ति 5. निरंतर मोड का चयन करें, और उसके बाद स्लाइसिंग प्रारंभ करने के लिए स्विच को चालू पर फ़्लिप करें।
    10. चूंकि ऊतक स्लाइस बफर ट्रे में आते हैं, इसलिए उन्हें इनोक्यूलेशन लूप या स्पैटुला का उपयोग करके तैयार 6-अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें।
    11. ब्लेड को नुकसान पहुंचाने या गोंद युक्त ऊतक को काटने से बचने के लिए, नमूना ट्यूब में ऊतक की ~ 2 मिमी मोटाई रहने पर टुकड़ा करना बंद करें।
    12. वांछित के रूप में अतिरिक्त फेफड़ों के ऊतकों को टुकड़ा करने के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
    13. मचान की तैयारी के लिए तुरंत स्लाइस को विकोशिकीय बनाएं, या स्नैप-फ्रीज करें और 2 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज करने के लिए, 4-6 स्लाइस को 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और स्लाइस के चारों ओर से किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। पकवानों को सूखी बर्फ और 100% इथेनॉल के स्नान में स्नैप-फ्रीज करने के लिए रखें, फिर पन्नी में लपेटें, प्लास्टिक बैग में सील करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
      नोट: ताजा स्लाइस को सीधे -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में न रखें क्योंकि ठंड की अपेक्षाकृत धीमी दर बर्फ के क्रिस्टल का कारण बन सकती है जो ऊतक को नुकसान पहुंचा सकती है।

3. फेफड़ों के ऊतक मचान की तैयारी

  1. सामग्री और विकोशिकीयकरण समाधान की तैयारी
    1. आटोक्लेव फ़्रेम, क्लिप, और टैब.
    2. तालिका 1 में उल्लिखित के रूप में विकोशिकीयकरण समाधान तैयार करें।
      नोट: उपयोग और बाँझ फिल्टर से ठीक पहले पूर्व गर्म बफर करने के लिए बेंज़ोनेज न्यूक्लियस जोड़ें। डिसेल्युलराइजेशन प्रक्रिया के 24-48 घंटे के भीतर ट्राइटन एक्स -100 और सोडियम डीऑक्सीकोलेट (एसडीसी) समाधान तैयार करें। एंटीबायोटिक /एंटीमाइकोटिक समाधान और बेंज़ोनेज बफर अग्रिम में 30 डी तक तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. काटना और फेफड़ों के स्लाइस को काटना
    नोट: जबकि काटने और कतरन बेंचटॉप पर गैर-बाँझ रूप से किया जा सकता है, धारा 3.3 में विकोशिकीयकरण कदम और ऊतक मचान के सभी बाद के हैंडलिंग को लामिना प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।
    1. पीबीएस के साथ लगभग एक तिहाई भरा 100 मिमी पेट्री डिश भरें। कैसेट स्थानांतरण (प्रत्येक दो क्लिप युक्त फ्रेम) और संदंश का उपयोग कर पकवान के लिए टैब.
    2. यदि जमे हुए स्लाइस का उपयोग कर रहे हैं, तो स्लाइस को कवर करने के लिए डिश में कमरे के तापमान पीबीएस डालकर एक समय में एक डिश को पिघलाएं। सूखी बर्फ पर शेष व्यंजन रखें।
    3. एक 150 मिमी पेट्री डिश के लिए एक पिघला हुआ टुकड़ा स्थानांतरण। धीरे ठीक संदंश का उपयोग कर टुकड़ा प्रकट, यदि आवश्यक हो, इतना है कि यह फ्लैट झूठ बोलता है, तो ध्यान से ऊतक के चारों ओर से अतिरिक्त पीबीएस आकांक्षा।
    4. एक गाइड के रूप में एक शासक के साथ एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें, पकवान के खिलाफ ब्लेड की पूरी लंबाई को मजबूती से दबाकर स्लाइस से 3 मिमी चौड़ी पट्टी काटने के लिए और इसे ब्लेड किनारे के साथ थोड़ा सा रॉक करें। वैकल्पिक रूप से, ऊतक स्ट्रिप्स को काटने के लिए 3 मिमी कस्टम-निर्मित स्पेसर (जैसे, एसिटल [पॉलीऑक्सीमिथाइलीन]) द्वारा अलग किए गए 2 समानांतर ब्लेड के साथ रेट्रोफिटेड रोटरी कटर का उपयोग करें। किसी भी आँसू, छेद, बड़े वायुमार्ग या जहाजों, या मोटी संयोजी ऊतक से बचें।
      नोट: सफल क्लिपिंग के लिए, पट्टी कम से कम 9 मिमी लंबी होनी चाहिए।
    5. संदंश का उपयोग करके, तैयार 100 मिमी पेट्री डिश के लिए ऊतक पट्टी हस्तांतरण।
    6. ऊतक पट्टी को कैसेट में क्लिप करें: कैसेट के ऊपर ऊतक को फ्लोट करें, ऊतक को किसी भी छोर पर क्लिप में छेद को ओवरहैंग करने के लिए केंद्रित करें। ठीक संदंश के साथ, एक टैब आंशिक रूप से एक छोर पर छेद में रखें, धीरे-धीरे ऊतक को सीधा करें, और फिर दूसरा टैब रखें। प्रत्येक हाथ में संदंश का उपयोग करके, ऊतक को सुरक्षित करने के लिए प्रत्येक टैब को पूरी तरह से दबाएं।
      नोट: यदि कतरन से पहले ऊतक को रखने में कठिनाई होती है, तो द्रव स्तर को कम करने के लिए पकवान से कुछ पीबीएस की आकांक्षा करें। सावधान रहें कि दूसरी क्लिप रखने में ऊतक को खिंचाव न करें, क्योंकि इससे फाड़ हो सकता है।
    7. वांछित के रूप में कई ऊतकों के लिए चरण 3.2.2-3.2.6 में विगलन, काटने और कतरन प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. स्लाइस विकोशिकीयकरण
    1. एक बार जब सभी स्लाइस क्लिप हो जाते हैं, तो कैसेट युक्त 100 मिमी डिश को लामिना के प्रवाह हुड में स्थानांतरित करें।
    2. विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल के चरण 1 को शुरू करें (तालिका 2 देखें): प्रत्येक कैसेट के नोकदार पक्षों को समझने के लिए एक घुमावदार हेमोस्टैट का उपयोग करके, पीबीएस + आयनों + एंटीबायोटिक दवाओं / एंटीमाइकोटिक्स प्रति अच्छी तरह से 3 एमएल से भरे 6-अच्छी तरह से प्लेटों (2 ऊतकों /
    3. 10 मिनट के लिए 30 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर अच्छी तरह से प्लेटों रखें।
    4. विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल के चरण 2 के साथ जारी रखें ( तालिका 2 देखें): प्रत्येक कुएं से तरल पदार्थ की आकांक्षा करें, फिर 3 एमएल / अच्छी तरह से पीबीएस + आयनों के साथ बदलें, 30 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर प्लेट रखें, और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. तालिका 2 में विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल में उल्लिखित समाधान और संबंधित अवधियों में से प्रत्येक के लिए चरण 3.3.4 दोहराएं।
    6. एंटीमाइकोटिक्स ( तालिका 2 के चरण 20) के साथ अंतिम कुल्ला चरण के बाद, ताजा पीबीएस + एंटीबायोटिक दवाओं / एंटीमाइकोटिक्स के साथ बाँझ 6-अच्छी तरह से प्लेटों में ऊतकों को स्थानांतरित करें, और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      एंटीमाइकोटिक्स के साथ नसबंदी के बाद, फेफड़ों के ऊतकों को तुरंत वरीयता दी जा सकती है, या 30 डी तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. स्लाइस पुनर्कोशिकीयकरण और संस्कृति

नोट: चित्रा 2 ऊतक बोने और संस्कृति के लिए एक प्रस्तावित समयरेखा दिखाता है, जिसमें स्लाइस को चूहे फेफड़ों के माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ पहले वरीयता दी जाती है और कम सीरम एंडोथेलियल माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है; फिर सीरम मुक्त एईसी 2 विकास माध्यम के साथ चूहे एईसी 2 एस और चूहे फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट के साथ वरीयता प्राप्त (जैकब एट अल 13 और आप एट अल 35 से अनुकूलित); तालिका 3 में परिणाम और संस्कृति मीडिया विवरण में उपयोग किए जाने वाले सेल स्रोतों पर अतिरिक्त नोट्स देखें। यह रणनीति एईसी 2 मोनोलेयर युक्त वायुकोशीय जैसी संरचनाओं का उत्पादन करती है।

  1. बीजारोपण के लिए ऊतक मचान तैयार करना (दिन -4 या -3)
    1. यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ऊतक मचानों का उपयोग करते हैं, तो बोने से पहले ताजा पीबीएस + एंटीबायोटिक्स / एंटीमाइकोटिक्स (10% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 4% एम्फोटेरिसिन बी, पीबीएस में 0.4% जेंटामाइसिन) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मचान सेते हैं।
    2. बाँझ पीबीएस (5 एमएल / अच्छी तरह से), 5 मिनट प्रत्येक के साथ मचान 3 एक्स कुल्ला।
    3. बोने के लिए ऊतकों का चयन करने के लिए 5x आवर्धन पर एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत मचानों की जांच करें।
      नोट: बोने के लिए सबसे अच्छा मचान कोई आँसू या छेद नहीं है और इसमें बड़े वायुमार्ग या जहाज नहीं होते हैं। जबकि सुविधाओं वाले मचानों को सफलतापूर्वक वरीयता दी जा सकती है, पुन: जनसंख्या पैटर्न वायुकोशीय क्षेत्रों में देखे गए लोगों से भिन्न हो सकते हैं।
  2. एंडोथेलियल सेल सीडिंग (दिन -3)
    1. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं की गणना करें और एंडोथेलियल माध्यम में एंडोथेलियल सेल निलंबन तैयार करें ( तालिका 3 देखें) 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर, प्रति टुकड़ा 500,000 एंडोथेलियल कोशिकाओं को बीज करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के साथ (उदाहरण के लिए, 12 स्लाइस के लिए, 1.2 एमएल माध्यम में 6 एक्स 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें)।
    2. 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में आटोक्लेव बोने वाले स्नान रखें। सीडिंग स्नान के लिए कुल्ला मचानों को उल्टा स्थानांतरित करें: नोकदार पक्षों द्वारा एक कैसेट को समझने के लिए एक ठीक घुमावदार हेमोस्टैट का उपयोग करें, कैसेट के एक छोर को समझने के लिए एक सीधे हेमोस्टैट या संदंश का उपयोग करें (ऊतक को छूने के लिए सावधान रहें) और फ्लिप करें, और फिर नोकदार पक्षों के साथ छेद के माध्यम से ठीक घुमावदार हेमोस्टैट की युक्तियों के साथ फिर से कैसेट को समझें, और एक बोने वाले स्नान में अच्छी तरह से रखें। शेष कैसेट के लिए दोहराएं।
      नोट: जब सही ढंग से रखा जाता है, तो मचान प्रत्येक कुएं के तल में, उल्टा केंद्रित होंगे। यदि आवश्यक हो, तो कैसेट के कोने पर हेमोस्टैट की युक्तियों के साथ धीरे-धीरे दबाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कैसेट कुएं में फ्लैट बैठा है। कैसेट के अनुचित बैठने से खराब ऊतक बोने का कारण बन सकता है। यह स्वीकार्य है अगर कुएं में पीबीएस की थोड़ी मात्रा होती है।
    3. मिश्रण करने के लिए धीरे तैयार सेल निलंबन भंवर, तो विंदुक टिप के साथ ऊतक को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है, सीधे अच्छी तरह से के आधार पर प्रत्येक ऊतक के शीर्ष पर पिपेट 100 μL कोशिकाओं विंदुक करने के लिए एक मैनुअल विंदुक का उपयोग करें।
    4. 5% सीओ 2 पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए वरीयता प्राप्तऊतकों स्थानांतरण।
    5. 2 घंटे के बाद, एक मैनुअल विंदुक का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 900 μL पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम जोड़ें, तो इनक्यूबेटर पर लौटें। यदि माध्यम जोड़ने पर एक कैसेट अनसीट (फ्लोट) हो जाता है, तो धीरे-धीरे पिपेट टिप के साथ कैसेट के कोने पर दबाएं ताकि यह कुएं में सपाट हो।
    6. दिन -2 पर माध्यम बदलें। पेट्री डिश झुकाव और मैन्युअल रूप से एक पिपेट टिप के साथ पाइपिंग द्वारा मध्यम निकालें हल्के ढंग से अच्छी तरह से कोने में रखा, ताकि कैसेट को परेशान न करें। अच्छी तरह से प्रति ताजा एंडोथेलियल माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  3. एईसी 2 और फाइब्रोब्लास्ट सीडिंग और टिशू कल्चर (दिन 0)
    1. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके एईसी 2 एस और फाइब्रोब्लास्ट की गणना करें। एमएल में एईसी 2 एस और फाइब्रोब्लास्ट्स का 1: 1 सेल निलंबन तैयार करें (उपकला आधार माध्यम + एईसी 2 की खुराक; तालिका 3 देखें) 5 एक्स 106 कुल कोशिकाओं / एमएल पर, 500,000 कोशिकाओं (250,000 एईसी 2 एस और 250,000 फाइब्रोब्लास्ट्स) प्रति स्लाइस बीज के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के साथ (उदाहरण के लिए, 12 स्लाइस के लिए, पुन: निलंबित 3 एक्स 10 ए
    2. चरण 4.2.6 में वर्णित के रूप में बोने स्नान के प्रत्येक कुएं से माध्यम से विंदुक। मिश्रण करने के लिए धीरे तैयार सेल निलंबन भंवर, तो विंदुक 100 μL कोशिकाओं सीधे अच्छी तरह से के आधार पर प्रत्येक ऊतक के शीर्ष पर।
      नोट: यह स्वीकार्य है यदि एंडोथेलियल माध्यम की एक छोटी मात्रा एईसी 2 / फाइब्रोब्लास्ट बोने से पहले कुएं में रहती है।
    3. 5% सीओ 2 पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए वरीयता प्राप्तऊतकों स्थानांतरण।
    4. 2 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में 900 μL पूर्व-गर्म एईसी 2 विकास माध्यम जोड़ें, फिर इनक्यूबेटर पर लौटें।
    5. संस्कृति के 24 घंटे (दिन 1) के बाद, कैसेट प्रति अच्छी तरह से पूर्व-गर्म एईसी 2 विकास माध्यम के 1 एमएल के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
    6. विंदुक बीजारोपण स्नान के प्रत्येक कुएं से मध्यम के 800 μL. बीजारोपण स्नान से कैसेट निकालें: नोकदार पक्षों के साथ छेद के माध्यम से एक ठीक घुमावदार हेमोस्टैट के साथ प्रत्येक को समझें, एक छोर पर कैसेट को समझने और फ्लिप करने के लिए सीधे हेमोस्टैट या संदंश में स्थानांतरित करें, फिर घुमावदार हेमोस्टैट का उपयोग करें नोकदार पक्षों के माध्यम से कैसेट को समझने के लिए और दाईं ओर-ऊपर-ऊपर स्थानांतरित करें, एक प्रति अच्छी तरह से, तैयार 12-अच्छी तरह से प्लेट में।
    7. दिन 7 तक या संस्कृति की वांछित लंबाई के लिए हर दूसरे दिन 12-अच्छी तरह से प्लेट में संस्कृति माध्यम बदलें: प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें, ऊतक को छूने के लिए सावधान रहें; अच्छी तरह से प्रति 1 एमएल ताजा एईसी 2 विकास माध्यम में पिपेट।
      नोट: ऊतक पुनर्जनसंख्या की डिग्री संस्कृति की अवधि के दौरान 5x आवर्धन पर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के माध्यम से निगरानी की जा सकती है।

5. ऊतक हार्वेस्ट और नमूना विश्लेषण

  1. हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए ईएलटी को ठीक करने के लिए, टिशू कल्चर कैसेट को 10% तटस्थ-बफर फॉर्मलिन में स्थानांतरित करें और घुमाव पर कमरे के तापमान पर 3-4 घंटे के लिए सेते हैं। एक ठीक नुकीले संदंश की नोक का उपयोग करके कैसेट से ऊतकों निकालें ऊतक जहां यह टैब से मिलता है काटने के लिए। पैराफिन एम्बेडिंग और हिस्टोलॉजी के लिए नियमित तरीकों के अनुसार ऊतक की प्रक्रिया; किसी विशेष तकनीक की आवश्यकता नहीं है।
  2. क्यूआरटी-पीसीआर के लिए ईएलटी को संसाधित करने के लिए, पीबीएस 2 एक्स में कैसेट में ऊतकों को कुल्लाएं, फिर ऊतकों को हटा दें और फ्रीज स्नैप करें या आरएनए निष्कर्षण के लिए लाइसिस के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: पूलिंग कम से कम 2 स्लाइस 1 x 106 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त और 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत डाउनस्ट्रीम पीसीआर विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए उपज चाहिए।

Representative Results

ईएलटी उत्पन्न करने की प्रक्रिया का अवलोकन - फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया, टुकड़ा कतरन और विकोशिकीयकरण, और मचान पुन: जनसंख्या शामिल है - चित्रा 3 में प्रस्तुत किया गया है। यहां प्रस्तुत ईएलटी को प्राथमिक चूहे फेफड़े के माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (सामग्री की तालिका देखें), नवजात चूहे एईसी 2 एस, और लिपोफिब्रोब्लास्ट-समृद्ध नवजात चूहे फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट36 का उपयोग करके सुसंस्कृत किया गया था। एईसी 2 को चुंबकीय मनका-आधारित सॉर्टिंग के माध्यम से ताजा रूप से अलग किया गया था जैसा कि पहलेवर्णित है 37; वैकल्पिक आइसोलेशन प्रोटोकॉल को विस्तृत किया गया है और कहीं और चर्चा की गई है 38,39,40। पृथक चूहे एईसी 2 एस की शुद्धता का मूल्यांकन चूहे-विशिष्ट एईसी 2 सतह मार्कर आरटीआईआई -7041 के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से किया जा सकता है, या आरटीआईआई -70 या प्रो-सर्फैक्टेंट प्रोटीन सी (पीएसपीसी) के लिए साइटोसेंट्रीफ्यूज्ड सेल नमूने के धुंधला होने के माध्यम से किया जा सकता है। चूहे फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट एक प्रकाशित प्रोटोकॉल42 के अनुकूलन के अनुसार प्रसवोत्तर दिन 7-9 चूहे पिल्ले से अलग थे और पारित होने 1-2 पर इस्तेमाल किया; वैकल्पिक अलगाव प्रोटोकॉल कहीं और43,44 वर्णित किया गया है। पृथक फाइब्रोब्लास्ट्स की शुद्धता का आकलन मेसेनकाइमल मार्कर विमेंटिन के लिए सुसंस्कृत या साइटोसेंट्रीफ्यूज्ड कोशिकाओं के धुंधला होने के माध्यम से किया जा सकता है, और तेल लाल ओ45 के लिए धुंधला होने के माध्यम से लिपोफिब्रोब्लास्ट संवर्धन का आकलन किया जा सकता है।

जब फेफड़ों के ऊतकों को समान रूप से एगरोज़ के साथ फुलाया जाता है, और ऊतक के टुकड़े रणनीतिक रूप से चयनित होते हैं और टुकड़ा करने की क्रिया के लिए उन्मुख होते हैं ताकि कुल और पैरेन्काइमल ऊतक क्षेत्र को अधिकतम किया जा सके, तो एक चूहे का फेफड़ा >100 वायुकोशीय ईएलटी के लिए ऊतक पैदा कर सकता है। पीसीएलएस की स्ट्रिप्स फाड़ने के कुछ (<5%) उदाहरणों (चित्रा 3 बी) के साथ ऊतक कैसेट में क्लिप करने के लिए पर्याप्त यांत्रिक अखंडता प्रदर्शित करती हैं।

फेफड़ों के स्लाइस को विकोशिकीय बनाने के लिए प्रोटोकॉल बारीकी से हमारे पहले प्रकाशित पूरे फेफड़ों के विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल पर आधारित है, जो मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स द्वारा कई ईसीएम घटकों को देशी फेफड़ों22 में उन लोगों से काफी अलग नहीं स्तरों पर संरक्षित करने के लिए प्रदर्शित किया गया था। विकोशिकीय टुकड़ा मचान एल्वियोली के मूल वास्तुकला को संरक्षित करते हैं, जैसा कि हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला (चित्रा 4 ए, बी) और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 सी) द्वारा देखा गया है। हम आम तौर पर बड़े वायुमार्ग या जहाजों (चित्रा 4 डी) या आँसू वाले मचानों को बाहर करते हैं, हालांकि पूर्व को शामिल किया जा सकता है यदि वे शोधकर्ता के लिए रुचि रखते हैं। विकोशिकीयकरण ऊतक डीएनए सामग्री में 96% की कमी की ओर जाता है जैसा कि डबल-फंसे डीएनए के लिए एक परख द्वारा मापा जाता है (सामग्री की तालिका देखें; 0.50 μg / मिलीग्राम ± 0.073 μg / मिलीग्राम बनाम 0.018 μg / मिलीग्राम ± 0.0035 μg / मिलीग्राम क्रमशः देशी बनाम विकोशिकीय ऊतक में, एसईएम ± मतलब है) (चित्रा 5 ए), हेमटॉक्सिलिन धुंधला द्वारा दिखाई देने वाला कोई डीएनए नहीं है विकोशिकीय मचानों के हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने से ईसीएम प्रोटीन कोलेजन, इलास्टिन, कोलेजन चतुर्थ और लैमिनिन के रखरखाव का पता चलता है, जिसमें वास्तुकला और देशी फेफड़ों के स्लाइस (चित्रा 5 बी-ई) के समान मात्रा होती है। ध्यान दें कि देशी ऊतकों के नाभिक ट्राइकोम (कोलेजन के लिए) और ईवीजी (इलास्टिन के लिए) दाग के साथ नीले / इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला ऊतकों37 धुंधला करने के लिए मानक तरीकों का उपयोग करके, पहले वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था। उपयोग किए गए एंटीबॉडी और उनकी संबंधित सांद्रता तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं।

सफल मचान पुन: जनसंख्या 7 दिनों के बाद अत्यधिक सेलुलर ईएलटी की ओर जाता है, जिसमें प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6 ए-सी) द्वारा दिखाई देने वाले वायुकोशीय-जैसे पुन: जनसंख्या पैटर्न होता है। कुछ मामलों में, बहुत अधिक सेलुलरता के साथ, ऑर्गेनोइड-प्रकार की संरचनाएं दिखाई दे सकती हैं (चित्रा 6 ए, बी)। असफल ऊतक बोने संस्कृति (चित्रा 6 सी) के दौरान चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है। एईसी 2 एस, फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ ऊतक मचानों को संवर्धन करने के बाद, ईएलटी वायुकोशीय जैसी संरचनाओं के साथ घनी आबादी वाले होते हैं जिसमें सभी तीन सेल वंश (चित्रा 6 डी, ई) शामिल होते हैं। दिन 7 या 8 में, एईसी 2 घनाकार आकृति विज्ञान बनाए रखते हैं और सर्फेक्टेंट प्रोटीन-बी (एसपीबी) और लैमेलर बॉडी प्रोटीन एबीसीए 3 व्यक्त करते हैं, एईसी 1 एस (चित्रा 6 ई, एफ) के लिए महत्वपूर्ण भेदभाव के सबूत के बिना। एईसी 2 एस ईएलटी में अत्यधिक प्रसारक हैं, जैसा कि 10 μM (चित्रा 6 जी) पर 2 घंटे की नाड़ी के बाद 5-एथिनाइल -2 '-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) निगमन द्वारा प्रदर्शित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: फेफड़ों के निष्कर्षण और समाशोधन के लिए छिड़काव प्रणाली की योजनाबद्ध( ए) छिड़काव प्रणाली में एक गुरुत्वाकर्षण संचालित अंग शामिल है, जिसका उपयोग प्रवाह के तहत फुफ्फुसीय धमनी के प्रारंभिक कैनुलेशन के लिए किया जाता है; और एक पंप-चालित अंग, जिसका उपयोग प्रारंभिक कैनुलेशन के बाद फेफड़ों को कुशलतापूर्वक साफ करने के लिए किया जाता है। पंप लाइन में एक "पल्स डैम्पनर" शामिल है जो पंप के कारण दबाव में स्पाइक्स को कम करता है। श्वासनली और फुफ्फुसीय धमनी प्रवेशनी का डिजाइन बाईं ओर विस्तृत है। एसएनपी = सोडियम नाइट्रोप्रससाइड। (बी) पल्स डैम्पनर असेंबली का विवरण। बीपीटी और सिलिकॉन टयूबिंग के प्रकारों को संदर्भित करते हैं। (सी) फेफड़ों के निष्कर्षण के दौरान रखे गए श्वासनली और फुफ्फुसीय धमनी प्रवेशनी की स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: त्रि-वंश पुनर्कोशिकीयकरण के लिए संस्कृति समयरेखा। त्रि-वंश ईएलटी बोने और संस्कृति के लिए प्रस्तावित समयरेखा, जिसमें दो-चरण बोने का समय भी शामिल है। प्रत्येक चरण के लिए बीजारोपण और संस्कृति माध्यम के लिए सेल नंबर इंगित किए जाते हैं। तालिका 3 में संस्कृति मीडिया विवरण देखें। एईसी 2 = वायुकोशीय उपकला प्रकार 2 सेल। ईसी = एंडोथेलियल सेल। एफबी = फाइब्रोब्लास्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी की योजनाबद्ध( ए) देशी फेफड़ों के ऊतकों को एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके स्लाइस में काट दिया जाता है। (बी) प्रेसिजन-कट फेफड़ों के स्लाइस को मानकीकृत 3 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स में काट दिया जाता है, पॉलीटेट्राफ्लोरेथिलीन (पीटीएफई) टिशू-कल्चर कैसेट में क्लिप किया जाता है, और एसेलुलर बाह्य मैट्रिक्स मचानों का उत्पादन करने के लिए डिटर्जेंट-विकोशिकीय किया जाता है। (सी) मचानों को विशेष बीजारोपण स्नान में फिर से बनाया जाता है जो बीजारोपण क्षेत्र को ऊतक के क्षेत्र तक सीमित करते हैं, और फिर एक मानक अच्छी तरह से प्लेट में सुसंस्कृत होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विकोशिकीय फेफड़ों के मचानों की संरचना। देशी (ए) और विकोशिकीय (बी) फेफड़ों के स्लाइस के एच एंड ई धुंधला हो जाना विकोशिकीयकरण के बाद वायुकोशीय वास्तुकला के संरक्षण को दर्शाता है। (सी, डी) चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा 5x आवर्धन पर देखे गए विकोशिकीय ईसीएम मचानों के उदाहरण, जिसमें मुख्य रूप से वायुकोशीय ऊतक (सी) शामिल हैं या बड़े शाखाओं वाले वायुमार्ग और जहाजों (डी, काले और लाल तीरहेड्स) शामिल हैं। स्केल सलाखों, 50 μm (ए, बी); 500 μm (सी, डी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विकोशिकीय फेफड़ों के मचानों में डीएनए हटाने और मैट्रिक्स संरक्षण ( ए) देशी और विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस में डीएनए का परिमाणीकरण (एसईएम, एन = 5 ± मतलब)। वेल्च का टी परीक्षण, ** पी 0.01 <। डेसेल = विकोशिकीय। (बी, सी) "कोलेजन (बी) और इलास्टिन (सी) के लिए देशी और विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस का हिस्टोलॉजिकल धुंधला हो जाना". एरोहेड्स, इलास्टिन विकोशिकीय ऊतक के वायुकोशीय प्रवेश द्वार के छल्ले में संरक्षित है। (डी, ई) "कोलेजन चतुर्थ (डी) और लैमिनिन (ई) के लिए देशी और विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना". स्केल सलाखों, 50 μm. सभी पैनलों में, बिंदीदार बक्से छवि क्षेत्र को रेखांकित करते हैं जो प्रत्येक संबंधित पैनल में दाईं ओर बढ़ाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों की सेलुलर पुन: जनसंख्या। (ए-सी) संस्कृति के दिन 7 पर पुनर्कोशिकीय ईएलटी के उदाहरण, जैसा कि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृति के दौरान कल्पना की गई थी। पुनर्कोशिकीयकरण पैटर्न ऊतक की वायुकोशीय संरचना को प्रतिबिंबित करता है। उच्च कोशिकीयता के कुछ क्षेत्रों में, ऑर्गेनोइड जैसी संरचनाएं बन सकती हैं (तीरहेड्स)। (ए) और (बी) सफल सेल रिपॉपुलेशन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि (सी) संस्कृति के 7 दिनों के बाद पुनर्कोशिकीयकरण के खराब स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी-जी) संस्कृति के 7 या 8 दिन पर पुनर्कोशिकीय ईएलटी का धुंधला होना। (डी) एच एंड ई धुंधला वायुकोशीय सेप्टा के सेलुलर पुन: जनसंख्या दिखा रहा है। (ई) इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला लेबल प्रोकोलेजनआई1+ फाइब्रोब्लास्ट्स, एबीसीए 3 + एईसी 2 एस, और सीडी 31 + एंडोथेलियल कोशिकाओं को शामिल करता है। (एफ) ऊतकों में प्रचुर मात्रा में एसपीबी + एईसी 2 होते हैं लेकिन इन स्थितियों के तहत कुछ आरटीआई -40 (पोडोप्लानिन) + एईसी 1 होते हैं। (जी) ईएलटी में कई एईसी 2 का प्रसार हो रहा है, जैसा कि ईडीयू निगमन द्वारा मापा जाता है। स्केल सलाखों, 500 μm (ए-सी); 25 μm (डी-जी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: विकोशिकीयकरण समाधान। विकोशिकीयकरण समाधानों के लिए तैयारी विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल। फेफड़ों के स्लाइस को विकोशिकीय बनाने के लिए प्रोटोकॉल का विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: संस्कृति मीडिया। एंडोथेलियल और एईसी 2 विकास मीडिया के लिए तैयारी विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 4: इम्यूनोस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी। इम्यूनोस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और उनकी सांद्रता का विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 1: लेजर काटने ऊतक संस्कृति कैसेट फ्रेम के लिए डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: लेजर काटने ऊतक संस्कृति कैसेट क्लिप के लिए डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 3: लेजर काटने ऊतक संस्कृति कैसेट टैब के लिए डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 4: स्नान मोल्ड बेस बोने के लिए सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 5: स्नान मोल्ड अंगूठी बोने के लिए सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह पेपर इन विट्रो में इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए एक मंच के रूप में विकोशिकीय परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस के उपयोग का वर्णन करता है, जिसमें बहु-वंश वायुकोशीय जैसी संरचनाएं होती हैं। रणनीतियों के संयोजन से जो हमने पहले पूरे फेफड़ों की इंजीनियरिंग22,31 के लिए उच्च-निष्ठा एसेलुलर ईसीएम फेफड़ों के मचानों को फिर से तैयार करने के लिए विकसित किया था, छोटे पैमाने पर इंजीनियर हृदयऊतकों 30 संवर्धन के लिए हमारी मजबूत प्रणाली के साथ, यह प्रोटोकॉल एक टिशू कल्चर सब्सट्रेट के रूप में शारीरिक रूप से प्रासंगिक फेफड़े ईसीएम के उपयोग को सक्षम बनाता है, एक दोहराने योग्य और मध्यम-थ्रूपुट तरीके से।

यहां प्रस्तुत विधियां चूहे के फेफड़ों से ईएलटी मचान तैयारी का विस्तार करती हैं, जो आसानी से प्राप्य हैं, को अगारोज मुद्रास्फीति के लिए बरकरार वायुमार्ग तक सीधी पहुंच के साथ एन ब्लॉक निकाला जा सकता है, और माउस फेफड़ों की तुलना में बड़े आकार के हैं। हालांकि, किसी भी फेफड़े के ऊतक जिसे एगरोज़ के साथ फुलाया जा सकता है और लंबाई में कम से कम 9 मिमी स्लाइस उपज इस प्रणाली के भीतर उपयोग किया जा सकता है। ऊतक स्रोत के बावजूद, एगरोज़ के साथ फेफड़ों के ऊतकों की समान मुद्रास्फीति डाउनस्ट्रीम ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया, कतरन और ऊतक हैंडलिंग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। अंडरफ्लेटेड फेफड़ों के ऊतक सफाई से टुकड़ा नहीं करते हैं, जबकि ओवरफ्लेटेड ऊतक कतरन के दौरान फाड़ सकते हैं। एगरोज़ जेलेशन के बाद, उचित रूप से फुलाए गए ऊतक क्षेत्र फर्म होते हैं लेकिन धीरे-धीरे संदंश के साथ दबाए जाने पर थोड़ा सा देते हैं। बरकरार चूहे के फेफड़ों के लिए, हमने पाया कि निकाले गए फेफड़ों को कई बार हवा के साथ फुलाने से पहले, निष्कर्षण के बाद जितनी जल्दी हो सके एगरोज मुद्रास्फीति के बाद, सर्वोत्तम टुकड़ा करने की क्रिया परिणाम और परिणामस्वरूप ऊतक मचानों की सर्वोत्तम गुणवत्ता होती है। एगरोज़ की उचित मात्रा को अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित करने की आवश्यकता है; चूहे के फेफड़े के लिए फेफड़ों को कुल फेफड़ों की क्षमता तक फुलाने के लिए आवश्यक मात्रा लगभग 30 एमएल / किग्रा पशु द्रव्यमान (उदाहरण के लिए, 350 ग्राम चूहे से फेफड़ों के लिए 10.5 एमएल अगारोज) है। कम सीधी वायुमार्ग पहुंच (जैसे मानव दाताओं से) के साथ बड़े विच्छेदित फेफड़ों के ऊतकों के लिए, ब्रोंकस32 के माध्यम से ऊतक को फुलाने के लिए कुछ अतिरिक्त समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। बाद के फेफड़ों के टुकड़े टुकड़े के दौरान, सवार पर ऊतक का चयन और अभिविन्यास 1 के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है) सुनिश्चित करें कि स्लाइस ऊतक स्ट्रिप्स उत्पन्न करने के लिए काफी बड़े हैं जिन्हें ऊतक संस्कृति कैसेट में क्लिप किया जा सकता है और 2) पैरेन्काइमल (वायुकोशीय) ऊतक क्षेत्र को अधिकतम करें, बड़े वायुमार्ग या जहाजों को छोड़कर।

टिशू कल्चर कैसेट में पीसीएलएस को क्लिप करना शुरू में एक चुनौतीपूर्ण कदम हो सकता है, लेकिन कैसेट विकोशिकीयकरण और बोने के दौरान ऊतक हैंडलिंग को बहुत सरल बनाते हैं। उत्पन्न होने वाली दो संभावित समस्याएं ऊतक फाड़ (या तो कतरन की प्रक्रिया के दौरान, या विकोशिकीयकरण के दौरान), या क्लिप में ऊतक की स्थिति जिसके परिणामस्वरूप खराब डाउनस्ट्रीम सीडिंग होती है (उदाहरण के लिए, कोई बीजारोपण नहीं, या सिरों पर बोना)। फाड़ एगरोज़ ओवरइन्फ्लेशन, टैब सम्मिलन के दौरान ऊतक के ओवरस्ट्रेचिंग, या टैब डालने के दौरान पर्याप्त ऊतक पकड़ प्रदान करने के लिए बहुत कम ओवरहैंग छोड़ने का परिणाम हो सकता है। ध्यान दें कि स्लाइस जो एक क्लिप अंत में आंसू को सफलतापूर्वक वरीयता दी जा सकती है, हालांकि, उन्हें संस्कृति के दौरान माइक्रोस्कोप के नीचे कल्पना करना मुश्किल है क्योंकि ऊतक सपाट नहीं है। खराब ऊतक बोने (जैसे कि चित्रा 6 सी में) संभवतः दो क्लिप के बीच फ्लैट झूठ नहीं बोलने वाले टुकड़े का परिणाम है, और इस प्रकार उल्टा फ़्लिप होने पर अच्छी तरह से बोने वाले स्नान के आधार के साथ खराब संपर्क बनाता है। एक अन्य संभावित कारण बोने वाले स्नान के तल में कैसेट का अनुचित बैठना अच्छी तरह से है। कतरन के संदर्भ में, दूसरी क्लिप रखते समय ऊतक में थोड़ा अधिक तनाव लागू करें ताकि इसे सपाट झूठ बोलने में मदद मिल सके। कुछ स्लाइस में थोड़ी सी उत्तलता होती है; इन मामलों में उत्तल पक्ष के साथ टुकड़ा क्लिप करें। अभ्यास के साथ, हम आमतौर पर 2% से कम स्लाइस के साथ असफल बीजारोपण का अनुभव करते हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा कुछ विशेष उपकरणों की आवश्यकता है - एक लेजर कटर और एक 3 डी प्रिंटर - ईएलटी तैयारी के लिए प्रारंभिक सामग्री उत्पन्न करने के लिए। हालांकि, एक बार टिशू कल्चर कैसेट और बोने वाले स्नान बनाए जाने के बाद, कोई अतिरिक्त विशेष सामग्री की आवश्यकता नहीं होती है। ईएलटी मचान तैयारी के फेफड़े के टुकड़ा करने की क्रिया और विकोशिकीयकरण चरण मामूली समय लेने वाले हैं; हालाँकि, इन चरणों को अग्रिम रूप से किया जा सकता है, या एक ही समय में कई प्रयोगों की तैयारी के लिए पर्याप्त संख्या में। कई पीसीएलएस (>100 यदि पैरेन्काइमल क्षेत्रों के लिए अनुकूलन करते हैं) को एक ही फेफड़े से काटा जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए स्नैप-जमे हुए किया जा सकता है। जबकि एक एकल फ्रीज-पिघलना चक्र ईसीएम46 को मामूली अल्ट्रास्ट्रक्चरल क्षति का कारण बन सकता है, यहां तक कि कई फ्रीज-पिघलना चक्रों को ईसीएम 23,47 में महत्वपूर्ण नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए प्रदर्शित किया गया है। एक प्रयोग से पहले पीसीएलएस को क्लिप और विकोशिकीय भी किया जा सकता है, जिसका उपयोग एक महीने के भीतर किया जा सकता है। (विशेष रूप से, वर्णित विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल को लगभग 6 घंटों में पूरा किया जा सकता है, जो पहले वर्णित विधियों पर एक महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व करता है जिसके लिए एक दिन या उससे अधिक27,28 की आवश्यकता होती है। एक बार मचान तैयार हो जाने के बाद, सेल सीडिंग प्रक्रिया सरल और तेज़ होती है, और ईएलटी की संस्कृति को विशेष तकनीकों की आवश्यकता नहीं होती है।

वर्णित ईएलटी विधि की एक चेतावनी क्षेत्र-विशिष्ट बोने की कमी है, अर्थात, विशेष रूप से वायुकोशीय अंतरिक्ष में एईसी 2 एस की डिलीवरी, या विशेष रूप से संवहनी अंतरिक्ष में एंडोथेलियल कोशिकाएं। फिर भी, यद्यपि कोशिकाओं को केवल ऊतक मचानों के शीर्ष पर वरीयता दी जाती है, पुनर्कोशिकीयकरण का पैटर्न गैर-यादृच्छिक है, जिसमें वायुकोशीय जैसे संगठन की कुछ झलक है, जिसमें उपकला के छल्ले भी शामिल हैं। हमें संदेह है कि सेल-सेल इंटरैक्शन, साथ ही ईसीएम संरचना और ज्यामिति20,21 में स्थानीय अंतर, संभवतः मनाया पुनर्कोशिकीयकरण पैटर्न में योगदान करते हैं। इस परिकल्पना के समर्थन में, एक पहले प्रकाशित अध्ययन, जिसमें फाइब्रोब्लास्ट्स को गैर-विशेष रूप से विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस पर वरीयता दी गई थी, ने प्रदर्शित किया कि ऊतक पुन: जनसंख्या और संबंधित सेलुलर फेनोटाइप का पैटर्न सूक्ष्म ऊतक क्षेत्र और ईसीएम मचान स्रोत (जैसे, स्वस्थ बनाम रोगग्रस्त) 27 द्वारा काफी भिन्न होता है। फाइब्रोब्लास्ट्स को इंटरस्टिटियम में आक्रमण करने के लिए भी देखा गया था - वह स्थान जिसमें वे देशी फेफड़ों केऊतकों 1,27 में रहते हैं। प्राथमिक वैकल्पिक विधि जिसे हम वास्तव में क्षेत्र-विशिष्ट तरीके से फेफड़ों के स्लाइस पर संस्कृति कोशिकाओं की कल्पना कर सकते हैं, वायुमार्ग31,48 और संवहनी डिब्बों49,50 के माध्यम से बरकरार विकोशिकीय फेफड़ों को बोना होगा, और फिर पुनर्कोशिकीय ऊतक को टुकड़ा करना होगा। हालांकि, यह विकल्प 1) काफी अधिक लागत-, समय-, और संसाधन-गहन है; 2) कम थ्रूपुट है; 3) जानवरों की बढ़ी हुई संख्या की आवश्यकता होती है; और 4) पूरे फेफड़ों की संस्कृति की चुनौतियों और वरीयता प्राप्त फेफड़ों के बाद के टुकड़ा करने की क्रिया के कारण संदूषण के बढ़ते जोखिम से जुड़ा हुआ है। देशी सेलुलर संगठन के सभी पहलुओं को दोहराते हुए, ईएलटी प्लेटफॉर्म शारीरिक रूप से प्रासंगिक ईसीएम सब्सट्रेट पर फेफड़ों की कोशिका संस्कृति को सक्षम बनाता है, इस तरह से जो कई और प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है।

ईएलटी प्रणाली का लचीलापन इस मंच का एक बड़ा लाभ है, और किसी भी संख्या में ऊतक मचान, कोशिकाओं या ब्याज की संस्कृति मीडिया के साथ छोटे पैमाने पर फेफड़ों के ऊतक संस्कृति की अनुमति देनी चाहिए। रोगग्रस्त ऊतक या चोट मॉडल से प्राप्त मचानों का उपयोग रोग-परिवर्तित ईसीएम 27,29,51 की स्थापना में सेल-सेल या सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति दे सकता है। हालांकि, ध्यान दें कि विकोशिकीयकरण प्रोटोकॉल को प्रजातियों के बीच मैट्रिक्स मतभेदों के लिए खाते में अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है52. वर्णित सीडिंग रणनीति का उपयोग किसी भी सेल प्रकार के लिए किया जा सकता है, और संस्कृति समयरेखा शोधकर्ता की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित है। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, पाड़ प्रति 1 x 106 कोशिकाओं को संस्कृति के 7 दिनों के भीतर एक अत्यधिक सेलुलर ऊतक उत्पन्न करना चाहिए, जबकि 1 एक्स 105 कुल कोशिकाओं के परिणामस्वरूप खराब सेलुलरता होती है। समयरेखा के किसी भी अनुकूलन में, ऊतक संस्कृति कैसेट को अंतिम ऊतक बोने के बाद 24 घंटे के बीजारोपण स्नान से हटा दिया जाना चाहिए। यहां, फेफड़ों के वायुकोशीय की कुछ सेलुलर जटिलता को मॉडलिंग करने के लक्ष्य के साथ, हम एक त्रि-संस्कृति पुनर्कोशिकीयकरण रणनीति का वर्णन करते हैं जो कम से कम 7 दिनों के लिए वायुकोशीय जैसी संरचनाओं में अच्छी तरह से विभेदित नवजात एईसी 2 के रखरखाव का समर्थन करता है। हमारे परिणाम ईएलटी के भीतर फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों के सफल प्रवेश को भी प्रदर्शित करते हैं, संस्कृति सब्सट्रेट की व्यापक प्रयोज्यता और सह-संस्कृति अध्ययन के लिए इसकी उपयुक्तता पर जोर देते हैं। ईएलटी में वयस्क कोशिकाओं को बोने से अधिक शांत वायुकोशीय संरचनाओं के मॉडलिंग की सुविधा मिल सकती है, जबकि मानव पीएससी-व्युत्पन्न एईसी 2 एस को बोना, जिसमें आनुवंशिक संशोधन भी शामिल हैं, मानव रोग13,53 के अनुवादसंबंधी अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। सामान्य तौर पर, ईएलटी प्लेटफ़ॉर्म द्वारा सक्षम बॉटम-अप दृष्टिकोण ब्याज के रीडआउट के लिए विशेष सेल प्रकारों के योगदान की जांच करने का अवसर प्रस्तुत करता है - जैसे कि एईसी 2 प्रसार या भेदभाव राज्य।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल एसेलुलर ईसीएम फेफड़ों के टुकड़े मचान के भीतर एईसी 2 एस, फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के सह-संस्कृति अध्ययन के लिए इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत प्रणाली की रूपरेखा तैयार करता है। ईएलटी प्राथमिक एईसी 2 के लिए एक उपन्यास 3 डी संस्कृति रणनीति का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो आज तक आमतौर पर एक अच्छी तरह से विभेदित फेनोटाइप 6,11,12 को बनाए रखने के लिए कम-शारीरिक जेल-प्रकार के मैट्रिक्स पर भरोसा करते हैं। वर्तमान मंच विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस 24,25,26,27,28,29 के पुनर्जनसंख्या में पिछले काम पर बनाता है, लेकिन कई फायदे प्रदान करता है: 1) विकोशिकीयकरण, बीजारोपण और संस्कृति के दौरान ईएलटी हैंडलिंग की सुविधा के लिए एक ऊतक संस्कृति कैसेट प्रणाली; 2) प्रत्येक टुकड़ा मचान पर कोशिकाओं की एक ज्ञात संख्या को ठीक से बीज करने के लिए एक अनुकूलित बीजारोपण स्नान; और 3) एक त्रि-संस्कृति रीसीडिंग रणनीति जो उपकला, मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ वायुकोशीय ऊतक पुन: जनसंख्या को सक्षम बनाती है। इस प्रकार, ईएलटी इन विट्रो मॉडल में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं जो देशी एल्वियोलस और एईसी 2 स्टेम सेल आला की सेलुलर और सब्सट्रेट जटिलता को पकड़ते हैं।

Disclosures

एलईएन हुमासाइट, इंक में एक संस्थापक और शेयरधारक है, जो एक पुनर्योजी दवा कंपनी है। हुमासाइट संवहनी सर्जरी के लिए एलोजेनिक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से इंजीनियर रक्त वाहिकाओं का उत्पादन करता है। एलईएन के पति या पत्नी की हमासाइट में इक्विटी है, और एलईएन हमासाइट के निदेशक मंडल में कार्य करता है। एलईएन पेटेंट पर एक आविष्कारक है जो हुमासाइट को लाइसेंस प्राप्त है और जो एलईएन एलईएन के लिए रॉयल्टी का उत्पादन करता है, ने येल में अपनी प्रयोगशाला में अनुसंधान का समर्थन करने के लिए एक अप्रतिबंधित अनुसंधान उपहार प्राप्त किया है। हुमासाइट ने इस रिपोर्ट में निष्कर्षों के आचरण, विवरण या व्याख्या को प्रभावित नहीं किया।

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले टिशू कल्चर कैसेट डिजाइन को विकसित करने के लिए लोरेंजो सेवानन और जॉर्ज नुनेज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं, उनके वाइब्रेटोम के उपयोग के लिए कामिंस्की प्रयोगशाला, फेफड़ों के टुकड़े करने की क्रिया के साथ सहायता के लिए मौरिज़ियो चियोसिओली और जेसिका नौस, प्रारंभिक पायलट प्रयोगों के साथ सहायता के लिए एली लारोक्को, और प्रोटोकॉल के सावधानीपूर्वक पढ़ने के लिए हांग कियान। इस काम को एनआईएच अनुदान एफ 30 एचएल 143880 (केएलएल), चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम प्रशिक्षण अनुदान टी 32 जीएम 136651 (केएलएल), और यू01 एचएल 145567 (एलईएन) द्वारा समर्थित किया गया था; और हुमासाइट इंक (एलईएन) से एक अप्रतिबंधित अनुसंधान उपहार द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printer: Form 2 Formlabs
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I5879
8-Bromo cAMP Sigma B7880
Agarose, UltraPure LMP Invitrogen 15517-014
Amphotericin B Sigma A2942
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch McMaster-Carr 5121K271
Benzonase nuclease Sigma E1014
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V Gemini 700-104P For AEC2 growth medium
Bovine serum albumin (BSA), standard grade Gemini 700-100P For benzonase buffer
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb Cole-Parmer SK-98553-10
CHIR99021 PeproTech 2520691
Clear Resin, 1 L Formlabs RS-F2-GPCL-04
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue Any hardware, craft, or drug store KG483 or similar
Dexamethasone Sigma D4902
DMEM (low glucose) Gibco 11885-084
DMEM (high glucose) Gibco 11965-092
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) Invitrogen P7589
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 AmericanBio AB00502-01000
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) Invitrogen C10340 Used according to manufacturer's directions
Elbow fitting, 3/8 inch McMaster-Carr 5121K907
F12 Gibco 11765-054
Fetal bovine serum (FBS), characterized Hyclone SH30071.03
Gentamicin sulfate Gemini 400-100P Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL
Hair clippers Wahl MiniArco
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free Gibco 14175-095
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL Sagent NDC: 25021-400-30 For intraperitoneal and intracardiac injection
Heparin sodium salt Sigma H4784 For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS
HEPES Buffer Corning 25-060-Cl
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch McMaster-Carr 5121K851
Inoculating loop, disposable Fisherbrand 22-363-600
Insulin from bovine pancreas Sigma I6634
Ketamine injection, 100 mg/mL Covetrus (Butler Animal Health) 010177
KGF, recombinant human PeproTech 100-19
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt Universal Laser Systems
L-glutamine Gibco 25030-081
Luer-lock, female, 3/32 inch Cole-Parmer 45508-02
Luer-lock, male, 1/8 inch Cole-Parmer 30800-24
Luer-lock, male, 1/4 inch McMaster-Carr 51525K146
MCDB-131 Complete without serum VEC Technologies MCDB-131 WOFBS
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M AmericanBio AB09006-00100
NaCl American Bioananalytical AB01915
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X Sigma D1408 Reconstitute to 1X with diH2O
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ Gibco 21300-058
PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corporation 4019862
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) Gibco 15140-122
Petri dish, 150 mm Falcon 351058
Plastic film (parafilm) Bemis PM-996
Pharmed BPT tubing, LS 16 Masterflex 06508-16
Pharmed BPT tubing, LS 17 Masterflex 06508-17
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 Masterflex 96420-14
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 Masterflex 96420-16
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 Masterflex 96410-36
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) Sigma P2443
Povidone/iodine prep pads, 10% Dynarex Corporation 1108
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick ePlastics PTFENAT0.060X12X12 For tissue culture cassette tabs
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick ePlastics PTFENAT0.093X12X12 For tissue culture cassette frames and clips
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive Cole-Parmer ZM-07528-30
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head Cole-Parmer EW-77202-60
Rat, Sprague Dawley Charles River Strain Code: 400
Razor blade Any hardware or craft store Personna 94-120-71 or similar
Retinoic acid Sigma R2625
Rotary blades, 28 mm Omnigrid 2046
Rotary cutter, 28 mm Olfa Model 9551
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma D6750
Sodium nitrorusside (SNP) Sigma 71778
Stopcock, 4-way Edwards 594WSC
Suture, 4-0 monofilament polypropylene Covidien VP-557-X
Syringe, 10 mL BD 302995
Syringe, 50 mL BD 309653
Tissue culture dish, 35 mm Falcon 353001
Tissue culture dish, 100 mm Corning 430167
Tissue culture plate, 6-well Falcon 353046
Tissue culture plate 12-well Falcon 353043
Transferrin human Sigma T8158
Tris, 1 M solution, pH 8.0 AmericanBio AB14043-01000
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z Precisionary Instruments LLC
Xylazine, 100 mg/mL Henry Schein NDC: 11695-4022-1
Y-connector, 1/16 inch barbed Cole-Parmer 30614-43

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 179
इंजीनियर फेफड़ों के ऊतकों को विकोशिकीय फेफड़ों के स्लाइस से तैयार किया जाता है
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Leiby, K. L., Ng, R., Campbell, S.… More

Leiby, K. L., Ng, R., Campbell, S. G., Niklason, L. E. Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices. J. Vis. Exp. (179), e63151, doi:10.3791/63151 (2022).

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