Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruerade lungvävnader framställda av decellulariserade lungskivor

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63151
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,4
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Yale School of Medicine, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 4Department of Anesthesiology, Yale School of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att generera reproducerbara, småskaliga konstruerade lungvävnader genom att återbefolka decellulariserade precisionsskurna lungskivor med alveolära epiteltyp 2-celler, fibroblaster och endotelceller.

Abstract

Det finns ett behov av förbättrade 3-dimensionella (3D) lungmodeller som rekapitulerar den arkitektoniska och cellulära komplexiteten hos den inhemska lungalveolen ex vivo. Nyligen utvecklade organoidmodeller har underlättat expansion och studier av lungepitelförefäder in vitro, men dessa plattformar förlitar sig vanligtvis på mustumör-härledd matris och / eller serum och innehåller bara en eller två cellulära linjer. Här beskriver vi ett protokoll för att generera konstruerade lungvävnader (ELT) baserat på multi-lineage recellularization av decellulariserade precisionsskurna lungskivor (PCLS). ELT innehåller alveolära liknande strukturer innefattande alveolart epitel, mesenkym och endotel, inom ett extracellulärt matrissubstrat (ECM) som liknar det hos infödd lunga. För att generera vävnaderna blåses råttlungor upp med agaros, skivas i 450 μm tjocka skivor, skärs i remsor och decellulariseras. De resulterande acellulära ECM-ställningarna återförs sedan med primära endotelceller, fibroblaster och alveolära epiteltyp 2-celler (AEC2s). AEC2 kan bibehållas i ELT-odling i minst 7 dagar med ett serumfritt, kemiskt definierat tillväxtmedium. Under hela vävnadsberednings- och odlingsprocessen klipps skivorna i ett kassettsystem som underlättar hantering och standardiserad cellsådd av flera ELT parallellt. Dessa ELT representerar en organotypisk odlingsplattform som bör underlätta undersökningar av cell-cell- och cell-matrisinteraktioner inom alveolus samt biokemiska signaler som reglerar AEC2s och deras nisch.

Introduction

Alveoler är de funktionella enheterna i den distala lungan, som består av ett nät av gasutbyte luftrum kantade av alveolära epiteliala typ 1-celler (AEC1s) och typ 2-celler (AEC2s). Bakom epitelet finns ett tätt nätverk av kapillärer samt stödjande mesenkym, allt stött av en extracellulär matris (ECM) byggnadsställning som ger både styrka och flexibilitet till dessa känsliga luftsäckar1. Alveolerna är också platsen för skada i många lungpatologier, inklusive idiopatisk lungfibros2, akut respiratoriskt nödsyndrom3 och svår koronavirussjukdom-19 (COVID-19)4. Även om arbetet under det senaste decenniet har avslöjat en anmärkningsvärd plasticitet inom lungepitelet, är mekanismerna som möjliggör distal lungreparation i vissa miljöer - och som utesluter reparation i andra - fortfarande ett område med intensiv undersökning5. Utvecklingen av förbättrade in vitro-plattformar för att modellera alveolen skulle underlätta studier av alveolär biologi, regenerering och terapi.

AEC2s självförnyas och differentieras till AEC1s, och anses därmed vara den primära stamcellen i den distala lungan 6,7,8. Dessa celler utgör dock en särskild utmaning för in vitro-studier med tanke på svårigheterna med att odla primära AEC2s utan förlust av fenotyp9. I konventionell 2-dimensionell (2D) kultur plattar AEC2s och antar vissa egenskaper hos AEC1-liknande celler10. Däremot stöder 3D-odlingsstrategier, oftast organoider, upprätthållandet av differentierade egenskaper i primära AEC2s 6,11,12 och tillåter långsiktig odling av pluripotenta stamceller (PSC) -härledda AEC2s13,14. Organoider har använts för att modellera distal lungutveckling15, virusinfektion11,15 och AEC2-relaterad genetisk sjukdom 13,16,17, vilket möjliggör viktiga insikter i AEC2-biologi och regenerering. Dessa odlingsmodeller består emellertid vanligtvis bara av en eller två cellulära släktlinjer och bäddar in cellerna i matriser av geltyp som inte lyckas rekapitulera varken arkitekturen eller ECM-substratet för den inhemska lungalveolen.

ECM är en kritisk regulator för cellfenotyp och beteende via molekylära, topologiska och mekaniska signaler; omfattar en nyckelkomponent i vävnadsspecifika nischer som reglerar stamcellens öde, och fungerar som en reservoar som modulerar tillgången på lokalt utsöndrade tillväxtfaktorer 18,19,20,21. Odling av celler på inhemsk ECM kan således öka in vitro-systemens prediktiva förmåga att modellera biologin hos in vivo-vävnader. Decellularisering, en process som tar bort cellulärt material från vävnader via tvättmedel, enzymer eller fysiska eller andra metoder, kan till stor del bevara ECM-byggnadsställningarna i ett inhemskt organ, när de noggrant utförs22,23. Sådana byggnadsställningar kan återbefolkas med celler för 3D-biomimetisk odling. Men medan decellulariserade byggnadsställningar används i stor utsträckning för vävnadstekniska applikationer, har deras användning för rutinmässig cellodling varit begränsad. Flera tidigare studier har rapporterat decellularisering och recellularisering av lungskivor eller små lungvävnadssegment. Förutom proof-of-concept-studier 24,25,26 har återbefolkade lungskivor använts för att studera fibroblast-matrisadhesion 27,28 och för att undersöka effekten av sjuka lungmatriser på fibroblastfenotyp27,29. Med förbättrad teknik tillgänglig för att generera precisionsskurna vävnadsskivor kan decellulariserade lungskivor erbjuda en bekväm och småskalig plattform för att odla celler, samtidigt som alveolära, luftvägs- och vaskulära understrukturer bevaras. Att införliva flera celltyper skulle möjliggöra studier av cell-cellinteraktioner inom en fysiologiskt relevant 3D-miljö. Förbättrade strategier behövs dock för att underlätta hanteringen av vävnader under hela odlingsprocessen och för att säkerställa kontrollerad och reproducerbar sådd av vävnader med känt antal celler.

Här presenterar vi ett protokoll för att generera konstruerade lungvävnader (ELT) genom att återbefolka decellulariserade precisionsskurna lungskivor (PCLS) med primära endotelceller, AEC2s och fibroblaster. I en anpassning av våra tidigare beskrivna konstruerade hjärtvävnadssystem30 och hela lungdecellulariserings-recellulariseringsstrategier 22,31 beskriver vi procedurer för att skära PCLS från råttlungor och för att klippa skivorna i återanvändbara vävnadsodlingskassetter som förenklar och standardiserar nedströmsmanipulationer. Klippta skivor decellulariseras för att bilda acellulära ECM-ställningar, som återbefolkas i anpassade såddbad. Lungskivor bevarar kritiska ECM-komponenter och arkitektur och stöder tillväxten av AEC2s inom alveolära strukturer med flera linjer i minst 7 dagar. ELT representerar ett nytt alveolära samodlingssystem inom en fysiologiskt relevant 3D-matris, som bör stödja utvecklingen av lungvävnadstekniska strategier, samtidigt som grundläggande biologiska studier av AEC2s och alveolus underlättas.

Protocol

Alla djurförsök som beskrivs i detta dokument godkändes av Yale Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Skapande av vävnadsodlingskassetter och såddbad

OBS: När de har tillverkats kan vävnadsodlingskassetter och såddbad autoklaveras och återanvändas för upprepade omgångar av ELT-odling.

  1. Vävnadsodlingskassetter
    1. Använd en laserskärare för att skära vävnadsodlingskassettramar och klipp ur 3/32 tum tjock polytetrafluoretylen (PTFE) enligt de mönster som anges i tilläggsfil 1 respektive tilläggsfil 2. Använd en laserskärare för att skära vävnadsodlingskassettflikar ur 1/16 tum tjock PTFE enligt tilläggsfil 3. Klipp konturer 3x med 80% effekt och 15% hastighet (för en 30 W laserskärare).
  2. Seeding Bad
    1. Använd CAD-filerna för såddbad (tilläggsfil 4 och tilläggsfil 5) för att 3D-skriva ut basen respektive ringen på såddbadformen med klart harts.
    2. Blötlägg formarna i en lösning av 10% poloxamer 407 i destillerat vatten över natten innan de används för att underlätta PDMS-frisättning. Låt lufttorka, montera sedan ringen över formens botten och linda in i flexibel plastfilm för att förhindra läckage.
    3. Bered minst 60 g per form av polydimetylsiloxan (PDMS) genom att blanda PDMS-elastomer i förhållandet 10: 1 med härdningsmedel och häll i den 3D-tryckta formen. Avgasa PDMS i en vakuum exsickator i 30 minuter för att avlägsna eventuella luftbubblor.
    4. Grädda såddbad vid 60 °C i 8 timmar.

2. Beredning av precisionsskurna lungskivor från råttlungor

  1. Orgel skörd
    1. Förbered ett delat perfusionssystem bestående av tyngdkrafts- och pumpdrivna lemmar, som visas i figur 1. Anslut en lungartärkanyl (PA) till slangens ände, bestående av en 1/16 tums taggad Y-kontakt fäst vid en 1/2 tums längd av LS 14 silikonslang och en 3/32 tums kvinnlig luerlåskontakt (se figur 1). Fäst inte en backventil på kanylen just nu.
    2. Fyll linjerna med PBS innehållande 100 U/ml heparin och 0,01 mg/ml natriumnitroprussid (SNP) för antikoagulation respektive vasodilatation. Förinställ perfusionspumpen på 30 ml/min.
      OBS: Tillsätt SNP färskt till heparinlösningen och håll dig skyddad från ljus.
    3. Dosera en vuxen (8-12 veckor gammal, cirka 300-350 g) Sprague-Dawley råtta med en intraperitoneal (IP) injektion av 400 U/ kg heparin för antikoagulering, följt av en IP-injektion av ketamin (75 mg / kg) och xylazin (5 mg / kg) för anestesi. Bekräfta ett kirurgiskt anestesiplan via brist på svar på skadlig stimulans (tånypa).
    4. Trimma bröstet och buken på pälsen med hårklippare. Spraya sedan med 70% etanol och torka 3x med 10% povidon-jod.
    5. Ta tag i huden under membranets nivå med råtttandtång. Gör sedan ett 1/2 tum tvärgående snitt i huden med finspetsig sax. Ta tag i den exponerade bukfascian med tången, gör ett 1/2 tum tvärgående snitt i fascian och förläng sedan snittet genom huden och fascian över övre delen av buken.
    6. Använd spetsen på den fina saxen för att göra ett litet snitt (högst 1/8 tum) i mitten av det främre membranet, vilket får lungorna att dra sig tillbaka i bröstkorgen. Förläng snittet i membranet över bröstets fulla bredd.
    7. Gör två vertikala snitt genom bröstkorgens fulla höjd mot nacken, var försiktig så att du inte skadar lungorna. Förläng snittet genom de vänstra revbenen för att skära genom nyckelbenet och längs sidan av nacken till struphuvudets nivå och utsätt luftstrupen.
    8. Dissekera luftstrupen fri från omgivande bindväv och från matstrupen. Gör ett tvärgående snitt över den främre halvan av luftstrupen mellan två broskringar, nära struphuvudet. Trä en 4-0 polypropen sutur bakom luftstrupen, under snittets nivå, och knyt löst den första halvan av en kirurgknut med två vändningar.
    9. Placera en kanyl bestående av en 1/16 tums taggad Y-anslutare ansluten till en envägs backventil och en 1/2 tums längd av LS 14 silikonslang med en 3/32 tums kvinnlig luerlåskontakt (se figur 1) i luftstrupen genom att sätta in en lem av Y-kontakten i trakealsnittet mot lungans riktning.
    10. Placera den förbundna suturöglan runt luftstrupen i nivå med den insatta kanylen och dra åt runt den insatta Y-kontakten för att säkra kanylen på plats. Lägg till två enkelvridna kast av suturen för att slutföra knuten.
    11. Fyll en 10 ml spruta med luft och anslut till trakealkanylens luerlås.
    12. Kläm fast den underlägsna vena cava nära membranet med hjälp av en krökt hemostat och injicera sedan hjärtat med 150 U heparin (1000 U / ml) via höger kammare (RV).
    13. Öppna delvis tyngdkraftslinjens stoppkran för att producera en långsam men stadig droppning av PBS / heparin / SNP från PA-kanylen som bereddes i steg 2.1.1.
    14. Trä nålen på en 4-0 polypropylensutur bakom basen av PA där den lämnar husbilen.
    15. Gör ett litet snitt (högst 1/8 tum) i husbilen strax nedanför och vinkelrätt mot PA med en fin sax och sätt sedan in en lem av PA-kanylen Y-kontakten i basen av PA. Säkra suturen runt PA och den isatta kontakten och lägg till ett enkelvridningskast för att slutföra kirurgens knut.
      OBS: Att kannulera PA-underflödet förhindrar införandet av luftbubblor i kärlen som kan förhindra tillräcklig rensning av lungorna.
    16. Fäst en envägsventil i den andra änden av PA-kateterns Y-kontakt och skär sedan av hjärtats topp för att tillåta blodflöde efflux via vänster kammare.
      OBS: Underlåtenhet att skära av hjärtats topp före perfusing via pumpen kan orsaka skador på blodgasbarriären, vilket leder till läckage av vätska i luftrummet.
    17. Växla perfusionsledningen till pumpsidan med hjälp av stoppkranen som förbinder de två ledningarna och slå sedan på pumpen vid 30 ml /min. Medan du perfuserar lungorna via PA, ventilera lungorna manuellt via 10 ml trakealspruta vid cirka 10-15 andetag / min, för att underlätta rensning av lungorna från blod. Perfuse lungorna tills de blir mestadels vita, vanligtvis kräver 40 ml PBS / heparin / SNP eller mindre.
      OBS: Otillräcklig rensning av lungorna av blod kan försämra nedströms decellularisering.
    18. Skär den bakre luftstrupen strax ovanför nivån på trakealkanylen och dissekera sedan lungorna och hjärtat fritt från all återstående bindväv och extrahera lungorna och hjärtat en block.
    19. Fyll en 10 ml spruta med 2% agaros med låg smältpunkt i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan fenolrött, förvärmd till 42 °C.
      OBS: Den exakta volymen agaros som krävs varierar beroende på lungstorlek. Större lungor (dvs från råttor större än 400 g) kommer att kräva mer än 10 ml agaros.
    20. Blåsa upp de extraherade lungorna manuellt 3x med 10 ml luft (dvs. till ungefär total lungkapacitet) via luftstrupen kanyl för att hjälpa till att rekrytera kollapsat parenkym.
    21. Blås omedelbart upp lungorna med den beredda sprutan av agaros genom att manuellt injicera agarosen via luftstrupen kanyl med en hastighet av cirka 40 ml/min, bara tills de mest distala spetsarna på lungloberna är uppblåsta. Om distala regioner i lungan förblir kollapsade, injicera ytterligare 1-2 ml agaros.
    22. Täck luftstrupen genom att fästa den vita kepsen från en 4-vägs stoppkran till det kvinnliga luerlåset på trakealkanylen. Lägg lungan i en 150 mm petriskål på is så att agarosen stelnar.
      OBS: Inflation av lungan strax efter extraktion är avgörande för att säkerställa enhetlig fyllning av lungparenkymen och efterföljande framgångsrik vävnadsskärning. Om lungan blåses upp mycket ojämnt, fortsätt inte med lungskärning eftersom skivkvaliteten blir dålig.
  2. Lungskärning
    OBS: Exakt skivningsförfarande kan behöva anpassas baserat på det vibrerande mikrotom (vibratom) som används; ytterligare exempel på PCLS-preparat med olika vävnadsskivor har publicerats tidigare 32,33,34.
    1. Kyl metallkyla metallkylblocket vid -20 °C och förvara på is när det inte används under hela skivningsproceduren.
    2. Använd en liten droppe cyanoakrylatlim för att fästa ett blad på bladhållaren. Fäst försiktigt bladhållaren i vibratomet med en insexnyckel så att den bara stämmer överens med änden på ett provrör som sätts in i buffertbrickan.
    3. Förbered 6-brunnsplattor med 3 ml per brunnsteril iskall HBSS utan fenolrött för att samla skivorna.
    4. Skär en bit lungvävnad ca 1-1,5 cm3 med en skalpell.
      OBS: Lungvävnad från de nedre och mellersta delarna av vänster lob, liksom från höger mitt- och bottenlob, ger lättast större vävnadsskivor som maximerar alveolära området. Om det finns ouppblåsta vävnadsregioner eller områden av bindväv, antingen klippa av denna vävnad med sax eller orientera nedåt mot kolven; sådan vävnad tenderar inte att skära rent.
    5. Placera en liten droppe cyanoakrylatlim på kolven på provröret. Doppa lungvävnad på en pappersservett för att avlägsna överflödig fukt och placera sedan omedelbart lungvävnaden ovanpå kolven med ett par pincett.
    6. Skjut metallröret på provröret upp till nivån på toppen av vävnaden och håll på plats, med kolven avbruten. Pipettera förvärmde 2% agaros i HBSS i toppen av röret för att helt omge vävnaden.
    7. Placera det iskalla kylblocket runt vävnaden i cirka 1 min så att agarosen stelnar.
    8. Sätt in provröret i buffertbrickan. Fyll brickan med iskall PBS för att halvvägs upp i vävnadsblocket. Vrid motorboxomkopplaren för att spola framåt (FF) för att föra motorboxkolven framåt så att den bara rör vid basen på provröret.
    9. Ställ in önskade inställningar för skivtjocklek, skärhastighet och svängningsfrekvens, till exempel 450 μm tjocklek, hastighet 4 och svängningsfrekvens 5. Välj Kontinuerligt läge och vänd sedan omkopplaren till På för att börja skiva.
    10. När vävnadsskivor faller in i buffertbrickan, överför dem till de beredda 6-brunnsplattorna med en ympande slinga eller spatel.
    11. Sluta skiva när ~ 2 mm tjocklek på vävnaden finns kvar i provröret för att undvika att skada bladet eller skärvävnaden som innehåller lim.
    12. Upprepa ovanstående steg för att skära ytterligare lungvävnad, efter önskemål.
    13. Decellularisera skivor omedelbart för beredning av byggnadsställningar, eller snäppfrys och förvara vid -80 °C i upp till 2 månader. För att frysa, överför 4-6 skivor till en 35 mm petriskål och aspirera försiktigt överflödig vätska från skivorna. Lägg diskarna i ett bad med torris och 100% etanol för att snäppa och frys in, linda sedan in folie, försegla i en plastpåse och överför till -80 °C.
      OBS: Placera inte färska skivor direkt i en frys på -80 °C eftersom den relativt långsamma frysningshastigheten kan orsaka att iskristaller bildas som kan skada vävnaden.

3. Beredning av lungvävnadsställningar

  1. Beredning av material och decellulariseringslösningar
    1. Autoklavera bildrutor, klipp och tabbar.
    2. Förbered decellulariseringslösningar enligt tabell 1.
      OBS: Tillsätt bensonasnukleas till förvärmd buffert omedelbart före användning och sterilt filter. Förbered Triton X-100 och natriumdeoxikolat (SDC) lösningar inom 24-48 timmar efter decellulariseringsproceduren. Bered antibiotika/antimykotiska lösningar och bensonasbuffert upp till 30 d i förväg och förvara vid 4 °C.
  2. Skärning och klippning av lungskivor
    ANMÄRKNING: Även om skärning och klippning kan utföras icke-sterilt på bänkskivan, måste avcellulariseringsstegen i avsnitt 3.3 och all efterföljande hantering av vävnadsställningarna utföras i en laminär flödeshuv.
    1. Fyll en 100 mm petriskål ungefär en tredjedel full med PBS. Överför kassetter (ramar som innehåller två klämmor vardera) och flikar till skålen med pincett.
    2. Om du använder frysta skivor, tina en skål i taget genom att hälla pbs i rumstemperatur i skålen för att täcka skivorna. Förvara resterande rätter på torris.
    3. Överför en tinad skiva till en 150 mm petriskål. Vik försiktigt ut skivan med fina pincett, om det behövs, så att den ligger platt och aspirera sedan försiktigt överskott av PBS från runt vävnaden.
    4. Använd ett rakblad, med en linjal som styrenhet, för att skära en 3 mm bred remsa från skivan genom att trycka hela bladets längd ordentligt mot skålen och gunga den något sida till sida med bladkanten på plats. Alternativt kan du använda en roterande skärare eftermonterad med 2 parallella blad åtskilda av en 3 mm skräddarsydd distans (t.ex. tillverkad av acetal [polyoxymetylen]) för att skära vävnadsremsor. Undvik tårar, hål, stora luftvägar eller kärl eller tjock bindväv.
      OBS: För lyckad klippning måste remsan vara minst 9 mm lång.
    5. Använd pincett och överför vävnadsremsan till den beredda 100 mm petriskålen.
    6. Kläm fast vävnadsremsan i kassetten: flyt vävnaden ovanför kassetten och centrera vävnaden för att överhänga hålen i klämmorna i vardera änden. Placera en flik delvis i hålet i ena änden med fina pincett, räta försiktigt ut vävnaden och placera sedan den andra fliken. Använd pincett i varje hand och tryck in varje flik helt för att säkra vävnaden.
      OBS: Om du har svårt att hålla vävnaden på plats före klippning, aspirera lite PBS från skålen för att sänka vätskenivån. Var försiktig så att du inte sträcker vävnaden när du placerar det andra klippet, eftersom det kan leda till rivning.
    7. Upprepa upptinings-, klippnings- och klippningsproceduren i steg 3.2.2-3.2.6 för så många vävnader som önskas.
  3. Segment decellularisering
    1. När alla skivor är klippta, överför 100 mm skålen som innehåller kassetterna till en laminär flödeshuv.
    2. Börja steg 1 i decellulariseringsprotokollet (se tabell 2): använd en krökt hemostat för att ta tag i de skårade sidorna på varje kassett, överför kassetter till 6-brunnsplattor (2 vävnader / brunn) fyllda med 3 ml PBS + joner + antibiotika / antimykotika per brunn (se lösningsrecept i tabell 1).
    3. Placera brunnsplattorna på en orbitalskakare vid 30 varv / minut i 10 minuter.
    4. Fortsätt med steg 2 i decellulariseringsprotokollet (se tabell 2): aspirera vätskan från varje brunn, ersätt sedan med 3 ml / brunn PBS + joner, placera plattan på orbitalskakaren vid 30 rpm och inkubera i 5 minuter.
    5. Upprepa steg 3.3.4 för var och en av lösningarna och motsvarande varaktigheter enligt beskrivningen i decellulariseringsprotokollet i tabell 2.
    6. Efter det sista sköljsteget med PBS + antibiotika/antimykotika (steg 20 i tabell 2), överför vävnader till sterila 6-brunnsplattor med färska PBS + antibiotika/antimykotika och inkubera vid 37 °C i 48 timmar.
      OBS: Efter sterilisering med antibiotika/antimykotika kan lungvävnadsställningar sås omedelbart eller förvaras vid 4 °C i upp till 30 d.

4. Slice Recellularization och kultur

OBS: Figur 2 visar en föreslagen tidslinje för vävnadssådd och odling, där skivor först frös med råtta lungmikrovaskulära endotelceller och odlas i endotelmedium med lågt serum; sedan sådd med råtta AEC2s och råtta lungfibroblaster med ett serumfritt AEC2-tillväxtmedium (anpassat från Jacob et al.13 och You et al.35); Se ytterligare anmärkningar om cellkällor som används i resultat och odlingsmediedetaljer i tabell 3. Denna strategi ger alveolära liknande strukturer som innehåller AEC2-monolager.

  1. Förbereda vävnadsställningar för sådd (dag -4 eller -3)
    1. Om du använder vävnadsställningar som förvaras vid 4 °C, inkubera byggnadsställningar över natten vid 37 °C med färska PBS + antibiotika/antimykotika (10 % penicillin/streptomycin, 4 % amfotericin B, 0,4 % gentamicin i PBS) före sådd.
    2. Skölj ställningarna 3x med steril PBS (5 ml/brunn), 5 min vardera.
    3. Undersök byggnadsställningar under ett faskontrastmikroskop med 5x förstoring för att välja vävnader för sådd.
      OBS: De bästa ställningarna för sådd har inga tårar eller hål och innehåller inte stora luftvägar eller fartyg. Medan byggnadsställningar med funktionerna kan sås framgångsrikt, kan återpopulationsmönster skilja sig från de som observerats i alveolära områden.
  2. Endotelcellssådd (dag -3)
    1. Räkna endotelceller med hjälp av en hemocytometer och förbered endotelcellsuspensionen i endotelmedium (se tabell 3) vid 5 x 106 celler/ml, med tillräckligt med celler för att så 500 000 endotelceller per skiva (t.ex. för 12 skivor, återsuspendera 6 x 106 celler i 1,2 ml medium).
    2. Placera autoklaverade såddbad i 100 mm petriskålar. Överför sköljda byggnadsställningar upp och ner till såddbad: använd en fin krökt hemostat för att ta tag i en kassett vid de skårade sidorna, använd en rak hemostat eller pincett för att ta tag i ena änden av kassetten (var försiktig så att du inte rör vid själva vävnaden) och vänd och ta sedan tag i kassetten igen med spetsarna på den fina böjda hemostaten via hålen längs de skårade sidorna, och placera i ett såddbad väl. Upprepa för återstående kassetter.
      OBS: När de är korrekt placerade kommer ställningarna att centreras, upp och ner, i botten av varje brunn. Tryck vid behov försiktigt ner i kassettens hörn med spetsarna på en hemostat för att säkerställa att kassetten sitter platt i brunnen. Felaktig sittning av kassetten kan leda till dålig vävnadssådd. Det är acceptabelt om brunnen innehåller en liten mängd PBS.
    3. Virvla den beredda cellsuspensionen försiktigt för att blanda, använd sedan en manuell pipett för att pipettera 100 μL celler direkt ovanpå varje vävnad vid basen av brunnen, var försiktig så att du inte skadar vävnaden med pipettspetsen.
    4. Överför fröade vävnader till cellodlingsinkubatorn vid 37 °C/5 %CO2.
    5. Efter 2 h tillsätt 900 μL förvärmt odlingsmedium till varje brunn med en manuell pipett och återgå sedan till inkubatorn. Om en kassett blir osedd (flyter) när du lägger till medium, tryck försiktigt ner på kassettens hörn med pipettspetsen så att den ligger platt i brunnen.
    6. Byt medium på dag -2. Ta bort mediet genom att luta petriskålen och manuellt pipettera med en pipettspets lätt placerad i brunnens hörn för att inte störa kassetten. Byt ut med 1 ml färskt endotelmedium per brunn.
  3. AEC2 och Fibroblast Seeding och vävnadsodling (Dag 0)
    1. Räkna AEC2s och fibroblaster med hjälp av en hemocytometer. Förbered en 1:1-cellsuspension av AEC2:or och fibroblaster i AEC2-tillväxtmedium (epitelialt basmedium + AEC2-tillskott; se tabell 3) vid 5 x 10totalt antal celler/ml, med tillräckligt många celler för att så 500 000 celler (250 000 AEC2s och 250 000 fibroblaster) per skiva (t.ex. för 12 skivor, resuspendera 3 x 106 AEC2s + 3 x 106 fibroblaster tillsammans i 1,2 ml medium).
    2. Pipettera ut mediet från varje brunn i såddbadet enligt beskrivningen i steg 4.2.6. Virvla den beredda cellsuspensionen försiktigt för att blanda och pipettera sedan 100 μL celler direkt ovanpå varje vävnad vid basen av brunnen.
      OBS: Det är acceptabelt om en liten mängd endotelmedium finns kvar i brunnen före AEC2 / fibroblast sådd.
    3. Överför fröade vävnader till cellodlingsinkubatorn vid 37 °C/5 %CO2.
    4. Efter 2 h, tillsätt 900 μL förvärmt AEC2-tillväxtmedium till varje brunn och återgå sedan till inkubatorn.
    5. Efter 24 timmars kultur (dag 1), förbered en 12-brunnsplatta med 1 ml förvärmt AEC2-tillväxtmedium per brunn per kassett.
    6. Pipettera 800 μl medium från varje brunn i såddbadet. Ta bort kassetter från såddbadet: ta tag i var och en med en fin krökt hemostat via hålen längs de skårade sidorna, överför till en rak hemostat eller pincett för att ta tag i kassetten i ena änden och vänd, använd sedan den böjda hemostaten för att ta tag i kassetten via de skårade sidorna och överför höger sida upp, en per brunn, till den förberedda 12-brunnsplattan.
    7. Byt kulturmedium i 12-brunnsplattan varannan dag fram till dag 7 eller för önskad kulturlängd: använd en pasteurpipett av glas för att aspirera mediet från varje brunn, var försiktig så att du inte rör vid vävnaden; pipett i 1 ml färskt AEC2-tillväxtmedium per brunn.
      OBS: Graden av vävnadsåterpopulation kan övervakas via faskontrastmikroskopi vid 5x förstoring under hela odlingsperioden.

5. Vävnadsskörd och provanalys

  1. För att fixa ELT för histologi och immunofluorescerande färgning, överför vävnadsodlingskassetter till 10% neutralbuffrat formalin och inkubera i 3-4 timmar vid rumstemperatur på en vippa. Ta bort vävnader från kassetter genom att använda spetsen på en finspetsad tång för att skära vävnaden där den möter flikarna. Processvävnad enligt rutinmetoder för paraffininbäddning och histologi; inga specialiserade tekniker krävs.
  2. För att bearbeta ELT för qRT-PCR, skölj vävnader i kassetter i PBS 2x, ta sedan bort vävnader och snäppfrysning eller fortsätt med lys för RNA-extraktion.
    OBS: Sammanslagning av minst 2 skivor sådda med 1 x 106 celler och odlade i 7 dagar bör ge gott om RNA för nedströms PCR-analys.

Representative Results

En översikt över processen för att generera ELT - bestående av lungskärning, skivklippning och decellularisering och ompopulation av byggnadsställningar - presenteras i figur 3. ELT: erna som presenteras här odlades med hjälp av primära råtta lungmikrovaskulära endotelceller (se materialtabell), neonatal råtta AEC2s och lipofibroblastberikade neonatal råtta lungfibroblaster36. AEC2:or isolerades nyligen via magnetisk pärlbaserad sortering enligt tidigare beskrivet37; alternativa isoleringsprotokoll har beskrivits och diskuterats på andra ställen 38,39,40. Renheten hos isolerade AEC2-filer på råtta kan bedömas via flödescytometri för råttspecifik AEC2-ytmarkör RTII-7041, eller via färgning av ett cytocentrifugerat cellprov för RTII-70 eller pro-ytaktivt protein C (pSPC). Råtta lungfibroblaster isolerades från postnatal dag 7-9 råttungar enligt en anpassning av ett publicerat protokoll42 och användes vid passage 1-2; alternativa isoleringsprotokoll har beskrivits på annat håll43,44. Renheten hos isolerade fibroblaster kan bedömas via färgning av odlade eller cytocentrifugerade celler för mesenkymal markör vimentin, och lipofibroblastanrikning kan bedömas via färgning för Oil Red O45.

När lungvävnaden är jämnt uppblåst med agaros och vävnadsstycken strategiskt utvalda och orienterade för skivning för att maximera det totala och parenkymala vävnadsområdet, kan en råttlunga ge vävnad för >100 alveolära ELT. Remsor av PCLS uppvisar tillräcklig mekanisk integritet för att klippas i vävnadskassetter med få (<5%) fall av rivning (figur 3B).

Protokollet för decellularisering av lungskivor är nära baserat på vårt tidigare publicerade protokoll för decellularisering av hela lungan, som genom kvantitativ proteomik visade sig bevara många ECM-komponenter på nivåer som inte signifikant skiljer sig från dem i native lung22. Decellulariserade skivställningar bevarar alveolernas ursprungliga arkitektur, sett av hematoxylin och eosin (H&E) färgning (figur 4A,B) och av faskontrastmikroskopi (figur 4C). Vi utesluter vanligtvis byggnadsställningar som innehåller stora luftvägar eller fartyg (figur 4D) eller tårar, även om de förstnämnda kan inkluderas om de är av intresse för forskaren. Decellularisering leder till en 96% minskning av vävnads-DNA-halten mätt med en analys för dubbelsträngat DNA (se materialtabell; 0,50 μg / mg ± 0,073 μg / mg vs 0,018 μg / mg ± 0,0035 μg / mg i inhemsk respektive decellulariserad vävnad, medelvärde ± SEM) (Figur 5A), utan att DNA syns genom hematoxylinfärgning (figur 4B). Histologisk och immunofluorescerande färgning av decellulariserade byggnadsställningar avslöjar underhåll av ECM-proteiner kollagen, elastin, kollagen IV och laminin med arkitektur och kvantitet som liknar den i inhemska lungskivor (Figur 5B-E). Observera att kärnorna i inhemska vävnader fläckar blått / svart med trichome (för kollagen) och EVG (för elastin) fläckar. Immunofluorescerande färgning utfördes som beskrivits tidigare med användning av standardmetoder för färgning av vävnader37. De antikroppar som används och deras respektive koncentrationer anges i tabell 4.

Framgångsrik återpopulation av byggnadsställningar leder till mycket cellulära ELT efter 7 dagar, med ett alveolärt liknande återpopulationsmönster synligt med ljusmikroskopi (figur 6A-C). I vissa fall, med mycket hög cellularitet, kan strukturer av organoidtyp vara synliga (figur 6A,B). Misslyckad vävnadssådd kan visualiseras genom faskontrastmikroskopi under odling (Figur 6C). Efter odling av vävnadsställningar med AEC2s, fibroblaster och endotelceller återbefolkas ELT tätt med alveolära strukturer som omfattar alla tre cellinjerna (figur 6D, E). Vid dag 7 eller 8 upprätthåller AEC2s kuboidal morfologi och uttrycker ytaktivt protein-B (SPB) och lamellärt kroppsprotein ABCA3, utan tecken på signifikant differentiering till AEC1s (figur 6E, F). AEC2s är mycket proliferativa i ELT, vilket demonstreras av 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering efter en 2 h puls vid 10 μM (figur 6G).

Figure 1
Figur 1: Schematisk över perfusionssystem för lungextraktion och röjning. och en pumpdriven lem, som används för att rensa lungorna effektivt efter initial kannulering. Pumpledningen innehåller en "pulsdämpare" som dämpar spikarna i tryck som orsakas av pumpen. Utformningen av trakeal- och lungartärkanylerna är detaljerad till vänster. SNP = natriumnitroprussid. B) Uppgifter om pulsspjällaggregat. BPT och silikon hänvisar till typer av slangar. (C) Positioner för trakeal- och lungartärkanyler placerade under lungextraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Kulturtidslinje för tri-lineage recellularization. Föreslagen tidslinje för elt-sådd och odling med tre linjer, inklusive tidpunkt för tvåfassådd. Cellnummer för sådd och odlingsmedium för varje fas anges. Se kulturmedieuppgifter i tabell 3. AEC2 = alveolär epitelial typ 2-cell. EC = endotelcell. FB = fibroblast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk över konstruerad lungvävnadsberedning. (B) Precisionsskurna lungskivor skärs i standardiserade 3 mm breda remsor, klipps i polytetrafluoretylen (PTFE) vävnadsodlingskassetter och tvättmedelsavcellulariseras för att ge acellulära extracellulära matrisställningar. (C) Byggnadsställningar återförs i specialiserade såddbad som begränsar såddområdet till vävnadsområdet och odlas sedan i en standardbrunnplatta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Struktur av decellulariserade lungställningar. H&E-färgning av inhemska (A) och decellulariserade (B) lungskivor som visar bevarande av alveolär arkitektur efter decellularisering. (C,D) Exempel på decellulariserade ECM-byggnadsställningar sedda vid 5x förstoring genom faskontrastmikroskopi, bestående av övervägande alveolär vävnad (C) eller innehållande stora förgrenande luftvägar och kärl (D, svarta och röda pilspetsar). Skalstänger, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: DNA-borttagning och matrisbevarande i decellulariserade lungställningar ±. Welchs t-test, **P < 0,01. Decell = decellulariserad. (B,C) Histologisk färgning av inhemska och decellulariserade lungskivor för kollagen (B) och elastin (C). Pilspetsar, elastin bevarade i alveolära ingångsringar av decellulariserad vävnad. (D,E) Immunofluorescerande färgning av inhemska och decellulariserade lungskivor för kollagen IV (D) och laminin (E). Skalstänger, 50 μm. I alla paneler markerar prickade rutor bildområdet som förstoras till höger i respektive panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Cellulär återbefolkning av konstruerade lungvävnader. (A-C) Exempel på recellulariserade ELT på dag 7 av kulturen, som visualiseras under odling genom faskontrastmikroskopi. Recellulariseringsmönstret speglar vävnadens alveolära struktur. I vissa områden med hög cellularitet kan organoidliknande strukturer bildas (pilspetsar). (A) och (B) representerar framgångsrik cellrepopulation, medan (C) representerar en dålig nivå av recellularisering efter 7 dagars odling. (D-G) Färgning av recellulariserade ELT på dag 7 eller 8 av kulturen. (D) H&E-färgning som visar cellulär återpopulation av den alveolära septa. (E) Immunofluorescerande färgningsetiketter ingraferade proCollagenIα1 + fibroblaster, ABCA3 + AEC2s och CD31 + endotelceller. (F) Vävnader innehåller rikligt med SPB + AEC2s men få RTI-40 (podoplanin) + AEC1s under dessa förhållanden. (G) Många AEC2s sprider sig i ELT, mätt genom EdU-införlivande. Skalstänger, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Decellulariseringslösningar. Förberedelsedetaljer för decellulariseringslösningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Decellulariseringsprotokoll. Detaljer om protokoll för decellularisering av lungskivor. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Kulturmedier. Förberedelsedetaljer för endotel- och AEC2-tillväxtmedier. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Antikroppar som används för immunfärgning. Uppgifter om antikroppar och deras koncentrationer som används för immunfärgning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande fil 1: Design för laserskärning av vävnadsodlingskassettramar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Design för laserskärning av vävnadsodlingskassettklämmor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: Design för laserskärning av vävnadsodlingskassettflikar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: CAD-fil för sådd av badformbas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 5: CAD-fil för sådd av badformring. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta dokument beskriver användningen av decellulariserade precisionsskurna lungskivor som en plattform för att generera konstruerade lungvävnader in vitro, som innehåller alveolära liknande strukturer med flera linjer. Genom att kombinera strategier som vi tidigare utvecklat för att återbefolka högkvalitativa acellulära ECM-lungställningar för hela lungteknik22,31, med vårt robusta system för odling av småskaliga konstruerade hjärtvävnader30, möjliggör detta protokoll användning av fysiologiskt relevant lung-ECM som ett vävnadsodlingssubstrat, på ett repeterbart och måttligt genomströmningssätt.

De metoder som presenteras här beskriver ELT-ställningsberedning från råttlungor, som är lätta att uppnå, kan extraheras i block med direkt tillgång till intakta luftvägar för agarosinflation och är av större storlek än muslunga. All lungvävnad som kan blåsas upp med agaros och ge skivor som är minst 9 mm långa får dock användas inom detta system. Oavsett vävnadskälla är enhetlig inflation av lungvävnaden med agaros det mest kritiska steget för att säkerställa framgång för nedströms vävnadsskärning, klippning och vävnadshantering. Underuppblåst lungvävnad tenderar att inte skiva rent, medan överuppblåst vävnad kan riva under klippning. Efter agarosgelering är lämpligt uppblåsta vävnadsregioner fasta men ger lite ge när de försiktigt pressas med pincett. För intakta råttlungor fann vi att föruppblåsning av de extraherade lungorna med luft flera gånger, följt av agarosinflation så snart som möjligt efter extraktion, resulterar i de bästa skivresultaten och bästa kvalitet på resulterande vävnadsställningar. Lämplig volym agaros måste optimeras empiriskt; För en råttlunga är den volym som krävs för att blåsa upp lungan till total lungkapacitet cirka 30 ml/kg djurmassa (t.ex. 10,5 ml agaros för lungor från en 350 g råtta). För större resekterade lungvävnader med mindre enkel luftvägsåtkomst (t.ex. de från mänskliga givare) kan ytterligare felsökning vara nödvändig för att blåsa upp vävnaden via en bronk32. Under efterföljande lungskärning är valet och orienteringen av vävnaden på kolven ett annat viktigt steg för att 1) se till att skivorna är tillräckligt stora för att generera vävnadsremsor som kan klippas i vävnadsodlingskassetter och 2) maximera parenkymal (alveolär) vävnadsarea, exklusive stora luftvägar eller kärl.

Att klippa PCLS i vävnadsodlingskassetter kan vara ett utmanande steg initialt, men kassetterna förenklar vävnadshanteringen kraftigt under decellularisering och sådd. Två potentiella problem som kan uppstå är vävnadsrivning (antingen under klippningsprocessen eller under decellularisering) eller vävnadspositionering i klippen som resulterar i dålig sådd nedströms (t.ex. ingen sådd eller sådd bara i ändarna). Rivning kan vara resultatet av agarosöverinflation, översträckning av vävnaden under flikinsättning eller lämnar för lite överhäng för att ge tillräckligt vävnadsgrepp när flikarna sätts in. Observera att skivor som rivs i en klippände kan sås framgångsrikt, men de är svåra att visualisera under mikroskopet under odling eftersom vävnaden inte är platt. Dålig vävnadssådd (som den i figur 6C) är sannolikt resultatet av att skivan inte ligger platt mellan de två klämmorna och därmed får dålig kontakt med basen på såddbadet väl när den vänds upp och ner. En annan möjlig orsak är felaktig sittning av kassetten i botten av såddbadbrunnen. När det gäller klippning, applicera lite mer spänning i vävnaden när du placerar det andra klippet för att hjälpa det att ligga platt. Vissa skivor har en liten konkavitet; i dessa fall klipp segmentet med den konvexa sidan uppåt. Med övning upplever vi vanligtvis misslyckad sådd med färre än 2% av skivorna.

En begränsning med detta protokoll är kravet på viss specialutrustning - en laserskärare och en 3D-skrivare - för att generera de ursprungliga materialen för ELT-förberedelse. Men när vävnadsodlingskassetterna och såddbaden har skapats krävs inga ytterligare specialmaterial. Lungskärnings- och decellulariseringsstegen för ELT-ställningsberedning är måttligt tidskrävande; Dessa steg kan dock utföras i förväg eller i antal som är tillräckliga för att förbereda sig för flera experiment samtidigt. Många PCLS (>100 om optimering för parenkymala regioner) kan skäras från en enda lunga och snäppfrysas för senare användning. Medan en enda frys-tö-cykel kan orsaka mindre ultrastrukturella skador på ECM46, har även flera frys-tö-cykler visat sig inte orsaka en signifikant förlust i ECM 23,47. PCLS kan också klippas och decellulariseras före ett experiment, för att användas inom en månad. (I synnerhet kan det beskrivna decellulariseringsprotokollet åstadkommas på cirka 6 timmar, vilket representerar en betydande fördel jämfört med tidigare beskrivna metoder som kräver en dag eller mer 27,28.) När ställningarna är förberedda är cellsåddsprocessen enkel och snabb, och odlingen av ELT kräver inte specialiserade tekniker.

En varning för den beskrivna ELT-metoden är bristen på regionspecifik sådd, dvs leveransen av AEC2s specifikt till det alveolära utrymmet eller endotelceller specifikt till kärlutrymmet. Ändå, även om celler helt enkelt sås ovanpå vävnadsställningarna, är mönstret för recellularisering icke-slumpmässigt, med en viss sken av alveolärliknande organisation, inklusive epitelringar. Vi misstänker att cell-cellinteraktioner, liksom lokala skillnader i ECM-sammansättning och geometri20,21, sannolikt bidrar till de observerade recellulariseringsmönstren. Till stöd för denna hypotes visade en tidigare publicerad studie, där fibroblaster såddes icke-specifikt på decellulariserade lungskivor, att mönstret för vävnadsbefolkning och associerade cellulära fenotyper varierade signifikant beroende på mikroskopisk vävnadsregion och ECM-ställningskälla (t.ex. friska kontra sjuka)27. Fibroblaster observerades också invadera in i interstitium - den plats där de bor i inhemsk lungvävnad 1,27. Den primära alternativa metoden som vi kan tänka oss att odla celler på lungskivor på ett verkligt regionspecifikt sätt skulle innebära sådd av intakta decellulariserade lungor via luftvägarna31,48 och vaskulära fack49,50 och sedan skära den recellulariserade vävnaden. Detta alternativ 1) är dock betydligt mer kostnads-, tids- och resurskrävande; 2) är lägre genomströmning; 3) kräver ökat antal djur; och 4) är förknippad med en ökad risk för kontaminering på grund av utmaningarna med hela lungkulturen och efterföljande skivning av den sådda lungan. Även om man inte rekapitulerar alla aspekter av den inhemska cellulära organisationen, möjliggör ELT-plattformen lungcellsodling på ett fysiologiskt relevant ECM-substrat, på ett sätt som är tillgängligt för många fler laboratorier.

ELT-systemets flexibilitet är en stor fördel med denna plattform och bör möjliggöra småskalig lungvävnadsodling med valfritt antal vävnadsställningar, celler eller odlingsmedier av intresse. Användningen av byggnadsställningar som härrör från sjuk vävnad eller från skademodeller kan möjliggöra studier av cell-cell- eller cellmatrisinteraktioner vid inställning av sjukdomsförändrad ECM 27,29,51. Observera dock att decellulariseringsprotokollet kan behöva anpassas för att ta hänsyn till matrisskillnader mellan arter52. Den beskrivna såddstrategin kan användas för vilken celltyp som helst, och odlingstidslinjen anpassas för att passa forskarens behov. Som utgångspunkt bör 1 x 106 celler per byggnadsställning ge en mycket cellulär vävnad inom 7 dagar efter odling, medan 1 x 105 celler totalt resulterar i dålig cellularitet. Vid varje anpassning av tidslinjen bör vävnadsodlingskassetterna avlägsnas från såddbadet 24 timmar efter den sista vävnadssådden. Här, med målet att modellera en del av den cellulära komplexiteten hos lungalveolen, beskriver vi en trikulturell recellulariseringsstrategi som stöder upprätthållandet av väl differentierade neonatala AEC2s i alveolära strukturer i minst 7 dagar. Våra resultat visar också den framgångsrika engraftmenten av både fibroblaster och endotelceller inom ELT, med betoning på den breda tillämpligheten av odlingssubstratet och dess lämplighet för samodlingsstudier. Sådd av vuxna celler i ELT kan underlätta modelleringen av mer vilande alveolära strukturer, medan sådd av humana PSC-härledda AEC2s, inklusive de med genetiska modifieringar, skulle kunna underlätta translationella studier av mänsklig sjukdom13,53. I allmänhet ger den bottom-up-strategi som möjliggörs av ELT-plattformen möjlighet att undersöka bidragen från vissa celltyper till avläsningar av intresse - såsom AEC2-spridning eller differentieringstillstånd.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll ett robust system för att generera konstruerade lungvävnader för samodlingsstudier av AEC2s, fibroblaster och endotelceller i acellulära ECM-lungskivor. ELT representerar en ny 3D-kulturstrategi för primära AEC2s, som hittills vanligtvis har förlitat sig på mindre fysiologiska gel-typmatriser för att upprätthålla en väl differentierad fenotyp 6,11,12. Den nuvarande plattformen bygger på tidigare arbete med återpopulation av decellulariserade lungskivor 24,25,26,27,28,29, men erbjuder flera fördelar: 1) ett vävnadsodlingskassettsystem för att underlätta ELT-hantering under decellularisering, sådd och odling; 2) ett anpassat såddbad för att exakt så ett känt antal celler på varje skivställning; och 3) en trikulturell reseedingsstrategi som möjliggör alveolär vävnadsrepopulation med epitel-, mesenkymala och endotelceller. Således representerar ELT ett viktigt steg framåt mot att skapa reproducerbara in vitro-modeller som fångar cell- och substratkomplexiteten hos den inhemska alveolen och AEC2-stamcellsnischen.

Disclosures

L.E.N. är grundare och aktieägare i Humacyte, Inc, som är ett regenerativt medicinföretag. Humacyte producerar konstruerade blodkärl från allogena glattmuskelceller för kärlkirurgi. L.E.N.s make har eget kapital i Humacyte, och L.E.N. sitter i Humacytes styrelse. L.E.N. är en uppfinnare på patent som är licensierade till Humacyte och som producerar royalties för L.E.N. L.E.N. har fått en obegränsad forskningsgåva för att stödja forskning i sitt laboratorium på Yale. Humacyte påverkade inte uppförandet, beskrivningen eller tolkningen av resultaten i denna rapport.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Lorenzo Sewanan och Jorge Nunez för deras arbete med att utveckla vävnadsodlingskassettdesignen som används i detta protokoll, Kaminski-labbet för användning av deras vibratom, Maurizio Chioccioli och Jessica Nouws för hjälp med lungskärning, Allie LaRocco för hjälp med inledande pilotexperiment och Hong Qian för noggrann läsning av protokollet. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) och U01HL145567 (L.E.N.); och av en obegränsad forskningsgåva från Humacyte Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printer: Form 2 Formlabs
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I5879
8-Bromo cAMP Sigma B7880
Agarose, UltraPure LMP Invitrogen 15517-014
Amphotericin B Sigma A2942
Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch McMaster-Carr 5121K271
Benzonase nuclease Sigma E1014
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V Gemini 700-104P For AEC2 growth medium
Bovine serum albumin (BSA), standard grade Gemini 700-100P For benzonase buffer
Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb Cole-Parmer SK-98553-10
CHIR99021 PeproTech 2520691
Clear Resin, 1 L Formlabs RS-F2-GPCL-04
Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue Any hardware, craft, or drug store KG483 or similar
Dexamethasone Sigma D4902
DMEM (low glucose) Gibco 11885-084
DMEM (high glucose) Gibco 11965-092
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) Invitrogen P7589
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 AmericanBio AB00502-01000
EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) Invitrogen C10340 Used according to manufacturer's directions
Elbow fitting, 3/8 inch McMaster-Carr 5121K907
F12 Gibco 11765-054
Fetal bovine serum (FBS), characterized Hyclone SH30071.03
Gentamicin sulfate Gemini 400-100P Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL
Hair clippers Wahl MiniArco
Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free Gibco 14175-095
Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL Sagent NDC: 25021-400-30 For intraperitoneal and intracardiac injection
Heparin sodium salt Sigma H4784 For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS
HEPES Buffer Corning 25-060-Cl
Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch McMaster-Carr 5121K851
Inoculating loop, disposable Fisherbrand 22-363-600
Insulin from bovine pancreas Sigma I6634
Ketamine injection, 100 mg/mL Covetrus (Butler Animal Health) 010177
KGF, recombinant human PeproTech 100-19
Laser cutter, VLS 3.50 30 watt Universal Laser Systems
L-glutamine Gibco 25030-081
Luer-lock, female, 3/32 inch Cole-Parmer 45508-02
Luer-lock, male, 1/8 inch Cole-Parmer 30800-24
Luer-lock, male, 1/4 inch McMaster-Carr 51525K146
MCDB-131 Complete without serum VEC Technologies MCDB-131 WOFBS
Magnesium chloride (MgCl2), 1 M AmericanBio AB09006-00100
NaCl American Bioananalytical AB01915
Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X Sigma D1408 Reconstitute to 1X with diH2O
Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ Gibco 21300-058
PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corporation 4019862
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) Gibco 15140-122
Petri dish, 150 mm Falcon 351058
Plastic film (parafilm) Bemis PM-996
Pharmed BPT tubing, LS 16 Masterflex 06508-16
Pharmed BPT tubing, LS 17 Masterflex 06508-17
Platinum-cured silicone tubing, LS 14 Masterflex 96420-14
Platinum-cured silicone tubing, LS 16 Masterflex 96420-16
Platinum-cured silicone tubing, LS 36 Masterflex 96410-36
Poloxamer 407 (Pluronic F-127) Sigma P2443
Povidone/iodine prep pads, 10% Dynarex Corporation 1108
PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick ePlastics PTFENAT0.060X12X12 For tissue culture cassette tabs
PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick ePlastics PTFENAT0.093X12X12 For tissue culture cassette frames and clips
Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive Cole-Parmer ZM-07528-30
Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head Cole-Parmer EW-77202-60
Rat, Sprague Dawley Charles River Strain Code: 400
Razor blade Any hardware or craft store Personna 94-120-71 or similar
Retinoic acid Sigma R2625
Rotary blades, 28 mm Omnigrid 2046
Rotary cutter, 28 mm Olfa Model 9551
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma D6750
Sodium nitrorusside (SNP) Sigma 71778
Stopcock, 4-way Edwards 594WSC
Suture, 4-0 monofilament polypropylene Covidien VP-557-X
Syringe, 10 mL BD 302995
Syringe, 50 mL BD 309653
Tissue culture dish, 35 mm Falcon 353001
Tissue culture dish, 100 mm Corning 430167
Tissue culture plate, 6-well Falcon 353046
Tissue culture plate 12-well Falcon 353043
Transferrin human Sigma T8158
Tris, 1 M solution, pH 8.0 AmericanBio AB14043-01000
Triton X-100 American Bioanalytical AB02025-00500
Vibratome, Compresstome VF-300-0Z Precisionary Instruments LLC
Xylazine, 100 mg/mL Henry Schein NDC: 11695-4022-1
Y-connector, 1/16 inch barbed Cole-Parmer 30614-43

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burri, P. H. Morphology and respiratory function of the alveolar unit. International Archives of Allergy and Applied Immunology. 76, Suppl 1 2-12 (1985).
  2. Barkauskas, C. E., Noble, P. W. Cellular Mechanisms of Tissue Fibrosis. 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (11), 987-996 (2014).
  3. Taylor, M. S., et al. A Conserved Distal Lung Regenerative Pathway in Acute Lung Injury. American Journal of Pathology. 188 (5), 1149-1160 (2018).
  4. Carsana, L., et al. Pulmonary post-mortem findings in a series of COVID-19 cases from northern Italy: a two-centre descriptive study. Lancet Infectious Diseases. 20 (10), 1135-1140 (2020).
  5. Basil, M. C., et al. The Cellular and Physiological Basis for Lung Repair and Regeneration: Past, Present, and Future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. Desai, T. J., Brownfield, D. G., Krasnow, M. A. Alveolar progenitor and stem cells in lung development, renewal and cancer. Nature. 507 (7491), 190-194 (2014).
  8. Evans, M. J., Cabral, L. J., Stephens, R. J., Freeman, G. Renewal of alveolar epithelium in the rat following exposure to NO2. The American Journal of Pathology. 70 (2), 1-24 (1973).
  9. Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
  10. Borok, Z., et al. Keratinocyte growth factor modulates alveolar epithelial cell phenotype in vitro: expression of aquaporin 5. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 18 (4), 554-561 (1998).
  11. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  12. Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary Type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
  13. Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Chen, Y. W., et al. A three-dimensional model of human lung development and disease from pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 19 (5), 542-549 (2017).
  16. Korogi, Y., et al. In vitro disease modeling of hermansky-pudlak syndrome Type 2 using human induced pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 431-440 (2019).
  17. Strikoudis, A., et al. Modeling of fibrotic lung disease using 3D organoids derived from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3709-3723 (2019).
  18. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  19. Chapman, H. A. Epithelial responses to lung injury: Role of the extracellular matrix. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (3), 89-95 (2012).
  20. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  21. Zhou, Y., et al. Extracellular matrix in lung development, homeostasis and disease. Matrix Biology. 73, 77-104 (2018).
  22. Calle, E. A., et al. Targeted proteomics effectively quantifies differences between native lung and detergent-decellularized lung extracellular matrices. Acta Biomaterialia. 46, 91-100 (2016).
  23. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  24. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: Detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  25. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1055 (2013).
  26. Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
  27. Burgstaller, G., et al. Distinct niches within the extracellular matrix dictate fibroblast function in (cell free) 3D lung tissue cultures. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (5), 708-723 (2018).
  28. Sun, H., et al. Fibroblast engraftment in the decellularized mouse lung occurs via a β1-integrin-dependent, FAK-dependent pathway that is mediated by ERK and opposed by AKT. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (6), 463-475 (2014).
  29. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  30. Schwan, J., et al. Anisotropic engineered heart tissue made from laser-cut decellularized myocardium. Scientific Reports. 6, 32068 (2016).
  31. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  32. Gerckens, M., et al. Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  33. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
  34. Neuhaus, V., et al. Assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (135), e57042 (2018).
  35. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (6), 1315-1321 (2002).
  36. Vaccaro, C., Brody, J. S. Ultrastructure of developing alveoli. I. The role of the interstitial fibroblast. The Anatomical Record. 192 (4), 467-479 (1978).
  37. Calle, E. A., et al. Fate of distal lung epithelium cultured in a decellularized lung extracellular matrix. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1916-1928 (2015).
  38. Dobbs, L. G., Gonzalez, R., Williams, M. C. An improved method for isolating type II cells in high yield and purity. American Review of Respiratory Disease. 134 (1), 141-145 (1986).
  39. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. American Journal of Physiology. 258, 134-147 (1990).
  40. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  41. Dobbs, L. G., Pian, M. S., Maglio, M., Dumars, S., Allen, L. Maintenance of the differentiated type II cell phenotype by culture with an apical air surface. The American Journal of Physiology. 273 (2), 347-354 (1997).
  42. Bruce, M. C., Honaker, C. E. Transcriptional regulation of tropoelastin expression in rat lung fibroblasts: changes with age and hyperoxia. American Journal of Physiology. 274 (6), 940-950 (1998).
  43. Berk, J. L., Franzblau, C., Goldstein, R. H. Recombinant interleukin-1 beta inhibits elastin formation by a neonatal rat lung fibroblast subtype. Journal of Biological Chemistry. 266 (5), 3192-3197 (1991).
  44. Schultz, C. J., Torres, E., Londos, C., Torday, J. S. Role of adipocyte differentiation-related protein in surfactant phospholipid synthesis by type II cells. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 283 (2), 288-296 (2002).
  45. Maksvytis, H. J., et al. In vitro characteristics of the lipid-filled interstitial cell associated with postnatal lung growth: evidence for fibroblast heterogeneity. Journal of Cellular Physiology. 118, 113-123 (1984).
  46. Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
  47. Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
  48. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
  49. Le, A. V., et al. Efficient and Functional Endothelial Repopulation of Whole Lung Organ Scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (9), 2000-2010 (2017).
  50. Ren, X., et al. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nature Biotechnology. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  51. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  52. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  53. Alysandratos, K. D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).

Tags

Bioteknik utgåva 179
Konstruerade lungvävnader framställda av decellulariserade lungskivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leiby, K. L., Ng, R., Campbell, S.… More

Leiby, K. L., Ng, R., Campbell, S. G., Niklason, L. E. Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices. J. Vis. Exp. (179), e63151, doi:10.3791/63151 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter